BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3. 1 Metode Penelitian 3. 1. 1 Rancangan Penelitian Untuk mengetahui pengaruh penambahan DHA terhadap ketahanan susu pasteurisasi rasa cokelat diperlukan rancangan penelitian serta analisis data statistik. Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan pola dwifaktor. Faktor 1 : perlakuan DHA terdiri dari tiga taraf : d0 = 0 % DHA, tanpa penambahan DHA (kontrol) d1 = 1 % DHA atau setara dengan 1,9 g DHA/liter susu pasteurisasi d2 = 2 % DHA atau setara dengan 3,8 g DHA/liter susu pasteurisasi d3 = 3 % DHA atau setara dengan 5,7 g DHA/liter susu pasteurisasi Faktor 2 : perlakuan lama penyimpanan empat taraf : h0 = 0 hari penyimpanan pada refrigator (suhu 6-8oC) h1 = 1 hari penyimpanan pada refrigator (suhu 6-8oC) h2 = 2 hari penyimpanan pada refrigator (suhu 6-8oC) h3 = 3 hari penyimpanan pada refrigator (suhu 6-8oC) h4 = 4 hari penyimpanan pada refrigator (suhu 6-8oC) Dengan demikian, banyaknya perlakuan yang dicobakan sebanyak 4 x 5 atau sama dengan 20
perlakuan. Percobaan
sehingga terdapat 60 unit percobaan. 37
diulang
sebanyak
3
kali,
38
Kombinasi perlakuan disusun sebagai berikut : 1. d0h0
6. d1h0
11. d2h0
16. d3h0
2. d0h1
7. d1h1
12. d2h1
17. d3h1
3. d0h2
8. d1h2
13. d2h2
18. d3h2
4. d0h3
9. d1h3
14. d2h3
19. d3h3
5. d0h4
10. d1h4
15. d2h4
20. d3h4
Melalui teknik pengacakan data maka diperoleh kombinasi penelitian dengan 3 kali pengulangan sebagai berikut: d0h0 d1h4 d2h3 d2h1
d0h0
d0h2
d1h1
d2h1
d3h4 d1h1
d1h1 d1h2 d1h3 d2h4
d3h0
d1h4
d1h3
d3h1
d0h3 d0h2
d0h4 d0h1 d3h2 d2h2
d3h3
d2h3
d3h3
d2h3
d1h0 d3h4
d3h2 d2h2 d2h4 d0h3
d2h0
d1h0
d3h0
d0h4
d3h1 d0h0
d0h2 d3h4 d2h0 d2h1
d3h1
d1h3
d1h4
d2h0
d3h3 d1h2
d3h2 d1h2 d3h0 d0h1
d0h4
d1h0
d0h1
d2h2
d2h4 d0h3
3. 1. 2 Rancangan Analisis Penelitian ini menggunakan rancangan analisis variansi dwifaktor dalam rancangan acak lengkap (RAL), dengan persamaan statistik : Yijk = µ + ρi + Aj + Bk + (AB)jk + Σijk Keterangan: Yijk
: Nilai pengamatan pada ulangan ke-i yang menggunakan faktor DHA taraf ke-j dan menerima perlakuan waktu penyimpanan taraf ke-k.
µ
: Nilai rata-rata pengamatan.
39
ρi
: Ulangan ke-i.
Aj
: Faktor DHA taraf ke-j.
Bk
: Pengaruh waktu penyimpanan taraf ke-k.
(AB)jk : Pengaruh interaksi DHA taraf ke-j dengan waktu penyimpanan taraf ke-k. : Pengaruh galat percobaan ke-i yang memperoleh taraf DHA ke-j dan
Σijk
waktu penyimpanan ke-k.
Pengujian signifikasi pengaruh perlakuan diuji dengan uji F hitung pada taraf 5%. Hipotesis yang digunakan dalam penelitian ini adalah: 1) pH susu pasteurisasi rasa cokelat terfortifikasi DHA H0
: Tidak ada pengaruh penambahan DHA terhadap pH susu pasteurisasi rasa cokelat.
