5
BAB II KAJIAN PUSTAKA
2.1
Tanaman Mentimun Tanaman mentimun berasal dari benua Asia, tepatnya dari Himalaya Asia
Utara (Rukmana, 1994). Saat ini, budidaya mentimum sudah meluas ke seluruh dunia, baik wilayah tropis atau subtropis. Daerah yang menjadi pusat pertanaman mentimun di Indonesia adalah Propinsi Jawa Barat, Daerah Istimewa Aceh, Bengkulu, Jawa Timur dan Jawa Tengah. Buah mentimun dibutuhkan masyarakat baik untuk pemenuhan gizi bagi tubuh, juga dibutuhkan bagi industri kosmetik dalam negeri. Buah ini mengandung mineral seperti kalsium, fosfor, kalium dan besi di samping vitamin A, B dan C. Mentimun muda dijadikan sayuran mentah atau bahan makanan yang diawetkan seperti acar. Buah mentimum dimanfaatkan untuk
perawatan
kecantikan
dan
untuk
pengobatan
tradisional
untuk
memperlancar buang air kecil dan menurunkan darah tinggi. Dewasa ini Indonesia telah mengekspor buah mentimun ke beberapa negara seperti Malaysia, Singapura, Jepang, Inggris, Perancis, dan Belanda (Samadi, 2002). Di daerah tropis, mentimun dapat ditanam di dataran rendah sampai dataran tinggi karena daya adaptasi tanaman pada berbagai iklim cukup tinggi. Di Indonesia tanaman mentimun ditanam di daerah daratan rendah dan dataran tinggi 0 sampai 1000 meter di atas permukaan laut. Untuk pertumbuhan yang optimum diperlukan iklim kering, sinar matahari yang cukup (tidak ternaungi), temperatur 21,1 sampai 26,7 0C dan tidak banyak hujan. Hampir semua jenis tanah cocok
5
6
untuk ditanami mentimun. Untuk tujuan komersil, sebaiknya lahan yang dilipih adalah lahan yang subur, gembur, banyak mengandung humus, tata air baik, tanah mudah meresapkan air, pH tanah antara 6 sampai 7. Mentimun lokal lebih cocok ditanam di dataran rendah dan biasanya merupakan tanaman yang diikutkan dalam pola pergiliran tanaman. 2.2
Squash Leaf Curl China Virus Penyebab Penyakit Daun Kuning Salah satu penyakit yang menyerang tanaman mentimun yaitu daun
keriting kuning, yang disebabkan oleh Squash leaf curl China virus merupakan virus dari genus Begomovirus famili Geminiviridae. Genus Begomovirus (Bean golden mosaic virus) memiliki genom bipartit atau monopartit, ditularkan oleh kutukebul Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera ; Aleyrodidae) secara persisten sirkulatif yang berasosiasi dengan gejala kuning, dan menginfeksi tanaman dikotil dan monokotil (Fauquet et al., 2008). Gambar 2.1 menunjukkan posisi gen dalam genom bipartit Begomovirus, dimana genom bipartit Begomovirus terdiri dari DNA A dan DNA B. Keduanya memiliki daerah intergenik (IR = Intergenic Region) yang mencakup daerah common region (CR) dengan fungsi pengaturan (regulatory function) yang terdiri dari beberapa ORF (Open Reading Frame). Pada IR/CR terdapat promotor dan urutan basanya sebagai awal terjadi transkripsi. Pada DNA A, terdapat protein selubung yang disandikan oleh Coat Protein gene (ORF AV1) berfungsi sebagai pembentuk selubung protein, penularan dengan vektor serta untuk pergerakan virus. Gen penyandi selubung protein merupakan daerah genom yang mempunyai runutan susunan DNA dengan derajat kesamaan yang tinggi (conserved) antar
7
