BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1. Tempat dan Waktu Penelitian 3.1.1. Tempat Penelitian Penelitian ini akan dilaksanakan di Laboratorium Zoologi Jurusan Biologi untuk pengaklimatisasian hewan uji serta pengambilan sampel spermatozoa dan Laboratorium Kimia untuk pembuatan ekstrak Myrmecodia pendens Merr. & Perry. 3.1.2. Waktu Penelitian Waktu pelaksanaan yang diperlukan yaitu selama 2 bulan mulai dari persiapan sampai dengan penyusunan laporan hasil penelitian. 3.2 Subjek Penelitian Subjek penelitian ini adalah Tikus putih (Rattus norvegicus L) jantan sebanyak 18 ekor. 3.3 Desain Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian kuantitatif. Metode penelitian yang digunakan adalah metode eksperimen, metode eksperimen dengan desain rancangan acak lengkap (RAL). Desain ini gunakan dalam penelitian karena perlakuan dikenakan sepenuhnya secara acak kepada unit-unit eksperimen serta dilakukan dalam skala laboratorium jadi kondisi lingkungan dianggap homogeny. Desain Rancangan Acak Lengkap (RAL) ini bertujuan untuk mengetahui kemungkinan adanya hubungan sebab akibat antar variable dalam penelitian. Perlakuan dalam penelitian ini terdiri dari tiga perlakuan dan enam ulangan sehingga jumlah unit percobaan 3 x 6 = 18.
19
Kontrol yang dilakukan : -
Kelompok K- (Kontrol negatif): Tidak mendapat perlakuan paparan asap rokok dan pemberian ekstrak Sarang semut.
-
Kelompok K+ (Positif): Hanya diberi paparan asap rokok tanpa pemberian ekstrak Sarang semut.
-
Kelompok P1: Diberi paparan asap rokok dan ekstrak sarang semut dosis 129 mg/200 gr BB Tikus. Pemberian dosis 129 mg/200 gr diambil berdasarkan penelitian
sebelumnya oleh Dawit (2012). Untuk perhitungan dosis didasarkan pada perhitungan dosis manusia yaitu, 10 Gram (Subroto, 2008) sedangkan dosis untuk hewan uji harus dikonversi terlebih dahulu. Berdasarkan Laurence dan Bacharach (1964) dalam dalam Amalia (2009) angka konversi dosis dari manusia 70 kg ke tikus 200 gr sebesar 0,018. Jika manusia dengan berat 50 kg (Berat rata-rata tubuh manusia Indonesia) mengkonsumsi sarang semut sebanyak 10 gr, maka dosis lazim untuk tikus dengan perhitungan konvesi berdasarkan nilai konsentrasi ekstrak sarang semut adalah: 50/70 x 10.000 mg x 0,018
= 128,6 mg/200 gr BB Tikus
= 129 mg/200 gr BB Tikus 3.4. Variabel Penelitian Varibel yang diamati atau diukur dalam penelitian ini yaitu : 1. Variabel bebas (X) yaitu Sarang semut jenis Myrmecodia pendens Merr. & Perry dan Asap Rokok.
20
2. Variabel terikat (Y) yaitu Morfologi spermatozoa tikus putih (Rattus norvegicus). 3.5 Definisi Operasional Variabel 3.5.1 Sarang Semut (Myrmecodia pendens Merr. & Perry) Sarang semut merupakan salah satu tumbuhan epifit yang tergolong dalam family Rubiaceae yang berasosiasi dengan semut (Subroto dan Saputro, 2008). 3.5.2 Morfologi Spermatozoa Morfologi spermatozoa merupakan bentuk normal dan abnormal yang di tandai dengan kepala, leher dan ekor. Spermatozoa normal memiliki kepala, leher, dan ekor. Abnormalitas dapat terjadi pada kepala, leher, badan, ekor atau kombinasi pada bagian-bagian tersebut. Abnormalitas pada kepala meliputi kepala kembar, pipih, atau berbentuk buah “pear” bulat, mengerut, membesar, menyempit, memanjang, dan kepala kecil, pada leher terdiri atas leher patah dan bengkok, pada badan antara lain bengkok, patah, pendek membesar, filiform ganda, dan seperti benang, sedang pada ekor meliputi melingkar ganda, patah, menggelung, dan keriting (Salisbury dan Vandemark, 1985 dalam Nugraheni dkk, 2003). 3.5.3 Asap Rokok Asap rokok terdiri dari asap utama (main stream smoke) dan asap samping (side stream smoke). Asap utama adalah asap tembakau yang dihisap langsung oleh perokok, sedangkan asap samping adalah asap tembakau yang disebarkan ke udara bebas, sehingga dapat terhirup oleh orang lain yang dikenal sebagai perokok pasif (Sitepoe, M. 2000).