H1
: Ada pengaruh penambahan DHA terhadap pH susu pasteurisasi rasa cokelat.
2) Kandungan bakteri total susu pasteurisasi rasa cokelat terfortifikasi DHA H0
: Tidak ada pengaruh penambahan DHA terhadap kandungan bakteri total susu pasteurisasi rasa cokelat.
H1
: Ada pengaruh penambahan DHA terhadap kandungan bakteri total susu pasteurisasi.
40
Perhitungan analisis variansi untuk percobaan dwifaktor dengan n replikasi dapat dilihat pada Tabel 10. Tabel 10. Analisis Variansi untuk Percobaan Dwifaktor dengan n Replikasi Jumlah
Sumber
Kuadrat
Variansi
(JK)
Derajat
Kuadrat Tengah
Kebebasan
(KT)
F hitung
Pengaruh A
JKA
a–1
KTA =
JKA a −1
FA =
KTA KTG
B
JKB
b–1
KTB =
JKB b −1
FB =
KTB KTG
AB
JK(AB)
(a-1)(b-1)
Galat
JKG
ab(n-1)
JKT
abn-1
Interaksi KT(AB) = KTG =
JK(AB) (a − 1)(b − 1)
JKG ab(n − 1)
Sumber : Ronald E., 1995 Rumus perhitungan jumlah kuadrat :
T2 JKT = ∑∑∑ y − abn i =1 j=1 k =1 a
b
n
2 ijk
a
∑T
2 i..
T...2 JKA = − bn abn i =1
b
∑T
2 j..
T...2 JKB = − an abn i =1
a
JK(AB) =
b
a
b
∑∑ T ∑ T ∑ T i =1 j=1
2 ij
−
i =1
2 i..
−
n bn JKG = JKT − JKA − JK(AB)
i =1
an
2 j..
+
T...2 abn
FAB =
KT(AB) KTG
41
3. 2 Pelaksanaan Penelitian 3. 2. 1 Alat dan Bahan 1) Alat Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain peralatan gelas, pipet volum 10 mL, pipet volum 1 mL, stirrer, neraca analitik termometer 100 o
C, pH meter, laktodensimeter, milkana superior, autoclave, inkubator, oven,
petri dish, pembakar spirtus, set alat pasteurisasi (meliputi: PHE (Plate Heat Exchanger) regeneratif I, PHE regeneratif II, PHE pasteurisasi, plate cooler, storage tank, homogenizer, mixing tank, agitator, holding tube, FDV (flow diversion valve)), kemasan botol 80 mL dan refrigator. 2) Bahan Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah susu segar, gula, cokelat bubuk, flavor cokelat, stabilizer (CMC), asam dokosaheksaenoat (DHA) produk NuMega Diphorm® HiDHA® 50, alkohol 70%, larutan ringer, media agar dan aquades.
3. 2. 2 Bagan Alir Penelitian Penelitian ini melalui empat tahapan penelitian yaitu tahap persiapan dan pengujian bahan baku susu segar, tahap pasteurisasi susu rasa cokelat, tahap penambahan DHA ke dalam susu pasteurisasi rasa cokelat dan tahap pengujian ketahanan susu pasteurisasi rasa cokelat terfortifikasi DHA. Bagan alir setiap tahapan penelitian dapat dilihat pada Gambar 11, Gambar 12, Gambar 13, dan Gambar 14.
