BAB III BAHAN DAN TATA KERJA
3.1. Bahan Penelitian Penelitian ini menggunakan bahan berupa bakal tunas aksiler nodus kotiledon dari kecambah sengon berumur 6 hari. Kecambah berasal dari biji yang ditanam pada medium perkecambahan. Biji sengon diperoleh dari Balai Benih Tanaman Hutan, Sumedang, Jawa Barat.
(a)
(b)
Gambar 3.1 (a) Biji dan (b) nodus kotiledon sengon 3.2. Komposisi Media Pada penelitian ini digunakan tiga jenis medium yaitu medium perkecambahan, medium pertumbuhan pucuk dan medium pengujian sensitfitas tanaman terhadap karbenisilin. Ketiga jenis medium ini menggunakan medium dasar yang sama yaitu medium Murashige dan Skoog / MS (1962, dalam Pierik, 1998). Medium MS selanjutnya ditambah dengan agar 7 gr/L untuk memadatkan medium dan sukrosa 3%.
10
3.2.1. Medium Perkecambahan Medium perkecambahan merupakan medium awal yang digunakan dalam penelitian ini. Medium ini hanya menggunakan medium MS tanpa zat pengatur tumbuh. 3.2.2. Medium Pertumbuhan Pucuk Pada medium pertumbuhan pucuk diberi perlakuan dua jenis sitokinin dengan 9 variasi konsentrasi. Perlakuan sitokinin ini berguna untuk mengetahui komposisi sitokinin yang optimum bagi pertumbuh pucuk aksiler sengon. Sitokinin yang ditambahkan berupa BAP (2,2 µM dan 4,4 µM) dan kinetin (2,3 µM dan 4,6 µM) serta medium tanpa zat pengatur tumbuh sebagai kontrol. 3.3.3. Medium Pengujian Sensitifitas Tanaman terhadap Karbensilin Komposisi medium optimum pertumbuhan pucuk yang didapat digunakan dalam medium pengujian sensitifitas tanaman terhadap karbenisilin. Medium tersebut kemudian ditambahkan karbenisilin dengan perlakuan konsentrasi 10, 20, 30, 40 dan 50 mg/L. Sebelum digunakan, karbenisilin telah disterilisasi terlebih dahulu menggunakan mikrofilter dan membran filter 0,22 μm.
3.3. Tahapan Kerja Tahapan kerja dilakukan melalui tiga tahap yaitu tahap isolasi dan induksi perkecambahan biji, tahap optimasi media pertumbuhan pucuk dan tahap pengujian sensitifitas tanaman terhadap karbensilin (Gambar 3.2).
11
Tahap Isolasi dan Perkecambahan Biji
• Dipotong hipokotil, epikotil dan sebagian kotiledon • Ditanam pada medium optimasi
Tahap Optimasi Media Pertumbuhan Pucuk
Tahap Pengujian Sensitifitas Tanaman terhadap Karbenisilin Gambar 3.2. Diagram alir tahapan kerja 3.3.1. Tahap Isolasi dan Induksi Perkecambahan Biji Biji yang akan ditanam dalam medium perkecambahan terlebih dahulu direndam air hangat selama 24 jam. Setelah perendaman dilakukan sterilisasi permukaan biji menggunakan fungisida 2000 mg/L dan clorox (yang mengandung zat aktif NaClO sebesar 5,6%). Biji yang telah steril kemudian ditanam dalam medium perkecambahan dan dipelihara selama 6 hari. Pada akhir pemeliharaan diamati jumlah biji yang dapat berkecambah. Kecambah biji sengon berumur 6 hari dipotong hipokotil, sebagian kotiledon dan radikula sehingga didapatkan nodus kotiledon. Nodus kotiledon kemudian ditanam dalam medium optimasi pertumbuhan pucuk. Nodus kotiledon dibiarkan tumbuh hingga 3 minggu dan diamati respon pertumbuhan pada akhir minggu ke-3.
12
3.3.2. Tahap Optimasi Media Pertumbuhan Pucuk Pada tahap optimasi media diamati pengaruh 6-benzylaminopurine (BAP) dan kinetin terhadap tinggi pucuk dan jumlah nodus pucuk aksiler sengon secara in vitro. Perlakuan kedua jenis sitokinin ini diberikan dalam kombinasi maupun terpisah dengan kontrol medium tanpa zat pengatur tumbuh (Tabel 3.1). Pengamatan dilakukan hanya satu kali subkultur yaitu hingga subkultur pertama. Tabel 3.1. Medium Pertumbuhan Pucuk Diberbagai Variasi Konsentrasi BAP dan Kinetin Kinetin (µM)
BAP (µM) 0
2,3
4,6
0
B0K0
B0K2
B0K4
2,2
B2K0
B2K2
B2K4
4,4
B4K0
B4K2
B4K4
3.3.3. Tahap Pengujian Sensitifitas Tanaman terhadap Karbensilin Pengujian sensitifitas tanaman terhadap antibiotik juga menggunakan eksplan nodus kotiledon yang berasal dari kecambah berumur 6 hari. Kecambah yang telah dihilangkan hipokotil, sebagian kotiledon dan radikula ditanam dalam medium mengandung antibiotik karbenisilin. Medium tersebut ditambah dengan zat pengatur tumbuh optimal yang didapatkan pada tahap optimasi media. Pengujian menggunakan lima konsentrasi karbensilin yaitu 10, 20, 30, 40 dan 50 mg/L serta kontrol yaitu medium tanpa karbensilin.
13
3.4. Pengamatan dan Evaluasi Data Pertambahan jumlah nodus dan panjang pucuk aksiler sengon merupakan parameter pengamatan dalam penelitian ini. Panjang pucuk diukur dari pangkal tunas aksiler hingga bagian apikal tunas aksiler yang tumbuh (Gambar 3.2). Penambahan nodus dihitung dari banyaknya nodus yang dihasilkan dalam satu pucuk aksiler.
Nodus
Panjang pucuk yang diukur (mm)
Gambar 3.3. Cara pengukuran parameter pengamatan Data hasil pengamatan dianalisis menggunakan uji statistik analisis varian (ANAVA) dalam rancangan acak lengkap (RAL) pada tingkat kepercayaan 95%. Jika terlihat adanya perbedaan nyata, maka dilanjutkan dengan post hoc test DMRT (Duncan’s multiple range test) pada tingkat kepercayaan 95%. Uji statistik dilakukan dengan program statistika SPSS (Statistical Product and Service Solution) for Windows release 13.
14
