BAB III METODOLOGIPENELITIAN
3.1.
Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di
Laboratorium Biokimia Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau-Pekanbaru dan dilakukan seiama lebih kurang 6 (enam) bulan.
3.2.
Alat dan Bahan
3.2.1. Alat Yang Digunakan Aiat-alat yang digunakan adalah spektrofotomerter sinar tampak yaitu Spektronic Genesis II keluaran Milton Roy Co. USA Cat. No. 400; Laminar Air flow (ESCO Micro PTE LTD HD 3); Autoklaf ALL American model 1925 X/KY-23D Wisconsin Aluminium Foundry Co. inc. Manitowoc; Rotary shaker (Stuart Scientific Inggis); pH meter 210 A Orion; Kertas saring GF/C Whatman (Cat. No. 1822055); Corning Sterile Syringe Filter 0,45 ^im CA (Cat. No. 431220); Waterbath termostat WK-24 (Shibata Scientific Technologamy Ltd.); Pompa vakum P-\69 (Fisher General Scientific Private Limited, Singapura); Vortex mixer Genie 2™ Cat. No. 12-82; tabung eppendrof dan alat-alat standar lainnya yang digunakan di laboratorium sesuai dengan prosedur keija.
3.2.2. Bahan Yang Digunakan Kitin koloidal keluaran SIGMA (nomor katalog C-9752), kitin cangkang kepiting komersil (crab shells) keluaran SIGMA (nomor katalog C-7170, Polivinil polipirilidon adalah keluaran SIGMA-Aldrich Chemical Co.St.Louis, MO (nomor katalog P-6755), Nystatin (N4014-50MG), Bacitracin (B0125) dan bahan kimia proanalisis atau bahan preparatif sesuai prosedur kerja.
11
3.3.
Rancangan Penelitian Sampel tanah diambil masing-masing sebanyak 5 gram dari lima titik
berbeda dengan jarak minimal 10 meter antar titik di zona inti Cagar Biosfir Giam Siak Kecil-Bukit Batu, Riau. Sampel dibawa ke laboratorium dilakukan isolasi fimgi filament pada media selektif dengan sumber karbon tunggal kitin, sehingga hanya produsen kitinase yang akan dapat tumbuh. Koloni yang tumbuh dimumikan pada media selektif yang sama sehingga akhimya nanti diperoleh koloni yang berasal dari spora tunggal.
Setelah pemumian, masing-masing
kultur diidentfikasi secara morfologis dan ditentukan aktivitas kitinase pada media produksi enzim cair. Adapun secara keseluruhan metodologi penelitian dapat dirangkum sebagaimana yang terlihat pada bagan di gambar 3.
Sampel tanah dari 5 titik dalam kawasan inti Cagar Biosfir Giam Siak Kecil-Bukit Batu, Riau.
Isolasi pada media selektif 1^ichoderma sp. dengan sumber karbon 1xmggal kitin.
Pemumian Koloni.
1
Identifikasi secara morfologi mikroskopik.
Gambar 3. Rancangan penelitian secara umum
12
3.4.
Prosedur Kerja
3.4.1. Penyediaan Sampel Isolasi galur Trichoderma sp. penghasil enzim kitinase Tanah untuk isolasi Trichoderma sp. penghasil enzim kitinolotik diambil dari lima titik dengan berat masing-masing 5 gr dengan teknik pengambilan yaitu sekop kecil yang sebelumnya di usap-usap pada permukaan tanah kawasan hutan gambut zona inti (Kawasan Suaka Margasatwa) Cagar Biosfir Giam Siak-Bukit Batu, Riau dan barulah diambil sebanyak tersebut di atas. Masing-masing titik pengambilan sampel berjarak satu sama lainnya minimal 10 meter. Sampel diletakkan pada plastik lalu segera di bawa ke laboratoriimi.
3.4.2. Pembuatan Medium Selektif Bahan-bahan yang digunakan untuk pembuatan medium selektif adalah sebagai berikut. label 1. Bahan Medium Selektif Ca(N03)2*4H20
0,3596 g
KNO3
0,065 g
MgS04*7H20
0,065 g
CaCl2
0,25 g
Agar
5g
KH2PO4
0,03 g
Kitin
0,5 g
Air
250 mL
Igepal
0,025 mL
Sodiimi Propionat
0,05%
Asam Sitrat
0,005%
Nystatin
0,002%
Klortetrasiklin
0,005%
Neomicin Sulfat
0,01%
Basitrasin
0,01%
Penicillin G
0,01%
13
Seluruh bahan dilarutkan dan dipanaskan hingga mendidih sehingga agar larut. Campuran tersebut disterilisasi dalam autoklaf (121° C, 20 menit). Setelah itu dimasukkan dalam petri dish ukuran diameter 30 cm dan diinkubasi seiama 3-4 hari.
