6
BAB II LANDASAN TEORI A. Tinjauan Pustaka 1. Rumput Laut Rumput laut atau seaweed merupakan salah satu tumbuhan laut yang tergolong dalam rumput laut benthik yang banyak hidup melekat di dasar perairan. Rumput laut merupakan ganggang yang hidup di laut dan tergolong dalam divisi Thallophyta. Secara garis besar, klasifikasi rumput laut terbagi menjadi 3 kelas utama, yaitu rumput laut hijau (Chlorophyta), rumput laut merah (Rhodophyta), dan rumput laut cokelat (Phaeophyta) sebagaimana disajikan pada Tabel 2.1. Tabel 2.1. Karakteristik dari Rumput Laut pada Masing-Masing Kelas Jenis Rumput laut Hijau (Chlorophyta)
Zat Penyusun dinding sel Selulosa
Merah (Rhodophyta)
CaCO3 (kalsium karbonat), selulosa, dan produk fotosintetik berupa karaginan, agar, fulcellaran, dan porpiran Asam alginate
Cokelat (Phaeophyta)
Habitat Air asin, air tawar Laut, sedikit di air tawar Laut
Sumber: Kimball, 1992; dan Simpson, 2006.
Rumput laut merupakan salah satu kelompok tumbuhan laut yang mempunyai sifat tidak bisa dibedakan antara bagian akar, batang, dan daun. Seluruh bagian tumbuhan disebut thallus, sehingga rumput laut tergolong tumbuhan tingkat rendah (Susanto dan Mucktianty, 2002 dalam Suparmi dan Sahri 2009). Bentuk thallus rumput laut bermacam-macam, ada yang bulat seperti tabung, pipih, gepeng, bulat seperti kantong, rambut, dan lain sebagainya. Thallus ini ada yang tersusun hanya oleh satu sel (uniseluler) atau banyak sel (multiseluler). Percabangan thallus ada yang thallus dichotomus (dua-dua terus menerus), pinate (dua-dua berlawanan sepanjang
7
thallus utama), pectinate (berderet searah pada satu sisi thallus utama), dan ada juga yang sederhana tidak bercabang. Sifat substansi thallus juga beraneka ragam ada yang lunak seperti gelatin (gelatinous), keras diliputi atau mengandung zat kapur (calcareous), lunak bagaikan tulang rawan (cartilagenous), berserabut (spongeous), dan sebagainya dengan berbagai keanekaragaman warna (Suparmi dan Sahri., 2009). Bagian–bagian rumput laut secara umum terdiri dari holdfast yaitu bagian dasar dari rumput laut yang berfungsi untuk menempel pada substrat dan thallus yaitu bentuk-bentuk pertumbuhan rumput laut yang menyerupai percabangan. Tidak semua rumput laut bisa diketahui memiliki holdfast atau tidak. Rumput laut memperoleh atau menyerap makanannya melalui sel-sel yang terdapat pada thallus-nya. Nutrisi terbawa oleh arus air yang menerpa rumput laut akan diserap sehingga rumput laut bisa tumbuh dan berkembang biak. Perkembangbiakan rumput laut melalui dua cara yaitu generatif dan vegetatif. Pertumbuhan dan percabangan thallus rumput laut antara jenis yang satu dengan yang lainnya berbeda-beda. Bentuk thallus rumput laut juga bervariasi, antara lain bulat seperti tabung, pipih, gepeng, bulat seperti kantong, lembaran dan juga ada yang berbentuk seperti helai rambut (Juneidi, 2004). 2. Rumput Laut di Indonesia Rumput laut atau lebih dikenal dengan sebutan seaweed merupakan salah satu sumber daya hayati yang sangat melimpah di perairan Indonesia yaitu sekitar 8,6% dari total biota di laut (Dahuri, 1998). Luas wilayah yang menjadi habitat rumput laut di Indonesia mencapai 1,2 juta hektar atau terbesar di dunia (Wawa, 2005). Di Indonesia jumlah jenis rumput laut mencapai 629 jenis. Rumput laut yang telah dimanfaatkan misalnya sebagai bahan obat tradisional mencapai 58 jenis. Jumlah ini terbagi atas kelas Chlorophyceae 18 jenis, Phaeophyceae 10 jenis, dan Rhodophyceae 30 jenis (Zaneveld, 1955; Soegiarto et al., 1978; Atmadja et al, 1992 dalam
8
PERHIPBA, 1996). Potensi rumput laut perlu terus digali, mengingat tingginya
keanekaragaman
rumput
laut
di
perairan
Indonesia
(Suparmi dan Sahri., 2009). Van Bosse (melalui ekspedisi Laut Siboga pada tahun 1899-1900) melaporkan bahwa Indonesia memiliki kurang lebih 555 jenis dari 8.642 spesies rumput laut yang terdapat di dunia. Dengan kata lain, perairan Indonesia sebagai wilayah tropis memiliki sumber daya plasma nutfah rumput laut sebesar 6,42% dari total biodiversitas rumput laut dunia (Santosa, 2003; dan Surono, 2004). Rumput laut dari kelas alga merah (Rhodophyceae) menempati urutan terbanyak dari jumlah jenis yang tumbuh di perairan laut Indonesia yaitu sekitar 452 jenis, setelah itu alga hijau (Chlorophyceae) sekitar 196 jenis, dan alga cokelat (Phaeophyceae) sekitar 134 (Winarno, 1996). Luas wilayah daratan Indonesia sepanjang 1,9 juta km2 sedangkan luas wilayah lautannya sepanjang 5,9 juta km2. Data tersebut menunjukkan bahwa luas perairan laut Indonesia tiga kali lebih besar jika dibandingkan dengan luas daratan Indonesia (Aprilianto dkk., 2014). Panjang pantai Indonesia mencapai 95.181 km dengan luas wilayah laut 5,9 juta km 2 mendominasi luas total territorial Indonesia sebesar 7,7 juta km 2.Wilayah sebaran jenis rumput laut ekonomis yang penting di Indonesia, tersebar diseluruh kepulauan. Rumput laut yang tumbuh alami (wild stock) terdapat di hampir seluruh perairan dangkal Laut Indonesia yang mempunyai terumbu karang. Produksi rumput laut nasional tahun 2010 mencapai 3,082 juta ton, diatas target yang ditetapkan Kementrian Kelautan dan Perikanan sebesar 2,574 juta ton. Rumput laut telah menjadi komoditas unggulan dan menjadi penyumbang utama produksi perikanan budidaya di Indonesia (Kementrian Kelautan dan Perikanan, 2009). Berdasarkan UNCLOS (1982) dalam Kementrian Kelautan dan Perikanan (2011) luas territorial lautan Indonesia yaitu 284.210,90 Km 2, luas Zona Ekonomi Eksklusif 2.981.211 Km2, dan Luas Laut 12 Mil
9
279.322 Km2. Panjang garis pantai Indonesia menurut Baksortanal (2006) dalam Kementrian Kelautan dan Perikanan (2011) adalah 104.000 Km. Komoditas rumput laut menjadi salah satu hasil laut yang diunggulkan dan dikembangkan secara luas, tersebar di seluruh wilayah perairan Indonesia (mencapai 384.733 ha) dengan target produksi pada tahun 2014 sebesar 8.8 juta ton (Kementrian Perdagangan Republik Indonesia, 2013). Produksi rumput laut pada tahun 2010-2014 ditunjukkan tabel berikut : Tabel 2.2 Produksi Rumput Laut Indonesia Tahun 2010-2014 Tahun Target (ton) Capaian (ton) Persentase (%) 2010 2.672.800 3.915.017 146,48 2011 3.504.200 5.170.201 147,54 2012 5.100.000 6.514.854 127,74 2013 6.500.000 9.298.473,87 125,87 2014 8.777.600 10.234.357,17 116,60 Sumber: Laporan Kinerja KKP 2014
Jenis rumput laut yang banyak terdapat di perairan Indonesia adalah Gracilaria, Gelidium, Eucheuma, Hypnea, Sargasum dan Tubinaria. Dari beragam jenis rumput laut tersebut, yang dibudidayakan, dikembangkan dan diperdagangkan secara luas di Indonesia hanya jenis karaginofit (di atarannya Eucheuma spinosium, Eucheuma edule, Eucheuma serra, Eucheuma cottonii, dan Eucheuma spp), agarofit (Gracilaria spp, Gelidium spp dan Gelidiella spp), serta alginofit (Sargassum spp, Laminaria spp, Ascophyllum spp dan Macrocystis spp), yang merupakan bahan baku berbagai industri karena merupakan sumber karaginan (tepung rumput laut), agar-agar dan alginat (Kementrian Perdagangan Republik Indonesia, 2011). 3. Pemanfaatan Rumput Laut Menurut Handayani (2006), terdapat beberapa jenis alga yang dapat dimanfaatkan sebagai bahan baku beberapa industri makanan, tekstil, keramik, kosmetik, pupuk, dan fotografi. Hardani (1999) juga melaporkan alga dapat dimanfaatkan dalam industri pangan dan bahan-bahan kimia,
10
misalnya: Gelidium sp dan Gracillaria sp, spesies penghasil agar yang digunakan dalam pengalengan ikan dan daging untuk mencegah kerusakan; pembuatan es krim, minuman, susu, kue, manisan, bahan-bahan kosmetik, industri cat, dan insektisida; serta mencegah kanker dan agen anti penuaan. Alga mengandung banyak vitamin dan minerai serta dietary fiber, sehingga dapat mencegah kegemukan (obesitas) (Wulandari, 2010). Menurut Yunial
