BAB I PENDAHULUAN. yang mempengaruhi proses pencernaan dan absorpsi nutrisi. Prosesnya

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Saluran pencernaan memiliki berbagai mikroorganisme hidup alami yang mempengaruhi proses pencernaan dan absorpsi nutrisi. Prosesnya berbeda pada setiap individu, dipengaruhi oleh ekologi mikrobia dalam saluran pencernaan. Faktor yang mempengaruhi ekologi mikrobia dalam saluran pencernaan menurut Snydman (2008) adalah jenis dan pola makan, stress, adanya penyakit, pasca operasi, dan dalam keadaan pengobatan antibiotik. Perlu penambahan mikrobia menguntungkan untuk mendapatkan ekologi mikrobia yang sehat melalui suplementasi sel bakteri probiotik sebanyak 1091010 CFU sel hidup setiap harinya (Hemaiswara et al., 2013). Probiotik merupakan mikroorganisme hidup, tidak bersifat patogen, memberikan pengaruh kesehatan dan menguntungkan bagi inangnya apabila dikonsumsi dalam jumlah yang cukup sebagai bagian dari makanan (FAO/WHO, 2001; FAO/WHO, 2002). Pengaruh kesehatan probiotik pada saluran pencernaan secara langsung dan tidak langsung melalui peningkatan fungsi permukaan mukosa dengan memodulasi sistem imun, menghasilkan senyawa antimikrobia seperti asam organik dan bakteriocin untuk menghambat pertumbuhan bakteri patogen, memelihara mikroflora alami dalam saluran pencernaan, meningkatkan pencernaan dan absorpsi nutrisi. Probiotik paling banyak berasal dari kelompok bakteri asam laktat (BAL) seperti Lactobacillus spp, tetapi beberapa juga berasal dari kelompok

1

Bifidobacterium, Saccharomyces, Streptococcus, dan Lactococcus, namun beberapa spesies Lactobacillus dan Bifidobacterium bukan mikroflora alami saluran pencernaan, untuk dapat digunakan secara efektif sebagai probiotik strain tersebut harus memiliki kemampuan beradaptasi dari kondisi saluran pencernaan yang kompleks seperti kemampuan bertahan dari kondisi asam lambung, garam empedu saluran pencernaan, dan bertahan dari serangan patogen (Emmawati, 2014; Rahayu et al., 2015). Probiotik kelompok BAL memiliki kemampuan menfermentasikan karbohidrat menjadi asam laktat dan komponen lainnya seperti etanol, diasetil, asetaldehid, dan hidrogen peroksida (Chowdhury et al, 2012), sehingga dapat dimanfaatkan sebagai kultur starter. Meningkatnya kepedulian konsumen terhadap makanan dan kesehatan menyebabkan BAL banyak dikembangkan dalam industri fermentasi makanan tradisional (Zhou et al., 2000). Fermentasi makanan traditional tersebut awalnya diproduksi secara inokulasi spontan dengan tujuan menghasilkan flavor dan memperpanjang umur simpan. Strain lokal probiotik banyak diisolasi dari hasil fermentasi makanan tradisional yang mengandung karbohidrat komplek seperti dadih (L. plantarum Dad-13), tempoyak (L. fermentum), gatot (L. plantarum Mut-7), growol (L. rhamnosus), dan tape singkong (L. plantarum) yang didominasi oleh isolat L. plantarum (Rahayu, 2003). Salah satu strain lokal Lactobacillus plantarum dengan kode strain Mut-7 berhasil diisolasi dari fermentasi makanan tradisional Gatot, terbuat dari fermentasi singkong diidentifikasi oleh Rahayu (2003) sebagai BAL indigenous. Sejak diisolasi dan diidentifikasi sebagai L. plantarum Mut-7,

2

strain lokal ini banyak diaplikasikan dalam pangan fungsional dan memiliki manfaat bagi kesehatan seperti diaplikasikan dalam jus nanas-pepaya dapat menurunkan kolesterol dengan viabilitas sel hidup 109CFU menjadi 108CFU setelah disimpan selama 3 bulan dan dapat bertahan pada kondisi asam (Lestari et al., 2003). L. plantarum Mut-7 dalam penelitian Sariri dkk. (2012), memiliki kemampuan sebagai kultur starter fermentasi tamarin pada daun, buah dan kulit untuk menurunkan kandungan saponin yang diikuti dengan peningkatan nutrisi terutama protein kasarnya. Seiring dengan barmunculan pemanfaatan L. plantarum Mut-7, kemampuannya sebagai kultur starter, dan kriteria probiotik yang dimiliki, perlu dilakukan evaluasi keamanan untuk dapat dinyatakan aman apabila digunakan dalam industri pangan secara luas. Meskipun Lactobasillus spp telah mendapatkan status GRAS (generally recognized as safe) (Gharaei dan Eslamifar, 2011), namun bakteri bersifat spesifik antara strain satu dengan yang lainnya berbeda (Kemgang et al., 2014). Rahayu et al. (2011), Rahayu et al. (2015), Lestari et al. (2008), Emmawati (2014) melakukan pengujian potensi probiotik indigenous secara in vitro, diketahui bahwa L. plantarum Mut-7 memiliki aktivitas antimikrobia dengan menghambat E. coli, S. dysenteriae, S. choleraecius dan Shigella flexneri, tahan terhadap asam lambung dan garam empedu, memiliki profil genetic yang berbeda dengan kelompok plantarum lainnya. . Evaluasi keamanan strain probiotik pada awalnya dilakukan isolasi dan identifikasi, dilakukan pengujian potensi probiotik secara in vitro, setelah didapat status sebagai kandidat probiotik, kemudian dilakukan evaluasi secara

3

in vivo. Evaluasi keamanan strain bakteri probiotik secara in vivo dilakukan dengan model hewan coba untuk mengetahui apakah bakteri tersebut berpotensi menyebabkan infeksi sistemik (Sanders et al., 2010), transfer antibiotik resisten dalam saluran pencernaan, bakteremia dan potensi endokarditis. Teori resiko probiotik tersebut belum terbukti (Zhou et al., 2000; Frias et al., 2009; Bernadeau et al., 2008; Canon et al., 2005) Analisa keamanan strain probiotik Lactobacillus plantarum Mut-7 menggunakan tikus Sprague Dawley sebagai model hewan coba dengan dosis yang diberikan sebesar 1011CFU/tikus selama 28 hari dilakukan pada penelitian ini. Dosis yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan jumlah probiotik dalam produk pangan (107-109 CFU/ml) diberikan sebagai alternatif cara untuk mengetahui efek konsumsi jangka panjang strain potensi probiotik tersebut. Evaluasi keamanan pada penelitian ini dilakukan berdasarkan pada modifikasi penelitian Athennia et al. (2015) dengan mengamati kemampuan probiotik strain, adanya perubahan fisiologis seperti perubahan kondisi fisik secara umum, perubahan berat organ, kadar hematologi, kadar SGOT dan SGPT, morfologi saluran cerna, dan analisa bakteri pada darah, paru, jantung, limpa, liver, dan ginjal.

1.2 Perumusan Masalah Apakah pemberian Lactobacillus plantarum Mut-7 dosis tinggi (1011CFU/ekor tikus) selama 28 hari secara oral menyebabkan masalah kesehatan pada tikus Sprague Dawley?

4

2.1 Tujuan Penelitian 2.1.1

Tujuan umum Mendapatkan informasi keamanan konsumsi jangka panjang strain L.

plantarum Mut-7 sebagai probiotik

2.1.2

Tujuan khusus Mengetahui pengaruh pemberian strain Lactobacillus plantarum Mut-7

dosis tinggi (1011CFU/ekor tikus) selama 28 hari terhadap: a. Kondisi fisiologis secara umum hewan coba (berat badan dan konsumsi pakan). b. Indeks berat organ (liver, limpa, paru, jantung, dan ginjal). c. Akitivitas hematologi dan marker biokimia (SGOT dan SGPT). d. Morfologi saluran cerna baik kuantitatif ataupun kualitatif. e. Kejadian translokasi bakteri pada organ (liver, limpa, paru, jantung, dan ginjal) dan darah.

2.2 Manfaat penelitian Sebagai salah satu kajian keamanan potensi probiotik L. plantarum Mut7 sehingga nantinya bakteri ini dapat digunakan secara luas dalam produk pangan.

5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Probiotik Pengertian probiotik menurut FAO dan WHO dalam konferensi tahun 2001 dan 2002 didefinisikan sebagai mikroorganisme hidup yang memiliki manfaat kesehatan bagi inangnya apabila dikonsumsi dalam jumlah yang cukup (Anonim, 2002). Probiotik ditambahkan dalam makanan sebagai food supplement sehingga memberikan manfaat menguntungkan, tidak bersifat patogen, stabil dalam produk ketika disimpan dan mengandung sejumlah sel yang cukup apabila dikonsumsi sebanyak 109-1010 CFU sel hidup (Hemaiswarya et al., 2013). Probiotik dapat memberikan pengaruh kesehatan (Collado et al., 2009) dengan cara menjaga keseimbangan dan meningkatkan mikroflora saluran pencernaan inangnya melalui produksi beberapa asam organik dan bakteriosin dari hasil aktivitas metabolik (Fuller, 1989). Sel hidup probiotik akan berkompetisi dengan bakteri patogen, menyebabkan perbaikan daya cerna dan daya serap nutrisi disaluran pencernaan. Mikroorganisme untuk dapat digunakan secara efektif sebagai probiotik berasal dari mikroflora asli saluran pencernaan sehingga mampu bertahan melewati saluran pencernaan yang kompleks, namun beberapa dari spesies Lactobacillus dan Biffidobacterium bukan mikrofora saluran pencernaan, untuk itu probiotik harus memiliki kemampuan bertahan dari kondisi asam lambung, garam empedu saluran pencernaan, dan bertahan dari serangan patogen (Rahayu et al., 2015).

6

Keseimbangan mikrobia saluran pencernaan penting diperhatikan, masalah kesehatan yang disebabkan oleh bakteri patogen seperti kembung, diare, konstipasi, dan anorexia akibat asupan yang tak terjaga higienitasnya sering terjadi. Peran probiotik penting dalam menjaga dan mendominasi mikrobia saluran pencernaan untuk mendapatkan fungsi kesehatan bagi tubuh. Manfaat probiotik bagi kesehatan tubuh dapat melalui mekanisme fungsi menurut Jean et al. (2003): 1) fungsi protektif, yaitu kemampuannya untuk menghambat patogen dalam saluran pencernaan sehingga meningkatkan daya cerna dan daya serap nutrisi. Terbentuknya kolonisasi probiotik dalam saluran pencernaan, mengakibatkan kompetisi lokasi adhesi (penempelan) antara probiotik dan bakteri lain, khususnya patogen. 2) fungsi sistem imun tubuh, melalui kemampuan probiotik untuk menginduksi pembentukan IgA, aktivasi makrofag, modulasi profil sitokin, serta menginduksi hyporesponsiveness terhadap antigen yang berasal dari pangan. 3) fungsi produksi agen antimikrobia yaitu metabolit yang dihasilkan oleh probiotik, termasuk kemampuan probiotik mendegradasi laktosa di dalam produk susu terfermentasi sehingga dapat dimanfaatkan oleh penderita lactose intolerance. Pertumbuhan probiotik juga akan menghasilkan berbagai komponen antimikrobia (asam organik, hidrogen peroksida, dan bakteriosin) yang mampu melakuakan adhesi, berkolonisasi, menekan pertumbuhan patogen (Collado et al., 2009) dengan cara menghasilkan asam organik dan bakteriosin (Dixit et al., 2013).

7

Tempat berkolonisasi bakteri probiotik sama dengan tempat pelekatan bakteri patogen terutama spesies Enterobactericeae, sehingga terjadi kompetisi di sel epitel usus (Mangell et al., 2002). Probiotik mencegah perluasan bakteri patogen didalam sel dengan memperkuat lapisan mukosa usus (Hemaiswarya et al., 2013), melepaskan produk metabolit saluran pencernaan yang bersifat protektif (arginine, glutamin, asam lemak rantai pendek, dan asam linoleat konjugasi), memproduksi senyawa antimikrobia seperti bakteriosin, asam oeganik, dan H2O2. Probiotik memiliki manfaat meningkatkan pencernaan dan adsorpsi nutrisi. Saluran cerna sangat penting bagi kesehatan tubuh. Fungsi utama saluran cerna adalah mencerna dan mengabsorbsi nutrisi agar kebutuhan tubuh dapat terpenuhi sehingga pada saluran cerna yang sehat, mukosa usus mampu mengabsorbsi mikronutrien dengan baik (Hemaiswarya et al., 2013). Probiotik mampu memperkuat lapisan mukosa dengan memicu produksi sitokin anti inflamasi (Kanra et al., 2006). Keberlangsungan hidup bakteri probiotik selama pengolahan, penyimpanan, dan didalam saluran pencernaan dipengaruhi oleh berbagai faktor, diantaranya ketersediaan oksigen, pH, aktivitas air (aW) dan temperatur. Untuk memberikan efek probiotik, strain bakteri harus dapat tahan terhadap mekanisme peristalsis usus pada sistem gastrointestinal. Probiotik mampu memperbaiki struktur vili dengan menstimulasi sistem imun melalui interaksi sel intestinal dan GALT (saluran pencernaan yang terhubung dengan jaringan lymphoid). Manfaat tersebut dipengaruhi oleh kemampuan pada setiap strain yang berbeda-beda. Salah satunya adalah

8

mekanisme sel melakukan adhesi, mempengaruhi kemampuan probiotik dalam menjaga keseimbangan

mikroflora

saluran pencernaan dan

mempengaruhi manfaat probiotik. Adhesi sel pada mukosa usus mencegah sel probiotik keluar secara langsung dari saluran pencernaan, memungkinkan kolonisasi sementara, dan memodulasi kekebalan tubuh (owehand et al., 2002). Adhesi sel melibatkan kontak antar sel bakteri, lapisan mukosa, dan penempelan pada sel epitel yang dipengaruhi oleh faktor pH, garam empedu, enzim pencernaan, adanya lignin, dan adanya strain probiotik lainnya. Kekuatan probiotik melakukan adhesi dan berkolonisasi didalam saluran pencernaan mempengaruhi sistem imun saluran pencernaan baik sistem imun adaptif maupun alami. Mekanisme probiotik dalam memodulasi sistem imun dapat dilihat pada Gambar 3.1.

