Az NO-cGMP-PKG-rendszer gyógyszeres befolyásolása szívinfarktus állatkísérletes modelljében

Cardiologia Hungarica 2012; 42 : 6–13 © 2012 Locksley Hall Media

Eredeti közlemény

Az NO-cGMP-PKG-rendszer gyógyszeres befolyásolása szívinfarktus állatkísérletes modelljében Barnucz Enikő1,2, Korkmaz Sevil2, Radovits Tamás1,2, Veres Gábor1,2,3, Hirschberg Kristóf1,2, Hegedűs Péter1,2, Páli Szabolcs2, Merkely Béla1, Szabó Gábor2 1

Semmelweis Egyetem, Kardiológiai Központ, Budapest 2 Heidelbergi Egyetem, Szívsebészeti Kutató Laboratórium, Heidelberg 3 Semmelweis Egyetem, Szívsebészeti Klinika, Budapest Levelezési cím: Barnucz Enikő 69120, Heidelberg Im Neuenheimer Feld 326. 2.OG, Tel.: +49 6221 566246 E-mail: [email protected]

Kulcsszavak: miokardiális infarktus, nitrogén-monoxid, cinaciguat, szolubilis guanilát-cikláz aktiváció Keywords: myocardial infarction, nitric oxide, cinaciguat, soluble guanylate cyclase activation

Bevezetés: Az NO-cGMP-cGMP-dependens protein-kináz-G útvonal szolubilis guanilát-cikláz aktivátorral (cinaciguat) történő aktiválása és ennek következtében az intracelluláris cGMP-szint emelkedése kardioprotektív hatással rendelkezik. Kísérleteink során a cinaciguat kezelés hatásait vizsgáltuk izoproterenol által indukált miokardiális infarktus kísérletes patkánymodelljén. Módszerek: SD-patkányokat napi két alkalommal négy napon át kezeltünk cinaciguattal, a kontrollállatokat ennek vivőanyagával (metilcellulóz-oldat). 85 mg/kg izoproterenol kétszeri (egymást követő napokon adott) szubkután injekciójával szívinfarktust idéztünk elő. 17 óra elteltével a szív pumpafunkcióját bal kamrai nyomás–térfogat-analízis során regisztráltuk konduktancia-katéter segítségével. A hemodinamikai mérést követően a vizsgált szívek hisztopatológiai és molekuláris biológiai vizsgálatok céljából konzerválásra kerültek. A relatív génexpresszió meghatározása kvantitatív real-time PCR-rel történt. Eredmények: A cinaciguat előkezelés hatására javult a szív pumpafunciója és relaxációs képessége, mérséklődött a nekroenzimek felszabadulása, továbbá csökkentek a vizsgált hisztopatológiai elváltozások, az oxidatív stressz mértéke, valamint a ciklooxigenáz-2, TGFß és béta-aktin mRNS expressziója a miokardiális infarktust elszenvedett állatokon. Konklúzió: A szolubilis guanilát-cikláz gyógyszeres aktiválása új terápiás alternatívát jelenthet az iszkémiás szívbetegségek megelőzésében és kezelésében. Pharmacological modulation of the NO-cGMP-PKG pathway in a rat model of myocardial infarction Background: Activation of the nitric oxide/cGMP/cGMP-dependent protein kinase G pathway exerts cardioprotective effects. The novel soluble guanylate cyclase activator cinaciguat has been reported to elevate intracellular cGMP levels and activate the nitric oxide/cGMP/cGMP-dependent protein kinase G pathway in vivo. We investigated the effects of cinaciguat on myocardial infarction induced by isoproterenol in rats. Methods: SD rats were treated orally twice a day for 4 days with methyl-cellulose vehicle or cinaciguat. Isoproterenol (85 mg/kg) was injected subcutaneously 2 days after the first treatment at an interval of 24 hours for 2 days to produce myocardial infarction. After 17 hours, left ventricular pressure-volume analysis was performed with a conductance catheter to assess cardiac function. Myocardial tissue samples were collected for histopathological and molecular biological measurements. Gene expression analysis was performed by quantitative real-time PCR. Results: Cinaciguat pretreatment improved cardiac performance, ameliorated intracellular enzyme release and histopathological lesions, reduced oxidative stress, and decreased cyclooxygenase-2, transforming growth factor-ß, and ß-actin mRNA expression in experimentally induced myocardial infarction in rats. Conclusion: Pharmacological soluble guanylate cyclase activation could be a novel concept for the prevention and treatment of ischemic heart disease.