(1999)
dalam
Suparmi
dan
Sahri
(2009)
pemanfaatan rumput laut secara ekonomis sudah dilakukan oleh beberapa negara. Cina dan Jepang sudah dimulai sejak tahun 1670 sebagai bahan obat-obatan, makanan tambahan, kosmetika, pakan ternak, dan pupuk organik. Rumput laut telah dimanfaatkan sebagai makanan sehari-hari bagi penduduk Jepang, Cina dan Korea. Di Indonesia, sebagian besar rumput laut hanya dibiarkan sebagai sampah lautan, mengapung, hanyut terbawa arus, ataupun terdampar di pinggir pantai. Kandungan rumput laut yang telah dimanfaatkan dalam industri, bidang kesehatan, dan sumber biopigmen. diantaranya agar, pikokoloid dan karagenan. Kandungan nutrisi dalam rumput laut yang menjadi dasar pemanfaatan rumput laut di bidang kesehatan diantaranya polisakarida dan serat, mineral, protein, lipid dan asam lemak, vitamin serta polifenol. Pigmen rumput laut yang biasa digunakan dalam berbagai bidang diantaranya klorofil, karotenoid, dan fikobilin (Suparmi dan Sahri, 2009). Pada Negara Filipina, Trono dan Ganzon Fortes (1988) mendaftar sejumlah 352 jenis rumput laut yang termasuk ke dalam 43 marga yang bernilai ekonomis. Sebanyak 48 jenis dari 26 marga di antaranya dinyatakan berkhasiat sebagai obat dengan 20 marga diantaranya terdapat di perairan Indonesia. Beberapa marga yang disebutkan digunakan sebagai obat anti kesuburan, anti tumor, penyakit jantung dan menurunkan darah tinggi yaitu marga Acanthophora, Hypnea, Dictyopteris, Sargassum, Stylophora, dan Ulva (Atmadja, 1996).
11
Masyarakat Indonesia terutama penduduk di daerah pulau-pulau atau kepulauan pada umumnya sudah memanfaatkan rumput laut di dalam kehidupannya sehari-hari. Beberapa contohnya adalah dijadikan sebagai lalab, sayur, makanan, bahan baku kue-kue dan beberapa diantaranya obatobatan. Namun pemanfaatan tersebut dilakukan sebagai sesuatu hal yang bersifat tambahan kebutuhan saja. Pemanfaatan lainnya yaitu dijadikan agar-agar oleh pabrik atau usaha industri rumah yang ada di Indonesia. Di Jepang, pemanfaatan rumput laut dilakukan secara optimal dengan memanfaatkannya sebagai bahan makanan atau keperluan industri, sehingga kebutuhan impor rumput laut terus meningkat. Di beberapa negara rumput laut digunakan pada beberapa keperluan misalnya: untuk makanan ternak (sapi, babi, dan lain-lain), pemupukan (tomat, kentang, ubi, ubi kayu, dan lain-lain), industri yodium dan lain-lain (Soegiarto et al., 1978). Beberapa jenis rumput laut di Indonesia yang bernilai ekonomis seperti Eucheuma sp dan Hypnea sp yang juga disebut carrageenophyte menghasilkan metabolit primer senyawa hidrokoloid yang disebut karagenan. Glacillaria sp dan Gelidium sp yang juga disebut agaerophyte menghasilkan metabolit primer senyawa hidrokoloid yang disebut agar. Sementara Sargassum sp yang disebut alginophyte menghasilkan metabolit sekunder yang disebut alginat. Di perairan Indonesia terdapat 28 spesies yang berasal dari 6 genus. Pemanfaatan rumput laut dapat digunakan dalam industri pangan, industri farmasi, kosmetik, bioteknologi serta industri non pangan. Pada industri farmasi dan pangan senyawa metabolit rumput laut digunakan sebagai suspending agent, thickener, emulsifier, stabilizer, film former, coating agent dan lain sebagainya. Pada industri kosmetik penggunaan agar, karagenan dan alginat biasanya digunakan untuk produk sabun krim, sabun cair, shampo, pasta gigi, pewarna bibir dan produkproduk pewarnaan kulit seperti hand body lotion dan pencuci mulut serta hair lotion. Penggunaan agar, karagenan dan alginat dalam industri non
12
pangan diantaranya industri makanan ternak, keramik, cat, tekstil, kertas dan pembuatan film fotografi (Sudariastuty, 2011).
Phaeophyta
Rhodophyta
Phaeophyceae
Rhodophyceae
Furcales
Sargassaceae
Solriaceae
Hypnea
Eucheuma Sargassum
Gelidiales
Gigertinales Gracilariceae
Gelidiaceae Gelidium
Gracilaria
Turbinaria E Cotonii
E Spinosum
G Gigas
G Verucossa
Hypnea
Alginat Karagenan
Gelidium Sp
Agar
Gambar 2.1 Diagram Klasifikasi Rumput Laut Komersial dan Produk Olahannya (Sumber : Sudariastuty, 2011) 4. Persebaran Rumput Laut di Binuangeun Binuangeun berada di Desa Muara, Kecamatan Wanasalam, Kabupaten Lebak, Provinsi Banten. Secara Geografis Binuangeun terletak pada 06050’18” LS dan 105052’58” BT. Perairan Binuangeun terletak di sebelah selatan Provinsi Banten yang berhubungan langsung dengan Samudera Hindia. Secara fisiografis Kecamatan Wanasalam mempunyai bentang lahan dengan kemiringan 0-15% dengan ketinggian tempat 98% kurang dari 100 mdpl. Binuangun terletak pada wilayah beriklim tropis dengan curah hujan rata-rata per tahun berkisar antara 2000-3000 mm/tahun dengan jumlah hari hujan 122-130 hari per tahun. Pada bulan DesemberFebruari Binuangeun memiliki curah hujan yang tinggi dan sering terjadi
13
angin kencang sehingga dapat memicu timbulnya gelombang yang besar, sementara pada bulan Mei-September angin relatif tenang sehingga tidak menimbulkan gelombang besar (Nababan, 2008). Pantai Binuangeun memiliki karakteristik suhu minimum sebesar 29,810C dan suhu maksimum sebesar 30,230C. Sementara pada faktor salinitas, Pantai Binuangen memiliki nilai salinitas pada kisaran 31.6233.63%. Hal ini disebabkan oleh letak Pantai Binuangeun yang berhubungan langsung dengan Samudra Hindia. Kondisi ini memungkinkan suhu dan salinitas didaerah pantai berpotensi terjadi pertukaran massa air dengan Samudera Hindia (Azis, 2007). Kusumawati dan Murdinah (2012) melaporkan Pantai Binuangeun memiliki persebaran alga coklat yang tinggi. Salah satu lokasi rumput laut coklat yang melimpah di wilayah Indonesia adalah pantai Binuangeun, Kabupaten Lebak, Banten, diperkirakan melimpah di sepanjang garis pantai tersebut (Nursid dkk., 2013). Dinas Kelautan dan Perikanan Kabupaten Lebak (2012) melaporkan produksi rumput laut Kabupaten Lebak pada tahun 2012 mencapai 4.900 kg. Beberapa laporan mengenai penelitian bioprospeksi rumput laut coklat yang berasal dari Binuangeun misalnya oleh Nursid, et al. (2007) dan Fajarningsih, et al. (2008) yang mengkaji potensi alga coklat Turbinaria decurrens sebagai bahan anti kanker. Namun sejauh ini laporan bioprospeksi alga coklat dari jenis lain dari wilayah ini masih terbatas (Nursid et al., 2013). 5. Senyawa Bioaktif Alga Hijau Menggunakan metode Folin Ciocalteu kadar fenol Ulva rigida diteliti dan dinyatakan dalam mg gallic acid 100g-1 FW. Pada penelitian ini, alga hijau Ulva rigida ditemukan memiliki kadar total fenol 73 mg gallic acid 100-1 FW. Pembandingan dengan beberapa sampel Codium fragile, Dictyopteris divaricata, Scytosiphon lomentaria, Gracilaria gracilis, dan Ceramium kondoi dihasilkan bahwa kadar total fenol Ulva rigida relatif lebih tinggi dari rumput laut tersebut. Komponen fenolik telah banyak mendapatkan
apresiasi
karena
peran
pentingnya
sebagai
molekul
14
antioksidan dan agen chemo-preventive. Celikler et al juga melaporkan Ulva rigida memiliki aktivitas antigenotoksik yang kuat pada limfosit manusia secara in vitro dan efek anti hiperglikemik secara in vivo (Yildiz et al., 2012). Berdasarkan penelitian terkini, secara jelas telah dibuktikan bahwa ekstrak Enteromorpha compressa mampu meningkatkan fungsi imun melalui regulasi plasma sel dalam sekresi antibodi IgE terhadap alergen makanan. Senyawa tertentu pada Enteromorpha compressa bertanggung jawab atas efek potensial anti alergi terhadap alergen berbeda pada berbagai haplotype
tikus
tanpa
pengaruh
latar
belakang
genetik.