Gambar 3.1 Mekanisme imunomodulasi probiotik (Galdeano et al., 2007) Keterangan: Interaksi probiotik dengan (1) sel epitel (E) atau sel M (M) atau sel-sel dendritik (DC) (2) pelepasan IL-6 oleh sel epitel, makrofag (MQ) dan sel dendritik (3) sel mast (MAC) menghasilkan sitokin IL-4 (4) IL-6 klonal IgA (5). Sel-sel Th1 memproduksi IFNγ, TNF dan IL-2, membunuh virus dan tumor.

9

Mekanisme probiotik dalam memodulasi sistem imun menurut Galdeano et al. (2007) diawali dengan interaksi probiotik dengan sel epitel atau sel M atau sel dendritik, menstimulasi pelepasan IL-6 oleh sel epitel, makrofag, dan sel dendritik untuk memproduksi TNF α dan IFN γ. Sel mast mensstimulasi terbentuknya cytokine IL4, bersama IL-6, dan TGF-β menginduksi T-regulatory (T-red) melakukan perubahan IgM menjadi IgA pada permukaan β-lymphosit. Terjadi peningkatan produksi anti body IgM, dan IgG dan mereduksi sekresi IgE. Sel Th 1 memproduksi pro inflammatory cytokine (IL2, TNF α dan IFNγ) menstimulasi proses fagositosis sehingga mikrobia patogen berkurang, menginduksi makrofag dan cytokin lymphosit T untuk membunuh virus dan tumor. Probiotik memiliki kemampuan lebih dalam modulasi sel dendriti dan Tred daripada respon T helper sedangkan kemampuan probiotik dalam meningkatkan aktivitas fagositosis sangat tergantung pada sifat strain bakteri, seperti pada penelitian Zhu et al. (2011) pada pemberian bakteri probiotik Bifidobacterium adolescentis BBNN23, B. longum BBMN68, dan Lactobacillus saliva Ren dapat meningkatkan aktivitas makrofag yang ditandai dengan peningkatan aktivitas fagositosis dan produksi nitrit oksida (NO), IL-6, dan TNF-α. 2.2 Potensi Lactobacillus dan Lactobacillus plantarum sebagai Probiotik Lactobacillus merupakan spesies BAL gram positif, anaerob, memiliki spora, tidak motil, uji katalase negatif, berukuran 2-5 mm, tidak berpigmen berbentuk batang. Suhu pertumbuhan optimum Lactobacillus 3040OC pada pH 5.5-6.6 dan menghasilkan asam laktat sebagai hasil

10

metabolisme glukosa (Versalovic, 2008). Lactobacillus diaplikasikan pada produksi fermentasi makanan dan minuman, memiliki kemampuan untuk menghambat bakteri patogen dan pembusuk dengan cara menghasilkan zat antimikroba (bakteriosin, asam organik) (Dixit et al., 2013). Banyak terdapat pada makanan hasil pasteurisasi seperti susu dan sayuran. Manfaat kesehatan Lactobacillus sebagai probiotik salah satunya adalah mencegah peningkatan berat badan yang berlebih pada kelompok probiotik apabila dibandingkan dengan kontrol, menunjukan bahwa pemberian probiotik dapat mencegah terjadinya obesitas pada beberapa strain Lactobacillus dengan mekanisme kontrol obesitas pada setiap strain berbeda (Dias et al., 2016). Beberapa kasus pada tikus yang diberi pakan tinggi lemak, penelitian Kim et al. (2013) menunjukan bahwa konsumsi L. rhamnosus GG 108CFU/tikus/hari memberikan pengaruh terhadap penurunan berat badan dibandingkan dengan kontrol sedangkan penelitian Kang et al. (2013) menunjukan bahwa konsumsi L. gisseri BNR17 109-10CFU/tikus/hari efektif dalam mencegah peningkatan berat badan tikus. Perkembangan produk makanan fermentasi dimasyarakat semakin menjadi perhatian karena masyarakat mulai peduli dengan apa yang dimakan dan manfaatnya bagi kesehatan tubuh (Zhou et al., 2000). Tujuan awal dari produk makanan fermentasi tradisional untuk menghasilkan flavor khusus dan memperpanjang umur simpan produk, karena proses fermentasi dilakukan secara spontan. Rahayu (2003) mengembangkan potensi isolat lokal dengan melakukan isolasi strain pada makanan fermentasi di Indonesia seperti asinan,

11

tempe, growol, gatot, madai, dan dadih, bakteri asam laktat yang tumbuh didominasi oleh L. plantarum dan L. pentosus. Salah satu strain Lactobacillus yang diisolasi dari makanan fermentasi, Lactobacillus plantarum Mut7 merupakan isolat lokal yang diisolasi dari Gatot terbuat dari hasil fermentasi tradisional singkong. Memiliki karakteristik yang mirip dengan spesies plantarum lainnya, merupakan bakteri gram positif, berbentuk batang, tidak berspora, katalase negatif, anaerob fakultatif, menfermentasikan glukosa pada kondisi standar, dapat tumbuh pada suhu tertentu, bertahan pada kondisi garam, asam, dan basa (Rahayu, 2003). Isolasi dan diidentifikasi L. plantarum Mut-7 menyebabkan strain lokal ini banyak diaplikasikan dalam pangan fungsional dan memiliki manfaat bagi kesehatan seperti diaplikasikan dalam jus nanas-pepaya dapat menurunkan kolesterol dengan viabilitas sel hidup 109CFU menjadi 108CFU setelah disimpan selama 3 bulan hanya mengalami penurunan jumlah mikroba sebanyak 1log0 dan dapat bertahan pada kondisi asam (Lestari et al., 2003). L. plantarum Mut-7 dalam penelitian Sariri dkk. (2012), memiliki kemampuan sebagangai kultur starter fermentasi tamarin pada daun, buah dan kulit untuk menurunkan kandungan saponin yang diikuti dengan peningkatan nutrisi terutama protein kasarnya. Mut-7 juga memiliki kemampuan bertahan pada garam empedu dan menghambat bakteri patogen (Salmonella choleraecius dan Shigella flexneri) (Lestari et al., 2008; Emmawati, 2014) Seiring dengan barmunculn pemanfaatan L. plantarum Mut-7, kemampuannya sebagai kultur starter, dan kriteria probiotik yang dimiliki, perlu dilakukan evaluasi keamanan untuk dapat dinyatakan aman apabila

12

digunakan dalam industri pangan secara luas. Meskipun Lactobasillus spp telah mendapatkan status GRAS (generally recognized as safe) (Gharaei dan Eslamifar, 2011), namun bakteri bersifat spesifik antara strain satu dengan yang lainnya berbeda (Kemgang et al., 2014). L. plantarum Mut-7 juda dapat meningkatkan produksi IgM sejalan dengan sel HB4C5 yang merupakan hasil difusi dari limfosit B manusia dari pasien kanker paru-paru (Lestari et al., 2010), selian itu L. plantarum Mut-7 juga memiliki efek imunomodulator yang dapat digunakan sebagai sumber kultur starter pada produk yogurt sinbiotik ubi jalar (Lestari et al., 2013). Strain probiotik didapatkan melalui serangkaian prosedur pengujian probiotik oleh WHO dan FAO. Strain baru potensi probiotik L. plantarum Mut-7 telah dilakukan pengujian secara in vitro terhadap sifat probiotik yang dimilikinya, sehingga perlu dilanjutkan hingga tahap selanjutnya yaitu penggunaannya secara in vivo pada hewan coba.

2.3 Keamanan Probiotik Keamanan strain kandidat probiotik menjadi perhatian khusus karena kesadaran konsumen akan makanan dan kesehatan. Hal tersebut yang menyebablan berkembangnya penelitian dibidang probiotik dan ditemukannya strain-strain baru dalam makanan fermentasi tradisional, sehingga probiotik banyak diaplikasikan dalam industri pangan seperti aplikasinya pada susu dengan strain probiotik yang sudah mendapat status aman. Strain probiotik memiliki target kesehatan yang spesifik dan dipengaruhi oleh jenis strain. Pengaruhnya terhadap kesehatan berbeda antara strain yang satu dengan strain yang lainnya (Gharaei dan Eslamifar, 2011). Perlu diperhatikan mekanisme

13

interaksi antara tubuh dengan mikrobia, terutama didalam saluran pencernaan. Interaksi tersebut adalah interaksi antara mikrobia dengan sel epitel, mikrobia dengan sistem imun, dan mikrobia dengan mikrobia. Interaksi antara mikrobia dengan sel epitel melibatkan adhesi mukosa sehingga menyebabkan peningkatan mucins, fungsi lapisan sel epitel, dan motilitas usus. Interaksi antara sistem imun dengan mikrobia berkaitan dengan mekanisme sel darah putih dan kelenjar getah bening dalam mempertahankan kekebalan tubuh. Interaksi antara mikrobia dengan mikrobia adalah menghambat patogen dengan sekresi zat anti mikrobia. Keamanan probiotik perlu dievaluasi, khususnya keamanan strain

baru bkarena bakteri bersifat spesifik pada

masing-masing strain. Menurut Marteau (2002) dan Snydman (2008) terdapat beberapa teori resiko merugikan probiotik pada manusia seperti adanya infeksi sistemik, hilangnya aktivitas metabolit tertentu dan terjadinya stimulasi imun berlebih, potensi transfer antibiotik resisten dalam saluran pencernaan. Infeksi sistemik merupakan awal dari terjadinya translokasi, menyebabkan terganggunya fungsi fisiologi karena hilangnya aktivitas metabolit tertentu. Menurut beberapa penelitian teori resiko merugikan probiotik tersebut tidak sepenuhnya benar, probiotik tidak memiliki kemampuan untuk bertranslokasi ataupun bermigrasi. Beberapa penelitian evaluasi keamanan probiotik menggunakan hewan coba pada penelitian Zhou et al. (2000) terdeteksi adanya bakteri pada kontrol sebanyak 1 dari 6 sampel di kelenjar getah bening dan liver; kelompok pemberian L. rhamnosus HN001 terdeteksi sebanyak 5 dari 18 sampel dikelenjar getah bening; kelompok pemberian L.

