BAB I PENDAHULUAN I.1 Latar Belakang dan Permasalahan Perkembangan bioteknologi pada abad ke dua puluh satu saat ini sangat pesat. Salah satu bidang pengembangan bioteknologi adalah teknologi enzim. Penggunaan teknologi enzim dapat membantu proses industri menjadi lebih mudah, ekonomis dan sederhana (Paul dkk., 2013). Enzim merupakan zat yang sangat penting dalam kehidupan. Masyarakat telah menggunakan enzim tanpa mengetahui apa sebenarnya enzim dan bagaimana enzim dapat bekerja (Arunachalam dan Saritha, 2009). Sebagai contoh sejak dulu masyarakat sering menggunakan daun pepaya atau buah nanas sebagai bahan pelunak daging. Seiring dengan perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi, diketahui bahwa pelunakan daging oleh daun pepaya dan buah nanas dikarenakan aktivitas enzim proteolitik yang terkandung didalamnya. Enzim proteolitik dapat membantu memecahkan protein daging menjadi komponen asam aminonya sehingga membuat tekstur daging menjadi lebih mudah untuk dikunyah. Oleh karena itu, enzim proteolitik merupakan enzim yang memiliki kemampuan untuk menghidrolisis ikatan peptida pada protein sehingga protein terpecah menjadi komponen peptida maupun asam aminonya. Enzim proteolitik pada jaringan tumbuhan dan hewan. Pemurnian enzim proteolitik dari jaringan tumbuhan secara umum lebih mudah daripada yang berasal dari jaringan hewan. Enzim proteolitik
telah diekstrak dari berbagai
macam tumbuhan antara lain dari nanas, labu, kacang dan gandum. Preparasi enzim proteolitik daru tumbuhan yang tinggi dan sulit untuk dimurnikan. Getah merupakan salah satu material pada tumbuhan yang mudah dipreparasi karena lebih mudah untuk dimurnikan (Balls dan Lineweaver, 1939). Salah satu getah dengan kandungan enzim proteolitik yang melimpah adalah getah dari tanaman pepaya yang memiliki nama ilmiah Carica papaya L. Pepaya atau Carica papaya L. merupakan salah satu jenis tanaman yang bernilai ekonomi tinggi. Buah pepaya tidak hanya dapat dikonsumsi dan memiliki 1
2
nilai gizi yang tinggi namun juga berpotensi untuk dikembangkan sebagai enzim yang bermanfaat bagi kehidupan manusia. Buah pepaya muda merupakan bagian yang paling penting karena mengandung jumlah lateks atau getah yang paling banyak. Getah pepaya mengandung banyak enzim terutama enzim proteolitik (Paul dkk., 2013). Enzim proteolitik yang terdapat di dalam getah pepaya antara lain adalah papain dan kimopapain. Kedua enzim tersebut merupakan enzim proteolitik
yang paling banyak ditemukan dalam getah pepaya. Papain dan
kimopapain disebut juga sebagai sistein protease karena memiliki sisi aktif pada residu asam amino sistein. Sampai saat ini, umumnya masyarakat Indonesia menanam pepaya hanya untuk dimanfaatkan daun dan buahnya saja. Seiring dengan kemajuan teknologi, pepaya juga dapat dimanfaatkan getahnya karena mengandung enzim papain. Papain dapat digunakan dalam berbagai industri sehingga menjadi komoditas yang sangat potensial. Sejak puluhan tahun yang lalu, India dan Sri Lanka telah menjadi produsen enzim papain untuk kebutuhan dunia. Setiap tahun kebutuhan papain di dunia semakin meningkat, sehingga negara-negara lain bermunculan sebagai produsen papain (Setyaningsih dan Sediawan, 2004). Indonesia sebagai produsen pepaya terbesar ke lima di dunia belum memanfaatkan peluang untuk ikut serta menjadi produsen enzim papain. Saat ini, enzim papain kasar telah diproduksi secara komersial sebagai pelunak daging (meat tenderizer). Enzim papain juga dapat digunakan dalam berbagai proses industri seperti industri kosmetik, farmasi dan pangan. Putri dkk. (2013) menyatakan bahwa enzim papain merupakan enzim proteolitik yang dapat berfungsi sebagai koagulan pada proses pembuatan keju dan menjadi alternatif sebagai pengganti enzim rennet yang harganya relatif lebih mahal. Hamzah dan Hamzah (2010) menyatakan bahwa enzim papain dapat diproduksi sebagai losion pemutih dan pembersih wajah. Papain yang ditambahkan pada facial wash dapat meningkatkan pengangkatan kulit mati pada permukaan kulit. Penggunaan papain pada facial wash juga dapat menghilangkan noda bekas jerawat dan melembutkan kulit wajah. Krishna dkk. (2008) menyatakan bahwa getah pepaya memiliki kemampuan sebagai bahan baku obat-obatan seperti obat cacing, dispesia, obat