Cardiologia Hungarica 2012; 42 : 6

Barnucz és munkatársai: Az NO-cGMP-PKG-rendszer gyógyszeres befolyásolása miokardiális infarktus során a koszorúerek elzáródása következtében felborul az egyensúly a szív oxigénellátottsága és oxigénszükséglete között, amely a véráramlás helyreállásának hiányában a szívizomzat elhalásához vezet. Több, nemzetközi kutatás foglalkozik a szívizomzat iszkémia-reperfúziós károsodással szembeni megóvásának lehetőségeivel. A kardioprotekció egyik lehetséges módja a nitrogén-monoxid (NO)/ szolubilis guanilát-cikláz (sGC)/ciklikus GMP (cGMP)/ cGMP-dependens protein-kináz-G (PKG)-útvonal gyógyszeres befolyásolása. Az intakt érfalban az endotheliális NO az sGC hem egységének ferro (Fe2+)-ionjához kötődve aktiválja az enzimet, amely fokozott cGMP-termelődéshez vezet. Az emelkedett intracelluláris cGMP szerteágazó hatásokat fejt ki, többek között: x vazodilatáció, x a trombocitaaggregáció-gátlás, x sejtproliferáció-gátlás (1). A kardiovaszkuláris rendszer betegségei mögött igen gyakran az NO-cGMP-cGMP-dependens protein-kináz-G útvonal károsodása áll. Fiziológiás körülmények között az sGC főként oxidált (hem-mentes), nem NOérzékeny sGC és redukált NO-érzékeny sGC formában van jelen, míg patofiziológiás körülmények között (pl. diabetes mellitus, iszkémiás szívbetegségek, ateroszklerózis) a nem NO-érzékeny sGC kerül túlsúlyba (2). A szerves nitrátok a koszorúér-betegségek terápiájában széles körben alkalmazott NO-donorok, azonban tartós használatuk tolerancia kialakulásához vezet, valamint nem képesek a nem NO-érzékeny sGC-t aktiválni (3, 4). Az újonnan kifejlesztett sGC-aktivátor cinaciguat képes az sGC NO-inszenzitív (hem-mentes), oxidált állapotának aktiválására, így cGMP-termelésen át vazodilatációt okoz – preferenciálisan a beteg ereken (5). A cinaciguat vazodilatátor hatással bír in vitro izolált ereken, in vivo pedig trombocitaaggregáció-gátló, vérnyomáscsökkentő, valamint a szerves nitrátokhoz hasonló hemodinamikai hatásait figyelték meg (6). Az izoproterenol béta-adrenerg agonista szintetikus katekolamin, amelyet akut miokardiális infarktus indukálására alkalmaznak kísérletes patkánymodellben, főként mivel az általa kiváltott akut miokardiális nekrózis (szérum enzimelváltozások, EKG- és hisztológiai eltérések) dinamikája hasonló a humán esetekéhez. A fent említett miokardiális infarktus modell jól standardizálható, noninvazív eljárás különböző kardioprotektív terápiás eljárások vizsgálatára (7–9). Kísérleteink során a cinaciguat hatásait vizsgáltuk izoproterenol-indukálta miokardiális infarktus modelljén patkányokban (10). Célparaméternek a szív funkciós, hisztológiai, biokémiai és génexpresszióbeli elváltozásokat tekintettük.