42
1) Tahap I Persiapan dan Pengujian Bahan Baku Susu Segar Uji organoleptik Uji temperatur
Susu Segar
Uji berat jenis Pengujian bahan baku susu
Uji alkohol Uji pH
Susu Segar Teruji
Uji kandungan susu
Disaring Ditimbang untuk mengetahui volume susu, menggunakan Milk Reception Scale Dialirkan ke Milk Reception Vat
Susu Segar (dalam Milk Reception Vat) ) Dialirkan ke Plate Cooler I (pendinginan tahap I)
Susu Segar (8 – 12 oC) Dialirkan ke Plate Cooler II (pendinginan tahap II)
Susu Segar (2 – 4 oC) Dialirkan ke dalam Storage Tank (tangki penyimpanan sementara)
Susu Segar dalam Storage Tank (2 – 4 oC)
Gambar 11. Bagan Alir Tahap Persiapan dan Pengujian Bahan Baku Susu Segar
43
2) Tahap II Pasteurisasi Susu Rasa Cokelat Susu Segar dalam storage tank (2 – 4 oC) Dialirkan ke dalam PHE (Plate Heat Exchanger)
Susu (20 – 40 oC) Dialirkan ke dalam mixing tank Ditambahkan gula Diaduk dengan menggunakan agitator dan diaduk secara manual dengan pengaduk stainless steel
Campuran (Susu + Gula) (20 – 40 oC) Ditambahkan cokelat, flavor cokelat dan stabilizer (CMC). Diaduk dengan menggunakan agitator dan diaduk secara manual dengan pengaduk stainless steel.
Susu Rasa Cokelat (20 – 40 oC) Dialirkan ke balance tank Dialirkan ke PHE regeneratif I
Susu Rasa Cokelat (60 – 70 oC) Dihomogenisasi dengan menggunakan homogenizer
(Lanjut ke halaman berikutnya)
44
Lanjutan
Susu Rasa Cokelat Homogen (60 – 70 oC) Dialirkan ke PHE pasteurisasi Dialirkan ke holding tube (suhu susu akan dipertahankan 82 oC selama 15 detik)
Susu Pasteurisasi Rasa Cokelat (82 oC) Dialirkan ke PHE Regeneratif II
Susu Pasteurisasi Rasa Cokelat (21oC) Dialirkan ke Plate Coller
Susu Pasteurisasi Rasa Cokelat (2 – 4 oC)
Dialirkan ke Storage Tank (tangki penyimpanan sementara)
Susu Pasteurisasi Rasa Cokelat (2 – 4 oC)
Gambar 12. Bagan Alir Tahap Pasteurisasi Susu Rasa Cokelat
45
3) Tahap III Penambahan DHA ke dalam Susu Pasteurisasi Rasa Cokelat Susu Pasteurisasi Rasa Cokelat
Tanpa DHA
+ DHA 2%
+ DHA 1%
+ DHA 3%
Dibuat secara triplo Dikemas dalam kemasan botol Diberi label
d01
d02
d03
d11
d12
d13
d21
d22
d23
d31
d32
d33
Susu Pasteurisasi Rasa Cokelat + DHA
Gambar 13. Bagan Alir Penambahan DHA ke dalam Susu Pasteurisasi Rasa Cokelat Keterangan: d01 : Susu pasteurisasi rasa cokelat tanpa penambahan DHA (ulangan ke-1) d02 : Susu pasteurisasi rasa cokelat tanpa penambahan DHA (ulangan ke-2) d03 : Susu pasteurisasi rasa cokelat tanpa penambahan DHA (ulangan ke-3) d11 : Susu pasteurisasi rasa cokelat dengan penambahan DHA 1% (ulangan ke-1) d12 : Susu pasteurisasi rasa cokelat dengan penambahan DHA 1% (ulangan ke-2) d13 : Susu pasteurisasi rasa cokelat dengan penambahan DHA 1% (ulangan ke-3) d21 : Susu pasteurisasi rasa cokelat dengan penambahan DHA 2% (ulangan ke-1) d22 : Susu pasteurisasi rasa cokelat dengan penambahan DHA 2% (ulangan ke-2) d23 : Susu pasteurisasi rasa cokelat dengan penambahan DHA 2% (ulangan ke-3) d31 : Susu pasteurisasi rasa cokelat dengan penambahan DHA 3% (ulangan ke-1) d32 : Susu pasteurisasi rasa cokelat dengan penambahan DHA 3% (ulangan ke-2) d33 : Susu pasteurisasi rasa cokelat dengan penambahan DHA 3% (ulangan ke-3)
46
4) Tahap IV Pengujian Ketahanan Susu Pasteurisasi Rasa Cokelat Terfortifikasi DHA Susu Pasteurisasi Rasa Cokelat + DHA Disimpan pada refrigator (6 – 8 oC) selama 4 hari
d0h0
d1h0
d2h0
d3h0
d0h1
d1h1
d2h1
d3h1
d0h2
d1h2
d2h2
d3h2
d0h3
d1h3
d2h3
d3h3
d0h4
d1h4
d2h4
d3h4
Diuji ketahanan susu: Uji pH, uji alkohol dan TPC (Total Plate Count).