3.4.3. Inokulasi Sampel pada Medium Selektif Sampel tanah yemg diambil dari lima titik tersebut masing-masingnya ditimbang sebanyak 0,6 gr kemudian dicampur dan diaduk merata. Agar tidak rusak, tanah disimpan dalam lemari pendingin sebagai stok sampel. Dari campuran tanah yang diperoleh. Tanah yang telah tercampur merata diencerkan dalam 100 ml air steril serta distirer agar homogen. Suspensi tersebut diencerkan dengan pengenceran 10^, 10"*, 10^, 10* dan sebanyak 1 ml suspensi sampel disebar pada media selektif Trichoderma sp. bersumber karbon tunggal sesuai target enzim pada 6 cawan petri dengan rincian yaitu 1 cawan petri ukuran besar, 2 cawan petri ukuran sedang dan 3 cawan petri ukuran kecil. Media selektif merupakan modifikasi dari media yang digunakan oleh Smith dkk. (1990).
3.4.4. Pemurnian Kultur Pemumian kultur dilakukan dengan metoda pour plate yaitu sebagai berikut air salin sebanyak 4,5 mL dan telah diautoklaf disiapkan. Spora digerus dan masukkan dalam tabimg reaksi berisi air salin, homogenkan dengan cara vortex. Setelah homogen, suspensi tersebut disaring dengan glasswoU dan diambil sebanyak 50 ^L lalu masukkan ke dalam tabimg berikutnya. Lakukan terns hingga pengenceran lO'*, 10^, 10^ 10^°, lO'^, lO'"*. Pada tabung reaksi pengenceran 10*, lO'", lO'^, lO'"* diambil masing-masing sebanyak 100 \iL dan ditanam pada media selaktif dalam petri dish. Ratakan dengan batang L yang telah disterilsasi. Timggu jamur meresap pada permukaan media dan inkubasi pada suhu kamar. Kegiatan pemumian ini dilakukan beberapa kali sampai diperoleh kultur mumi.
14
3.4.5. Pembuatan Medium Padat Bahan-bahan yang digunakan untuk pembuatan medium padat Potato Dextrosa Agar (PDA) adalah kentang 250 g, glukosa 20 g, agar 17 g, aquadest 1000 mL, asam sitrat 0,005% dan beberapa antibiotik. Kentang diiris-iris kecil dan dimasukkan ke dalam 500 mL aquadest, didihkan 20 menit kemudian disaring dengan kain kasa. Filtrat yang diperoleh dicampurkan dengan glukosa. Dimasukkan aquadest sampai 1000 mL dan agar. Campuran dipanaskan sampai agar larut. Setelah itu diautoklaf seiama 20 menit. Asam sitrat ditambahkan dalam medium tersebut setelah proses sterilisai selesai dan dimasukkan ke dalam petri dish dan tabimg reaksi (5 mL) untuk dibuat agar miring lalu diinkubasi selam 3 hari.
3.4.6. Inokulasi Jamur pada Media Padat Jamur yang telah tumbuh pada medium selektif dipindahkan dalam medium padat (PDA) dengan cara mengambil miselia jamur tersebut dengan menggunakan tusuk gigi yang telah disterilisasi terlebih dahulu. Setelah itu, jamur digoreskan pada permukaan agar dengan jarum ose steril dan dibiarkan seiama 1 jam. Setelah 1 jam jamur diinkubasi pada suhu kamar hingga tumbuh koloni baru jamur.
3.4.7. Identifikasi Morfologi Trichoderma sp. Fungi diidentifikasi berdasarkan morfologis wama, ukuran dan bentuk fialospora, bentuk susunan failida, ada tidaknya klamidospora serta morfologi miselia (Rifai, 1969). Meskipun cara ini tidak akan dapat mengidentifikasi spesies secara tepat tetapi cara ini cukup baik untuk identifikasi di tingkat genus saja (Nugroho dkk., 2008, Druzhinina dkk., 2006).
15