A

Módszerek Akut miokardiális infarktus modell Izoproterenol szubkután injekciójával (85 mg/kg) kezeltünk hím Sprague–Dawley-patkányokat (250-300 g) két egymást követő napon miokardiális infarktus kiváltása céljából (7–9). Vizsgálatainkat a kísérleti állatok tartásáról és felhasználásáról szóló nemzetközi szabályoknak (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, US National Institutes of Health 1996; 85–23.) mindenben megfelelően, érvényes hatósági engedély birtokában végeztük.

KÍSÉRLETI CSOPORTOK A patkányokat randomizáltan, 4 kísérleti csoportba soroltuk be, a kísérleti csoportokba 9-14 kísérleti állat tartozott. A „kontrollcsoportba” tartozó állatok 4 napon át a cinaciguat vivőanyagát (metilcellulóz-oldat) kapták, a 3. és 4. napon pedig steril desztillált vizet (az izoproterenol oldószerét) szubkután injekció formájában. Az „izoproterenol” csoport 4 napon át metilcellulóz előkezelést, a 3. és 4. napon izoproterenolt kapott. A „cinaciguat+izoproterenol” csoport 4 napon át cinaciguat előkezelésben részesült, majd a 3. és 4. napon izoproterenolt kapott szubkután. A „cinaciguat” csoport 4 napon át cinaciguatot kapott és a 3. és 4. napon desztillált vizet szubkután. A cinaciguat és a metilcellulóz kezelés gyomorszondán át történt, a cinaciguat dózisa 10 mg/kg volt. A hemodinamikai mérések 17-22 órával az utolsó kezelést követően történtek.

Hemodinamikai mérések A bal kamrai nyomás–térfogat-diagramokat Millarkonduktancia katéter segítségével regisztráltuk pentobarbitállal (60 mg/kg) altatott állatokon (11).

Biokémiai vizsgálatok A biokémiai mérésekhez vért vettünk az állatoktól (a vena cana inferiorból) majd a vérplazmát a későbbi vizsgálatokhoz –80 ºC-on tároltuk. A plazma cGMP és cAMP koncentrációját ELISA-módszer segítségével határoztuk meg (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Az LDH (laktát-dehidrogenáz) és a TBARS (tiobarbitursav-reaktív anyagok, az oxidatív stressz markere) aktivitást kereskedelmi forgalomban lévő kittel határoztuk meg (Biotrend Chemikalien GmbH, Cologne, Germany; ZeptoMetrix Corp, Buffalo, NY).

Kvantitatív real-time PCR A szívek apikális részéből a teljes RNS-t Rneasy Fibrous Tissue Minikittel (Quiagen, Hilden, Germany) izoláltuk. Az RNS mennyiségét és minőségét fotometriás módszerrel határoztuk meg (260, 280 és 230 nm). A reverz transzkripcióhoz QuantiTect Reverse Trans-

Cardiologia Hungarica 2012; 42 : 7

Barnucz és munkatársai: Az NO-cGMP-PKG-rendszer gyógyszeres befolyásolása

Kontroll

Izoproterenol

Cinaciguat+Izoproterenol

Cinaciguat

1. ábra. A szívizom szövettani vizsgálata hematoxillin-eozin festéssel (100×)

cription Kitet (Quiagen) használtunk. A kvantitatív real-time PCR-t LightCycler480-nal végeztük.

Eredmények Hisztopatológiai eredmények

Hisztopatológiai eljárások A kísérleti állatok szívének bazális részét pufferelt 4%-os formalin oldatban, az apikális részét folyékony nitrogénben konzerváltuk. A hisztológiai vizsgálatokhoz a szívekből 5 µm-es szeleteket készítettünk. A metszetek morfológiai értékeléséhez hematoxillineozin (HE) festést végeztünk. A szívek 4 területéről készítettünk 100×-os nagyítással felvételt, amelyet azután a következő „score” rendszer szerint, szemikvantitatívan értékeltünk: x A: nincs patológiás eltérés, x +: kevesebb, mint a terület 10%-a érintett, x ++: a patológiás jelenség a terület 11-50%-án figyelhető meg, x +++: a sérülés több mint 50%.