Data Hasil Analisis
Gambar 14. Bagan Alir Pengujian Ketahanan Susu Pasteurisasi Rasa Cokelat Terfortifikasi DHA Keterangan: d0 = 0 % DHA, tanpa penambahan DHA (kontrol) d1 = 1 % DHA atau setara dengan 1,9 g DHA/liter susu pasteurisasi d2 = 2 % DHA atau setara dengan 3,8 g DHA/liter susu pasteurisasi d3 = 3 % DHA atau setara dengan 5,7 g DHA/liter susu pasteurisasi h0 = 0 hari penyimpanan pada refrigator (suhu 6-8oC) h1 = 1 hari penyimpanan pada refrigator (suhu 6-8oC) h2 = 2 hari penyimpanan pada refrigator (suhu 6-8oC) h3 = 3 hari penyimpanan pada refrigator (suhu 6-8oC) h4 = 4 hari penyimpanan pada refrigator (suhu 6-8oC)
47
3. 2. 3 Cara Kerja 1) Persiapan Bahan Baku Susu Segar Susu pasteurisasi rasa cokelat menggunakan susu segar sebagai bahan baku. Susu segar yang digunakan harus mempunyai kualitas yang baik. Oleh karena itu dilakukan pengujian terhadap kualitas bahan baku susu segar. Adapun pengujian yang dilakukan adalah uji organoleptik, temperatur, berat jenis, uji alkohol, uji pH dan uji kandungan susu (lemak, SNF/solid non fat, TS/total solid dan protein) dengan menggunakan milkana superior. Bahan baku susu segar yang telah diuji kualitasnya disaring untuk menghilangkan pengotor dengan menggunakan saringan yang terbuat dari kain nilon. Kemudian susu ditimbang dengan menggunakan milk reception scale. Penimbangan ini bertujuan untuk mengetahui volume susu dengan cara mengkonversi massa susu yang diperoleh ke dalam volume susu (berat jenis susu diketahui melalui pengukuran). Setelah ditimbang susu dialirkan ke milk reception vat untuk ditampung kemudian susu dialirkan ke plate cooller I (pendinginan tahap I) dengan menggunakan pompa sentrifugal. Suhu susu pada tahap pendinginan ini sekitar 8 – 12 oC. Setelah itu susu dialirkan ke plate cooler II untuk pendinginan tahap II, suhu susu sekitar 2 – 4 oC. Setelah proses pendinginan susu dialirkan ke dalam storage tank (tangki penyimpanan sementara). Bahan baku susu segar siap digunakan untuk proses pasteurisasi susu rasa cokelat.