Hasil
memperlihatkan bahwa ekstrak Enteromorpha compressa pada konsentrasi seperti 0.25 mg dan 0.1 mg per tikus, mampu memperlihatkan penekanan yang signifikan (P<0.05). Untuk pemahaman yang lebih baik terhadap efek menguntungkan dari Enteromorpha compressa studi yang lebih panjang perlu dilakukan berkaitan dengan fungsi imun humoral termasuk peran sitokin dalam penekanan antibodi IgE dan identifikasi komponen aktif Enteromorpha compressa (Raman et al., 2004). Penentuan aktivitas antioksidan Enteromorpha prolifera dilakukan menggunakan ekstrak etanol, dan subfraksi pelarutnya, terbagi atas nhexane (HX), chloroform (CF), dan ethylacetate (EA). Fraksi CF memperlihatkan potensi terbesar aktivitas radical scavenging terhadap DPPH dan OH dengan kemampuan reduksi yang kuat. Fraksinasi lebih lanjut dan analisa spektroskopi pada fraksi CF mengindikasikan bahwa aktivitas antioksidan yang kuat tersebut utamanya disebabkan oleh senyawa klorofil, pheophorbide a, dibandingkan senyawa fenolik (Cho et al., 2011). Makroalga hijau Enteromorpha antenna, dan Enteromorpha linza memiliki potensi sebagai sumber antioksidan alami. Aktivitas free radical scavenging ekstrak metanolik kedua sampel tersebut diuji menggunakan uji DPPH dengan tokoferol digunakan sebagai standar. Penuruan signifikan terhadap konsentrasi radikal DPPH diamati berdasarkan kemampuan scavenging yang dimiliki. Hasil uji memperlihatkan Enteromorpha antenna
15
dan Enteromorpha linza berturut-turut menghasilkan nilai IC50 sebesar 70 μg/mL, dan 80 μg/mL. Hal ini mengindikasikan keduanya merupakan sumber antioksidan alami yang baik (Narasimhan et al., 2013). Evaluasi terhadap ekstrak metanolik Enteromorpha intestinalis untuk aktivitas antiproliferative (penghambatan perkembangbiakan) pada sel kanker serviks HeLa. Polisakarida yang diekstraksi dengan alkali (DAEB) dari Enteromorpha intestinalis diketahui cocok untuk menghambat pembentukan Sarcoma 180 tumor dan memiliki beberapa aktivitas antitumor yang diperantarai oleh peningkatan imun pada sistem imun sebagai ganti sitotoksisitas secara langsung. Dengan nilai IC 50 yang lebih kecil dibandingkan dengan Rizoclonium riparium (yang diujikan), ekstrak Enteromorpha
intestinalis
diketahui
lebih
bersifat
antiproliferative
(Paul dan Kundu, 2013). Pengujian aktivitas antibakteri pada dua spesies alga Enteromorpha flexuosa dan Gracilaria cortica diteliti. Hasil memperlihatkan bahwa kedua ekstrak tersebut aktif terhadap kedua patogen yang digunakan yaiktu Klebsiella pneumonia dan Eschericia coli. Aktivitas maksimum dilaporkan terdapat pada Enteromorpha flexuosa dengan zona penghambatan terhadap Klebsiella pneumonia sebesar 2.5 mm, dan Eschericia coli sebesar 3.7 mm. Hasil ini menunjukkan Enteromorpha flexuosa merupakan sumber senyawa anti bakteri yang potensial dalam bidang medis (Rebecca et al., 2013). Enteromorpha intestinalis diketahui memiliki aktivitas anti mikroba secara in vitro. Hasil penelitian memperlihatkan ekstrak metanolik Enteromorpha intestinalis mampu menghasilkan aktivitas anti mikroba yang baik
terhadap
bakteri
yang
diujikan
dengan
memproduksi
zona
penghambatan dari 8.0- 19.0 mm. Uji time kill mengindikasikan bahwa ekstrak metanolik Enteromorpha intestinalis mampu secara sempurna menghambat pertumbuhan MRSA dan juga menunjukkan aktivitas antibakteri yang berlangsung lama. Berdasarkan hal tersebut dapat disimpulkan bahwa ekstrak metanolik Enteromorpha intestinalis berpotensi
16
untuk dikembangkan sebagai agen antibakteri dalam bidang farmaseutikal (Ibrahim dan Lim, 2015). 6. Lektin Tema riset lektin diperkenalkan pada tahun 1954 oleh William C. Boyd,
dari
Universitas
Boston,
lektin
tanaman
tersebut
atau
phytohemagglutinins, ditunjukkan pada tahun 1940-an yang menjadi spesifik terhadap tipe darah. Lektin pada hewan pertama kali ditemukan dalam hati kelinci di tahun 1974. Sementara aktivitas lektin pada hewan pertama kali dideteksi pada ular di tahun 1902. Grup pertama lektin spesifik-A ditemukan pada kerang di tahun 1960 yang kemudian diikuti oleh penemuan grup anti-A lektin pada siput (Kilpatrick, 2002). Lektin adalah protein pengikat karbohidrat atau glikoprotein nonimun, dan berperan terhadap pelacak molekul pada sel-sel atau interaksi antar matrik-sel. Beberapa lektin berfungsi sebagai penanda pada glycomics dan pada bidang kesehatan karena mampu membedakan struktur karbohidrat dan mengungkapkan beragam aktivitas biologi melalui keterikatannya dengan karbohidrat. Interaksi lektin-karbohidart juga ditemukan dapat memainkan peranan penting dalam mengenal antara mikroorganisme dengan sel fagositis (seperti granulosit dan makrofag) memimpin dalam uptakedan membunuh organisme. Fenomena ini dinamakan dengan lectinophagocytosis, merupakan contoh awal innate immunity. Tidak seperti antibodi, lektin menunjukkan keanekaragaman struktur molekuler dan spesifitas pengikatan karbohidrat, tergantung pada organisme sumbernya (Hung et al., 2012). Hemaglutinin atau lektin adalah protein pengikat karbohidrat origin non-immune, mengaglutinasi sel atau mempresipitasi glikokonjugat (Goldstein et al., 1980). Brooks, et al (2002), Sharon dan Halina (2003), Varki, et al (1999) dalam Praseptiangga (2013) melaporkan tiap molekul lektin pada umumnya memiliki 2 atau lebih sisi carbohydrate-binding, tidak hanya berinteraksi dengan gula di permukaan sel (contoh: eritrosit), lektin
17
juga berinteraksi membentuk ikatan silang dengan molekul-molekul polisakarida atau glikoprotein dan menginduksi terjadinya presipitasi, disebut fenomena aglutinasi. Lektin tidak memiliki aktivitas katalitik seperti enzim. Lektin berbeda dengan antibodi dan bukan produk dari respon imun. Lektin berguna sebagai alat yang mudah digunakan untuk menunjukan perbedaan struktur karbohidrat serta memiliki berbagai macam aktivitas biologis terkait dengan pengikatan dan interaksinya dengan karbohidrat, sehingga terdapat ketertarikan yang besar dalam upaya untuk menemukan dan mengisolasi lektin baru dari perspektif penggunaan lektin, khususnya dalam bidang glikomiks dan medis (Praseptiangga, 2013). Gambar 2.2 menunjukan interaksi permukaan sel lektin-karbohidrat. Lektin membawa berbagai jenis sel yang berbeda seperti virus pada sel lain melalui karbohidrat pada permukaan. Pada beberapa kasus, lektin pada permukaan sel mengikat terutama glikoprotein (misal asialoglikoprotein), dikasus lain karbohidrat pada permukaan sel glikoprotein atau glikolipid pada sisi pengikatan digunakan untuk mengikat molekul biologi aktif lektin (contoh karbohidat-bakteri spesifik dan toksin tanaman atau galektin). Berdasarkan original diagram dari BioCarbAB (Lund, Sweden) (Sharon dan Lis, 2004).