anggota geminivirus. Oleh karena sifatnya tersebut, daerah genom tersebut banyak digunakan sebagai dasar pemilihan primer untuk mengamplifikasi DNA geminivirus. Komponen AV1 juga berperan dalam melindungi ssDNA virus dan penularan oleh vektor ketika virus masuk ke dalam sistem pencernaan serangga vektor dengan melindungi partikel virus dari degradasi (Morin et al., 2000; Astier et al., 2001; Fauquet et al., 2005). CP dan Pre CP (BV1) berperan untuk pergerakan keluar masuk genom virus dari inti sel inang (Briddon et al., 2004). Replikasi Begomovirus diatur oleh Rep gene pada ORF AC1. Adapun transkripsi Begomovirus diaktivasi oleh TrAP gene pada ORF AC2 yang merupakan protein aktivator transkripsi. Pada ORF AC3 terdapat Ren gene yang berfungsi sebagai pembentukan protein untuk penginduksi replikasi (replication enhancer). Ekspresi gejala penyakit diatur regulasinya oleh C4 pada DNA A. Pada DNA B dapat ditemukan adanya Nuclear Shuttle Protein (NSP) gene pada ORF BV1 yang berfungsi sebagai penyandi virion DNA B dan membentuk nuclear shuttle protein. Selain itu pada DNA B, terdapat Movement Protein (MP) gene (ORF BC1) yang berfungsi sebagai protein yang bertanggung jawab untuk perpindahan dari satu sel ke sel lain dalam plasmodesmata inang (Fauquet et al., 2005; Hull, 2002; Van Regenmortel et al., 2000). Genom monopartit merupakan kombinasi antara DNA A dan DNA B pada genom bipartit yang dikemas dalam satu partikel dengan fungsi yang sama (Fauquet et al., 2005; Hull, 2002).
8
Gambar 2.1 Organisasi genom DNA-A dan DNA-B Begomovirus. DNA-A memiliki enam open reading frame (ORF), yaitu AV1 (gen AR1; protein selubung, CP) dan AV2 (gen AR2; protein AV2 atau protein untuk perpindahan virus, MP) pada salah satu untai; AC1 (gen AL1; protein replikasi, Rep), AC2 (gen AL2; protein aktivator transkripsi, TrAP), AC3 (gen AL3, peningkat replikasi, REn) dan AC4 (gen AL4; protein AC4) pada untai komplementer. DNA-B mengandung dua protein pengkode ORF yang terlibat dalam perpindahan virus, yaitu BV1 (gen BR1; protein selubung inti, NSP) pada salah satu untai dan BC1 (gen BL1; protein untuk perpindahan virus, MPB) pada untai komplementer (Seal et al. 2006, Fauquet et al. 2005b). 2.3 Kloning Salah satu teknologi DNA rekombinan yang dikembangkan saat ini adalah kloning gen. Menurut Glick dan Pasternak (2003) kloning gen adalah sejumlah eksperimen yang bertujuan memindahkan DNA dari satu organism ke organism lain. Eksperimen DNA rekombinan secara umum meliputi: (1) ekstraksi DNA sisipan dari organisme donor, (2) pemotongan dan penyambungan secara enzimatis ke DNA vektor untuk membentuk molekul DNA rekombinan baru, (3) pemindahan hasil konstruksi vektor kloning-DNA sisipan ke dalam suatu sel inang dan pemeliharaan di dalam sel tersebut, dan (4) penyeleksian sel-sel inang
9
yang membawa konstruksi DNA. Prinsip dari ekstraksi DNA dalam proses kloning adalah menghancurkan dinding sel, baik secara mekanis atau enzimatis; melisis sel dengan menambahkan deterjen (seperti: SDS; membersihkan debris sel menggunakan pelarut organik fenol dan chloroform-isoamilalkohol; dan mengendapkan DNA dari lisat jernih dengan menambahkan etanol dan garam natrium (Old dan Primrose 2003). DNA sisipan dan DNA vektor dipotong menjadi fragmen linear. Pemotongan DNA merupakan kerja enzim restriksi yang bersifat spesifik sehingga menghasilkan DNA dengan potongan unik, baik berujung tumpul (bluntend)
ataupun
lancip
(sticky-end).