3
diare, permasalahan pencernaan dan penyakit-penyakit lainnya. Menurut Suryatinah dkk. (2013) enzim papain dengan volume 25 mL dapat membunuh 8 ekor cacing Ascaridia galli selama 100 menit inkubasi. Stepek dkk. (2005) menyatakan bahwa kemampuan ekstrak getah pepaya dalam membunuh cacing diakibatkan karena aktivitas dari enzim sistein protease seperti papain dan kimopapain. Getah pepaya memiliki beberapa jenis enzim proteolitik terutama enzim papain dan kimopapain. Penelitian ini akan fokus pada isolasi enzim papain. Warisno (2003) menyatakan bahwa enzim papain didalam perdagangan dibagi menjadi dua jenis yaitu papain kasar (crude papain) dan papain murni (crystal papain). Papain kasar adalah getah pepaya yang dikeringkan dan kemudian dihaluskan sehingga berbentuk tepung. Papain kasar masih mengandung material dan enzim lainnya seperti kimopapain dan lisozim. Papain murni adalah papain kasar yang dimurnikan sehingga tidak mengandung material dan enzim lainnya selain enzim papain. Enzim papain memiliki aktivitas yang tinggi dalam pemecahan protein menjadi peptida dan asam aminonya. Aktivitas enzimatis pada enzim proteolitik dapat diketahui dengan mengukur aktivitas proteolitiknya. Semakin tinggi aktivitas proteolitik yang dimiliki oleh enzim papain maka semakin baik kualitas enzim papain tersebut. Menurut Paul dkk. (2013) aktivitas proteolitik enzim dapat ditentukkan dengan melakukan reaksi hidrolisis pada substrat protein. Reaksi tersebut akan menghasilkan zat warna atau fluorosensi sehingga dapat diukur dengan menggunakan spektrofotometer atau fluorometer. Kualitas papain kasar dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya adalah penambahan antioksidan dan metode pengeringan getah pepaya. Iriani (1991) menyatakan bahwa papain sangat mudah bereaksi dengan oksigen dan juga tidak stabil pada suhu yang relatif tinggi yaitu 75-80 ºC. Penambahan antioksidan seperti natrium bisulfit dan natrium klorida dalam getah pepaya dapat menghambat proses oksidasi dengan udara sehingga aktivitas proteolitik papain kasar yang dihasilkan lebih tinggi. Metode pengeringan getah pada awalnya hanya dilakukan dengan metode pengeringan dibawah sinar matahari. Metode ini
4
menghasilkan aktivitas proteolitik yang sangat rendah akibat mudah teroksidasi oleh udara dan terkontaminasi oleh mikroorganisme. Metode pengeringan getah pepaya kemudian dikembangkan agar dihasilkan enzim dengan aktvitas proteolitik yang tinggi. Menurut Warisno (2003) papain
kasar dapat
diperoleh dengan
mengeringkan getah pepaya dibawah sinar matahari selama 1-3 hari atau sampai semua air dari getah menguap. Papain kasar juga didapatkan dengan mengeringkan getah pepaya pada oven dengan suhu antara 50-60 ºC. Berdasarkan Samson (1986), Purseglove menyatakan untuk mendapatkan papain kasar dari getah pepaya dapat dilakukan dengan mengeringkan getah pepaya pada oven dengan suhu optimum pada 55 ºC. Menurut Paul dkk. (2013) selain pengeringan dengan oven, metode pengeringan getah pepaya juga dapat dilakukan dengan menggunakan freeze dryer dengan suhu optimum yaitu -40 ºC. Iriani (1991) menyatakan bahwa pengeringan getah pepaya dengan suhu rendah akan mengakibatkan enzim papain memiliki kadar air yang tinggi sehingga mudah terserang mikroorganisme sedangkan pengeringan dengan suhu tinggi akan mengakibatkan