14

acidophilus HN017 terdeteksi

1 dari 18 sampel di ginjal; kelompok

pemberian L. achidopilus LA-1 dari 18 sampel terdeteksi 3 kelenjar getah bening, 1 limpa, 2 liver, 2 ginjal; kelompok pemberian Bifidobacterium lactis HN019. Setelah diidentifikasi dengan metode molekuler RAPD Finger Printing bahwa bakteri yang terdeteksi pada sampel berbeda polanya dengan perlakuan. Hal yang sama juga terjadi terjadi pada penelitian Athenia et al. (2015), terdeteksi adanya koloni bakteri yang tumbuh di sampel organ (ginjal, limfa, dan liver) dan darah baik pada kontrol dan pemberian probiotik. Setelah diverifikasi strain bakteri tersebut melalui deteksi molekuler oleh Rusdan et al. (2015) diketahui bahwa bakteri tersebut bukan strain L. plantarum Dad-13. Mereka menyatakan bahwa infeksi tersebut bukan dari strain probiotik yang sengaja ditambahkan namun dari mikroflora alami yang sudah ada di saluran pencernaan, dengan mekanisme invasi mikrobia saluran pencernaan ke dalam organ belum diketahuai secara pasti. Hasil yang berbeda terjadi pada penelitian Frias et al. (2009) menggunakan strain probiotik L. rhamnosus dengan strain T-21162, T-4846, PRSF-L42, dan T-31583 dengan sengaja hewan uji dikondisikan dlm keadaan normal dan radang usus besar, hasil yang didapatkan bahwa semua kelompok perlakuan dan kontrol terdeteksi adanya koloni bakteri yang tumbuh, namun pada tikus sehat masing-masing pemberian probiotik lebih banyak dibandingkan dengan dalam keadaan radang usus besar, dan pada kelompok kontrol jumlah koloninya lebih banyak bila dibandingkan dengan tikus sehat. Hal tersebut berkaitan dengan sistem imun yang meningkat pada tikus yang mengalami radang usus besar dan bakteri yang ada telah lebih dahulu

15

berkompetisi dengan sistem imun dan probiotik. Selain itu hal tersebut dapat terjadi dan dimungkinkan bahwa bakteri telah bermigrasi kedalam jaringan yang lainnya. Belum dapat strain dipastikan strain bakteri yang terdeteksi mengingat penelitian tidak dilanjutkan ke tahap identifikasi molekuler. Respon adanya infeksi oleh bakteri, virus, dan jamur pertama kali ditandai dengan berkembangnya respon fase akut (APR) yang disebabkan oleh produk metabolit mikrobia dan produksi sitokin yang mempengaruhi nafsu makan (Kanra et al. 2006),. Hal ini dapat dideteksi melalui berat badan hewan coba, penurunan berat badan mungkin disebabkan oleh adanya infeksi namun di penelitian Athenia et al. (2015) tidak terjadi penurunan berat badan sehingga dimungkinkan tidak terjadi infeksi. Terjadinya infeksi hingga menyebabkan bakterimia dan septicemia disebabkan karena ketika mengkonsumsi probiotik sedang dalam perawatan dan terjangkit penyakit sehingga imun tubuh melemah dan bakteri saluran pencernaan dapat melakukan migrasi melalui mukosa saluran pencernaan, hal tersebut yang terjadi pada infeksi Bacillus yang berhubungan dengan konsumsi probiotik (Spinosa et al., 2000) Respon fase akut yang terjadi meliputi respon metabolik (panas, adipsia,

gastroparesis,

metabolisme

lipid),

respon

imun

(leukosit,

hematopoiesis, produksi sitokin, dan sintesis protein), respon tingkah laku (anorexia, insomnia), respon endokrin (hiperinsulin, hipoglikemia). Sel darah putih, limfosit, dan neutrofil berperan dalam sistem imun di lapisan pertahanan submukosa saluran pencernaan yang menghalangi terjadinya infeksi bakteri hingga terjadi translokasi melalui sistem sekresi tipe 3 melalui sel M dalam lapisan sel epitel melewati patch peyer hingga kelenjar getah bening dan aliran

16

darah (Kemgag et al., 2016). Melalui aliran darah inilah bakteri bertranslokasi kedalam liver, ginjal, limpa, jantung, dan paru-paru. Potensi transfer antibiotik resisten melalui transfer gen oleh probiotik dikhawatirkan dapat menggagalkan pengobatan antibiotik terhadap bakteri patogen (Snydman, 2008). Namun belum ada penelitian terkait dengan mekanisme tersebut dalam saluran pencernaan manusia. Sejauh ini Bernadeau et al. (2008) melakukan penelitian terhadap beberapa makanan yang mengaandung bakteri probiotik dan plasmid gen resisten antibiotic namun belum bisa dipastikan penyebabnya.

2.4 Uji Keamanan Bakteri Probiotik Uji keamanan bakteri probiotik bertujuan untuk mendapatkan status aman strain baru kandidat probiotk sehingga dapat digunakan sebagai probiotik dalam pangan fungsional. Pengujian keamanan probiotik sudah dilakukan oleh beberapa peneliti sebelum regulasi status probiotik dikeluarkan untuk diaplikasin pada produk pangan. Hal tersebut seperti yang dilakukan oleh Norin et al. (1991), pengujian kemampuan spesies Lactobacillus acidophilus A10 dan Bifidobacterium bifidum B11 dan pengaruhnya terhadap karakteristik mikroflora saluran pencernaan. Berkembangnya penelitian tetntang probiotik dan ditemukannya berbagai strain dari hasil proses fermentasi yang kemudian banyak digunakan sebagai kultur starter produk pangan fungsional membuat WHO/FAO (2002) mengatur prosedur uji keamanan yang harus dilakukan untuk mendapatkan status probiotik. Persyaratan minimum yang harus dilakukan untuk mendapatkan status probiotik setelah didapatkan strain probiotik harus melalui tahapan 1)

17

identifikasi strain meliputi gen, spesies dan strain; 2) karakterisasi fungsi kesehatan dari probiotik baik secara in vitro ataupun in vivo dengan hewan uji; 3) pengujian keamanan secara in vivo dengan hewan uji dan studi pada manusia; 4) pengujian keberhasilan terhadap studi pada manusia; 5) pengujian efektivitas terhadap manusia dengan kondisi tertentu. Prosedur evaluasi probiotik untuk dapat digunakan pada produk pangan sifatnya luas karena berhubungan dengan mikroorganisme hidup yang dapat berinteriaksi dengan inangnya terutama pada tahap evaluasi keamanan. Banyak pertanyaan bermunculan terkait dengan metode pengujian dan cara pengujian yang harus dilakukan pada hewan coba seperti model hewan coba yang digunakan, rekomendasi dosis, dan parameter apa saja yang harus dilakukan untuk membuktikan bahwa strain kandidat probiotik aman. WHO/ FAO (2002) menfokuskan pada keamanan dari mekanisme probiotik dan teori tentang kemungkinan adanya efek samping dari konsumsi probiotik oleh Marteau (2002) yaitu terjadinya infeksi sistemik, hilangnya aktivitas metabolit, menstimulasi imun berlebih, dan adanya transfer gen. WHO/ FAO (2002) mungkin memiliki pertimbangan tersenderi terkait teori tersebut penting digunakan untuk evaluasi keamanan strain probiotik. Sub-bab sebelumnya telah banyak membahas kelemahan teori tersebut, Marteau (2002) sendiri mengungkapkan teori tersebut tidak sepenuhnya benar, banyak faktor terkait dengan keadaan inangya dan belum ada bukti bahwa strain probiotik dapat menyebabkan terjadinya resiko seperti yang dijelskan tersebut pada sub bab sebelumnya..

18

Pengujian keamanan probiotik pada produk pangan dapat dilakukan melalui pendekatan terhadap sifat intrinsik dari strain probiotik yang akan diuji dan interaksi bakteri probiotik dengan inangnya. Sifat intrinsik dari strain probiotik dapat dideteksi melalui enzim yang dihasilkan sebagai tanda adanya aktivitas metabolik pada mukosa saluran pencernaan dan ada tidaknya degradasi mukosa melalui sekresi berlebih imun dan morfologi pada saluran cerna. Pendekatan sifat intrinsik inilah yang dilakukan pada penelitian Steppe et al. (2014) terhadap pengujian potensi probiotik Butyricicoccus pullicaecorum memproduksi butirat yang dimungkinkan dapat berpengaruh pada fungsi sel epitel dan sistem imun sehingga analisa yang dilakukan meliputi morfologi saluran cerna, hematologi terutama pengaruh leukosit, dan enzim alanine aminotransferase dan aspartate aminotransferase penting untuk dideteksi. Mountzouris et al. (2009) melakukan analisa aktivitas yang akan mengalami perubahan akibat dari aktivitas metabolik probiotik L. achidophilus dan perubahan asupan nutrisi enzim seperti α/β-galactosidase, α/β-glucosidase, dan β-glucuronidase. Pendekatan yanga kedua adalah melalui interaksi bakteri probiotik dengan inangnya, banyak dilakukan pada penelitian pengujian keamanan probiotik. Penentuan sifat strain bakteri secara invitro yang akan digunakan sebagai kandidat probiotik penting dilakukan untuk kemudian dilanjutkan dengan pemberian sel bakteri yang ingin diketahui pengaruhnya dengan dosis tinggi 1ml yang mengandung 1.5 x 1010 CFU/hari (Frias et al., 2009) atau 1x 109CFU/ml (Steppe et al., 2014) terhadap hewan coba. Beberapa penelitian menggunakan lebih dari satu dosis misalnya 5x107, 1x109, 5x1010 CFU/hari

19

terhadap tiga kelompok hewan coba (Zhou et al., 2000). FDA dalam redbook chapter IV dan prosedur OECD (badan yang mengatur perdagangan asiapasifik) telah mengatur tentang pemberian dosis untuk uji toksisitas acute secara oral yaitu minimum 5 ml/kg berat badan hewan coba minimal pemberian selama 14 hari, setara dengan 1 ml/200g berat hewan coba, namun dosis tersebut dosis absolut tidak bisa diterapkan apabila pengujian menggunakan sel mikroorganisme, untuk itu pada penelitian Steppe et al. (2014) menggunakan prosedur OECD namun pemberian setiap ekor hewan cobanya 1 ml dengan konsentrasi 1 ml 109 CFU kemudian dikonversikan ke dalam tabel konversi perhitungan dosis untuk manusia dengan berat 70 kg. Keadaan hewan coba pada pendekatan Interaksi bakteri probiotik dengan inangnya untuk digunakan pada produk pangan, pengujian keamanan probiotik menggunakan hewan coba dalam keadaan normal/ sehat, namun memang beberapa pengujian klinis ingin mengetahui pengaruh probiotik yang ditambahkan terhadap hewan coba yang diberikan perlakuan khusus. Kim et al. (2013) dengan sengaja memberikan pakan dengan kadar lemak berlebih, Frias et al. (2009) menggunakan tikus normal dan mengalami radang usus besar dengan diinduksi DSS (Dextran Sulfate Sodium) 5% , untuk kemudian dilihat pengaruhnya apakah translokasi disebabkan oleh probiotik yang ditambahkan. Evaluasi dilakukan setelah pemberian probiotik yang diuji pada periode waktu tertentu. Pemberian strain bakteri dalam dosis tinggi pada jangka waktu tertentu menggunakan model hewan coba dilakukan untuk

20

melihat potensi efek samping yang dapat diberikan oleh strain bakteri baru. Potensi tersebut dievaluasi dengan mengamati beberapa parameter seperti : a. Kondisi kesehatan secara umum Kondisi kesehatan secara umum dapat dilihat dari kondisi fisik dan penyimpangan yang terjadi pada hewan coba (penampilan umum, perilaku, postur, dan mobilitas (Hubler et al., 2005)). Pengamatan juga dapat dilakukan melalui kondisi pakan, perubahan konsistensi tinja (Mountzouris et al., 2009), dan berat badan hewan coba. b. Indeks berat organ dan berat badan Indikator terjadinya inflamasi ataupun infeksi lokal pada organ dengan mengetahui indeks berat organ dan berat badan. Namun analisa ini dapat digunakan jika sampel yang digunakan memiliki jenis kelamin yang sama (Sander et al., 2010). Pengamatan berat organ telah dilakukan pada uji keamanan berbagai strain Lactobacillus baru seperti Lactobacillus paracasei GW080 (Jia et al., 2011). c. Analisa kadar biokimia dan hematologi Pengukuran parameter haematologi bertujuan untuk mengevaluasi potensi infeksi pada sel darah putih dan sel darah merah. Pengukuran hemato-biokimia marker seperti konsentrasi glukosa dan aktivitas glutamic-oxalacetic transminase (GOT). Pengukuran aktivitas enzim GOT dapat digunakan untuk mengetahui adanya kerusakan pada organ-organ tersebut. Serum alfa-amiloid protein juga dapat digunakan sebagai marker sepsis pada plasma (Villoslada et al., 2007).

21

d. Analisa translokasi bakteri Analisa translokasi bakteri dapat dianalisa melalui adanya sel hidup merupakan tahap utama terdapatnya resiko patogenisitas yang dimiliki oleh bakteri (Zhou et al., 2000). Analisa ini juga dapat dilakukan pada organ liver, limpa, ataupun organ lain yang berpotensi terjadi translokasi (Villoslada et al., 2006; Steppe et al., 2014).

2.5 Landasan Teori Bakteri probiotik spesies Lactobacillus pada umumnya telah mendapatkan status Generally Recognized as Safe (GRAS) sehingga dinyatakan aman. Pengujian keamanan bakteri probiotik perlu dilakukan melalui penelitian yang terkontrol untuk membuktikan strain bakteri tersebut adalah bakteri probiotik, khususnya strain baru karena bakteri bersifat strainspecific (Gharaei and Eslamifar, 2011). Lactobacillus dapat bertahan hidup disaluran pencernaan dan jarang menyebabkan penyakit pada manusia. Kasus bakteri probiotik yang menyebabkan penyakit belum diketahui penyebabnya secara pasti.. Woo et al. (2002) juga melaporkan kasus bacteremic cholecystitis disebabkan oleh Lactobacillus salivarius. Canon et al.(2005) melaporkan kasus bacteremic yang diduga berkaitan dengan probiotik Lactobacillus. Tanet al. (2013) juga melaporkan kasus peradangan kantung empedu (Chloresystitis) akut yang disebabkan oleh Lactobacillus plantarum setelah dilakukan isolasi dan pencocokan kode gen. Berdasarkan pada kasus diatas, uji keamanan strain Lactobacillus plantarum Mut-7 penting di lakukan dengan memberikan

22

suspensi sel bakteri dosis tinggi sebanyak 1011CFU/hari selama 28 hari pada model tikus Sparague Dawley. 2.6 Hipotesis L. plantarum Mut-7 sebagai probiotik diduga bersifat aman. Pemberian suspensi sel L. plantarum Mut-7 dosis tinggi (1011CFU/ekor tikus) selama 28 hari diduga: 1. Tidak memberikan pengaruh signifikan terhadap kondisi fisiologis hewan coba (berat badan, konsumsi pakan, efisiensi pakan). 2. Tidak memberikan pengaruh signifikan terhadap indeks berat liver, limpa, dan ginjal. 3. Tiidak memberikan pengaruh signifikan terhadap parameter hematologi dan marker biokimia (SGOT dan SGPT. 4. Tidak memberikan pengaruh signifikan terhadap morfologi saluran cerna. 5. Tidak menyebabkan terjadinya translokasi bakteri pada organ (limpa, liver, paru, jantung dan ginjal) dan darah.

