Azid sodný a animální modely Alzheimerovy nemoci Sodium Azide and animal models of Alzheimer’s disease Zdena Krištofiková1,2, Jan Bureš1,3, Daniela Řípová1,2 1Centrum neuropsychiatrických studií 2 Psychiatrické centrum Praha 3
Fyziologický ústav Akademie věd České republiky
SOUHRN Primární příčina Alzheimerovy nemoci není v současnosti ještě známá, zdá se však, že výraznou roli v patogenezi tohoto typu demence hraje dysfunkce mitochondrií. Chronická aplikace azidu sodného, selektivního inhibitoru oxidázy cytochromu c, vyvolává deficity v testech učení a paměti a je používaná při animálním modelování různých neurodegenerativních poruch, včetně Alzheimerovy nemoci. Práce udává krátký přehled změn vyvolaných azidem sodným a také seznam plánovaných neurochemických a behaviorálních metod, které by měly být v budoucnosti použity v našich laboratořích při testování validity tohoto modelu.
Klíčová slova: azid sodný, Alzheimerova nemoc, animální model, behaviorální testy, neurochemická analýza
SUMMARY A primary cause of Alzheimer disease is not known yet, however, it seems that mitochondrial dysfunction plays an important role in the pathogenesis of dementia. Chronic application of sodium azide, a selective inhibitor of cytochrome c oxidase, leads to deficits in learning and memory tasks and is used in animal models of different neurodegenerative disorders including Alzheimer’s disease. The study shows a short summary of alterations mediated by sodium azide and also a survey of suggested neurochemical and behavioral methods that should be used in our laboratories for future evaluation of the validity of the model.
Key words: sodium azide, Alzheimer disease, animal model, behavioral tasks, neurochemical analysis
Krištofiková Z, Bureš J, Řípová D. Azid sodný a animální modely Alzheimerovy nemoci. Psychiatrie 2005; 9(Suppl. 3):–38
Úvod Primární příčina demence Alzheimerova typu (AD) není v současnosti ještě známá, zdá se však, že výraznou roli v patogenezi onemocnění hraje dysfunkce mitochondrií (např. Davis et al., 1997; Bubber et al., 2005). V mozku lidí s AD bylo oproti nedementním stejně starým jedincům nalezeno kromě jiných abnormalit také snížené množství synaptických proteinů. Předpokládá se, že jednou z možných příčin této redukce mohou být defektní neuronální mitochondrie, které snížením hladin ATP vyvolají úbytek synapsí a narušení synaptických funkcí. Analýza autoptické mozkové tkáně pacientů s AD odhalila změny v aktivitě řady mitochondriálních enzymů (Bubber et al., 2005), v poslední době se však pozornost soustřeďuje zejména na výzkum 17β-hydroxysteroidové dehydrogenázy typu 10 (17β-HSD-10, dříve označované také jako ERAB, SCHAD nebo ABAD). Experimentální výsledky naznačují, že tento mitochondriální enzym interaguje s intracelulárně lokalizovanými peptidy amyloidu β a vzniklý komplex hraje roli při zprostředkování toxických účinků peptidů (např. Opperman et al., 1999; Frackowiak et al., 2001; He et al., 2002; Wen et al., 2002; Kissinger et al., 2004). Jedním z mnoha užívaných farmakologických animálních modelů AD je chronická aplikace azidu sodného. Tento selektivní inhibitor mitochondriálního enzymu oxidázy cytochromu c způsobí v mozku zvířat změny, které korespondují s některými nálezy pozorovanými u pacientů s AD a vyvolává deficity v testech učení a paměti (např. Bennett a Rose, 1992; Bennett et al., 1992; Bennett et al., 1996; Gibson et al., 1999; Berndt et al., 2001; Szabados et al., 2004). V laboratořích Centra neuropsychiatrických studií je plánováno testování