Bakteri
menghasilkan
enzim
yang
menghancurkan DNA fag sebelum fag ini sempat mengadakan replikasi dan mengarahkan sintesis partikel fag baru. DNA bakteri sendiri terlindung dari enzim ini, hal ini dikarenakan DNA mempunyai gugus metil tambahan yang menghalangi kerja degradatif enzim. Enzim-enzim degradatif ini disebut endonuklease restriksi dan disintesis oleh banyak spesies bakteri. Jenis-jenis enzim restriksi antara lain: Hindlll, Kpnl, Sacl, BamHl, spel, BstXl, EcoRl, EcoV,Notl, Xhol, Nsil, Xbal dan Apal (Brown, 2003; Glick dan Pasternak, 2003). Penyambungan DNA sisipan dengan DNA vektor dilakukan oleh enzim ligase. Konstruksi DNA sisipan-vektor plasmid ditransfer ke sel inang melalui proses transformasi. Prinsip transformasi adalah membuat suatu kondisi yang mempengaruhi sel hidup sehingga dapat menarik dan membiarkan molekul DNA asing masuk kedalam sel melalui membran sel dari lingkungannya (sel kompeten). Sel
10
kompeten dibuat dengan menurunkan suhu pertumbuhan sel beberapa lama, lalu memberikan kejutan panas. Kemungkinan DNA asing masuk ke dalam sel menjadi lebih besar jika pada lingkungannya terdapat ion-ion divalen Ca2+ dan Mg2+. Suatu inang yang baik hendaknya memenuhi prasyarat: pertumbuhan cepat, non patogenik, mampu menangkap molekul DNA dan stabil dalam kultur memiliki enzim yang sesuai untuk replikasi vektor rekombinan, mempunyai informasi genetik selengkap mungkin, dan mempunyai genotipe spesifik untuk efektifitas hasil kloning (Glick dan Pasternak, 2003) sistem inang E.coli umum digunakan. Galur E.coli DH5α adalah E.coli yang dimutasi pada bagian lacZ (lacZΔM15) sehingga dapat dimanfaatkan sebagai penseleksi transforman, jika galur ini ditransformasikan oleh plasmid yang membawa daerah regulator operon lac yaitu gen penyandi ß-galaktosidase dan suatu segmen pendek DNA penyadi ujung animo terminal plasmid tersebut berkombinasi dengan produk ßgalaktosidase tidak lengkap yang dihasilkan galur lacZΔM15, menghasilkan ßgalaktosidase yang fungsional. Peristiwa penggabungan potongan protein lacZ menjadi lacZ fungsional ini disebut komplementasi-α. Enzim ß-galaktosidase fungsional ini dapat diinduksi oleh IPTG (Isopropyl-Beta-d-Thiogalactopyranoside). Fenotip ini dapat diamati sebagai warna biru yang dihasilkan dari reaksi dengan substrat kromogenik X-gal (5-bromo-4chloro-3indoly-ß-D-galactoside), telah dirancang tepat pada bagian hilir lacZ suatu multiple cloning region atau multiple cloning sites (MCS), yaitu suatu daerah sempit sebagai situs penyisipan suatu fragmen DNA. Jika DNA terklon pada daerah tersebut, maka aktivitas fungsional lacZ di
11
plasmid terganggu, sehingga tidak dihasilkan ß-galaktosidase yang fungsional, akibatnya substrat tidak bereaksi menghasilkan warna biru. Prinsip seleksi koloni biru putih bermanfaat untuk membedakan transforman dengan koloni lainya (Glick dan Pasternak, 2003). Seleksi transforman hanya menggambarkan masuk tidaknya konstruksi DNA ke dalam inang. Untuk membedakan rekombinasi yaitu koloni yang membawa konstruksi DNA dengan plasmid non rekombinasi perlu dilakukan uji ekspresi klon gen pada media tertentu. Keberhasilan transformasi dipengaruhi oleh: jenis plasmid yang digunakan, suhu, jumlah dan ukuran DNA, lama perlakuan, adanya enzim nuclease pada sel inang, lama dan cara pemberiannya kejutan panas, spesifitas panas, kekuatan ion, konformasi dan konsentrasi DNA. Untuk menghindari religasi vektor plasmid maka alkalin fosfatase dapat digunakan sehingga tidak muncul transforman yang tidak mengandung insert (Glick dan Pasternak, 2003). Gambar 2.2 menunjukkan bagian situs pemotongan untuk plasmid (vektor) dari pTZ57R/T dengan beberapa enzim yang bisa digunakan untuk proses restriksi. Pada plasmid ini terdapat bagian antiampisilin dimana plasmid ini berserta gen yang telah tersisipi nanti akan tetap tumbuh pada media selektif agar (Luria Bertani) yang telah mengandung ampisilin. Plasmid ini menggunakan prosedur InsTAclone (TA cloning) dimana produk PCR (gen) yang akan disisipi sudah memiliki ujung A dan A sedangkan plasmid pTZ57R/T ini sudah terpotong berujung T dan T. Selain itu posedur ini mudah dilakukan karena bisa langsung digunakan untuk proses ligasi tidak perlu proses pemotongan plasmid (vektor).