18
Gambar 2.2 Interaksi Permukaan Sel Lektin-Karbohidrat menurut Sharon dan Lis (2004) Lektin sebagai senyawa bioaktif dapat untuk deteksi immunologi, biologi sel, penelitian tentang kanker (Hori et al., 1981) dan menghambat pertumbuhan sel leukimia (Queiroz et al., 2009). Keistimewaan lektin yang merupakan protein berikatan dengan karbohidrat spesifik juga dapat digunakan sebagai deteksi beberapa aktivitas biologi seperti aglutinasi sel, presipitasi polisakarida, aktivitas mitogenik, aktivitas anti tumor, dan toksisitas (Sharon & Lis, 1972; Lis & Sharon, 1973; Nicolson, 1976; Gold & Balding, 1975 dalam Hori et al., 1981). 7. Lektin Alga Lektin pada alga laut telah diteliti dalam berbagai penelitian dengan alga yang diperoleh dari Puerto Rico (Boyd et al., 1966), Inggris (Blunden et al.,1975, 1978; Rogers et al., 1980), Jepang (Hori et al., 1981, 1988), Spanyol (Fabregas et al., 1985, 1992), USA (Chiles dan Bird, 1989; Bird et al., 1993), dan Brazil (Ainouz dan Sampaio, 1991; Ainouz et al., 1992; Freitaz et al., 1997), lebih dari 200 spesies alga telah dilaporkan mengandung hemaglutinin. Jepang (Hori et al.,1981), China (Wang et al., 2004), Vietnam (Hung et al., 2007), Pakistan (Alam dan Usmanghani 1994), dan India (Kumar dan Barros 2010) tercatat merupakan negara Asia pelaku riset terkait lektin alga (Hung et al., 2012). 20 spesies alga laut Brazil (16 alga merah dan 4 alga hijau) dianalisis aktivitas hemaglutinasi menggunakan darah manusia golongan A, B, O dam AB yang diperlakukan dengan enzim, kemudian ditambahkan darah ayam, kelinci, domba, kambing dan sapi. Ekstrak salin dari 10 alga mengaglutinasi eritrosit kelinci, 7 mengaglutinasi eritrosit ayam, 6 mengaglutinasi darah sapi, dan 4 mengaglutinasi eritrosit domba. Darah kambing tidak teraglutinasi dengan semua ekstrak alga yang diuji. Aglutinasi non spesifik sel darah merah manusia dijumpai pada ekstrak 2 alga merah (Gracilaria
19
ferox dan Hypnea musciformis) dan 1 alga hijau (Caulerpa cupressoides) (Ainouz dan Sampaio, 1991). 44 spesies ekstrak alga Vietnam terdiri dari 15 alga hijau, 18 alga merah, dan 11 alga coklat dengan berbagai eritrosit hewan dan eritrosit manusia tanpa perlakuan enzim dan dengan perlakuan enzim. Aktivitas hemaglutinasi paling kuat pada ekstrak dari dua Klorofita (Anadyomene plicata dan Avrainvillea erecta) dan empat Rhodofita (Gracilaria eucheumatoides, Gracilaria salicornia, Kappaphycus alvarezii,
dan
Kappaphycus striatum) dengan eritrosit kelinci perlakuan enzim dan eritrosit domba. Pada uji penghambatan aktivitas hemaglutinasi dengan berbagai monosakarida dan glikoprotein, tidak ada satupun hemaglutinin yang memiliki afinitas dengan monosakarida, kecuali Codium arabicum dan Gracilaria euchematoides dimana aktivitasnya dihambat N-acetyl-Dgalactosamine dan N-acetyl-D-glucosamine (Hung et. al., 2009). Dua belas macam lektin diisolasi dari empat spesies alga, Boodles coacta (Alga hijau), Hypnea japonica (Alga hijau), Carpopeltis flabelata (Alga merah) dan Solieria robusta (Alga merah) untuk kemudian dicatat karakteristik kimia dan biologinya. Lektin alga mampu mengaglutinasi dengan kuat eritrosit kelinci yang diberikan perlakuan enzim tripsin dan aktivitasnya biasanya dihambat glikoprotein yang berhubungan dengan Nglikan. Rata-rata lektin alga tidak memiliki afinitas dengan monosakarida. Karakter inilah yang membuatnya sulit untuk diisolasi menggunakan kromatografi afinitas dengan gula sederhana seperti pada ligan dan eluan. Sementara itu aktivitas hemaglutinasi pada alga tidak terpengaruh dengan pemanasan pada suhu 100oC selama 30 menit. Berhubungan dengan kemampuan aglutinasi sel oleh lektin, secara umum dapat dijelaskan bahwa lektin memiliki satu sisi pengikatan setiap satu atau dua unit, dan karena hubungan sub unit ini, memiliki minimal dua sisi pengikatan yang dapat mengaglutinasi sel (Hori et al., 1990). Eksperimen biokimia berdasarkan uji aglutinasi mengungkapkan adanya aktivitas hemaglutinasi pada banyak ekstrak alga terhadap eritrosit
20
dari beberapa spesies binatang. Pada banyak studi, aktivitas hemaglutinasi ini diartikan sebagai keberadaan protein atau glikoprotein yang memiliki spesifisitas untuk secara selektif mengikat struktur karbohidrat pada sel darah merah. Protein tersebut banyak ditemukan pada berbagai jenis organisme, juga dilaporkan ada pada beberapa jenis alga (Boyd et al., 1966). Banyak lektin rumput laut memiliki massa molekul yang lebih rendah dibandingkan lektin dari tanaman lain pada umumnya, memiliki bentuk monomerik, termostabil, dan aktivitas hemaglutinasi yang tidak dipengaruhi oleh kehadiran kation divalen. Lektin tidak memiliki afinitas terhadap gula sederhana melainkan terhadap gula yang lebih kompleks seperti oligosakarida, terlebih glikoprotein, seperti yang ditemukan pada hewan (Hori et al., 1990; Rogers dan Hori, 1993). Studi karakterisasi menunjukkan bahwa banyak lektin alga, terutama dari alga merah, memiliki karakter umum yaitu ukuran molekul yang kecil, bentuk monomerik, tidak memiliki afinitas terhadap monosakarida, memiliki stabilitas suhu dan divalent cation-independent yang mengindikasikan bahwa alga adalah sumber lektin yang baik (Hung et al., 2009). Banyak lektin alga dilaporkan memiliki aktivitas anti-tumor terhadap sela kanker manusia (Karasaki et al, 2001; Timoshenko et al, 2001; Wang et al, 2000). Kemampuan active targeting terhadap tumor secara spesifik sering diteliti dengan mengimobilisasi ligan spesifik tumor (antibodi, peptida, atau sakarida) kedalam sistem drug-carrier (Forssen dan Wills, 1998; Peer et al, 2007; Trochilin, 2005). Selain itu lektin turunan dari alga laut juga kaya akan komponen antiviral. Aktivitas antiviral bergantung pada kemampuan mengikat oligosakarida yang mengandung manosa yang ada pada permukaan virus yang ditutupi oleh glikoprotein. Interaksi spesifik lektin alga dengan glikan target pada permukaan virus akan menekan inveksi virus (Balzarini, 2007). Studi terkini menunjukkan bahwa rumput laut lektin juga terlibat dalam aktivitas in-vitro atau in-vivo imunomodulatori, anti tumor, dan anti
21
kanker (Kawakubo et al., 1997; Sugahara et al., 2001; Neves et al., 2001; dan Pinto et al., 2009). Lektin dari alga meah Griffithsia sp. adalah inhibitor multiplikasi HIV paling potensial (Mori et al., 2005) atau lektin ESA-2 dari alga merah Eucheuma serra yang memiliki spesifitas tinggi terhadap high mannose N-glycans dan menunjukkan aktivitas anti-HIV (Hori et al., 2007). Lektin dari berbagai alga seperti CV-N dari Nostoc ellipsosporum (Boyd et al., 1997), SVN dari Scytonemavarium (Bokesch et al., 2003), MVL dari Microcystis viridis (Bewley et al., 2004), dan OAA dari Oscillatoria agardhii (Sato et al., 2007), memiliki potensi lebih besar sebagai anti-HIV dibandingkan dengan lektin pengikat manosa dan lektin pada tanaman darat. Hal ini menunjukkan bahwa alga dapat menjadi sumber dominan lektin yang
bermanfaat
dalam
aplikasi
biokimia
dan
biomedikal
(Hung et al., 2012).