23

BAB III METODE PENELITIAN

3.1. Bahan Penelitian Bahan penelitian utama pada penelitian ini menggunakan kultur murni bakteri L. plantarum Mut-7 dan susu skim. Kultur murni L. plantarum Mut-7 diperoleh dari divisi Food & Nutrition Culture Collection (FNCC) Pusat Studi Pangan dan Gizi, Universitas Gadjah Mada. Susu skim yang digunakan untuk membuat suspensi bakteri L. plantarumMut-7 adalah susu skim rendah lemak (Lactona) steril dengan konsentrasi 10%. Bahan yang digunakan untuk media produksi biomassa sel adalah media PGY, dalam 1 L aquades berisi 10 g glukosa anhydrous (Merck, Darmstadt, Germany), 10 g bacteriological peptone (Oxoid, UK), dan 5 g yeast extract (Oxoid, UK). Media analisa untuk seleksi bakteri asam laktat menggunakan de Man Rogosa Sharpe (MRS) agar dengan komposisi dalam 1 L aquades mengandung 52g MRS (Merck, Darmstadt, Germany), 15 g bacteriological agar (Oxoid, UK), 3 g CaCO3, dan 1 ml NaN2. Media MRS broth sama dengan MRS agar namun tanpa penambahan agar. Media analisa untuk seleksi plantarum berdasarkan Bujalance et al. (2006) menggunakan Lactobacillus plantarum Selective Medium (LPSM) dengan komposisi 1 L aquades, 15 g bacteriological agar (Oxoid, UK), 20 g sorbitol, 10 g bacteriological peptone (Oxoid, UK), 10 g beef extract (Oxoid, UK), 5 g yeast extract (Oxoid, UK), 5 g CH3COONa, 2 g K3PO4, 0,1 g MgSO4, 0,05 g MnSO4, 0,02 g bromocresol purple, dan 2 ml antibiotik (Ciprofloxacin infus IV 0,2%). Larutan pengencer Phosphat Buffer

24

Saline (PBS) dengan komposisi 1 L aquades, 9 g NaCL, 1,79 g NaH2PO4. 2H20, dan 6,63 g Na2PO4. 2H2O. Bahan uji in vivo antara lain 24 ekor tikus Sprague Dawley (SD) betina berumur 2 bulan dengan berat 200+20 gram dan pakan standar hewan coba dengan formulasi AIN-93-M modifikasi (Reeves et al., 1993) tanpa menggunakan tert-butihidroquinon dengan komposisi pakan 63, 07 % pati jagung, 14% kasein, 10% sukrosa, 4% minyak kedelai, 5% serat, 3,5% campuran mineral, 0,18% L-Cystine, 1% campuran vitamin, 0,25% cholin bitartrate. Bahan yang digunakan untuk analisa adalah alkohol 70 %, alkohol 90%, CH3OH, EDTA 10%, formalin 10%, 3.2 Alat Penelitian Alat-alat gelas yang digunakan antara lain erlenmeyer 1 L, gelas ukur 250 ml, tabung reaksi, cawan petri, spreader, dan oose. Alat yang akan digunakan untuk proses preparasi suspensi bakteri antara lain autoklaf kapasitas 60 L (Labtech), timbangan analitik kapasitas 6 kg (Denver, top balance SI 6002), inkubator (Memmert, INCO108med), sentrifuge kapasitas 4L (Sorvall, RC-6Plus,), quebec darkfield colony counter (Reichert), vortex (Labnet, VX100), dan laminery flow bench (Microflow). Sedangkan alat yang digunakan dalam pemeliharaan hewan coba antara lain kandang pemeliharaan individu yang terbuat dari stainless steel, botol minum secara ad libitum, timbangan, peralatan bedah, dan oral gavage. Alat yang digunakan untuk analisa meliputi mikrohematokrit 0,2 mm (Isolab), hematology analyser (Celldyne, 3700),

25

3.3 Tahapan Penelitian 3.3.1

Produksi biomassa sel Produksi biomassa sel L. plantarum Mut-7 dalam 1 ml konsentrasi sel

1x1011CFU dilakukan secara steril dengan media PGY cair dan MRS agar (sterilisasi suhu 121˚C, 15 menit); susu skim 10% (sterilisasi suhu 118˚C, 15 menit); dan peralatan produksi meliputi erlenmeyer, tabung reaksi, dan tabung sentrifugasi (sterilisasi suhu 121˚C, 20 menit). Media PGY yang disiapkan untuk inokulasi awal adalah media PGY dalam tabung reaksi sebanyak 10 ml dan untuk inokulasi menghasi kan sel konsentrasi 1011 CFU dalam 1 ml susu skim 10%, membutuhkan 1000 ml media PGY dalam 1 L erlenmeyer. Media MRS agar untuk enumerasi sebanyak 1000 ml. Sejumlah enam ekor tikus kelompok probiotik selama 28 harinya membutuh 200 ml dan 20000 ml media PGY. Susu skim yang dibutuhkan sebanyak 200 ml untuk 200 appendorf (168 untuk 6 tikus kelompok probiotik, 20 untuk enumerasi, 12 untuk cadangan). Proses produksi dilakukan sebanyak 5 kali, dengan 1 kali batch produksi dalam 4 tabung masing-masing memiliki kapasitas 1 L. Setiap batch produksi Tahapan yang pertama dilakukan adalah inokulasi awal persiapan starter bakteri, membutuhkan 4 tabung reaksi, masing-masing berisi 10 ml PGY dan sebanyak 0,1 ml starter bakteri diinokulasikan kedalamnya, diinkubasi pada suhu 37˚C selama ± 24 jam dan didapat konsentrasi sel L. plantarum 109 CFU. Tahapan yang kedua adalah produksi sel, dengan inokulasi tahap pertama dalam masing-masing tabung yang berisi 1 L media PGY, diinkubasi selama 20 jam. Panen sel dilakukan pada jam ke 20,

26

kemudian di sentrifugasi kapasitas 4 L selama 20 menit 3000 rpm. Pelet hasil sentrifugasi masing-masing tabung ditambahkan 10 ml susu skim steril 10%, kemudian divortex dan dienumerasi sebanyak 1 ml pada masing-masing tabung, rata-rata jumlah sel yang tumbuh 1011 CFU (Lampiran 6). Sisanya setiap 1 ml suspensi sel dimasukan dalam appendorf kemudian disimpan beku suhu -4OC hingga akan digunakan. Diagram alir produksi biomassa sel yang dilakukan dalam setiap produksi dapat dilihat pada Gambar 3.1. 4x10 ml Media PGY Cair Steril Inokulasi kultur starter L. plantarum Mut7 Inkubasi (37˚C, 24 jam) Inokulasi kedalam 4 x 1 L media PGY cair steril Inkubasi (37˚C, 20 jam) Sentrifugasi (3000 rpm, 20 menit) Pelet Pensuspensian dalam 4x10 ml susu skim steril 10% 4 tabung suspensi sel L. plantarum Mut7 Enumerasi

Pembagian dalam ependorf 1 ml Penyimpanan dalam lemari beku bersuhu -4˚C

Gambar 3.2 Tahapan proses persiapan suspensi sel L. plantarum Mut-7 dalam setiap produksi

27

3.3.1 Pengujian In vivo 3.3.1.1 Persyaratan etik Pengelolaan hewan coba pada penelitian ini telah mengikuti animal ethics. Prosedur pelaksanaan sesuai dengan etichal clearance meliputi perawatan dalam kandang, pemberian makan dan minum, aliran udara dalam kandang, perlakuan saat penelitian, perlakuan sebelum pembedahan untuk menghilangkan rasa sakit, pengambilan darah dan organ untuk penelitian, dan prosedur pemusnahan. Sebelum penelitian dilaksanakan, proposal telah dimintakan persetujuan Komisi Ethik Penelitian Kesehatan LPPT UGM Yogyakarta, surat kelaikan etik didapat dengan nomor 331/KECLPPT/X/2015. 3.3.1.2 Prosedur pengujian In vivo Penelitian ini menggunakan tikus albino Norway rats (Rattus norvrgicus) galur Sprague Dawley betina berusia dewasa 8 minggu dengan berat 200+20 gram dipelihara didalam kandang individu yang terbuat dari stainless steel dengan sirkulasi udara memadai, siklus gelap-terang 12 jam, dan kondisi ruangan terkontrol (suhu 22-25

O

C, kelembaban udara 60%)

berdasarkan Codex FDA 1993 draft Redbook Chapter IV dan OECD guideline no 420. Pakan standar AIN 93 M diberikan setiap hari sebanyak 15 g/ ekor tikus dan air mineral diberikan secara adlibitum. Tikus yang digunakan adalah jumlah minimal untuk dapat mendeteksi perbedaan kecil antar kelompok perlakuan secara signifikan dengan rumus (t-1)x(n-1)>15, t adalah treatment dan n adalah jumlah sampel (Federer, 1991).

28

Sebanyak 24 tikus dibagi secara acak menjadi 4 kelompok berdasarkan perlakuan yang diberikan, yaitu: a. Kondisi awal (P.0), sejumlah 6 tikus dalam kondisi fisik sehat. Adaptasi lingkungan dan pakan standar AIN 93M selama 7 hari dan pada hari ke-8 dilakukan pembedahan. b. Kontrol (P.1), sejumlah 6 tikus dalam kondisi fisik sehat. Adaptasi lingkungan dan pakan standar AIN 93M selama 7 hari dilanjutkan dengan pemberiian pakan standar selama 28 hari dan pada hari ke-29 dilakukan pembedahan. c. Kelompok susu skim (P.2), sejumlah 6 tikus dalam kondisi fisik sehat. Adaptasi lingkungan dan pakan standar AIN 93M selama 7 hari dilanjutkan dengan pemberian pakan standar dan intervensi 1ml susu skim 10% selama 28 hari, pada hari ke-29 dilakukan pembedahan. d. Kelompok susu skim (P.2), sejumlah 6 tikus dalam kondisi fisik sehat. Adaptasi lingkungan dan pakan standar AIN 93M selama 7 hari dilanjutkan dengan pemberian pakan standar dan intervensi 1ml suspense sel L. plantarum Mut-7 dalam susu skim 10% selama 28 hari, pada hari ke-29 dilakukan pembedahan. Pemberian intervensi kelompok susu skim dan probiotik dilakukan secara force feeding sebanyak 1,0 ml dengan konsentrasi sel 1011CFU (sel sudah diresuspensikan kedalam 1 ml susu skim 10% dan sudah disimpan dalam keadaan beku pada masing-masing appendorf) perhitungan konversi pada manusia sesuai dengan penelitian penelitian Steppe et al. (2014) menggunakan prosedur OECD namun pemberian setiap ekor hewan cobanya 1 ml dengan

29

konsentrasi 1 ml 109 CFU kemudian dikonversikan ke dalam tabel konversi perhitungan dosis untuk manusia dengan berat 70 kg (Lampiran 6). Selama masa pemeliharaan, berat badan dan konsumsi pakan diamati. Pada akhir masa perlakuan dilakukan pengambilan sampel darah kemudian tikus dieuthanasia untuk pengambilan organ berupa hati, limpa, ginjal, paru, jantung dan bagian intestinalnya. Setelah itu dilakukan analisa terhadap darah dan organ-organ yang telah diambil. Tahapan proses pengujian in vivo secara singkat dapat dilihat pada Gambar 3.2. 24 Ekor tikus Sprague Dawleybetina

Adaptasi 1 minggu Pembagian kelompok

Kondisi. Awal 6 ekor tikus

Kontrol 6 ekor tikus

Susu skim 6 ekor tikus

Perlakuan 28 hari

Pembedahan

-

Mut-7 1012CFU/ml 6 ekor tikus

Analisa fisik: -Berat - Sisa pakan - Kondisi fisik

Analisa hematologi, GOT, GPT

Darah - Ileum - Feses - Darah Analisa BAL Jantung - Sekum - Digesta dan L. Analisa H&E Hati - Kolon plantarum dan mikroskop Limpa Paru Analisa BAL dan L. Ginjal plantarumpengujian in vivo Gambar 3.3 Tahapan proses jalannya

30

3.4 Metode Analisa 3.4.1 Analisa populasi BAL dan L. plantarum pada digesta dan feses Analisa populasi bakteri asam laktat dan L. plantarum pada Feses dan digesta mengacu pada modifikasi metode Frias et al. (2009), Yakabe et al. (2009), Zhou et al. (2000), dan Athenia dkk. (2015). Hewan coba dianalisa dengan metode spread plate, sampel feses dan digesta sebanyak 1 gram dimasukan kedalam tabung yang berisi 9 ml larutan PBS, dicampur dengan vortex dan dibuat seri pengenceran tertentu. Setiap seri pengeceran diambil 0,1 ml dan diratakan sampai meresap di media agar MRS dan LPSM dalam cawan petri. Kemudian, cawan dibalik dan diinkubasi pada suhu 37˚C selama 48 jam. Jumlah koloni bakteri yang tumbuh dihitung menggunakan quebec darkfield colony counter. 3.4.2 Analisa kondisi fisiologis secara umum pada hewan coba Pengamatan terhadap kondisi fisik hewan coba dilakukan dengan mengevaluasi konsumsi pakan, perubahan berat badan, dan index berat organ. Pengamatan kondisi fisik secara umum pada hewan coba mengacu pada modifikasi dari metode yang dilakukan oleh Kemgang et al. (2009). a.