validity různých farmakologických i genetických animálních modelů AD, prvním farmakologickým modelem bude chronické podávání azidu sodného potkanům kmene Long Evans. Oxidáza cytochromu c je terminálním enzymem mitochondriálního respiračního řetězce a klíčovým enzymem v oxidační fosforylaci. Zdá se, že při akutním podání a v experimentech in vitro azid sodný inhibuje reverzibilně oxidázu vazbou do binukleárního centra, chronické podávání azidu však pravděpodobně způsobí ireverzibilní inhibici disociací holoenzymu (Leary et al., 2002). Jiné respirační enzymy azid výrazně neovlivňuje. Inhibice oxidázy vede ke zvýšenému uvolňování kyslíkových volných radikálů a k excitotoxickému poškození nejzranitelnějších oblastí mozku. Morfologická analýza, provedená dva měsíce po skončení jednoměsíční aplikace azidu v množství 24–51 mg/kg/den samcům potkana Sprague-Dawley, signalizovala úbytek nervových buněk ve frontálním kortexu již v případě nejnižší dávky. U vyšších dávek bylo v mozku potkana detekováno i zvýšené množství hyperfosforylovaného tau proteinu a peptidů amyloidu β, překvapivě však žádné změny v aktivitách enzymů spjatých s cholinergní neurotransmisí (Szabados et al., 2004). Metody Cílem neurochemické analýzy provedené v laboratoři Psychiatrického centra Praha bude otestování změn vybraných oblastí mozku a jejich srovnání s nálezy u AD. Plánovány jsou následující metody: 1. Měření stupně peroxidace lipidů pomocí testu s kyselinou thiobarbiturovou. V případě dlouhodobé aplikace azidu sodného lze očekávat následkem zvýšeného uvolňování volných radikálů výrazné změny, které budou srovnány s četnými literárními údaji i s našimi předchozími výsledky (Krištofiková et al., 1995;
Krištofiková et al., 1998). 2. Měření aktivity syntáz oxidu dusnatého pomocí značeného citrulinu v pravé i levé hemisféře. Údaje v literatuře naznačují, že všechny tři syntázy mohou hrát roli v patogenezi AD (např. Molina et al. 1998). Naše experimenty provedené na autoptické hipokampální tkáni pacientů s AD signalizují oproti nedementním kontrolám výrazné změny v aktivitách syntáz zejména v levé hemisféře a jsou tak v souladu s nálezy výraznějšího neurodegenerativního poškození dominantní hemisféry (Toga and Thompson, 2003). Měření změn asymetrie mozku je velmi citlivým ukazatelem neurovývojových a neurodegenerativních poruch. Zdá se, že by mohlo být výhodně použito při testování validity animálních modelů, protože na neurotransmiterové a neuromediátorové úrovni byla oznámena jistá podobnost v lateralitě mozku lidí a hlodavců (Zareba et al., 2002; Krištofiková et al., 2004). 3. Stanovení aktivity hipokampálních presynaptických cholinergních nervových zakončení měřením hladin vysokoafinitního uptaku značeného cholinu. Ačkoliv chronická aplikace azidu sodného nevyvolala žádné změny v aktivitách cholinové acetyltransferázy a acetylcholinesterázy (Szabados et al., 2004), poškození schopnosti prostorového učení v závislosti na užité dávce naznačuje, že by aktivita vysokoafinitního transportu mohla být snížena, a to zejména v hipokampu. Experimentální data totiž signalizují významnou korelaci mezi hladinami uptaku cholinu v hipokampu a prostorovou referenční pamětí, prostorovou navigací a prostorovou pracovní pamětí (Tarricone et al., 1996). 4. Stanovení množství rozpustných a nerozpustných peptidů amyloidu β (fragmenty 1-40 a 1-42) v kortexu potkana pomocí specifických protilátek metodou ELISA. Poměr rozpustných/nerozpustných peptidů i delšího/kratšího fragmentu nebyl zatím v případě azidu sodného ještě stanoven.