8. Pengujian Aktivitas Hemaglutinasi Lektin spesifik golongan darah manusia berperan penting pada siklus pendugaan awal struktur dasar spesifisitas antigen dengan sistem darah ABO. Tahun 1950, Walter J.T. Morgan dan Winifred M. Watkins dari Institut Lister, London menemukan aglutinasi sel darah merah tipe A terhadap lektin lima
bean
yang
menghambat
dengan
baik
ikatan
α-N-acetyl-D-
galactosamine dan eritrosit O oleh lektin dari L. tetragonolobus dihambat dengan baik ikatan α-L-fucose. Mereka menyimpulkan bahwa α-N-acetyl-Dgalactosamine dan α-L-fucose menentukan golongan darah A dan O masingmasing secara spesifik. Kesimpulan ini kemudian diperkuat dengan penelitian selanjutnya (Sharon dan Lis, 2004). Pada eritrosit manusia, aglutinasi eritrosit golongan darah A, B, dan O terjadi karena pengikatan yang kuat oleh lektin secara berturut-turut pada gugus N-acetyl-D-
22
galactosamine,
D-galactose,
dan
L-fucose
pada
permukaannya
(Khan et al., 2002). Bentuk sistem imun antibodi berlawanan dengan dengan antigen golongan darah ABO tidak ditemukan di sel darah merah manusia. Golongan darah A memiliki antibodi anti-B dan golongan darah B memiliki antibodi anti-A. golongan darah O secara umum memiliki antibodi anti Adan anti-B pada serumnya. Golongan darah AB tidak memiliki antibodi antiA dan anti-B pada serum. Tabel 2.3 menunjukan sistem penggolongan darah manusia. Tabel 2.3 Sistem Penggolongan Darah Manusia Golongan Darah A B AB O
Antigen pada Sel Darah Merah A B A dan B Tidak memiliki
Antibodi pada serum Anti-B Anti-A Tidak memiliki Anti-A dan Anti-B
Sumber: Dean, 2005
Antibodi ABO terdapat secara alami di dalam serum.pembuatan antibodi ini distimulasi ketika sistem imun bertemu dengan antigen golongan darah ABO pada makanan atau mikroorganisme. Hal ini terjadi pada usia dini karena gula yang identik dengan golongan darah ABO ditemukan di seluruh alam. Alel A mengkode Glycosyltransferase yang menghasilkan antigen A dan memiliki gula imunodiminan N-Acetyl galactosamine. Alel B mengkode Glycosyl transferase menghasilkan antigen B dan memiliki gula imunodominan D-Galaktosa (Dean, 2005). Rogers, et al (1980) dan Hori, et al (1988) melaporkan bahwa aktivitas hemaglutinasi lebih terdeteksi ketika eritrosit diberikan perlakuan enzim (enzyme treated). Ainouz, et al (1991) menunjukkan bahwa eritrosit kelinci lebih sensitif terhadap lektin makroalga dibandingkan dengan eritrosit manusia, terutama ketika sel diberikan perlakuan enzim. Efek dasar yang dihasilkan oleh eritrosit dengan perlakuan enzim proteolitik adalah pembebasan sialoglikoprotein dari permukaan sel, sehingga menurunkan
23
muatan negatif permukaan pada sel dan memfasilitasi aglutinasi yang dilakukan oleh lektin (Rogers dan Hori, 1993). Efek kation divalen, pH, dan suhu terhadap aktivitas hemaglutinasi pada hemaglutinin dari beberapa spesies alga Vietnam diteliti (Amansia rhodantha, Avrainvillea obscura, Boodlea composita, Dictyosphaeria versluysii, Dictyosphaeria cavernosa, Halimeda discoidea, Gelidiopsis scoparia, dan Valonia fastigiata). Mayoritas aktivitas hemaglutinasi agglutinin alga tersebut tidak berubah setelah dialisis dengan 50mM EDTA dan dengan penambahan 10mM CaCl2 atau MgCl2, kecuali lektin Gelidiopsis scoparia yang aktivitasnya mengalami sedikit penurunan setelah di dialisis dengan EDTA. Penambahan CaCl2 atau MgCl2 pada konsentrasi 10mM mengembalikan hampir semua aktivitas hemaglutinasi seperti semula. Aktivitas hemaglutinasi Dictyosphaeria versluysii dan Halimeda discoidea tidak berubah setelah pemanasan pada 1000C selama 30 menit. Lektin
Amansia
rhodantha,
Avrainvillea
obscura,
Dictyosphaeria
cavernosa, dan Valonia fastigiata juga bersifat termostabil karena aktivitasnya tidak berubah dalam pemanasan pada 80-900C selama 30 menit. Namun aktivitas hemaglutinin tersebut hilang seluruhnya pada pemanasan 1000C selama 30 menit. Disisi lain, hemaglutinin Gelidiopsis scoparia bersifat labil terhadap panas karena aktivitasnya menurun secara signifikan dengan suhu inkubasi mencapai 500C. Hemaglutinin alga lainnya cukup stabil pada rentang suhu yang relatif luas. Mayoritas hemaglutinin alga yang diuji mampu mempertahankan aktivitasnya pada range pH yang luas diantara 5 dan 9 dengan sedikit penurunan aktivitas pada media yang lebih asam
dan
basa.
Pengecualian
terjadi
pada
Boodlea
composita,
Dictyosphaeria versluysii dan Valonia fastigiata yang tidak berubah pada rentang pH 3-9 (Hung et al., 2012). 15
Spesies
alga
Vietnam
diuji
spesifisitas
masing-masing
hemaglutininnya menggunakan presipitat ammonium sulfat dari masingmasing ekstrak, dengan pengujian hemaglutinasi inhibisi meggunakan
24
berbagai
jenis
monosakarida
dan
glikoprotein.
Hasil
penelitian
menunjukkan aktivitas hemaglutinasi spesies alga tersebut tidak dihambat oleh berbagai monosakarida yang diujikan, kecuali ekstrak Codium arabicum
dan
Gracilaria
eucheumatoides.
Di
sisi
lain
aktivitas
hemaglutinasi mampu dihambat oleh glikoprotein terikat high mannose Nglycan, Complex N-glycan, atau O-glycan. Karakteristik hemaglutinasi inhibisi dengan berbagai jenis glikoprotein berbeda tergantung spesies hemaglutininnya. Tanpa mengabaikan hemaglutinin Boodlea struveoides, Kappaphycus alvarezii, dan Eucheuma denticulatum, yeast mannan terikat high mannose N-glycan adalah inhibitor terkuat, dan porcine stomach thyroglobulin terikat high mannose dan complex N-glycan juga merupakan inhibitor yang baik. Hasil ini mengindikasikan bahwa spesies alga ini masing-masing mengandung paling sedikit, lektin spesifik untuk high mannose N-glycan (Hung et al., 2009). 9. Pemurnian Lektin Pemurnian protein adalah salah satu cara untuk memisahkan protein dari protein jenis lain dan kontaminannya. Secara umum, pemurnian protein dibagai menjadi tiga tahap, yaitu ekstraksi, pemekatan, dan fraksinasi. Salah satu tujuan pemurnian protein adalah untuk mengidentifikasi fungsi dan struktur protein. Komponen protein yang murni dari protein lain dan senyawa kontaminan dapat digunakan untuk keperluan medis, farmasi, dan penelitian biokimia karena spesifisitasnya yang tinggi (Lehninger, 1993). Tahap awal dari proses pemurnian adalah mengisolasi protein dari sumber yang memproduksinya baik sel tanaman, hewan, maupun mikroorganisme. Protein ekstraseluler yang disekresikan ke dalam medium diperoleh melalui pemisahan sel dari media fermentasi dengan teknik filtrasi dan sentrifugasi. Protein target berada dalam medium bebas sel yang biasanya dalam bentuk yang sangat encer. Sedangkan untuk protein intraseluler, sel dipanen dan diresuspensi dalam larutan buffer atau air