Pengamatan konsumsi pakan dilakukan setiap hari. Konsumsi pakan hewan coba diketahui dengan menghitung selisih jumlah pakan yang diberikan (15 g/tikus/hari) dan sisa pakan hewan coba (g). Jumlah konsumsi pakan per tikus kemudian dirata-rata setiap kelompok perlakuan. Setelah didapatkan rata-rata harian setiap kelompok perlakuan, jumlah konsumsi pakan dirata-rata setiap minggunya.

31

b. Pengamatan perubahan berat badan dilakukan dengan menimbang berat badan hewan coba. Besarnya perubahan berat badan hewan coba diketahui dengan menghitung selisih berat badan dengan berat badan hari ke-0. c. Analisa Indeks Berat Organ Limpa, Liver, Paru, Jantung dan Ginjal. Setelah pembedahan, organ berupa limpa, liver, dan ginjal masing-masing diambil dan ditimbang. Indeks berat organ dihitung dengan rumus menurut Zhou et al.(2000) [Berat organ (g)/ Berat badan terakhir (g)]x100.

3.4.2 Analisa kadar hematologi, aktivitas SGOT, dan SGPT Sampel darah diambil 12 jam setelah dipuasakan menggunakan mikrohematokrit steril melalui sinus orbitalis pada mata dan dimasukan dalam tube yang berisi EDTA 10%. Analisa spesimen darah yang dilakukan pada analisa kadar hematologi menggunakan hematology analyzer untuk analisa sel darah putih (leukosit (WBC), limfosit, dan neutrofil), jumlah sel darah merah (RBC), jumlah trombosit (PLT) nilai hematokrit (HCT), konsentrasi hemoglobin (HGB), volume eritrosit rata-rata (MCV), jumlah hemoglobin eritrosit rata-rata (MCH), dan konsentrasi hemoglobin eritrosit rata-rata (MCHC). Analisa hematologi dilakukan berdasarkan prinsip flow cytometer, metode pengukuran jumlah dan sifat-sifat sel yang dilapisi oleh aliran cairan melalui celah sempit. Ribuan sel dialirkan melalui celah tersebut sedemikian rupa sehingga sel dapat lewat satu per satu, kemudian jumlah sel dan ukurannya dihitung (Zhou et al., 2000).

32

Analisa aktivitas enzim aspartate amino transferase (AST) atau yang biasa disebut serum glutamic oxalocetic transaminase (SGOT) dan enzim alanine amino transferase (ALT) atau yang biasa disebut serum glutamic piruvic transaminase (SGPT) pada sampel darah dengan cara sentrifugasi untuk didapatkan serumnya. Serum direaksikan dengan reagen enzim dan reagen pemulai (reagen kit) menggunakan alat Microlab 300, dibaca absorbansinya dengan metode spektrofotometri panjang gelombang 340 nm (Steppe et al., 2014).

3.4.3 Analisa morfologi saluran cerna Organ intestinal berupa ileum, sekum, dan kolon dianalisa histopatologi dengan gambaran mikroskopis organ dan analisa kuantitatif seperti tinggi vili, tinggi epitel, dan tebal mukosa dengan metode pewarna yang digunakan pada analisa ini ialah Hematoxilin Eosin (HE) (Lampiran 6b) berdasarkan metode yang dilakukan oleh Muntiha (2001).

3.4.4 Analisa bakteri pada darah dan organ Organ berupa hati, ginjal, dan limpa digunakan untuk analisa translokasi bakteri yang dilakukan dengan streak plate dengan pengkayaan terlebih dahulu pada media MRS cair selama 1 jam dan 24 jam. Masing-masing sampel darah sebanyak 0,1 ml dan sampel organ dimasukan dalam tabung reaksi berisi media MRS cair kemudian diinkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam. Setelah itu, ose yang telah disterilkan dimasukan kedalam tabung reaksi yang berisi sampel dan kemudian digoreskanpada media MRS agar dan Lactobacillus plantarum Selective Medium (LPSM) dalam cawan. Cawan

33

dibalik dan diinkubasi pada suhu 37˚C selama 48 jam. Adanya pertumbuhan koloni bakteri pada media MRS dan LPSM selanjutnya diduga sebagai bakteri asam laktat dan Lactobacillus plantarum (Modifikasi Zhou et al., 2000; Athennia dkk., 2015).

3.4.5 Analisa statistik Analisa statistik yang akan dilakukan pada data menggunakan analisa ANOVA satu arah dengan tingkat kepercayaan 95% dan dilanjutkan dengan uji DMRT untuk mengetahui signifikansi perbedaan jika terdapat hasil yang berbeda nyata pada P < 0.05 menggunakan software SPSS 17.

3.5 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di laboratorium mikrobiologi dan laboratorium Pusat Studi Pangan dan Gizi (PSPG), Universitas Gadjah Mada (UGM). Penelitian dilaksanakan pada bulan September 2015 sampai Maret 2016.

34

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Populasi Bakteri Asam Laktat pada Digesta dan Feses Populasi mikroflora saluran pencernaan dianalisa melalui digesta dan feses pada akhir masa perlakuan dengan metode kultur seri pengenceran. Pengambilan sampel dilakukan pada akhir perlakuan masing-masing kelompok. Populasi BAL media MRS dapat dilihat pada Tabel 4.1. Tabel 4.1 Populasi BAL (Log CFU/g) pada media MRS pada akhir masa perlakuan Populasi BAL pada Media MRSA (Log CFU/ml) Kelompok Digesta Feses Rata-Rata Min Max Rata-Rata Min Max K. Awal (P0) 5,32 4,08 6,79 5,77 3,78 6,90 Kontrol (P1) 4,64 3,00 6,16 5,29 4,32 6,00 Susu Skim (P2) 5,77 4,46 6,38 6.37 5,33 7,48 Probiotik (P3) 7,18 6,25 8,23 8.16 7,29 8,48

Pemberian perlakuan L.plantarum Mut-7 dosis tinggi memberikan pengaruh positif terhadap populasi mikroflora saluran pencernaan khususnya populasi BAL. Rerata populasi BAL kelompok probiotik paling tinggi dibandingkan dengan kelompok perlakuan awal, kontrol, dan susu skim. Populasi bakteri asam laktat antara feses dan digesta nilainya hampir sama dan cenderung meningkat pada feses (Tabel 4.1). Menunjukan bahwa L. plantarum Mut-7 dapat bertahan hidup hingga feses. Populasi BAL pada digesta tikus berkisar 108-7 CFU/ml dengan pemberian suspense sel L. plantarum Mut-7 1011 CFU/tikus/hari secara oral. Jumlah tersebut sejalan dengan penelitian yang

35

dilakukan oleh Norin et al. (1991), jumlah BAL pada kolon dan sekum berkisar 108 CFU/ml setelah pemberian suspensi L. Achidopillus dan Athennia dkk. (2015), jumlah BAL pada digesta berkisar 107CFU/ml dan meningkat difeses menjadi 108CFU/ml setelah pemberian suspense sel L. plantarum Dad-13. Keberlangsungan hidup L. plantarum sebagai bakteri probiotik dalam saluran pencernaan dapat dilihat pada Tabel 4.7

Tabel 4.2 Populasi BAL dan L. plantarum (Log CFU/g) pada media LPSM pada akhir masa perlakuan Populasi L. plantarum pada Media LPSM (Log CFU/ml) Kelompok Digesta Feses Rata-Rata Min Max Rata-Rata Min K. Awal (P.0) nd nd nd nd nd Kontrol (P.1) nd nd nd nd nd Susu Skim (P.2) nd nd nd nd nd Probiotik (P.3) 4,85 3,65 5,58 4,90 3,81

Max nd nd nd 6,48

Keterangan: nd=not detected

Analisa populasi L. Plantarum menunjukan bahwa pemberian suspensi sel L. plantarum Mut-7 memberikan pengaruh positif terhadap populasi mikrobia didalam saluran pencernaan. Populasi BAL didalam saluran pencernaan pertumbuhannya didukung oleh adanya treatment probiotik. Hasil Tabel 4.7 sesuai dengan syarat probiotik (WHO/FAO, 2002) adalah mikroorganisme hidup dan memberikan pengaruh kesehatan terhadap saluran pencernaan, dengan cara menjaga keseimbangan mikrobia saluran pencernaan. L. plantarum yang awalnya tidak terdeteksi dalam saluran pencernaan menjadi terdeteksi dengan rata-rata pertumbuhannya 104-5 CFU/ml dan meningkatkan pertumbuhan BAL dalam saluran pencernaan. Hasil Tabel 4.1 dan 4.2

36

menunjukan manfaat L. plantarum Mut-7 sebagai probiotik mampu bertahan hidup melewati lambung, saluran pencernaan, dan meningkatkan populasi BAL didalam saluran pencernaan, sesuai dengan penelitian Rahayu et al. (2015), bahwa pengujian secara in vitro L. plantarum Mut-7 mampu bertahan pada asam lambung pH 2, konsentrasi garam empedu hingga 3%., dan mampu bertahan dari serangan dan menghamt bakteri patogen. 4.2 Pengaruh Pemberian L. plantarum Mut7 terhadap Kondisi Fisiologis Hewan Coba Pemberian suspensi sel L. plantarum Mut-7 pada hewan coba sebanyak 1x1011 CFU/tikus/hari terhadap kondisi fisiologis dapat diamati melalui konsumsi pakan dan berat badan hewan coba. Pengamatan dilakukan setiap hari selama masa adaptasi 7 hari dan selama masa intervensi 28 hari. Evaluasi rerata konsumsi pakan hewan coba selama masa perlakuan disajikan dalam Tabel 4.3.

Tabel 4.3Rerata konsumsi pakan tikus pada masing-masing kelompok (gram) selama masa intervensi 28 hari Rerata Konsumsi Pakan Tikus per kelompok (gram) Kelompok pada minggu ke0 1 2 3 4 a a b a P.1 9,19 + 0,24 9,17 + 0,24 10,98 +0,51 10,57 +0,55 10,45a+0,48 P.2 9,21a + 0,36 9,29a + 0,41 9,21a +0,29 9,93a +0,12 9,76a+0,52 P.3 9,21a + 0,42 9,12a + 0,41 10,17ab +0,40 10,48a +0,42 10,67a+0,69 Keterangan: Notasi Superscript huruf kecil berbeda pada kolom yang sama menunjukkan adanya beda nyata (P>0,05), +SEM=standar eror. Kelompok P.0 (kondisi awal), P.1 (kelompok kontrol), P.2 (kelompok susu skim), P.3 (kelompok probiotik).

37

Konsumsi pakan tikus setiap minggunya berdasarkan perbandingan antar kelompok perlakuan tidak menunjukan adanya perbedaan yang signifikan (P>0.05). Konsumsi pakan tikus setiap minggunya cenderung mengalami pertambahan pada masing-masing kelompok. Hasil tersebut menunjukkan bahwa pemberian L. plantarum Mut-7 pada kelompok perlakuan probiotik tidak mempengaruhi pola konsumsi pakan pada tikus. Selama masa perlakuan tidak terjadi penurunan nafsu makan setiap minggunya. Penurunan nafsu makan digunakan sebagai indikator adanya infeksi, berdasarkan review Kanra et al. (2006) berkurangnya nafsu makan dsebabkan oleh produksi metabolit mikrobia dan pelepasan sitokin yang mempengaruhi signal syaraf nafsu makan pada syaraf pusat. Konsumsi pakan kelompok perlakuan probiotik cenderung lebih stabil mengalami peningkatan dibandingkan dengan perlakuan kontrol dan susu skim. Konsumsi probiotik pada dasarnya dapat meningkatkan nafsu makan. Peningkatan nafsu makan disebabkan oleh pengaruh positif probiotik yang bersifat strain spesifik dalam saluran pencernaan mempenrbaiki mikroflora saluran pencernaan. Hasil tersebut sesuai dengan penelitian Kemgang et al. (2014), konsumsi probiotik meingkatkan berat badan dan membantu pertumbuhan mikroflora menguntungkan didalam mukosa saluran pencernaan. Hal tersebut berkaitan dengan kemampuan probiotik menjaga integritas sel melalui kemampuan adhesi pada sel epitel, sehingga ketika terdapat serangan patogen terjadi peningkatan sekresei IgA. Hasil penelitian Zhou et al. (2000), pemberian dosis tinggi oral probiotik pada hewan coba tidak memberikan perbedaan signifikan apabila dibandingkan dengan kontrol.