Statisztika Az értékeket átlag±átlag szórása (SEM) formában tüntettük fel. A csoportok összehasonlítása egyutas ANOVA-val és Bonferroni-teszt alkalmazásával történt, a p£0,05 értékeket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak (*p<0,05 vs. kontroll, #p<0,05 vs. izoproterenol).

Az izoproterenollal kezelt patkányok myocardiumában miofibrilláris degenerációt figyeltünk meg gyulladásos jelekkel és intersticiális ödémával (1. ábra). Cinaciguat kezelés hatására szignifikánsan csökkent a nekrózis és gyulladás mértéke izoproterenol adását követően. A cinaciguattal kezelt csoportban a szívizom szerkezete szövettanilag ép maradt. Az 1. táblázatban a cinaciguat szövettani változásokra gyakorolt hatása látható a különböző csoportokban.

Plazma LDH- és TBARS-aktivitás Izoproterenollal kezelt patkányokban emelkedett LDH-szintet figyeltünk meg, amely cinaciguat előkezelés hatására normalizálódott (2. A ábra). A plazma TBARS-szintje izoproterenol kezelés hatására megemelkedett, amelyet a cinaciguat kezelés szignifikánsan csökkentett (2. B ábra).

A cinaciguat kezelés hatása a szív funkcionális paraméterekre akut miokardiális infarktust követően Az izoproterenollal kezelt patkányok szisztolés pumpafunkciója szignifikánsan csökkent a kontrollcso-

2. ábra. A cinaciguat hatásai a plazma laktát-dehidrogenáz (LDH; A) és TBARS (B) szintre izoproterenol (Izo) indukálta szívinfarktus után patkányokban. Az értékek átlag±SEM vannak ábrázolva * p<0,05 vs. kontroll, #p<0,05 vs. izoproterenol

Cardiologia Hungarica 2012; 42 : 8

Barnucz és munkatársai: Az NO-cGMP-PKG-rendszer gyógyszeres befolyásolása 1. táblázat. A cinaciguat kezelés hatása a szívizom szövettani képére izoproterenol indukálta szívinfarktus után (0: elváltozás nélkül; +: enyhe mértékű elváltozás; ++: közepes mértékű elváltozás; +++: súlyos mértékű elváltozás)

Csoportok Kontroll

Nekrózis Ödéma

Gyulladás

0

0

0

++

++

+++

Izoproterenol+ cinaciguat

+

+

++

Cinaciguat

0

0

0

Izoproterenol

porthoz képest. A bal kamrai végszisztolés nyomás–térfogat-diagram (ESPVR) egyenesének meredeksége (Emax) és az ún. preload recruitable stroke work jelentősen csökkent az izoproterenollal kezelt állatokban (12). A cinaciguat előkezelés jelentős növekedést eredményezett a fent említett paraméterekben

(3. A és 3. B ábra). Az izoproterenol kezelés meredekebb egyeneseket eredményezett a végdiasztolés nyomás–térfogat-diagramon (EDPVR), jelezvén a nagyobb végdiasztolés merevséget, míg a „cinaciguat+izoproterenol” csoport esetén nem különbözött a kontrollcsoporttól (3. C ábra). Az izoproterenol kezelés hatására csökkent relaxációs képességet figyeltünk meg (megnyúlt tau-g), amely cinaciguat előkezelés hatására normalizálódott (3. D). Az „izoproterenol” csoportban a szívfrekvencia szignifikánsan emelkedett, csökkent az ejekciós frakció és a kardiális munkavégzés (stroke work) (2. táblázat). SGC-aktivátorral való kezelés hatására a fenti paraméterek jelentősen javultak. Az infarktust elszenvedett csoportban a bal kamrai végdiasztolés nyomás emelkedett, csökkent a verőtérfogat és a relaxációs képesség (dP/dtmin); ezen paraméterek nem változtak cinaciguat előkezelés hatására. A „cinaciguat+ izoproterenol” csoportban csökkent artériás középnyomást és bal kamrai nyomást regisztráltunk; a cinaciguat kezelés nem volt hatással a hemodinamikai paraméterekre ezen csoportban.