48
2) Proses Pasteurisasi Susu Rasa Cokelat Proses pasteurisasi susu rasa cokelat pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan set alat pasteurisasi, teknik pasteurisasi dan teknisi pasteurisasi dari Milk Treatment Koperasi Peternakan Bandung Selatan (MT KPBS) Pangalengan. Adapun tahapan pasteurisasinya adalah susu segar dalam storage tank dialirkan ke PHE (plate heat exchanger). Pada tahap ini suhu susu naik menjadi 20 – 40 oC. Penaikan suhu susu ini bertujuan untuk memudahkan pelarutan bahan-bahan tambahan susu pasteurisasi rasa cokelat seperti gula pasir, bubuk cokelat, flavor cokelat dan stabilizer (CMC). Susu dari PHE kemudian dialirkan ke dalam mixing tank untuk dilakukan pencampuran. Gula pasir ditambahkan ke dalam susu kemudian diaduk dengan menggunakan agitator dan dibantu dengan pengadukan secara manual menggunakan pengaduk stainless steel. Setelah gula larut kemudian ditambahkan bubuk cokelat, flavor cokelat dan CMC kemudian diaduk kembali hingga semua bahan larut. Susu cokelat kemudian dialirkan ke balance tank. Balance tank berfungsi untuk mengatur keseimbangan aliran susu agar lebih stabil selama berlangsungnya proses pasteurisasi. Selanjutnya susu dialirkan ke PHE regeneratif I (suhu susu menjadi 60 – 70oC) kemudian susu dialirkan ke homogenizer untuk menghomogenkan globula-globula lemak susu. Setelah globula lemak susu homogen selanjutnya susu dialirkan ke PHE pasteurisasi dan kemudian dialirkan ke holding tube. Disinilah proses pasteurisasi akan berlangsung. Proses pasteurisasi yang berlangsung termasuk ke dalam metode
49
pasteurisasi HTST (High Temperature Short Time). Suhu susu dipertahankan 82oC selama 15 detik. Suhu susu akan terdeteksi oleh flow diversion valve (FDV), yaitu sebuah alat pendeteksi untuk kesempurnaan pasteurisasi. Apabila suhu susu kurang dari 82oC, maka susu akan kembali ke proses pasteurisasi dimulai dari tahap pertama (kembali ke PHE regeneratif I) sampai suhu susu tersebut mencapai 82oC. Selanjutnya susu dialirkan ke PHE regeneratif II, pada PHE ini susu turun menjadi 21 oC. Kemudian susu didinginkan hingga suhu 2 – 4 oC dengan cara dialirkan ke plate cooler. Setelah itu susu pasteurisasi rasa cokelat dialirkan ke dalam storage tank (tangki penyimpanan sementara). Susu pasteurisasi rasa cokelat siap digunakan untuk tahapan penambahan DHA. 3) Penambahan DHA ke dalam Susu Pasteurisasi Rasa Cokelat DHA yang ditambahkan berupa serbuk sehingga penambahan dilakukan secara langsung ke dalam susu pasteurisasi rasa cokelat kemudian diaduk sampai homogen. DHA ditambahkan dengan variasi konsentrasi 1%, 2% dan 3% yang dibuat secara triplo. Susu pasteurisasi rasa cokelat yang digunakan sebanyak 1500 mL untuk setiap konsentrasi. Penambahan DHA 1% setara dengan 1,9 g DHA/liter susu pasteurisasi, penambahan DHA 2% setara dengan 3,8 g DHA/liter susu pasteurisasi dan penambahan DHA 3% setara dengan 5,7 g DHA/liter. Setelah ditambahkan DHA kemudian susu tersebut dibagi ke dalam 18 kemasan botol (80 mL/botol). Setelah sampel susu dikemas kemudian di beri label. Sampel susu pasteurisasi selain dibuat dengan variasi konsentrasi DHA, juga dibuat sampel kontrol (tanpa penambahan DHA) untuk membandingkan hasil pengujian.