12
Gambar 2.2 Peta plasmid (vektor) pTZ57R/T yang digunakan dalam proses ligasi. Serta situs pemotongan oleh EcoRI dan BamHI pada plasmid (Thermo Scientific, US).
2.4 Sekuensing Sekuen pengenalan atau sering disebut juga situs pengenalan merupakan sekuen DNA yang menjadi tempat menempelnya enzim restriksi dan melakukan pemotongan pada sekuen tersebut. Menurut Philips (2010) panjang sekuen pengenalan enzim restriksi berbeda-beda, seperti enzim EcoRI, SacI, dan SstI mempunyai sekuen pengenalan sepanjang 6 pasang basa, sedangkan NotI 8 pasang basa, dan Sau3AI hanya 4 pasang basa. Kebanyakan dari enzim restriksi bersifat palindromik (palindromic) yang berarti sekuen pengenalan sama jika dibaca dari 5’
3’ baik utas atas maupun utas bawah. Contohnya adalah HindIII
dengan situs pengenalan 5’-AAGCTT-3’ (utas atas)/3’-TTCGAA-5’ (utas bawah). Enzim restriksi yang berbeda dapat mempunyai situs pengenalan yang sama, contohnya: SacI dan SstI. Ezim yang mempunyai situs pengenalan yang sama
13
disebut dengan istilah isoschizomers. Dalam beberapa kasus, isoschizomers juga memotong DNA pada tempat yang sama, namun beberapa tidak demikian. Situs pengenalan pada enzim restriksi dapat pasti atau ambigu. Seperti contohnya pada BamHI, enzim ini sudah pasti memotong pada sekuen GGATCC. Sementara itu, situs pengenalan HinfI adalah GANTC. N dalam situs pemotongan HinfI berarti dapat diganti oleh basa apa saja, inilah yang dimaksud dengan situs ambigu. Contoh lainnya situs ambigu adalah XhoII. Enzim ini mempunyai situs pemotongan PuGATCPy. Pu merupakan singkatan dari purin (basa A atau G), sedangkan Py merupakan singkatan dari pirimidin (pyrimidine) (basa T atau C). Jadi XhoII dapat mengenali dan memotong sekuen AGATCT, AGATCC, GGATCT dan GGATCC. Situs pengenalan satu enzim dapat mengandung situs pengenalan enzim lainnya. Situs pengenalan BamHI mengandung situs pengenalan Sau3AI. Oleh karena itu, semua sekuen pemotongan BamHI akan dipotong oleh Sau3AI, tapi tidak sebaliknya (Philips, 2010). Panjang dari sekuen pengenalan mempengaruhi seringnya enzim restriksi memotong DNA dalam ukuran tertentu. Misalnya pada enzim yang memiliki panjang 4 basa, enzim ini diperkirakan akan memotong setiap 256 nukleotida. Perhitungan tersebut diperoleh dengan mengasumsikan setiap basa mempunyai kemungkinan yang sama untuk muncul, yaitu sebesar 1/4 (kemungkinan muncul 1 dari 4 basa). Jadi jika sekuen pengenalan mempunyai panjang 6 basa, maka perhitungannya menjadi: (1/4)6 = 1/4096. Perhitungan ini hanya sebagai perkiraan, pada kenyataannya belum tentu demikian. Beberapa sekuen bisa jadi lebih sering atau lebih jarang ditemui dalam suatu organisme. Seperti pada
14
mamalia, sekuen CG sangat jarang ditemui sehingga enzim HpaII yang mempunyai sekuen pengenalan CCGG akan lebih jarang memotong pada DNA mamalia. Enzim restriksi yang mempunyai sekuen pengenalan yang pendek akan menghasilkan banyak potongan DNA; sedangkan jika mempunyai sekuen pengenalan yang panjang, akan dihasilkan potongan DNA yang lebih sedikit. Baik enzim yang mempunyai sekuen pemotongan pendek maupun panjang, mempunyai fungsi masing-masing dalam rekayasa genetika (Philips, 2010).