3. ábra. A cinaciguat kezelés hatásai. A: Emax-ra (a bal kamrai végszisztolés nyomás-térfogat összefüggés meredeksége); B: az ún. preload-recruitable stroke workre (PRSW); C: végdiasztolés nyomás-térfogatösszefüggésre (EDPVR); D: a bal kamrai relaxáció időkonstansára (tau-g). Az értékek átlag±SEM vannak ábrázolva. *p<0,05 vs. kontroll, #p<0,05 vs. izoproterenol

Cardiologia Hungarica 2012; 42 : 9

Barnucz és munkatársai: Az NO-cGMP-PKG-rendszer gyógyszeres befolyásolása 2. táblázat. A cinaciguat kezelés hatása a szívfrekvenciára, artériás középnyomásra (MAP), bal kamrai szisztolés nyomásra, bal kamrai végdiasztolés nyomásra, ejekciós frakcióra, bal kamrai (LV) kontraktilitásra (+dP/dt) és relaxációra (–dP/dt), végdiasztolés térfogatra, végszisztolés térfogatra, verőtérfogatra, hatékonyságra, teljes perifériás rezisztenciára (SVR), artériás tágulékonyságra (Ea), miokardiális munkavégzésre, végdiasztolés nyomás-térfogat összefüggésre (EDPVR) izoproterenol indukálta szívinfarktusban patkányokban. Az értékek átlag±SEM vannak ábrázolva. *p<0,05 vs. kontroll, #p<0,05 vs. izoproterenol

Kontroll

Izoproterenol

Cinaciguat+ izoproterenol

Cinaciguat

427±9 102±3

485±12* 89±3

448±12 64±3*#

413±10# 115±7#

133±4

102±3*

88±4*#

138±4#

Szívfrekvencia (ütés/perc) MAP (Hgmm) Bal kamrai szisztolés nyomás (Hgmm) Bal kamrai végdiasztolés nyomás (Hgmm) Ejekciós frakció (%) LV+dP/dt (Hgmm/s)

5,9±0,3

10,5±1,0*

9,9±0,8*

6,1±0,3#

56±6 8372±389

41±4* 7607±370

46±4 8660±548

54±6 8426±520

LV–dP/dt (Hgmm/s) Végdiasztolés volumen (µl)

12 063±770 280±42

6474±457* 329±39

6608±430* 348±29

12 087±545# 246±16

Végszisztolés volumen (µl)

213±26

270±33

230±21

171±10#

Verőtérfogat (µl)

192±12

165±15

155±12

Hatékonyság (%)

61,8±4,0

137±16* 63,0±4,2

SVR (Hmmg · min/ml) Ea (Hgmm/µl) Miokardiális munkavégzés (Hgmm · µl) +dP/dt-EDV (Hgmm/s/µl)

61,3±3,2 #

54,0±4,6

1,75±0,22 0,92±0,12

1,85±0,17 1,02±0,10

1,17±0,22 0,69±0,09#

1,79±0,13 1,07±0,09

16 057±1172

9711±1211*

10 338±1141*

13 005±1345

46,6±6,4

35,7±2,9

42,0±9,9

43,7±3,4

A cinaciguat kezelés hatása az akut miokardiális infarktust követő mortalitásra A „kontroll” és a „cinaciguat” csoportokban nem fordult elő elhullás. A kísérletek során az elhullási arány 56% volt az „izoproterenol” csoportban, 33% a „cinaciguat+izoproterenol” csoport esetében.