terjadinya
denaturasi
enzim
papain
sehingga
aktivitas
proteolitiknya rendah. Oleh karena itu, diperlukan perbandingan antara kedua metode pengeringan oven dan freeze dryer untuk mengetahui metode yang paling efektif dalam menghasilkan enzim papain dengan aktivitas proteolitik yang tinggi. Metode penelitian ini juga dilakukan dengan menambahkan NaCl sebagai senyawa antioksidan untuk menghambat proses oksidasi yang mungkin terjadi, sehingga kualitas enzim papain yang dihasilkan dapat lebih baik dan memiliki aktivitas yang lebih tinggi. Menurut Budiman (2003) papain kasar sering digunakan sebagai bahan dasar pengempuk daging, penggunaan lain dari papain adalah sebagai bahan baku kosmetik dan obat-obatan. Penggunaan papain sebagai bahan baku kosmetik dan obat-obatan memerlukan pemisahan pengotor dan enzim-enzim lain yang dikhawatirkan dapat berpengaruh tidak baik terhadap konsumen. Oleh karena itu, enzim papain perlu dimurnikan dari senyawa lainnya. Balls dan Lineweaver (1939) telah melakukan pemurnian parsial enzim papain dari getah pepaya segar.
5
Berdasarkan
penelitiannya,
enzim
papain
proteolitiknya terhadap substrat hemoglobin
dapat
ditingkatkan
aktivitas
melalui penambahan aktivator
berupa sianida dan senyawa sulfihidril. Kimmel dan Smith (1954) untuk pertama kalinya melakukan pemurnian papain dengan sempurna. Kimmel dan Smith memodifikasi metode Balls dan Lineweaver untuk menghasilkan papain murni dengan aktivitas proteolitik yang tinggi. Berdasarkan penelitiannya, dihasilkan papain murni dengan aktivitas proteolitik yang tinggi terhadap substrat BAA (Benzoil Arginin Amida) yang dicampurkan dengan sistein dan EDTA. Namun karena kelangkaan dan tingginya harga getah pepaya segar, Kimmel dan Smith menggunakan getah pepaya kering komersial sebagai bahan baku untuk mendapatkan papain murni. Kimmel dan Smith menekankan bahwa getah pepaya kering komersial tidak selalu memberikan hasil yang memuaskan. Oleh karena itu, pada penelitian ini akan digunakan papain kasar yang dibuat dari getah pepaya segar sebagai bahan baku untuk mendapatkan papain murni. Metode ini diharapkan akan menghasilkan papain murni dengan aktivitas proteolitik yang lebih tinggi. Akibat mudahnya metode yang digunakan, metode Kimmel dan Smith masih digunakan oleh para peneliti dalam memurnikan enzim papain. Burke dkk. (1974) menggunakan metode Kimmel dan Smith untuk mendapatkan papain murni yang selanjutnya dipisahkan dengan kromatografi afinitas untuk menghilangkan pengotor-pengotor yang masih tertinggal. Hamzah dan Hamzah (2010) telah memurnikan enzim papain dengan metode Kimmel Smith dan mengembangkannya sebagai produk losion pemutih kulit serta sabun pembersih muka. Menurut Paul dkk. (2013) pemurnian enzim papain oleh Kimmel dan Smith dari getah pepaya komersial dapat dilakukan dengan cara ekstraksi getah. Awalnya pH dinaikkan sampai 9 untuk menghilangkan senyawa yang tidak larut, kemudian di lakukan pengendapan melalui 3 kali proses rekristalisasi. Protein yang dihasilkan berupa active papain, activable papain dan non-activable papain. Activable papain dapat diaktifkan dengan mereaksikannya pada senyawa yang mengandung gugus tiol. Penggunaan sistein pada pemurnian enzim papain dapat
6
membuat activable papain teraktivasi dengan terbentuknya gugus sulfihidril. Oleh karena itu, enzim papain semakin banyak yang teraktivasi dan mengakibatkan enzim papain memiliki aktivitas proteolitik yang tinggi. Berdasarkan penelitian Kimmel dan Smith (1954), pemurnian dilakukan dengan membuat enam fraksi tingkat pemurnian. Semakin tinggi fraksi pemurnian, enzim papain yang didapatkan juga akan semakin tinggi aktivitas proteolitiknya terhadap
benzoil-L-arginin-amida.