50
4) Pengujian Ketahanan Susu Pasteurisasi Rasa Cokelat Terfortifikasi DHA Sampel kontrol dan susu pasteurisasi rasa cokelat yang telah difortifikasi (ditambahkan) DHA disimpan di dalam refrigator (6 – 8 oC) selama 4 hari. Pengujian ketahanan susu dilakukan sejak hari pertama preparasi sampel (hari ke 0). Adapun pengujian yang dilakukan adalah uji alkohol, uji pH dan uji kandungan bakteri total dilakukan setiap hari selama 4 hari. Ketiga uji tersebut dapat dijadikan sebagai indikator ketahanan susu pasteurisasi.
5) Cara Kerja Pengujian Kualitas dan Ketahanan Susu Pengujian kualitas susu digunakan untuk menguji kualitas bahan baku susu yang meliputi uji organoleptik, temperatur, berat jenis, uji alkohol, uji pH dan uji kandungan susu dengan menggunakan milkana superior. Sedangkan uji ketahanan susu digunakan untuk menguji ketahanan susu pasteurisasi rasa cokelat yang meliputi uji pH, uji akohol dan uji kandungan bakteri total dengan menggunakan metode TPC (Total Plate Count). a) Uji organoleptik Uji
organoleptik
merupakan
pengujian
sensorik
dengan
menggunakan indera. Tujuan uji organoleptik adalah untuk mengetahui kelainan-kelainan susu baik dari konsistensi, warna, rasa maupun aroma susu dengan menggunakan indera manusia. Caranya: diambil susu secukupnya, kemudian dipergunakan indera untuk mengamati warna, rasa dan aroma susu. Pengujian organoleptik pada penelitian ini dilakukan oleh tester KPBS Pangalengan.
51
b) Uji temperatur Temperatur susu diukur dengan menggunakan termometer 100oC. Caranya: termometer dicelupkan dalam sampel susu selama ±1 menit kemudian dibaca temperaturnya. c) Uji berat jenis Berat jenis susu diukur dengan menggunakan alat laktodensimeter. Prinsip pengukuran ini menggunakan hukum Archimides yaitu jika suatu benda dicelupkan ke dalam suatu cairan, maka benda tersebut akan mendapat tekanan ke atas sesuai dengan berat volume cairan yang dipindahkan (diisi). Cara kerjanya: laktodensimeter dicelupkan ke dalam sampel susu dan dibiarkan sampai benar-benar seimbang kemudian skala laktodensimeter dibaca pada permukaan susu pada suhu standar 27oC. Apabila suhunya tidak mencapai suhu standar maka berat jenis yang tertera pada skala dikonversi ke dalam suhu standar (koefisien pemuaian susu 0,0002/oC). d) Uji alkohol Tujuan dari uji alkohol adalah untuk mengamati dengan cepat apakah susu telah pecah atau belum. Cara uji alkohol adalah susu diambil sebanyak 2 mL, dimasukkan dalam tabung reaksi lalu ditambahkan alkohol 70% sebanyak 2 mL, kemudian dikocok perlahan. Diamati apakah terbentuk gumpalan atau tidak. Apabila terbentuk gumpalan berarti positif (+) atau susu pecah, tapi apabila tidak terbentuk gumpalan (susu tetap homogen) berarti negatif (-) atau susu tidak pecah.
52
e)
Uji pH pH susu diukur dengan menggunakan pH meter. Caranya: elektroda pH
meter dicelupkan ke dalam sampel susu sambil diaduk perlahan kemudian skalanya dibaca. f)
Uji kandungan susu menggunakan milkana superior Kandungan susu yang dapat diukur dengan menggunakan milkana superior adalah lemak, SNF (Solid non Fat), protein, densitas (berat jenis), penambahan air (added water) dan titik beku (freezing point). Milkana superior beroperasi pada suhu susu sekitar 15 – 30oC dengan kelembaban relatif 30 – 80%. Cara pengujian dengan menggunakan milkana superior adalah susu diambil sebanyak ± 10 mL kemudian dimasukkan ke dalam wadah sampel selanjutnya diuji dengan milkana superior. Pengujian membutuhkan waktu 90 detik kemudian akan keluar print out berupa data kandungan lemak, SNF, protein, densitas, added water, dan freezing point susu. Pengujian dengan menggunakan milkana superior lebih cepat dan efektif dibandingkan dengan cara manual.