25
kemudian
dipecahkan
agar
dapat
dipisahkan
proteinnya
saja
(Ellyasheva dan Rachman, 2005). Protein target biasanya berada dalam bentuk terlarut sehingga perlu dilakukan proses pemekatan. Metode pemekatan yang umum dilakukan di laboratorium adalah: (1) pemekatan dengan pengendapan/presipitasi menggunakan garam ammonium sulfat atau pelarut; (2) pemekatan menggunakan ultrafiltrasi. Pengendapan menggunakan ammonium sulfat adalah salah satu cara yang paling sering digunakan dan populer karena kelarutannya yang tinggi, murah, tidak menyebabkan denaturasi protein dan memiliki efek stabilitas pada protein. Penambahan ammonium sulfat dapat meningkatkan kelarutan protein (salting-in) dan penambahan garam selanjutnya akan mendestabilisasi protein sehingga protein akan mengendap (salting-out). Pemekatan dengan pengendapan garam biasanya tidak memberikan peningkatan kemurnian yang tinggi, namun memberikan rendemen (yield) tinggi. Pelarut yang biasa digunakan dalam pemekatan protein adalah etanol, isopropanol, aseton, dan dietil eter. Larutan protein dapat juga dipekatkan dengan menggunakan ultrafiltrasi. Pemekatan protein menggunakan ultrafiltrasi dengan ukuran pori membrane 1-20 nm cukup untuk menahan protein berbobot molekul rendah (Nurachman, 2006). Kromatografi merupakan metode yang kuat untuk deteksi dan purifikasi substansi biologi. Prinsip dari pemisahan menggunakan kromatografi adalah pengelompokan atau pembagian molekul yang terpisah diantara dua fase yang bercampur yang disebut fase gerak dan fase stasioner. Metode kromatografi diklasifikasikan berdasarkan kriteria yang berbeda termasuk bentuk fisik fase stasioner, sifat fase gerak dan atau fase stasioner, mekanisme pemisahan atau sifat sistem kromatografi. Sebagai contoh, kromatografi kertas disebut demikian berdasarkan material yang digunakan pada fase stasioner; kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi kolom dinamakan berdasarkan bentuk fisik pada fase stasioner. Kromatografi gascair memiliki fase gerak gas dan fase stasioner cair. Berdasarkan mekanisme pemisahan kromatografi diklasifikasikan sebagai kromatografi pengisapan,
26
kromatografi pemisahan, kromatografi size-exclusion, kromatografi penukar ion dan afinitas, serta kromatografi interaksi hidrofobik (Sattayasai, 2012). a. Hydrophobic Interaction Cromatography (HIC) Terdapat beberapa tahapan proses selama HIC yaitu equilibration, sample application, elution 1, elution 2, elution 3, dan wash. Pada tahap equilibration HIC medium diekuilibrasi menggunakan start buffer dengan kadar garam berkonsentrasi tinggi. Pada tahap sample application, start buffer menyebabkan protein hidrofobik berikatan dengan ligan hidrofobik pada medium, sehingga menjadi terkonsentrasi pada kolom. Pada tahap ini, protein yang tidak cukup hidrofobik akan terelusi selama atau hanya setelah injeksi sampel. Pada tahap elution 1, akan terjadi pengurangan kadar garam (menggunakan linear gradient) yang menyebabkan protein hidrofobik terelusi dengan protein yang memiliki hidrofobisitas paling kecil akan terelusi pertama. Pada tahap elution 2, pengurangan garam yang masih berlanjut akan terus mengelusi protein sehingga hanya yang paling hidrofobik saja yang tertinggal (semakin rapat terikat). Pada elution 3, ketika medium sudah bebas dari garam, protein yang paling hidrofobik juga akan terlepas bersamaan dengan protein yang memiliki hidrofobisitas sejenis. Pada tahap wash, kondisi bebas garam akan menghilangkan semua ikatan hidrofobik
protein
sebelum
memasuki
tahap
re-equilibration
(GE Healthcare, 2006). Hydrophobic Interaction Cromatography (HIC) merupakan metode
kromatografi
yang
memisahkan
protein
berdasarkan
hidrofobisitas, sama seperti reverse-phase liquid chromatography (RPLC). Fase stasioner pada kromatografi ini merupaka ligan hidrofobik yang terhubung dengan matriks. Namun, tingkat hidrofobisitas dan jumlah ligan pada kromatografi ini lebih sedikit dari RPLC. HIC cocok untuk purifikasi protein dengan kondisi penggunaan kondisi elusi protein yang diserap tidak terlalu ekstrim. Ligan hidrofobik pada HIC utamanya merupakan kelompok alkil (etil hingga oktil) atau fenil atau kelompok
27
poliamida; matriksnya berikatan silang dengan agarosa atau silica. Untuk prosedur umum HIC, sample dimasukkan kedalam kolom yang telah diekuilibrasi dengan fase gerak yang secara keseluruhan mengandung kadar garam tinggi. Protein yang diserap selanjutnya dielusi dengan pelarut yang mengurangi konsentrasi garam menjadi semakin rendah. HIC sangat cocok untuk pemisahan protein setelah metode presipitasi dengan garam/kromatografi penukar ion sejak protein telah larut dalam larutan garam konsentrasi tinggi. HIC mampu membuka kemungkinan baru untuk pemurnian sejumlah biomolekul seperti protein reseptor dan protein membrane (Walker, 2005). HIC adalah step kolom pertama yang logis untuk protein yang sebelumnya telah mengalami perlakuan presipitasi dengan ammonium sulfat. Sampel awal dapat disimpan secara aman pada suhu rendah untuk waktu yang lama dalam ammonium sulfat jenuh. Ketika akan dilanjutkan ke proses purifikasi, sampel perlu dithawing, disesuaikan dengan konsentrasi ammonium sulfat yang sesuai, dan dimasukkan kedalam kolom HIC yang telah diekuilibrasi menggunakan ammonium sulfat dengan konsentrasi yang sama. Adapun pengonsentrasian ini dimaksudkan untuk meningkatkan ikatan ligan dengan protein target. HIC memberikan pemisahan yang signifikan dengan menjaga protein pada medium yang stabil. Jika ammonium sulfat harus dijaga pada konsentrasi yang tinggi, maka dapat digunakan medium hidrofobik yang lemah (butil agarosa, atau metil agarosa). Dengan menggunakan medium HIC yang lemah akan menjamin konsentrasi ammonium sulfat dapat dijaga tetap tinggi, baik untuk pengikatan, maupun elusi, sehingga garam penstabil selalu ada. Jika stabilitas pada tahap awal bukan merupakan fokus utama, maka medium dengan pengikatan yang kuat seperti fenil agarose dapat digunakan. Jika, seperti kebanyakan kasus pada fenil agarosa, maka dibutuhkan elusi menggunakan air buffer (atau alkohol konsentrasi rendah dalam larutan buffer) (Ward, 2009).
28
Media HIC terdiri dari ligan yang mengandung kelompok alkil atau aril yang berpasangan dengan matriks inert yang berbentuk partikel bulat. Matriks tersebut berpori yang dimaksudkan untuk memberikan luas permukaan internal yang tinggi, dimana ligan memainkan peran penting dalam hidrofobisitas akhir medium.
Ketika ligan secara
signifikan berkontribusi terhadap derajat hidrofobisitas medium, matriks juga dapat mempengaruhi selektivitas akhir.