Kimmel
dan
Smith
tidak
melakukan
perbandingan aktivitas proteolitik fraksi papain murni dengan papain kasar dari getah pepaya komersial. Mempertimbangkan bahwa metode pemurnian membutuhkan proses dan waktu yang lama serta bahan-bahan yang diperlukan untuk pemurnian relatif mahal, maka perlu adanya perbandingan antara aktivitas proteolitik fraksi papain murni dengan papain kasar agar dapat diketahui metode yang paling efisien untuk menghasilkan enzim papain dengan aktivitas yang tinggi. Kimmel dan Smith (1954) menyatakan bahwa hasil samping dari fraksi ke tiga pada pemurnian enzim papain adalah enzim kimopapain. Silaban dkk. (2012) menyatakan bahwa enzim papain kasar terdiri dari papain, kimopapain A, kimopapain B dan papaya peptidase. Daya enzimatis papain kasar sangat tinggi dibandingkan dengan enzim papain murni karena terdiri dari gabungan keempat enzim proteolitik tersebut. Oleh karena itu, pada penelitian ini akan dibandingkan aktivitas proteolitik papain kasar dari getah pepaya segar dengan fraksi ke tiga hasil pemurnian metode Kimmel dan Smith sebagai representasi enzim papain yang telah dipisahkan dari enzim kimopapain sehingga dapat diketahui pengaruh pemisahan enzim kimopapain terhadap aktivitas enzim papain murni (crystal papain). Enzim papain juga memiliki sifat sebagai antibakteri. Menurut penelitian yang telah dilakukan oleh Arum dkk. (2014), getah pepaya kering dapat menyebabkan kebocoran pada membran sel bakteri Staphylococcus aureus. Kebocoran membran sel diakibatkan oleh aktivitas senyawa-senyawa aktif yang merupakan enzim proteolitik. Akibat dari kemampuan memecah protein, enzim proteolitik dalam getah pepaya kering mampu memecah membran sel bakteri.
7
Berdasarkan Arum dkk. (2014), Ashok dkk. menyatakan bahwa ekstrak petroleum eter dan metanol dari getah pepaya menunjukkan kemampuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa. Menurut Anibijuwon dan Udeze (2009) enzim papain telah terbukti memiliki sifat sebagai antibakteri. Enzim proteolitik ini dapat menghambat pertumbuhan bakteri seperti Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli, Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus dan Proteus mirabilis.