38

Pengamatan kondisi secara fisik yang dilakukan terhadap hewan coba, selain menghitung konsumsi pakan juga dapat melalui pengamatan berat badan dan perubahan berat badan per minggu selama intervensi. Rerata berat badan tikus per kelompok dapat dilihat pada Tabel 4.3.

Tabel 4.4 Rerata berat badan tikus pada masing-masing kelompok (gram) selama masa intervensi 28 hari Rerata Berat Badan Tikus per kelompok (gram) pada minggu ke-

Kel 0

1

2

3

4

P.1

209,83a +3.17 220,50a +3.22 231,33a +4.12 242,00a +3.24 248,00a +5.09

P.2

210,33a +4.58 221,33a +5.19 231,33a +5.26 239,83a +6.19 245,50a +6.48

P.3

205,83a +5.47 212,67a +5.66 223,17a +5.34 235,83a +5.36 243,50a +4.64

Keterangan: Notasi Superscript huruf kecil berbeda pada kolom yang sama menunjukkan adanya beda nyata (P>0,05), +SEM=standar eror. Kelompok P.0 (kondisi awal), P.1 (kelompok kontrol), P.2 (kelompok susu skim), P.3 (kelompok probiotik)

Analisis statistika rerata berat badan tikus antar kelompok tidak mengalami perbedaan yang signifikan (P>0.05), namun mengalami pertambahan berat setiap minggunya. Pemberian intervensi probiotik dan susu skim memberikan pengaruh positif, terhadap perubahan berat badan, meskipun pada susu skim laju kenaikan terlihat lebih rendah apabila dibandingkan dengan kontrol dan probiotik. Berdasarkan pengamatan terhadap konsumsi pakan dan perubahan berat badan selama masa intervensi, pemberian suspensi sel L. plantarum Mut-7 dosis tinggi selama 28 hari tidak memberikan pengaruh negatif hingga bedampak pada kematian hewan coba. Perbaikan berat badan terjadi karena adanya perbaikan metabolisme meliputi perbaikan daya cerna dan daya serap nutrisi disaluran pencernaan. Keseimbangan mikroflora disaluran pencernaan meningkatkan daya cerna dan

39

daya serap nutrisi melaui konsumsi probiotik. Aktivitas antimikrobia probiotik dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen dengan menghasilkan enzim, asam butirat, asam propionat, asam laktat, dan bacteriocin (Choudhury et al, 2012). Peningkatan berat badan yang tidak berlebih pada kelompok probiotik apabila dibandingkan dengan kontrol menunjukan bahwa pemberian probiotik dapat mencegah terjadinya obesitas pada beberapa strain Lactobacillus dengan mekanisme kontrol obesitas pada setiap strain berbeda (Dias et al., 2016). 4.3 Pengaruh Pemberian L.plantarum Mut7 terhadap Indeks Berat Organ Pengamatan rerata indeks berat organ dalam bentuk rasio berat organ dengan berat hewan coba bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian suspensi sel L. plantarum Mut-7 1011 CFU/tikus/hari terhadap organ jantung, limpa, paru, liver, dan ginjal.

Tabel 4.5 Rerata indeks berat organ tikus pada masing-masing kelompok Kel

P.0 P.1 P.2 P.3

Rerata Indeks Berat Organ ((berat organ/ berat badan hewan coba)x100) Jantung Limpa Paru Liver Ginjal 0,55 a + 0,06 0,68 a +0,13 0,89 a +0,16 3,07 a +0,37 0,75 a +0,04 0,55 a +0,06 0,59 a +0,08 0,90 a +0,09 2,87 a +0,35 0,80 a +0,04 0,52 a +0,04 0,47 a +0,05 0,76 a +0,02 2,53 a +0,11 0,80 a +0,02 0,56 a +0,03 0,50 a +0,11 0,77 a +0,08 2,52 a +0,15 0,79 a +0,04

Keterangan: Notasi Superscript huruf kecil berbeda pada kolom yang sama menunjukkan adanya beda nyata (P>0,05), +SEM=standar eror. Kelompok P.0 (kondisi awal), P.1 (kelompok kontrol), P.2 (kelompok susu skim), P.3 (kelompok probiotik)

Analisis statistika rerata berat organ tikus antar kelompok tidak mengalami perbedaan yang signifikan (P>0,05). Pemberian probiotik selama 28 hari tidak menyebabkan terjadinya rasio pertambahan berat organ yang

40

signifikan, hal tersebut menunjukan bahwa pemberian probiotik selama 28 hari tidak memicu terjadinya infeksi bakteri hingga organ. Terjadinya infeksi dapat dideteksi dengan terjadinya pertambahan berat organ. Kultur probiotik dapat melindungi perluasan translokasi bakteri patogen hingga organ. Mikroflora saluran pencernaan yang sehat secara normal mengandung sangat sedikit bakteri patogen. Pemberian probiotik konsentrasi 108 CFU/ml selama 30 hari sebelum infeksi Salmonella dan 20 hari

setelah infeksi pada penelitian

Kemgang et al. (2016), dapat menghambat pertumbuhan patogen pada hati dan limpa. Tidak adanya perbedaan signifikan dari masing-masing kelompok juga menunjukkan tidak adanya inflamasi yang disebabkan oleh infeksi karena virus, bakteri dan jamur. Hasil tersebut menunjukan bahwa pemberian intervensi sel L.plantarum Mut-7 dosis tinggi selama 28 hari tidak memicu inflamasi dan infeksi sehingga tidak terjadi pertambahan berat pada organ hewan coba.

4.4 Pengaruh Pemberian L. plantarum Mut7 terhadap Kadar Hematologi Pemeriksaan hematologi bertujuan mengetahui keadaan darah, status kesehatan, mendeteksi kelainan fungsi sel darah merah (anemia dan leukemia), mendeteksi kelainan sistemik (hati dan ginjal), dan mendeteksi adanya infeksi. Kadar hematologi merupakan parameter penting, hasil analisa kadar hematologi dapat dilihat pata Tabel 4.6.

41

Tabel 4.6 Rerata kadar hematologi darah pada akhir masa perlakuan Kelompok (rerata+SEM) Parameter P.0 P.1 P.2 P.3 Ref 3 a a a a WBC (x10 /µL) 7,7 +1,08 7,5 +0,85 8,1 +0,53 7,2 +0,95 5,3 6 a a a a RBC (x10 /µL) 6,8 +0,31 7,2 +0,37 7,9 +0,46 7,3 +0,29 8,2 a a a a HGB (g/dL) 13,5 +0,46 14,0 +0,58 14,7 +0,48 13,9 +0,34 14,6 HCT (%) 41,1 a+1,35 41,9 a+1,87 44,2 a+1,86 42,3 a+1,08 44,6 MCV (fL) 60,3 a+1,24 57,9 a+0,83 56,3 a+1,26 58,4 a+0,86 54,4 MCH (pg) 19,8 a+0,53 19,4 a+0,47 18,7 a+0,60 19,2 a+0,51 17,78 MCHC (g/dL) 32,8 a+0,55 33,5 a+0,53 33,2 a+0,37 32,9 a+0,51 32,72 PLT (x104/µL) 67,3 a+12,82 60,4 a+4,78 77,7 a+9,86 68,4 a+6,47 87,0 LYM (%) 65,7 a+3,96 55,5 a+6,06 70,5 a+3,99 67,6 a+4,67 76,8 LYM# (x102/µL) 50,6 a+6,32 40,7 a+5,98 57,5 a+5,93 47,0 a+4,03 41,6 NEUT (%) 34,3 a+3,96 44,5 a+6,06 29,5 a+3,99 32,4 a+4,67 24,1 2 NEUT# (x10 /µL) 27,3 a+6,27 34,3 a+6,08 23,1 a+2,89 24,8 a+6,76 10,3 Keterangan: Notasi Superscript huruf kecil berbeda pada baris yang sama menunjukkan adanya beda nyata (P>0,05). Kelompok P.0 (kondisi awal), P.1 (kelompok kontrol), P.2 (kelompok susu skim), P.3 (kelompok probiotik). Ref (referensi (Steppe et al., 2014)), NN (nilai normal parameter Unit Praklinih Hewan Percobaan (UPHP, UGM). Parameter yang digunakan WBC (leukosit), LYM (lymphosit), NEUT (neutrophil), RBC (eritrosit), PLT (jumlah trombosit), HCT (nilai hematokrit), HGB (konsentrasi hemoglobin), MCV (volume eritrosit rata-rata), MCH (jumlah hemoglobin eritrosit rata-rata), dan MCHC (konsentrasi hemoglobin eritrosit rata-rata).

Analisa statistika terhadap kadar hematologi darah menunjukan tidak ada perbedaan signifikan pada setiap kelompok perlakuan dan masih dalam nilai normal. Hasil penelitian menunjukan bahwa tidak terjadi peningkatan yang signifikan kadar leukosit pada kelompok probiotik apabila dibandingkan dengan kontrol, kondisi awal, dan susu skim. Leukosit pada semua kelompok perlakuan masih dalam range nilai normal. Kadar lymphosit kelompok probiotik apabila dibandingkan dengan kondisi awal, kontrol, dan susu skim tidak terjadi peninngkatan signifikan. Aktivitas neutrophil kelompok probiotik apabila dibandingkan dengan kondisi awal, kontrol, dan susu skim tidak terjadi peninngkatan signifikan. Apabila

42

dibandingkan dengan penelitian Steppe et al. (2014) nilai leukosit dan neutrophilnya lebih tinggi pada semua perlakuan meskipun dalam nilai normal dimungkinkan adanya aktivitas tubuh melawan infeksi pada semua kelompok perlakuan. Menurut Jeppsson et al. (2004) leukosit melindungi tubuh dari infeksi bakteri dan virus, bertanggung jawab terhadap imunitas tubuh, evaluasi infeksi bakteri dan virus, dan deteksi adanya metabolit yang berasifat racun. Leukosit terdiri dari limfosit yang berperan memproduksi antibody dan neutrophil yang berperan melindungi tubuh melawan infeksi. Hasil penelitian kadar hematologi sel darah merah (eritrosit) sama dengan kdar leukosit, menunjukan bahwa tidak terjadi peningkatan yang signifikan kadar eritrosit pada kelompok probiotik apabila dibandingkan dengan kontrol, kondisi awal, dan susu skim. Kadar eritrosit pada semua kelompok perlakuan masih dalam range nilai normal. Hasil yang sama juga diperoleh pada kadar MCV (volume eritrosit rata-rata), PLT (jumlah trombosit), HCT (nilai hematokrit), HGB (konsentrasi hemoglobin meliputi MCH dan MCHC).

Sel darah merah didalamnya terkandung protein

(hemoglobin) yang berfungsi untuk membawa oksigen keseluruh tubuh dan membawa kembali karbondioksida ke paru-paru. Kadar hemoglobin (MCH, MCV, MCHC) dipengaruhi oleh kecukupan besi didalam tubuh, cadangan besi disimpan di liver, limpa, dan sumsum tulang. Berdasarkan hasil analisa Tabel 4.4, pemberian probiotik L. plantarum Mut-7 dosis tinggi selama 28 hari tidak memberikan perbedaan yang signifikan dan tidak memicu terjadinya infeksi bakteri.

43

4.5 Pengaruh Pemberian L. plantarum Mut7 terhadap SGOT dan SGPT Salah satu pengukuran biokimia sebagai marker terjadi kerusakan hepatosit yang akan disekresikan melalui hati, sel jantung, otot lurik, ginjal, otak, pancreas, paru-paru, leukosit, dan eritrosit dengan mengukur serum enzim glutamic oxaloacetic transaminase (SGOT). Normalnya SGOT ditemukan dalam serum dengan kadar yang sedikit. Hasil pengukuran SGOT pada akhir masa perlakuan dapat dilihat pada Gambar 4.1. 250.00 171.88b 200.00

149.57ab

SGOT

127.67a 150.00

98.50a

100.00 50.00 0.00 P.0 P.1

P.1 P.2 Perlakuan

P.2 P.3

P.3 P.4

Gambar 4.1 Grafik rerata aktivitas SGOT (U/l) darah tikus masing-masing kelompok pada akhir masa perlakuan Keterangan: Notasi huruf kecil berbeda menunjukkan adanya beda nyata (P>0,05). P.0= Kondisi Awal P.1 = Kontrol P.3 = Susu skim P.4 = Probiotik

Hasil statistika pengukuran kadar SGOT menunjukan bahwa pemberian probiotik tidak memberikan perbedaan signifikan pada kelompok awal, kontrol, dan probiotik. Kelompok susu skim memberikan perbedaan yang signifikan dengan kondisi awal dan kontrol. Kadar SGOT normalnya yaitu 82,7-139,6 U/l sedangkan kadar SGOT kelompok susu skim dan probiotik

171,88 U/l dan 149,57 U/l, lebih tinggi dari nilai normal. Kadar

SGOT probiotik lebih tinggi dari nilai normal dan hasil statistika menunjukan

44

tidak berbeda signifikan dengan kondisi awal dan kontrol. Peningkatan kadar SGOT yang lebih tinggi juga terjadi pada kelompok susu skim, bahkan lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok probiotik. Sehingga belum bisa dipastikan kenaikan kadar SGOT diatas nilai normal disebabkan oleh konsumsi L. plantarum Mut-7 dosis tinggi selama 28 hari. Kadar SGOT pada penelitian ini nilainya pada kondisi awal masih lebih tinggi namun normal nilainya apabila dibandingkan dengan kadar SGOT pasien penyakit radang usus pada penelitian Stepe et al. (2014) dengan treatment 109 CFU/ml probiotik Butyricicoccus pullicaecorum penghasil butyrate yaitu 92,8 U/l. Penelitian Athenia dkk. (2015) treatment 1011CFU/ml probiotik L. plantarum Dad-13 kadar SGOT awal mencapai 190,2 U/l setelah 28 hari turun menjadi 185,8 U/l, nilainya lebih tinggi dari hasil uji pada penelitian ini. Kondisi masing-masing individu hewan coba menjadi faktor utama yang mempengaruhi kadar SGOT. Adanya kerusakan hepatosit yang akan disekresikan melalui hati, leukosit, dan eritrosit juga dapat dideteksi dengan mengukur serum enzim glutamic pyruvic transaminase (SGPT). Normalnya SGPT ditemukan di serum darah dengan kadar yang sedikit. Hasil pengukuran SGPT pada akhir masa perlakuan dapat dilihat pada Gambar 4.2.