21
3.6. Teknik Pengumpulan Data 3.6.1. Alat dan Bahan yang digunakan 3.6.1.1 Alat Alat yang digunakan pada penelitian ini meliputi: alat bedah (Pisau, gunting, pinset), bak bedah, pipet, cawan petri, selang plastik, mikroskop cahaya, kaca objek, kaca penutup, kamera photo, dan kandang perlakuan, neraca analitik untuk menimbang bahan uji, pipet untuk pengambilan bahan cair selama penelitian, kertas label, sarung tangan, masker, dan alat tulis menulis data penelitian. 3.6.1.2 Bahan Bahan yang digunakan adalah ekstrak yang berasal dari tumbuhan sarang semut, radikal bebas yang digunakan berasal dari asap rokok. Jenis rokok yang digunakan adalah rokok kretek jenis Gudang Garam Merah. Tikus yang digunakan adalah tikus putih jantan dewasa sebanyak 30 ekor, yang digunakan hanya 18 ekor, pakan untuk tikus, aquades untuk kelompok kontrol, larutan pengencer NaCL 0,9 %, etanol untuk menetrasi pada saat pembuatan ekstrak sarang semut, dan eosin 0,5 %. . 3.6.2. Prosedur Penelitian 3.6.2.1 Persiapan Bahan Uji Tumbuhan yang digunakan berasal dari ekstrak sarang semut. Radikal bebas yang digunakan berasal dari asap rokok Jenis rokok yang digunakan adalah rokok kretek jenis Gudang Garam Merah. Untuk pembuatan ekstrak sarang semut dilakukan langkah-langkah sebagai berikut:
22
1.
Sarang semut dibersihkan dan di keringkan, sebelum dikeringkan, sarang semut disayat tipis untuk mempercepat pengeringan.
2.
Pembuatan serbuk: bahan yang sudah kering di grainer sampai halus dan diayak sehingga diperoleh serbuk yang homogen.
3.
Ekstraksi serbuk dengan etanol, dimaserasi selama 24 jam. Kemudian di filtrasi sehingga menghasilkan filtrate, filtrate diuapkan sehingga diperoleh ekstrak yang dibutuhkan.
3.6.2.2 Persiapan Hewan Uji Hewan coba yang digunakan adalah Tikus putih jantan dewasa yang memenuhi kriteria (baik umur maupun berat badan) sebanyak 18 ekor . Sampel penelitian diperoleh secara acak dengan kriteria inklusi: Tikus putih jantan, umur 8-12 minggu, berat badan 150-200 gram. Langkah-langkah persiapan hewan uji sebagai berikut: 1. Tikus terlebih dulu diadaptasikan selama 2 minggu serta diberikan makan dan minum secara ad ibitum. 2. Menimbang hewan uji sebanyak 18 ekor. Alur kerja mulai dari tahap aklimatisasi selama 2 minggu sampai perlakuan pada tikus putih selama 2 minggu, dapat dilihat pada gambar berikut: 18 Ekor tikus putih 14 hari
Adaptasi
Randomisasi
23
Enam ekor Tikus putih
Enam ekor Tikus Putih
Enam ekor Tikus Putih
Kontrol (-) Tanpa asap rokok dan sarang semut
Kontrol (+) Asap Rokok
P1 (Sarang semut + Asap rokok)
2 Minggu
Pembedahan dan pengambilan sperma dari epididimis
Analisis Morfologi spermatozoa Gambar 3. Alur Kerja Penelitian 3.6.2.3 Perlakuan Semua Tikus dibagi menjadi tiga kelompok secarau acak, masing – masing terdiri dari 6 ekor tikus dengan tiga perlakuan berbeda pada tiap kelompoknya. Kelompok K- (kontrol negatif): tidak mendapat perlakuan paparan asap rokok dan pemberian ekstrak sarang semut, Kelompok K+ (kontrol positif): hanya diberi paparan asap rokok tanpa pemberian ekstrak sarang semut, Kelompok P1: diberi paparan asap rokok dan ekstrak sarang semut dosis 129 mg/200 gram BB Tikus. Perlakuan dilakukan selama 14 hari. Pemaparan asap rokok dilakukan dengan cara setiap kelompok kontrol Tikus putih yang akan diberikan perlakuan dengan asap rokok dimasukkan pada kandang dengan ukuran 30 x 15 x 15 cm dengan menggunakan spuid yang ujungnya diberi rokok yang dibakar, dipapar dengan menghabiskan 1 batang rokok.