Keseimbangan optimal
diantara porositas dan ukuran partikel pada matriks akan memberikan area permukaan yang besar yang dapat ditutup oleh ligan yang akan memastikan kapasitas pengikatan yang tinggi. Porositas tinggi dengan struktur pori terbuka merupakan keuntungan ketika memisahkan biomolekul berukuran besar. Stabilitas fisik yang tinggi juga akan memastikan volume medium yang telah dikemas akan tetap (tidak berkurang) walaupun terjadi perubahan ekstrim pada konsentrasi garam atau pH, sehingga akan meningkatkan reproduktifitas dan mencegah dari kemungkinan melakukan packing kolom kembali. Selain itu, stabilitas fisik
yang
tinggi,
disertai
keseragaman
ukuran
partikel
akan
memfasilitasi flow rate yang tinggi, terutama selama tahap cleaning atau re-equilibration (GE Healthcare, 2006). Beberapa faktor utama yang harus dipertimbangkan ketika memilih media HIC dan optimalisasi proses pemisahan menggunakan media HIC adalah: (1) tipe ligan dan derajat substitusi, (2) tipe matriks dasar, (3) tipe dan konsentrasi garam, (4) pH , dan (5) temperatur. Tipe ligan yang diimobilisasi (alkil atau aril) menentukan terutama selektivitas penyerapan protein pada adsorbent HIC. Secara umum, ligan alkil rantai lurus (hidrokarbon) menunjukan karakter hidrofobik alami, dimana ligan aril menunjukkan sifat gabungan dimana baik interaksi hidrofobik dan aromatik mungkin terjadi. Selain itu juga dapat diketahui, pada derajat substitusi yang konstan, kapasitas pengikatan terhadap protein pada adsorbent HIC akan meningkat dengan bertambah
29
panjangnya rantai alkil. Sementara pada faktor kedua, yaitu tipe matriks dasar, dua tipe pendukung yang secara luas digunakan adalah karbohidrat hidrofilik kuat seperti cross-linked agarose, atau material kopolimer sintetis. Pada ligan yang sama selektivitas yang dihasilkan pada kopolimer tidak akan sama dengan agarose. Pada faktor ketiga, ketika konsentrasi garam meningkat, jumlah protein yang terikat juga akan meningkat hampir linear sampai pada konsentrasi garam spesifik, dan berlanjut meningkat pada konsentrasi yang masih tinggi. Tipe garam juga mempengaruhi HIC. Sodium, potassium, ammonium sulfat masingmasing menghasilkan presipitasi yang tinggi. Garam tersebut akan meningkatkan interaksi hidrofobik secara efektif dan memberikan pengaruh kestabilan pada struktur protein. Sementara pengaruh
pH
secara umum adalah ketika pH meningkat akan melemahkan interaksi hidrofobik, yang diduga sebagai hasil dari peningkatan titrasi kelompok bermuatan, sehingga
meningkatkan hidrofilisitas protein. Sementara
penuruan pH akan menghasilkan peningkatan interaksi hidrofobik. Berdasarkan hal tersebut protein yang tidak terikat dengan ligan HIC pada pH netral, akan mengikat pada pH asam. Efek terakhir, yaitu temperatur telah dibuktikan oleh teori yang dikembangkan oleh Hjerten., yang melaporkan bahwa interaksi hidrofobik zat terlarut dalam air akan meningkat seiring dengan peningkatan temperatur. Bukti eksperimental telah dilaporkan oleh Hjerten dan Jennisen yang melaporkan bahwa gaya van der waals yang menggerakkan interaksi hidrofobik juga akan meningkat seiring dengan peningkatan yang terjadi pada temperatur (Amersham Pharmacia Biotech, 1993). b. Reverse Phase Chromatography (RPC) Secara teori, HIC dan Reverse-Phase Chromatography (RPC) sangat berhubungan dengan teknik kromatografi cair. Namun secara praktik keduanya berbeda. Adsorben RPC lebih banyak disubstitusi dengan ligan hidrofobik dibandingkan dengan adsorben HIC. Derajat substitusi adsorben RPC biasanya beberapa ratus μ mol/ml gel C 4-C18
30
ligan alkil. Sebagai konsekuensi, pengikatan protein pada adsorben RPC biasanya lebih kuat, yang dibutuhkan penggunaan pelarut non-polar untuk elusinya. RPC telah menemukan aplikasi yang luas dalam pemisahan analitis terutama pada peptida dan protein dengan berat molekul
rendah
yang
stabil
pada
pelarut
cair
organik
(Amersham Pharmacia Biotech, 1993). RPC telah menjadi teknik pemisahan dan analisis protein beresolusi tinggi yang sangat penting. Teknk ini ideal digunakan untuk aplikasi seperti pemetaan peptida, atau pengecekan kemurnian, dan seringnya digunakan untuk final polishing oligonukleotida dan peptida. RPC memisahkan molekul berdasarkan perbedaan hidrofobisitasnya. Secara teori RPC dan HIC sangat berhubungan erat karena keduanya menggunakan prinsip berdasarkan interaksi diantara patch hidrofobik pada permukaan biomolekul dan permukaan hidrofobik medium kromatografi. Namun secara praktik kedua teknik ini sangat berbeda. Permukaan medium RPC biasanya lebih hidrofobik dari medium HIC. Hal ini menyebabkan interaksi yan lebih kuat dimana agar elusi berjalan sukses, harus berbalik menggunakan pelarut organik non polar seperti asetonitril atau metanol. RPC menawarkan fleksibilitas yang baik dalam kondisi pemisahan. Separasi dengan resolusi sangat tinggi dapat dicapai dengan memisahkan komponen yang memiliki perbedaan hidrofobisitas yang sangat sedikit. RPC juga dapat digunakan untuk memisahakan molekul
yang
memiliki
perbedaan
hidrofobisitas
signifikan
(GE Healthcare, 2006). 10. Penentuan Berat Molekul Lektin Sebagai akibat tingginya kebutuhan polimer, maka telah dilakukan penelitian dan pengembangan secara berkelanjutan pada polimer. Salah satu penelitian pada polimer adalah menentukan berat molekul polimer (Mn). Dengan mengetahui berat mtolekul polimer (Mn), akan dapat diketahui karakteristik polimer tersebut. Hal tersebut akan
31
memudahkan dalam penyesuaian penggunaan polimer dengan tepat (Billmeyer dalam Nugraheni dkk., 2015). Berat molekul merupakan variabel yang istimewa karena berhubungan langsung dengan sifat kimia polimer. Umumnya polimer dengan berat molekul tinggi mempunyai sifat yang lebih kuat. Banyak sekali bahan polimer yang tergantung pada massa molekulnya (Cowd dalam Habibah dkk., 2013).
a. SDS-PAGE Elektroforesis adalah suatu proses migrasi molekul bermuatan di dalam suatu media yang bermuatan listrik, dimana kecepatan migrasinya tergantung pada muatan, ukuran, dan bentuk setiap molekul yang terlibat. Pada pemisahan protein metode yang paling umum digunakan adalah
dengan
cara
elektroforesis
menggunakan
discontinuous
polyacrylamide gel sebagai medium penyangga dan sodium dodecyl sulfate (SDS) untuk mendenaturasi protein. Metode ini disebut sebagai Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDSPAGE) atau dapat disebut juga metode Laemmli (Wibowo, 2011). Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) adalah teknik satu dimensi berresolusi tinggi, yang cocok untuk pemisahan analitis terhadap penyusun polipeptida pada campuran protein kompleks. Denaturasi protein dengan SDS dan agen pereduksi, menghasilkan polipeptida yang terikat dengan SDS pada rasio berat yang konstan sehingga mobilitas elektroforesis merupakan fungsi penentuan berat molekul. Namun teknik ini memiliki kelemahan, yaitu hanya mampu
mengeksploitasi
satu
parameter
fisikokimia,
yang
memungkinkan masing-masing pita protein memiliki lebih dari satu komponen
polipeptida
(Marshall, 1964).
yang
akan
menghalangi
identifikasi
32
Faktor kunci pada sistem elektroforesis gel adalah gel itu sendiri. Gel menentukan laju migrasi protein dan penahanan protein ditempat ketika mencapai akhir proses hingga dapat dilakukan staining untuk peneraan. Gel poliakrilamid merupakan medium dasar yang paling cocok untuk elektroforesis protein. Gel tersebut memberikan range ukuran pori yang cocok untuk penyaringan protein. Keunggulan lainnya adalah reaksi polimerisasi akan mudah terjadi dan mampu diproduksi kembali, ukuran pori dapat ditentukan dengan kondisi polimerisasi dan dapat dengan mudah diubah dengan mengubah konsentrasi monomer, gel bersifat hidrofilik dan bermuatan netral ketika dibuat, serta transparan terhadap cahaya pada panjang gelombang 250 nm dan tidak mengikat pewarna protein. Gel dapat berperan sebagai penyaring molekular untuk molekul protein. Gel terdiri atas jaringan tiga dimensi material solid dan pori. Selama elektroforesis pada gel, material polimerik
berperan
sebagai
barrier
terhadap
gerakan
protein,
menekannya untuk bergerak diantara pori yang telah diisi oleh buffer pada gel. Pada pembentukan gel akrilamid, sistem kimia yang sering digunakan untuk membentuk radikal bebas yang dibutuhkan untuk polimerisasi terdiri atas ammonium persulfate (APS), dan N,N,N’,N’tetramethylethylenediamine
(TEMED).
TEMED
berfungsi
untuk
mempercepat dekomposisi molekul persulfat menjadi radikal bebas sulfat yang selanjutnya akan menginisiasi polimerisasi. Basa bebas TEMED dibutuhkan untuk reaksi ini, sehingga polimerisasi sangat efisien pada pH basa. Laju polimerisasi bergantung pada (1) konsentrasi jaringan monomer dan inisiator, (2) temperatur, dan (3) kemurnian reagen. Reagen yang digunakan harus standar elektroforesis dan air yang digunakan harus benar-benar air deionisasi atau akuades. Untuk hasil dengan kualitas tertinggi, oksigen terlarut harus dihilangkan dari campuran monomer dengan menghilangkan gasnya, karena oksigen akan menurunkan laju polimerisasi (Garfin, 2003).
33
Pada prosesnya, untuk mendapatkan hasil pemisahan protein yang optimal, stacking gel
dituangkan tepat diatas separating gel.