Širším cílem plánovaného behaviorálního výzkumu je vypracování nových citlivějších testů kognitivních funkcí, které by umožnily detekci poruch dříve, než dojde k narušení základních forem prostorové navigace. V pokusech prováděných v posledních pěti letech na transgenních myších v Laboratoři neurofyziologie paměti Fyziologického ústavu Akademie věd České republiky docházelo k poruše navigace až u starších myší s výraznou expresí amyloidu β buď rozpuštěného (Koistinaho et al., 2001) nebo tvořícího plaky (Syková et al., 2005). Ve spolupráci s finským pracovištěm prof. Koistinaho byla studována možnost nahradit genetický model farmakologickým zákrokem (intracerebrální injekcí prekurzorového proteinu amyloidu β podávaného tříměsíčním myším). U takto ošetřených zvířat došlo k přechodnému prodloužení únikových latencí v Morissově vodním bludišti, které se však po několika týdnech opět upravilo a nazanechalo patrné patologické následky. Podobné selhání behaviorálních metod při detekci prvních příznaků Alzheimerovy choroby vedlo ke snaze navrhnout novou generaci navigačních testů, které by odhalily i fyziologické, metabolické a morfologické poruchy, k nimž je klasické vodní bludiště necitlivé. Základem těchto nových postupů je disociace navigačního testu v situacích, které připouštějí různá řešení (Bureš et al., 1997; Bureš et al., 1998 ). Na kruhové aréně je vymezen šedesátistupňový sektor, sahající od periferie až 10 cm od středu arény, jehož návštěva je trestána slabou elektrickou ranou do tlapek. Pokud se aréna neotáčí, je poloha zakázaného sektoru vymezena aloteticky vůči vzdáleným, mimo arénu ležícím orientačním bodům, ale i idioteticky vůči zrakově, čichově i hmatově percipovatelným oblastem na podlaze arény (substrátová idiotéze). Zvíře může použít jak alotetický, tak idiotetický referenční systém k určení své polohy a směru k cíli. Alotetické podněty je možno potlačit temnotou, idiotetické
pohybem po beztvarém substrátu (vodní hladina, zasněžená nebo jemným pískem pokrytá pláň), ale i jediný referenční systém může zajistit spolehlivou navigaci. Složitější situace nastává, začne-li se aréna pomalu otáčet kolem své osy (Fenton et al., 1998). V tomto případě zůstává idiotetická orientace vázána na nitroarénové orientační body, alotetická orientace na referenční body ležící mimo arénu. V průběhu rotace se tedy zakázaná oblast rozdvojí ve dvě části, jedna zůstává na stejném místě rotující podlahy, druhá zůstává stejně daleko od různých význačných bodů místnosti (od dveří, okna, knihovny) a postupně se po rotující aréně posunuje. Chování zvířete záleží na podmínkách pokusu vymezujících, zda elektrická rána bude aplikována po vstupu do idioteticky určené oblasti arény nebo do aloteticky definovaného prostoru místnosti, jímž povrch arény projíždí. Trestající podnět může být aplikován v obou případech, což vyžaduje, aby se zvíře vyhnulo pohyblivému alotetickému sektoru i náhodnému vstupu do idiotetického sektoru, pevně umístěného na rotující podlaze. Rotující aréna se jeví jako laboratorní abstrakce, ale mnohé situace vyskytující se v přirozeném prostředí jsou analogické. Vodní ptáci, hnízdící na břehu řeky, hledají potravu v tekoucím proudu, vracejí se však k mláďatům v hnízdě na pevném břehu. Podobně ptáci hnízdící v křovinách a stromech se často přemísťují k místům, kde sbírají potravu, přelety v rychle proudícím vzduchu, jehož pohyb může značně změnit trajektorii odpovídající nejkratší dráze start – cíl ve stabilním prostředí. V těchto případech musí navigující subjekt vzít v úvahu dráhu, kterou by zamýšlená lokomoce generovala ve stabilním prostředí, změny prostředí, k nimž ve stejné době dojde bez jeho přičinění a anticipovat opravnou lokomoci, která by mohla nežádoucí výsledek potlačit a realizovat původní záměr. Zřejmě jde o náročnější výpočetní operaci, která vyžaduje generaci dvou různých navigačních scénářů a jejich citlivé vyrovnání. Není proto překvapující, že již funkční vyřazení jednoho hipokampu brání kryse vyhnout se nebezpečnému místu na pohyblivé, ale ne na stabilní aréně (Cimadevilla et al., 2001). Různé referenční rámce nejsou omezeny jen na pohybující se a fixní části terénu, ale zahrnují i jednotlivé biologicky významné organizmy, jejichž přiblížení k subjektu je nebezpečné (predátoři) nebo žádoucí (samička, matka). Jednoduchý model predátora a pronásledovaného zvířete je možno realizovat na kruhové aréně, po níž se pohybují dva potkani hledající po aréně rozptýlenou potravu. Potkan mající úlohu pronásledovaného zvířete se nesmí přiblížit na méně než 20 cm k potkanu predátorovi. V této nebo menší vzdálenosti dostává každou sekundu slabé elektrické rány do tlapek, které může přerušit tím, že zvětší svou vzdálenost od predátora na více než 20 cm. Počet ran, které pronásledované zvíře dostává, je registrován podobně jako průměrná vzdálenost oddělující obě zvířata od sebe. Pokud nejsou aplikovány bolestivé podněty, je průměrná vzdálenost obou zvířat během 20minutového sezení 15 až 20 cm. Po 15 sezeních antipredačního chování vzroste tato vzdálenost na 30–40 cm (Fenton a Bureš, 2003). Elektrické ráně je možno se vyhnout i jiným způsobem obdobným sociální obraně. Ta většinou spočívá v přivolání silného protektora, jehož přítomnost utlumí agresivní chování predátora. V počítačové simulaci jsou nasazena tři zvířata: subjekt, predátor a protektor. Úloha prvních dvou je stejná jako v předchozím případě, ale další řešení poskytuje přítomnost protektora. Subjekt se může vyhnout elektrické ráně nejen utěkem od predátora, ale i vstupem do ochranné zóny protektora (např. méně než 40 cm). Je-li splněna tato podmínka, je šokový obvod blokován a subjekt nedostává žádné elektrické rány, i když je v těsné blízkosti predátora. Vytvoření této možnosti podstatně zlepšuje dostupnost potravy pro trestanou krysu, která v interakci subjekt predátor nemůže beztrestně navštívit blízké okolí predátora. Projeví-li však o tuto oblast s bohatým výskytem potravy zájem i protektor, může ji subjekt v jeho doprovodu kdykoli navštívit, a tak podstatně zvýšit dostupnost potravy v prostoru pokusné aparatury. Výše popsané testy budou použity jednotlivě i v kombinacích. Lze očekávat, že jednotlivé testy budou odolné vůči menším poruchám hipokampové funkce, které však znemožní optimalizaci chování jejich kombinací.
Závěr Cílem připravovaného výzkumu je vyvinout základní formy výše uvedených testů, prozkoumat jejich odolnost vůči různě intenzivní azidové intoxikaci a ověřit diferencovanou reverzibilitu zjištěných poruch. Po vyhodnocení výsledků neurochemické analýzy a behaviorálních testů a po jejich následném srovnání bude odhadnuta validita tohoto modelu AD.
Podpořeno projektem MŠMT 1M0002375201.
Ing. Zdena Krištofiková Psychiatrické centrum Praha, Ústavní 91, 181 03 Praha 8 e-mail:
[email protected] LITERATURA Bennett MC and Rose GM. Chronic sodium azide treatment impairs learning of the Morris water maze task. Behav Neural Biol 1992; 58:72–75. Bennett MC, Diamond DM, Stryker SL, Parks JK, Parker WD. Cytochrome oxidase inhibition: a novel animal model of Alzheimer’s disease. J Geriatr Psychiatry Neurol 1992; 5:93–101. Bennett MC, Mlady GW, Fleshner M, Rose GM. Synergy between chronic corticosterone and sodium azide treatments in producing a spatial learning deficit and inhibiting cytochrome oxidase activity. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:1330–1334. Berndt JD, Callaway NL, Gonzales-Lima F. Effects of chronic sodium azide on brain and muscle cytochrome oxidase activity: a potential model to investigate environmental contributions to neurodegenerative diseases. J Toxicol Environ Health 2001; 63:67–77. Bubber P, Haroutunian V, Fisch G, Blass JP, Gibson GE. Mitochondrial abnormalities in Alzheimer brain: Mechanistic implications. Ann Neurol 2005; 57:695–703. Bureš J, Fenton AA, Kaminsky Y, Rossier J, Sacchetti B, Zinyuk L. Dissociation of exteroceptive and idiothetic orientation cues: effect on hippocampal place cells and place navigation. Philos Trans R Soc London B 1997; 352:1515–1524. Bureš J, Fenton AA, Kaminsky Y, Wesierska M, Zahalka A. Rodent navigation after dissociation of the allocentric and idiothetic representations of space. Neuropharmacology 1998; 37:689–699. Cimadevilla JM, Wesierska M, Fenton AA, Bures J. Inactivating one hippocampus impairs avoidance of a stable place through which the arena moves. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:3531–3536. Davis RE, Miller S, Herrnstadt CX, Ghosh SS, Fahy E, Shinobu LA, Galasko D, Thal LJ, Beal MF, Howell N, Parker WD. Mutation in mitochondrial cytochrome c oxidase genes segregate with late-onset Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 94:4526–4531. Fenton AA, Bureš J. Navigation in the moving world. In Jeffery KJ (Ed.) The neurobiology of