Jika
dikaitkan
dengan
permasalahan
lingkungan
yang
ada,
mikroorganisme merupakan salah satu penyebab pencemaran yang terjadi di dalam air sungai. Bakteri pencemar air sungai lazimnya adalah bakteri yang sering dikeluarkan dari usus manusia yaitu fecal coliform. Hal tersebut diakibatkan karena sungai tercemar oleh tinja manusia. Air sungai yang tercemar oleh fecal coliform dapat menimbulkan berbagai macam penyakit terutama penyakit pencernaan. Anonim (2012) menyatakan bahwa 76% sungai di daerah Sleman tercemar bakteri E.coli. Anonim (2006) menyatakan pengujian laboratorium beberapa instansi terkait menunjukan bahwa kualitas air sungai di perkotaaan Yogyakarta sudah sangat memprihatinkan dan tidak layak untuk di konsumsi. Sungai dengan kualitas air terburuk adalah Sungai Code, karena bakteri coliform tinja terdeteksi paling tinggi dan kadungan oksigen terlarut paling rendah. Berdasarkan Data Kualitas Air Sungai Daerah Istimewa Yogyakarta (2014) yang dilakukan oleh Badan Lingkungan Hidup Daerah Istimewa Yogyakarta, hasil analisis air Sungai Code dengan 8 titik lokasi yaitu Boyong, Ngentak, Gondolayu, Sayidan, Keparakan, Tungkak, Ngoto dan Wonokromo memiliki jumlah fecal coliform antara 9000-460000 JPT/100 mL sedangkan total coliform antara 15000-2400000 JPT/100 mL. Titik lokasi yang memiliki jumlah fecal coliform dan total coliform tertinggi terdapat pada lokasi Gondolayu. Peraturan Pemerintah Nomor 82 Tahun (2001) Tentang Pengelolaan Kualitas Air dan Pengendalian Pencemaran Air menyebutkan bahwa kadar maksimum fecal coliform dalam air bersih kelas I adalah 100 JPT/100 mL, kelas II 1000 JPT/100 mL, kelas III dan kelas IV 2000 JPT/100 mL, sedangkan kadar maksimum total coliform dalam air bersih kelas I
8
adalah 1000 JPT/100 mL, kelas II 5000 JPT/100 mL kelas III dan kelas IV 10000 JPT/100 mL. Oleh karena itu, fecal coliform dan total coliform dalam air Sungai Code telah melewati ambang batas yang telah ditentukan. Melalui aktivitas proteolitik sekaligus aktivitas antibakteri yang dimiliki enzim papain, maka diharapkan enzim papain dapat mengurangi jumlah fecal coliform di dalam air sungai sebelum pemakaian oleh rumah tangga. Berdasarkan hal tersebut, terdapat beberapa permasalahan yang akan diteliti yaitu : 1. Apakah metode pengeringan getah pepaya pada oven dan freeze dryer berpengaruh terhadap aktivitas proteolitik papain kasar ? 2. Apakah papain kasar dan fraksi ke tiga papain murni metode Kimmel dan Smith memiliki perbedaan aktivitas proteolitik dengan substrat kasein ? 3. Apakah enzim papain memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri E.coli ? 4. Apakah penambahan enzim papain dalam sampel air sungai Code mempengaruhi jumlah fecal coliform dan total coliform ?
I.2 Tujuan Penelitian Penelitian ini diusulkan dengan tujuan untuk: 1. Mengetahui pengaruh metode pengeringan getah pepaya dengan menggunakan oven dan freeze dryer terhadap aktivitas proteolitik papain kasar 2. Mengetahui perbedaan aktivitas proteolitik dari papain kasar dan fraksi ke tiga papain murni metode Kimmel dan Smith 3. Mengetahui aktivitas antibakteri crude papain terhadap E.coli dan pengaruh penambahannya terhadap jumlah fecal coliform dan total coliform pada sampel air Sungai Code
9
I.3 Manfaat Penelitian Manfaat yang ingin diperoleh dari penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Mendapatkan informasi metode pengeringan getah pepaya yang efektif untuk mendapatkan enzim papain dengan aktivitas proteolitik yang tinggi 2. Mendapatkan
informasi
metode
yang
paling
efisien
untuk
mendapatkan enzim papain dari getah buah pepaya dengan aktivitas proteolitik yang tinggi 3. Mendapatkan informasi aktivitas antibakteri enzim papain terhadap bakteri E. coli 4. Mendapatkan informasi aktivitas antibakteri enzim papain terhadap fecal coliform dan total coliform pada sampel air Sungai Code 5. Memberikan alternatif desinfektan yang ramah lingkungan dengan menggunakan enzim papain sebagai zat untuk mengurangi fecal coliform dan total coliform dalam air.