Stacking gel memiliki konsentrasi akrilamid yang lebih rendah (ukuran pori yang lebih besar), pH yang lebih rendah, dan perbedaan kadar ion yang berbeda dengan separating gel. Hal ini memungkinkan pita protein menjadi lebih rapat (protein terkonsentrasi) sebelum memasuki proses pemisahan pada separating gel (Thermo Scientific, 2010). β 2-mercaptoethanol akan mengurangi ikatan intra dan intermolekul disulfida pada protein untuk memungkinkan pemisahan yang tepat bukan berdasarkan bentuk tetapi ukuran. Sementara detergen SDS berfungsi untuk mengikat secara berkala semua muatan positif pada protein, sehingga memberikan setiap protein muatan negatif secara keseluruhan (protein akan terpisah berdasarkan ukuran bukan muatan). SDS juga akan mendenaturasi protein dan subunitnya sehingga pemisahan dilakukan berdasarkan pada ukuran bukan bentuk. SDS memiliki kemampuan pengikatan protein sebesar 1.3 g/g protein. Bromophenol blue berperan sebagai indikator warna, dan indikator migrasi yang dapat diamati melalui pergerakan pewarna yang berjalan didepan protein. Bromophenol blue juga berfungsi untuk memudahkan sampel agar terlihat saat proses pemasukan kedalam sumuran gel bersamaan dengan marker. Sementara gliserol pada laemmli buffer akan meningkatkan densitas sampel sehingga sampel akan terjatuh didasar sumuran, yang akan meminimalisir kehilangan sampel protein pada buffer dan dinding sumuran sampel (Laemmli, 1970). Oleh karena resolusinya yang tinggi, hanya sistem discontinuous yang digunakan. Poin sederhana yang harus diingat untuk sistem anionik yang digunakan untuk SDS-PAGE adalah bahwa untuk setiap sistem yang digunakan, mobilitas ion sangat bergantung pada nilai pH. Semakin tinggi pH, semakin cepat pergerakan garis batas, dan dengan demikian akan semakin banyak sistem mampu memisahkan protein dengan massa molekul rendah dengan mengorbankan ruang pemisahan untuk protein
34
dengan massa molekul tinggi. Sebaliknya, semakin rendah pH, akan semakin banyak ruang bagi pemisahan protein dengan massa molekul tinggi, dengan protein bermassa molekul rendah bermigrasi dengan garis batas ion (Rabiiloud, 2010). SDS-PAGE normalnya digunakan untuk menghitung kemurnian dan massa molekul protein. Metode serbaguna ini dapat diproduksi kembali dan low-cost. Secara prinsip Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) pada sistem akan mengikat kebanyak protein dalam jumlah kurang lebih sebanding dengan massa molekul protein sehingga masing-masing protein memiliki rasio muatan dengan berat yang identik, dan bermigrasi sesuai dengan massa molekulnya. Penggunaan SDS-PAGE secara luas merupakan protokol Laemmli yang terdiri
dari sistem buffer
discontinuous. Pada sistem buffer ini, terdapat dua bagian gel poliakrilamid, yaitu stacking gel dan separating gel. Terdapat beberapa perbedaan diantara keduanya, yaitu komposisi, konsentrasi, dan pH diantara buffer elektroda, yaitu buffer stacking dan separating. Kegunaan sistem buffer ini adalah efek penumpukan yang terjadi pada stacking gel. Efek ini akan meningkatkan konsentrasi protein pada sampel yang akan membantu pemisahan protein pada separating gel. Protein yang dipisahkan dengan gel poliakrilamid dapat dilihat dengan berbagai jenis pewarnaan. Pewarnaan menggunakan pewarna, khususnya Coomassie Brilliant Blue R250 merupakan yang paling umum digunakan karena mudah, low-cost, serta efektif. Pewarnaan dengan beberapa pewarna lainnya dan silver staining juga tersedia untuk tujuan yang lebih spesifik. SDS-PAGE dapat digunakan untuk menghitung massa molekul protein dengan menggunakan kurva standar diantara mobilitas relative dan nilai log massa molekul protein standar (Hames, 1998). b. Ultrafiltrasi Membran ultrafiltrasi merupakan jenis dari teknologi membran yang memiliki spesifikasi ukuran membran 0.001-0.1 μm. Secara umum,
35
ultrafiltrasi
diaplikasikan
dalam
proses
pemisahan
unsur-unsur
partikulat, makromolekul (fraksionasi), koloid, dan polimer organik maupun anorganik dari larutannya dengan memanfaatkan beda tekanan dalam proses kerjanya. Aplikasi proses ultrafiltrasi di industri diantaranya adalah untuk proses sterilisasi obat-obatan dan produksi minuman, klarifikasi ekstrak jus, pemrosesan air ultra murni pada industri semi konduktor, metal recovery, dan sebagainya. Pada proses pemurnian harus diperhatikan kondisi operasi yang optimal agar membran dapat memurnikan suatu cairan secara optimal yang ditunjukkan oleh parameter berupa fluks, permeabilitas dan faktor rejeksi dari membran (Laboratorium Operasi Teknik Kimia ITB, 2010). Berdasarkan pada karakter membran yang digunakan, dikenal berbagai proses filtrasi. Mekanisme pemisahannya adalah mekanisme pengayakan (sieving mechanism) dimana partikel atau molekul yang lebih kecil dari ukuran pori media penyaring akan lolos melewati membran sedangkan yang lebih besar dari ukuran pori akan tertahan di sisi
umpan.
Membran
ultrafiltrasi
biasanya
digunakan
untuk
memisahkan molekul dengan rentang ukuran 1000-100.000 Dalton (1100 mm) seperti protein, lemak, dan koloid. Karakteristik membran ultrafiltrasi biasanya dinyatakan dengan nilai Molecular Weight Cut Off (MWCO – yaitu bilangan yang menyatakan berat molekul terbesar dari partikel yang mampu lolos pada membran). Penentuan MWCO ini dilakukan dengan melewatkan beberapa solut dengan berbagai berat molekul, misalnya poli etilen glikol, pada suatu membran dan kemudian diukur berat molekul dari solut yang mempunyai nilai rejection sekitar 90%. Nilai MWCO ini bergantung pada jenis molekul yang digunakan, distribusi berat molekul, adsorpsi membran dan efek polarisasi konsentrasi (Wahyuni, 1994). Seperti dialisis, ultrafiltrasi menggunakan membran semi permeabel dengan ukuran pori yang cukup besar yang memungkinkan
36
pergerakan molekul kecil dan cukup kecil untuk mencegah lolosnya protein. Namun tidak seperti dialisis, dimana molekul kecil bergerak melalui
membran
dengan
difusi
yang
didorong
oleh
gradien
konsentrasinya, serta air yang cenderung bergerak ke dalam didorong oleh tekanan osmotiknya, pada ultrafiltrasi molekul kecil bergerak dalam larutan air karena kekuatan pendorong eksternal. Beberapa perangkat ultrafiltrasi menggunakan tekanan tinggi (~500 kPa). Beberapa lainnya menggunakan sentrifugasi dimana gaya sentrifugal akan memacu pergerakan air dan padatan kecil melalui membran. Walaupun ultrafiltrasi sedikit kurang efisien untuk menghilangkan zat terlarut, ultrafiltrasi merupakan proses yang cepat dan hasilnya dalam bentuk konsentrasi sampel protein (Brandt, 2014). Metode pemisahan dengan membran ultrafiltrasi memiliki kelebihan yaitu pengaruhnya lebih kecil terhadap denaturasi protein dibandingkan presipitasi dengan polietilen glikol ataupun salting out. Penggunaan membran ultrafiltrasi akan sangat menghemat, walaupun tidak semua protein dapat dipisahkan dengan membran ultrafiltrasi yang memiliki ukuran membran tertentu. Prinsip pemisahan dengan proses ultrafiltrasi adalah memisahkan komponen berdasarkan berat molekul. Meskipun retensi molekul merupakan fungsi dan ukuran molekul, namun terbukti berat molekul dapat digunakan sebagai pengubah yang lebih praktis, khususnya pada molekul dengan berat molekul tinggi (Bollag dan Edelstein, 1991).
37
B. Kerangka Berpikir
Indonesia memiliki perairan tropis kaya akan biodiversitas alga
Alga hijau kaya akan senyawa bioaktif
Alga hijau melimpah namun pemanfaatan kurang optimal
Tidak seperti polisakarida, Protein dari rumput laut belum dikaji secara luas
Lektin adalah protein pengikat karbohidrat yang dapat dimanfaatkan sebagai penanda karbohidrat dan memiliki bioaktivitas yang berpotensi sebagai obat
Pesisir Pantai Binuangeun, Banten memiliki keragaman biodiversitas alga hijau melimpah
Lektin alga memiliki keunggulan termostabil, stabil rentang pH luas, berat molekul rendah, mengikat molekul lebih kompleks dari monosakarida seperti oligosakarida dan glikoprotein
Belum ada penelitian purifikasi lektin Enteromorpha clathrata di Indonesia
Gambar 2.3 Kerangka Berpikir Penelitian Lektin Makroalga hijau Enteromorpha clathrata dari Pesisir Pantai Binuangeun, Banten
Perlu dikaji purifikasi parsial dan karakterisasi awal senyawa bioaktif lektin dari pesisir Pantai Binuangeun, Banten