spatial behaviour. Oxford University Press 2003; 240–258. Fenton AA, Wesierska M, Kaminsky Y, Bureš J. Both here and there: simultaneous expression of autonomous spatial memories in rats. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95:11493–11498. Frackowiak J, Mazur-Kolecká B, Kaczmarski W, Dickson D. Deposition of Alzheimer’s vascular amyloid-β is associated with decreased expression of brain L-3-hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase (ERAB). Brain Res 2001; 907:44–53. Gibson GE, Park LC, Zhang H, Sorbi S, Calingasan NY. Oxidative stress and a key metabolic enzyme in Alzheimer brains, cultured cells, and an animal model of chronic oxidative deficits. Ann NY Acad Sci 1999; 893:79–94. He XY, Wen GY, Merz G, Lin D, Yang YZ, Mehta P, Schulz H, Yang SY. Abundant type 10 17β-hydroxysteroid dehydrogenase in the hippocampus of mouse Alzheimer’s disease model. Mol Brain Res 2002; 99:46–53. Kissinger CR, Rejto PA, Pelletier LA, Thomson JA, Showalter RE, Abre MA, Agree CS, Margosiak S, Meng JJ, Aust RM, Vanderpool D, Li B, Tempczyk-Russel A, Villafranca JE. Crystal structure of human ABAD/HSD10 with a bound inhibitor: implications for design of Alzheimer’s disease therapeutics. J Mol Biol 2004; 342:943–952. Koistinaho M, Ort M, Cimadevilla JM,Vondrous R, Cordell B, Koistinaho J, Bures J, Higgins LS. Specific spatial learning deficits become severe with age in beta-amyloid precursor protein transgenic mice that harbor diffuse beta-amyloid deposits but do not form plaques. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:3537–3542. Krištofiková Z, Klaschka J, Tejkalová H. Effect of aging on lipid peroxide levels induced by L-glutamic acid and estimated by means of a thiobarbituric acid test in rat brain tissue. Exp Gerontol 1995; 30:645–657. Krištofiková Z, Majer E, Fales E, Pěkný I, Klaschka J. Effects of aging and dementia on the levels of thiobarbituric-acid-reactive products stimulated by L-glutamic acid in human autopsy and biopsy brain tissue. Dement Geriatr Cogn Disord 1998; 9:6–12. Krištofiková Z, Šťastný F, Bubeníková V, Druga R, Klaschka J, Španiel F. Age- and sex-dependent laterality of rat hippocampal cholinergic system in relation to neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. Neurochem Res 2004; 29:671–680. Leary SC, Hill BC, Lyons CN, Carlson CG, Michaud D, Kraft CS, Ko K, Glerum M, Moyes CD. Chronic treatment with azide in situ leads to an irreversible loss of cytochrome c oxidase activity via holoenzyme dissociation. J Biol Chem 2002; 277:11321–11328. Molina JA, Jiménez-Jiménez FJ, Ortí-Pareja M, Navarro JA. The role of nitric oxide in neurodegeneration. Drugs & Aging 1998; 12:251–259. Oppermann UCD, Salim S, Tjernberg LO, Terenius L, Jörnvall H. Binding of amyloid β-peptide to mitochondrial hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (ERAB): regulation of an SDR enzyme activity with implications for apoptosis in Alzheimer’s disease. FEBS Lett 1999; 451:238–242. Syková E, Voříšek I, Antonova T, Mazel T, Meyer-Luehman M, Jucker M, Hajek M, Ort M, Bures J. Changes in extracellular space size and geometry in APP23 transgenic mice: a model of Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 102:479–484. Szabados T, Dul C, Majtényi K, Hargitai J, Pénzes Z, Urbanics R. A chronic Alzheimer’s model
evoked by mitochondrial poison sodium azide for pharmacological investigations. Behav Brain Res 2004; 154:31–40. Tarricone BJ, Simon JR, Li YJ, Low WC. Neural grafting of cholinergic neurons in the hippocampal formation. Behav Brain Res 1996; 74:25–44. Toga AW and Thompson PM. Mapping brain asymmetry. Nature Rev 2003; 4:37–48. Wen GY, Yang SY, Kaczmarski W, He XY, Pappas KS. Presence of hydroxysteroid dehydrogenase type 10 in amyloid plaques (APs) of Hsiao’s APP-Sw transgenic mouse brains, but absence in APs of Alzheimer’s disease brains. Brain Res 2002; 954:115–122. Zareba G, Hojo R, Zareba KM, Watanabe C, Markowski VP, Baggs RB, Weiss B. Sexually dimorphic alterations of brain cortical dominance in rats prenatally exposed to TCDD. J Appl Toxicol 2002; 22:129–137.