45

120.00 100.00

86.48a

74.48a

76.40a

71.18a

SGPT

80.00 60.00 40.00 20.00 0.00

P.0 P.1

P.1 P.2

P.2 P.3

P.3 P.4

Perlakuan

Gambar 4.2 Grafik rerata aktivitas GPT (U/l) darah tikus masing-masing kelompok pada akhir masa perlakuan Keterangan: Notasi huruf kecil berbeda menunjukkan adanya beda nyata (P>0,05). P.0= Kondisi Awal P.1 = Kontrol P.3 = Susu skim P.4 = Probiotik

Hasil statistika pengukuran kadar SGPT menunjukan bahwa pemberian probiotik tidak memberikan perbedaan signifikan pada kelompok awal, kontrol, dan susu skim. Kadar SGPT normalnya yaitu 34,2-61,6 U/l. Kadarnya lebih tinggi dari nilai normal untuk semua kelompok perlakuan. Menunjukan bahwa peningkatan kadar SGPT yang diduga disebabkan karena kerusakan hepatosit sudah terjadi sejak kondisi awal. Stress oksidative juga dapat menjadi pemicu tingginya kadar SGOT dan SGPT karena terjadi akumulasi metabolit dalam tubuh mengganggu keseimbangan radikal bebas dan antioksidan. Sehingga dapat dipastikan kenaikan kadar SGPT diatas nilai normal tidak disebabkan oleh konsumsi L. plantarum Mut-7 dosis tinggi selama 28 hari.

4.6 Pengaruh Pemberian L. plantarum Mut7 terhadap morfologi saluran cerna Morfologi saluran cerna yang diamati pada penelitian ini adalah ileum, sekum, dan kolon (Lampiran). Hasil analisa mikroskopik hasil analisis histopatologi pada ileum dapat dilihat pada Gambar 4.3.

46

P1 d c b a

Gambar 4.3 Gambar mikroskopik pewarnaan H&E ileum Keterangan: P.0= Kondisi Awal P.1 = Kontrol P.2 = Susu skim P.3 = Probiotik, Ileum: a. lumen, b. mucosa, c. muscularis mucosa, d. sub mucosa

Gambar 4.3 menunjukan bahwa setelah pemberian L. plantarum Mut7 dengan dosis 1011 CFU/tikus/hari tidak menimbulkan inflamasi yang memicu terjadinya infeksi. Inflamasi terjadi ditandai dengan perubahan struktur pada ileum dalam bentuk bintik-bintik kemerahan, pembesaran globula-globula mukosa, terjadinya penipisan mukosa, vili usus menjadi lebih panjang, dinding usus menebal, ruang antar vili dan kripta menjadi lebih lebar (Shackelford dan Elwell, 1999). Tanda-tanda yang sama juga terjadi pada sekum dan kolom (Lampiran). Pengamatan terhadap morfologi saluran cerna penting dilakukan, lapisan permukaan saluran pencernaan, pernapasan dan saluran genitourinaria merupakan permukaan mukosa yang menjadi tempat bertemunya antigen atau agen infeksi. Kekebalan mukosa dipengaruhi oleh jaringan limfoid pada

47

saluran pencernaan, terdiri dari agregat limfoid termasuk patch peyer yang terletak pada distal usus halus terutama ileum. Sistem mukosa memiliki sel epitel sebagai penghalang fisik utama dan sistem imun, secara sinergis mencegah tubuh dari serangan patogen (Koch dan Nusrat 2012). Kerusakan mukosa saluran pencernaan merupakan parameter kejadian tanslokasi oleh bakteri, virus, dan jamur dapat diamati melalui morfologi saluran pencernaan (ileum) hingga sekum dan kolon karena probiotik memiliki sifat mampu bertahan hidup hingga akhir saluran pencernaan, sehingga metabolisme probiotik akan berlangsung sepanjang saluran pencernaan. Gambar 4.3 sel epitel dalam keadaan sehat dan microvilli ileum kelompok probiotik terlihat lebih lebat. Mekanisme penempelan (adhesi) bakteri pertama kali terjadi di lapisan mukosa pada ikatan antara struktur bakteri dengan reseptor spesifik yang terdapat pada permukaan sel epitel yaitu glikokonjugat (melekat pada sisi rantai oligosakarida membran mikrovili) (Owehand dan Salminen, 2003). Bakteri dengan spesies dan strain tertentu akan menempel pada spesifik juga. Kemampuan suatu bakteri dalam melakukan penempelan pada lapisan mukosa berbeda-beda tergantung jenis strainnya. Bakteri yang bersifat patogen akan menyebabkan pengikisan dan kerusakan pada lapisan mukosa permukaan sel epitel. Kerusakan dan perubahan struktur dapat diketahui melalui analisa kuantitatif pada Tabel 4.7.

48

Tabel 4.7 Analisa kuantitatif histologi saluran cerna pada akhir masa perlakuan Parameter

Group (Mean + SEM) P.0 P.1 P.2 P.3 a a a Ileum (tinggi villi) 310,35 +51,35 250, 45 +13,51 293,08 +60,56 308,06 a+33,33 Ileum (tinggi sel epitel) 17,65 a+02,26 17,43 a+02,37 18,11 a+01,72 17,13 a+01,91 a Ileum (jumlah villi) 21,17 +01,05 24,67 a+01,78 21,33 a+01,78 26,67 a+01,58 a Sekum (tebal mucosa) 244,50 +17,90 257,9 a+20,28 220,54 a+08,66 213,69 a+21,06 a Sekum (tinggi sel epitel) 17,38 +01,36 17,63 a+01,17 16,64 a+01,26 18,53 a+01,51 a Kolon (tebal mucosa) 210,59 +09,65 225,89 a+15,43 209,83 a+10,51 231,44 a+14,97 Kolon (tinggi sel epitel) 21,97 a+02,88 17,82 a+01,65 21,51 a+08,01 20,05 a+01,41 Keterangan: Notasi Superscript huruf kecil berbeda pada kolom yang sama menunjukkan adanya beda nyata (P>0,05), P.0= Kondisi Awal P.1 = Kontrol P.3 = Susu skim P.4 = Probiotik

Hasil statistika analisa kuantitatif morfologi saluran cerna antar kelompok tidak mengalami perbedaan yang signifikan (P>0.05) terhadap tinggi villi, tinggi epitel, jumlah villi, dan tebal mukosa. Tidak terjadi perubahan struktur dan kerusakan pada ileum, sekum, dan kolon akibat pemberian L .plantarum Mut-7 dosis tinggi selama 28 hari. Kemampuan mengganggu pertahanan mukosa saluran cerna hingga terjadi inflamasi merupakan indikator awal bakteri bersifat patogen, digunakan untuk evaluasi keamanan probiotik (Marteau, 2001). Berdasarkan review yang dilakukan oleh Ahrne dan Hagslatt (2011) infeksi oleh pathogen menyebabkan meningkatnya permeabilitas paraselular di sel kolon. Permeabilitas paraselular merupakan struktur kompleks dari junction yang terletak antara sel epitel. Peningkatan permeabilitas paraselular ini dapat dideteksi dari tinggi epitel dan mukosa.

Mukosa saluran pencernaan mempunyai peran penting di usus yang berfungsi mencegah invasi patogen masuk ke dalam sistem jaringan. Inflamasi pada saluran mukosa dapat dideteksi dengan melihat perubahan struktur microvilli. Gambar 4.2 dan Tabel 4.5 sesuai dengan penilitian Zhou et al. (2000), evaluasi potensi probiotik BAL strain L. rhamnosus HN001, L. acidophilus HN017, dan Bifidobacterium lactis HN019 yang diinokulasikan

49

secara oral pada mencit tidak menunjukan pengaruh negatif terhadap integritas lapisan mukosa saluran pencernaan.

4.7 Analisa Bakteri pada Organ dan Darah Koloni bakteri pada sampel organ yang tumbuh hanya pada enrichment selama 24 jam yang ditumbuhkan pada media selektif bakteri asam laktat. Koloni bakteri pada sampel organ yang tumbuh dapat dilihat pada Tabel 4.8.

Tabel 4.8 Jumlah organ dan darah tikus yang terdeteksi Bakteri Asam Laktat setelah enrichment 24 jam dan inkubasi 48 jam pada media MRS Kontrol K. Susu skim K. Probiotik K. Awal (P0) (P1) (P2) (P3) Darah 2/6 0/6 0/6 1/6 Jantung 2/6 1/6 3/6 4/6 Liver 4/6 5/6 4/6 5/6 Paru 4/6 5/6 2/6 4/6 Ginjal 3/6 2/6 Limpa 3/6 1/6 a/b=Tikus yang terdeteksi/ jumlah tikus

2/6 5/6

3/6 1/6

Hasil analisa mikrobiologi dengan menggunakan MRS dengan penambahan CaCO3 terdeteksi adanya koloni bakteri pada darah kondisi awal dan kelompok probiotik, pada organ jantung, limpa, liver, paru, ginjal terdeteksi pada semua kelompok. Koloni bakteri yang terdeteksi diduga sebagai BAL. Penelitian sebelumnya terdeteksi adanya bakteri pada hewan coba pernah terjadi pada penelitian Zhou et al. (2000), uji keamanan potensi probiotik BAL strain L. rhamnosus HN001, L. acidophilus HN017, dan Bifidobacterium lactis HN019 yang dilakukan pada kelenjar betah bening, limpa, liver, ginjal, dan darah terdeteksi pada semua perlakuan dan kontrol. Penelitian Athenia dkk. (2015) evaluasi keamanan kandidat probiotik L.

50

plantarum Dad-13 hasil yang sama juga terjadi pada media MRS terdeteksi bakteri yang diduga sebagai BAL pada kelompok awal organ liver dan ginjal seluruh sampel tikus, organ limpa terdapat 3 tikus, darah terdapat 1 tikus dan pada kelompok probiotik hampir seluruh tikus terdeteksi. Kemampuan mikroflora indigenous saluran pencernaan melakukan translokasi keluar usus menuju organ sudah banyak dibahas dalam penelitian sebelumnya, namun belum diketahui mekanisme khusus yang berhubungan dengan hal tersebut. Koloni bakteri yang terdeteksi pada kondisi awal menunjukan bahwa sebelum intervensi sel L. plantarum Mut-7 pada tikus sudah terdapat koloni bakteri begitu juga dengan bakteri yang terdeteksi pada kelompok kontrol dan susu skim menunjukan bahwa koloni bakteri yang terdeteksi pada kelompok probiotik belum tentu disebabkan oleh intervensi sel L. plantarum Mut-7 melainkan mikroflora indigenous saluran pencernaan yang ada di dalam individu tikus. Sampel yang ditumbuhkan pada media MRS dengan pertumbuhan koloni bakteri yang tumbuh diduga sebagai BAL juga ditumbuhkan pada media LPSM sehingga nantinya yang tumbuh hanya bakteri L. plantarum saja untuk melihat kemungkinan bakteri tersebut berasal dari intervensi L. plantarum Mut-7 dapat dilihat melalui Tabel 4.9.

51

Tabel 4.9 Jumlah organ dan darah tikus yang terdeteksi sebagai L. plantarum setelah enrichment 24 jam dan inkubasi 48 jam pada media LPSM Kontrol K. Susu skim K. Probiotik K. Awal (P0) (P1) (P2) (P3) Darah 0/6 0/6 0/6 0/6 Jantung 0/6 0/6 0/6 0/6 Liver 0/6 0/6 0/6 0/6 Paru 0/6 0/6 0/6 0/6 Ginjal Limpa

0/6 0/6

0/6 0/6

0/6 0/6

0/6 0/6

a/b=Tikus yang terdeteksi/ jumlah tikus

Hasil analisa mikrobiologi menggunakan media LPSM menunjukkan bahwa tidak terdeteksi adanya koloni yang tumbuh pada media LPSM, menunjukkan bahwa koloni BAL tersebut bukanlah L. Plantarum dan tidak berasal dari intervensi L. plantarum Mut-7 1011CFU/tikus/hari. Hasil tersebut sesuai dengan teori bahwa Lactobacillus tidak dapat mengalami translokasi oleh dirinya sendiri, namun dapat terjadi ketika mukosa usus terganggu atau ketika sistem kekebalan tubuh tidak mampu mengendalikan mikroorganisme pathogen terjadi translokasi pada aliran darah menyebabkan sepsis atau infeksi lokal (Kemgag et al., 2014). Penelitian yang dilakukan oleh Frias et al. (2009), menyatakan bahwa translokasi berhubungan dengan sistem imun dan kerusakan mukosa. Ketika terjadi kerusakan mukosa sel epitel maka terjadi sekresi sistem imun (IgA) pengaruh secara klinis strain probiotik.