24
Pemberian ekstrak sarang semut (Myrmecodia pendens Merr & Perry) diberikan satu kali dalam sehari selama 14 hari penelitian, tiap tikus dalam kelompok perlakuan diberi ekstrak sarang semut sesuai dosis yang telah ditentukan. Setelah 14 hari perlakuan pada hewan uji, pada hari ke-15 Tikus hewan uji tersebut dimatikan dengan cara didislokasi leher kemudian dibedah dan dipisahkan organ reproduksinya, kemudian diambil sampel spermatozoa pada tiap-tiap kelompok untuk diperiksa morfologi spermatozoa. Sampel diambil dari kauda epididimis diamati dengan cara mengambil organ testis beserta epididimis lalu diletakkan di dalam cawan petri yang berisi NaCl 0,9 %, kemudian kauda epididimis dipisahkan dengan cara memotong bagian proksimal korpus epididimis dan bagian distal vas deferens. Bagian kauda epididimis yang telah dipotong tersebut dimasukkan ke dalam gelas arloji yang berisi 1 ml NaCl 0,9 % untuk dipotong sedikit pada bagian proksimal kauda dengan gunting kemudian menekan kauda dengan perlahan hingga cairan epididimis keluar dan tersuspensi dengan NaCl 0,9 %. Selanjutnya, untuk mengetahui morfologi spermatozoa diperiksa dengan cara pewarnaan supravital dengan eosin 0,5% pada gelas objek, diteteskan satu tetes suspensi sperma ditambah dengan satu tetes eosin, kemudian dibuat sediaan hapus. Pengamatan sediaan dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 100 kali dan dihitung dengan menggunakan counter. Perhitungan dilakukan pada 200 spermatozoa, diamati bentuk spermatozoa normal, dan abnormal.
25
3.7. Teknik Analisis Data Teknik analisis data yang digunakan pada penelitian ini yaitu dengan teknik analisis data statistik. Data yang diperoleh dianalisis dengan analisis varians (ANAVA) untuk melihat ada tidaknya pengaruh Pemberian ekstrak sarang semut (Myrmecodia pendens Merr & Perry) terhadap morfologi spermatozoa tikus putih (Rattus norvegicus L) yang dipapar asap rokok. Jika hasil analisis varians (ANAVA) menunjukkan bahwa ekstrak sarang semut (Myrmecodia pendens Merr & Perry) berpengaruh terhadap viabilitas spermatozoa tikus putih (Rattus novergicus L) yang dipapar asap rokok, maka uji dilanjutkan dengan uji BNT untuk melihat ada tidaknya perbedaan dari setiap perlakuan. 3.8. Hipotesis Statistik Adapun hipotesis satatistik pada penelitian ini adalah: 1.
H0: Tidak terdapat pengaruh pada pemberian ekstrak Sarang semut (Myrmecodia pendens Merr & Perry) berpengaruh terhadap morfologi spermatozoa Tikus putih (Rattus norvegicus L) yang dipapar asap rokok.
2.
H1: Terdapat pengaruh
pemberian ekstrak Sarang semut (Myrmecodia
pendens Merr & Perry) berpengaruh terhadap morfologi spermatozoa Tikus putih (Rattus norvegicus L) yang dipapar asap rokok. Jika F hitung > F tabel yang berarti bahwa H0 ditolak dan H1 diterima, jadi pemberian ekstrak Sarang semut terhadap Tikus putih yang dipapar asap rokok berpengaruh pada morfologi spermatozoa.
26