g)
Uji kandungan bakteri total (TPC/Total Plate Count) Bahan utama yang digunakan dalam pengujian kandungan bakteri dengan
metode TPC adalah media agar dan larutan ringer. Media agar berfungsi sebagai bahan nutrisi bakteri pada saat kultivasi. Media agar yang digunakan pada penelitian ini merupakan jenis defined media yaitu media agar yang tersusun atas bahan-bahan kimia murni seperti glukosa, ammonium sulfat, kalium sulfat,
53
natrium sulfat, dan magnesium sulfat. Media agar dalam bentuk serbuk dilarutkan dalam aquades (22 g/L). Pelarutan media agar dibantu dengan pemanasan dan pengadukan sampai larutan homogen. Larutan ringer digunakan untuk pengenceran sampel. Larutan ringer dibuat dengan cara melarutkan tablet ringer ke dalam aqudes (1 tablet/500mL aquades). Tablet ringer mengandung garam-garam yang dapat membunuh jamur dalam aquades sehingga proses pengenceran dapat berlangsung secara steril. Larutan ringer dimasukkan ke dalam tabung reaksi berpenutup sebanyak 9 mL. Jumlah tabung reaksi yang digunakan sesuai dengan tingkat pengenceran yang dilakukan, misalnya untuk 12 sampel dengan pengenceran 10-3 dan 10-4 diperlukan 36 tabung reaksi. Peralatan serta bahan-bahan yang akan digunakan dalam pengujian kandungan bakteri harus dalam keadaan steril. Hal ini bertujuan untuk menghindari kontaminasi bakteri yang dapat mempengaruhi hasil pengujian. Sterilisasi yang dilakukan pada penelitian ini ada dua cara yaitu sterilisasi kering dan sterilisasi basah. Sterilisasi kering dilakukan dengan menggunakan oven pada suhu 120oC selama 8 jam. Sedangkan sterilisasi basah dilakukan dengan menggunakan autoclave pada suhu 120oC dengan tekanan 1 bar selama 15 menit. Peralatan seperti petri dish dan pipet volum disteril dengan cara sterilisasi kering, sedangkan media agar dan larutan ringer disteril dengan cara sterilisasi basah. Setelah semua peralatan dan bahan steril, tabung reaksi yang berisi larutan ringer dan petri dish diletakkan secara berderet dan masing-masing diberi label.
54
Sampel susu dipipet sebanyak 1 mL kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 mL larutan ringer kemudian dihomogenkan dengan menggunakan stirrer. Untuk menghindari terjadinya kontaminasi, pada saat menuangkan sampel ke dalam tabung reaksi harus di dekatkan dengan pembakar spirtus. Sampel susu tersebut diencerkan sampai beberapa kali. Batas maksimum pengenceran adalah 10-6. Dari hasil pengenceran, sampel dipipet sebanyak 1 mL dan 0,1 mL lalu dituangkan ke dalam petri dish yang berbeda kemudian segera ditutup. Setelah semua sampel dimasukkan ke dalam petri dish kemudian media agar dituangkan ke dalamnya (±10 mL). Sampel dan agar dalam petri dish diratakan dengan cara menggoyangkan petri dish dengan hatihati. Setelah rata kemudian dibiarkan sampai terbentuk gel selanjutnya disimpan dalam inkubator untuk diinkubasi selama 72 jam pada suhu 32oC. Setelah diinkubasi koloni bakteri yang terbentuk kemudian dihitung. Untuk lebih jelas tahapan pengenceran pada pengujian TPC dapat dilihat pada Gambar 15.
Gambar 15. Tahapan Pengenceran pada Pengujian TPC (Total Plate Count)