52

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan 1. Strain probiotik L. plantarum Mut-7 memiliki kemampuan sebagai probiotik karena mampu bertahan pada asam lambung dan garam empedu, dibuktikan dengan pemberian L. plantarum Mut-7 1011 CFU/ ekor tikus selama 28 hari mampu meningkatnya populasi BAL dan terdeteksinya L. plantarum pada feses dan digesta kelompok probiotik. 2. Bakteri probiotik L. plantarum Mut-7 bersifat aman karena pemberian suspensi sel dosis tinggi tidak memberikan pengaruh yang signifikan terhadap perubahan berat badan, pola konsumsi pakan, indeks berat organ, kadar hematologi, SGOT, SGPT, dan morfologi saluran cerna. 3. Pemberian suspensi sel L. plantarum Mut-7 dosis tinggi selama 28 hari tidak terdeteksi adanya bakteri pada organ hati, jantung, ginjal, limpa, paru, dan darah. 5.2 Saran 1. Analisa mikrobiologi, hematologi, dan biokimia pada darah sebaiknya dilakukan secara rutin. 2. Analisa molekuler perlu dilakukan untuk verifikasi bakteri yang ditemukan diorgan terkait bakteri alami saluran pencernaan atau BAL. 3. Uji respon imunitas perlu dilakukan untuk melihat pengaruh protektif terhadap pemberian Lactobacillus plantarum Mut-7

53

DAFTAR PUSTAKA Ali, A.A. 2011. Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria Isolated from Traditional Drinking Yoghurt in Khartoum State. Sudan. Curr Res Bacteriol 4:16-22. Ahrne, S. dan Hagslatt, M. J. 2011. Effect of Lactobacilli on Paracellular Permeability in the Gut. Journal Nutriens 3:104-117. Anonim. 2002. Probiotics in Food: Health and Nutritionals Properties and Guidelines for Evaluation. WHO FAO of the united nations, Rome. Athennia, A., Tyas, U., Y. Marsono., Endang S, R. 2015. Evaluasi Keamanan Kandidat Probiotik: Efek Pemberian Lactobacillus plantarum Dad 13 Dosis Tinggi pada Performa Tikus Sprague Dawley. Tesis S2. Program Pasca Sarjanan UGM: Yogyakarta.Unpublish. Bernardeaua, M., Vernouxa, J., P., Dubernetc, S., dan Guéguena M. 2008. Safety Assessment of Dairy Microorganisms: The Lactobacillus Genus. Contribution to the safety assessment of technological microflora found in fermented dairy products 126 (3): 278–285. Collado, M., C., Isolauri, E., Salminen, E. dan Sanz, Y. 2009. The Impact of Probiotic on Gut Health. Current Drug Metabolism 10: 68-78. Choi Eun Ah and Chang Hae Choon. 2015. Cholesterol Lowering Effects of a Putative Probiotic Strain Lactobacillus Plantarum EM Isolated from Kimchi. International Journal Food Science and Technology 62(15): 210217. Chowdhury, A., Hossain, M. N., Fakkrudin, M.,Billah, M.M., dan Ahmed, M.M. 2012. Screening of Lactobacillus spp. From Buffalo Yoghurt for Probiotic and Antibacterial Activity. J. Bacteriol Parasitol 3:8. Dixit G, Samarth D, Tale V, and Bhadeker R. 2013. Comparative Studies on Potential Probiotic Characteristics of Lactobacillus Acidophilus Strains. EurAsian Journal of BioSciences 7 (13): 1-9. Emmawati, A. 2014. Study of Antiinfection Properties of Lactic Acid Bacteria Isolated from Mandai (Dissertation), Graduate School, Bogor Agricultural University, Indonesia Frias, R., Ouwehand, A., Spillmann, T., Vankerckhoven, V., Trautwein, M. W., Salminen, S., dan Guemonde, M. 2009. Effect of Clinical and Probiotic Lactobacillus rhamnosus Strains on Intestinal Permeability and Bacterial Translocation in Healthy and Colitic Rats. Food Research International Journal 42(2009): 636–640.

54

Fuller. 1989. Probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology 66: 365-378. Galdeano CM, LeBlanc AM, Viderola G, Bonet MEB, dan Perigón D. 2007. Proposed Model: Mechanisms of Immunomodulation Induced by Probiotic Bacteria. Clin. Vaccine Immunol 14: 485-492. Guerra DG, Decottignies A, Bakker BM, dan Michels PA. 2006. The Mitochondrial FAD Dependent Glycerol 3 Phosphate Dehydrogenase of Trypanosomatidae and The Glycosomal Redox Balance of Insect Stages of Trypanosoma Brucei and Leishmania spp. Mol Biochem Parasitol 149(2):155-69 Gharaei F, dan Eslamifar M . 2011. Isolation and Applications of one strain of Lactobacillus paraplantarum from tea leaves (Camellia sinensis). AmJ Food Technol 6: 429-434. Hemaiswarya, S., Raja, R., Ravikumar, R. dan Carvalho, I.S. 2013 Mechanism Of Action of Probiotics. Braz Arch Biol Technol 56, 113–119. Jean, F., Vassilia T., dan Lionel, B. 2003. Probiotics: what are they? What are their effects on gut physiology? Best Prac & Res Clin Gastroenterol 17: 711-724. Jeppsson, B., Mangell, P., Adawi, D., dan Molin, G. 2004. Bacterial translocation: Impact of probiotics. Journal of Nutrition Narings for skning 48:37-41 Jia, X. Wang, W., Song, Y. Dan Li, N.. 2011. A 90-Day Oral Toxicity Study On A New Strain Of Lactobacillus Paracasei In. Food And Chemical Toxicology 49:1148–1151. Kanra G1, Kara A, Demiralp O, Contorni M, Hilbert AK, Spyr C, dan Viviani S. 2006. Safety and immunogenicity of a new fully liquid DTPw-HepB-Hib combination vaccine in infants. Hum Vaccin 2(4):155-60. Kemgag, S.T., Kapila, S., Shanmugam, V.P., dan Kapila, R. 2014. Cross-talk between probiotic lactobacilli and host immune system. J Appl Microbiol 117: 303–19. Kemgag, S.T., Kapila, S., Shanmugam, V.P., Reddidan, S., dan Kapila, R. 2016. Fermented milk with probiotic Lactobacillus rhamnosus S1K3 (MTCC5957) protects mice from salmonella by enhancing immune and nonimmune protection mechanisms at intestinal mucosal level. Journal of Nutritional Biochemistry 30: 62–73. Koch, S. dan Nusrat, A. 2012 The life and death of epithelia during inflammation: lessons learned from the gut. Annu Rev Pathol 7: 35–60. Kusumawati, N., Jenie, B., S., L., dan Setyahadi, S. 2003. Selection of indigenous Lactic Acid Bacteria as probiotic strain to reduce cholesterol. J. Mikrobiol. Indones. 8 (2) (2003) 39–43. 55

Lestari LA, Harmayani E, dan Sugahara T. 2010. Immunomodulatory Effect of Heat-Killed Indigenous Probiotic in HB4C5 cell-line and Balb/c Mice. In Proceeding of the 2nd International Symposium on Probiotic and Prebiotic, Jakarta, 4-5 August. Lestari LA, Setyabudi FS, Julia M, dan Amalia LD. 2013. Effect of Synbiotic Yogurt Made with Indigenous Probiotic Lactobacillus plantarum Mut7 and Sweet Potato Fiber (Ipomoea batatas) in Healthy Children. International Reaserch Journal of Microbiology 4(3): 98-102. Marteau, P. 2001. Safety Aspects of Probiotics Products. Scandinavian Journal of Nutrition l4(5): 22. Macfie, J. 2004. Current status of bacterial translocation as a cause of surgical sepsis. Combined Gastroenterology Unit, Scarborough Hospital, Scarborough, UK. Muntiha, M., 2001, Teknik Pembuatan Preparat Histopatologi dari Jaringan Hewan dengan Pewarnaan Hematoksilin dan Eosin, Temu Teknis Non Peneliti, :156-163. Nuraida, L. 2015. A review : Health promoting lactic acid bacteria in traditional Indonesian fermented foods. Food Science and Human Wellness, 4(2), 47– 55. Norin, K. E., 1991. Establishment of Lactobacillus And Bifidobacterium Species In Germfree Mice And Their Influence On Some Microflora-Associated Characteristics. Applied and Environmental Microbiology; 1850-1852 Ouwehand, A. C. dan Salminen, S.2003. A review In vitro adhesion assays for probiotics and their in vivo relevance. Microbial Ecology in Health and Disease 15 (4): 175-184. Rahayu, E., S. 2003. Lactic acid bacteria in fermented foods of Indonesian origins, Agritech 23:75–84 Rahayu, E., S., Yogeswara, A., Mariyatun, Windiarti, L., Utami, T., and Watanabe, K. 2015. Molecular characteristics of Indigenous probiotic strains from Indonesia. International Journal of Probiotics and Prebiotics 10(4): 109116. Sariri, A., K., Mulyono, A., M., W., dan Tari, A., I., N. 2012. Effectiveness of Lactobacillus plantarum Mut-7 Agents Fermentation to Reduce Trembesi (Albizia saman) Saponins Content. Universitas Veteran Bangun Nusantara, Sukoharjo Sanders, M., Louis M.A. Akkermans,Dirk Haller,Cathy Hammerman, James Heimbach, Gabriele Hörmannsperger, Geert Huys, dan D. Levy. 2010. Safety Assesment of Probiotic Human Use. Gut Microbes 1(3): 164-185.

56

Shackelford CC, Elwell MR. 1999. Small and Large Intestine, and Mesentary. Di dalam: RR Maronpot, GA Boorman, BW Gaul, Editor. Pathology of the Mouse Reference and Atlas. Vienna: Cache River Press. Hlm 81-115 Snydman, D. 2008. The Safety of Probiotics. Clinical Infectious Diseases 46: 104– 11. Sonfack, T., Kapila, S., Perumal, V., Reddi, S., dan Kapila, R. 2016. Fermented milk with probiotic Lactobacillus rhamnosus S1K3 ( MTCC5957 ) protects mice from salmonella by enhancing immune and nonimmune protection mechanisms at intestinal mucosal level. Journal of Nutritional Biochemistry 30:67-73 Steppe, M., Nieuwerbugh, F., V., Boyen, F., Eeckhaut, V., Deforce, D., Haesebrouck, F., Ducatelle, R., Immerseel, F., V. 2014. Safety assessment of the butyrate-producing Butyricicoccus pullicaecorum strain 25-3T, a potential probiotic for patients with inflammatory bowel disease, based on oral toxicity tests and whole genome sequencing. Food and Chemical Toxicology 72(14): 129–137. Tan D, Martinez NM, Losa C, dan Fernandez C. 2013. Acute Acalculous Cholecystitis Complicated with Peritonitis Caused by Lactobacillus Plantarum. International Journal of Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 76 (13): 510–512 Versalovic, J. 2003. Effects of probiotics on gut microbiota: mechanisms of intestinal immunomodulation and neuromodulation. The Adv Gastroenterol 6(1): 39–51. Villoslada, F, Sierra S, Diaz Roperro, M. Oliveras, dan J Xaus. 2006. Safety Assesment of The Human Milk Isolated Probiotic. Journal of Dairy Science 90: 3583 – 3589 Walker, W. A. 2000 Role of Nutrients and Bacterial Colonization in the Development of Intestinal Host Defense. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 30:52-57. Woo PCY, Fung AMY, Lau SKP, dan Yuen KY. 2002. Identification by 16S rRNA Gene Sequencing of Lactobacillus Salivarius Bacteremic Cholecystitis. J Clin Microbiol 40: 265–7. Yakabe, T., Moore, E., L., Yokota, S., Sui, H., Nobuta, Y., Fukao, M., Palmer, H., and Yajima, N. 2009. Safety assessment of Lactobacillus brevis KB290 as a probiotic strain. Journal of Food and Toxicology. Zhou, J.S., Shou, Q., Rutherfurd, K.J. Prasad, J., Gopal, P.K., dan GilL., S.H. 2000. Acute Oral Toxicit and Bacterial Translocation Studies on Potentially Probiotic Strain of Lactic Acid Bacteria. Food and Chemical Toxicology 38:156-166.

57

Zhu, J., Zhao, L., Guo, H., Jiang, L., dan Ren, F. 2011. Immunomodulatory effects of novel Bifi dobacterium and Lactobacillus strains on murine macrophage cells. Af J Microbiol Res 5(1):8-15.

58