A cinaciguat kezelés hatása a plazma cGMP-, cAMP-szintjére és a szívizomzat cGMP-szintjére A plazma cGMP-szint szignifikáns emelkedését figyeltük meg az „izoproterenol” és a „cinaciguat+izoproterenol” csoportokban, ezzel szemben a „kontroll” és a „cinaciguat” csoportokban nem észleltünk változást (4. A ábra). A plazma cAMP-szint nem különbözött az egyes csoportokban (4. B ábra). A cinaciguattal előkezelt csoportban a miokardiális cGMP-szint szignifikánsan emelkedett a kontrollcsoporthoz képest (4. C ábra).

A cinaciguat kezelés hatása a miokardiális génexpresszióra Az atriális nátriuretikus fehérje (ANP), ciklooxigenáz2 (COX-2), TGFß1, ß-aktin mRNS-expresszió az „izoproterenol” csoportban szignifikánsan emelkedett volt a kontrollcsoporthoz viszonyítva, míg a ß-miozin nehéz lánc és az endotheliális NOS mRNS-expressziója nem változott. A cinaciguat kezelés megelőzte a COX-2, TGFß1 és ß-aktin mRNS-expresszió emelkedését, az ANP-expresszió nem különbözött az egyes csoportokban (5. ábra).

Megbeszélés Kísérleteink során az NO- és hem-független sGC-aktivátor cinaciguat hatásait vizsgáltuk izoproterenol által indukált akut szívinfarktus modellen. Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy a cinaciguat kezelés hatására a szív pumpafunkciója javul, az oxidatív stressz, a hisztopatológiai elváltozások és a miokardiális nekroenzim kiáramlás mértéke csökken.

Cardiologia Hungarica 2012; 42 : 10

Barnucz és munkatársai: Az NO-cGMP-PKG-rendszer gyógyszeres befolyásolása (EF) csökkenése is. Az EF-et az elő- és utóterhelés is befolyásolja, a kontraktilitás pontos jellemzésére nem alkalmas, ezért elő- és utóterheléstől független érzékeny kontraktilitás-paramétereket is számítottunk (a végszisztolés nyomás-térfogat összefüggés (ESPVR) meredeksége (Emax) és a verőmunka-végdiasztolés térfogat összefüggés meredeksége (az ún. preload recruitable stroke work – PRSW), amelyek jelentősen csökkentek az „izoproterenol” csoportban) (12). A PV-hurkokból számított dP/dtmax-végdiasztolés térfogat összefüggés meredeksége is igen érzékeny, előterheléstől független kontraktilitás-paraméter, amely csökkent az izoproterenol-kezelt patkányokban. Továbbá romlott a bal kamrai relaxáció (csökkent dP/dtmin, megnyúlt tau-g, megnövekedett bal kamrai végdiasztolés nyomás) és növekedett végdiasztolés merevség [növekedett EDPVR (végdiasztolés nyomás-térfogat összefüggés meredeksége)] az „izoproterenol” csoportban. A miokardiális relaxáció aktív folyamat, mely főleg a diasztole alatti szarkoplazmatikus Ca2+-visszavételtől függ, míg a végdiasztolés merevséget főleg a myocardium szerkezeti elemei befolyásolják. A diasztolés diszfunkcióval összefüggésben a bal kamrai végdiasztolés nyomás is emelkedett az „izoproterenol” csoportban, ennek megfelelően emelkedett előterhelést és fokozott vénás visszaáramlást regisztráltunk. A kardiális funkciót jellemző paraméterek (bal kamrai kontraktilitás és pumpafunkció, relaxáció és a diasztolés merevség) cinaciguat kezelés hatására javultak. Szívinfarktus során a verőtérfogat gyakran csökkent a romló bal kamrai kontraktilitás miatt; az utóterhelés a vérnyomás fenntartása érdekében emelkedett. Különböző állatkísérletes modellekben és humán vizsgálatokban is kimutatták, hogy cinaciguat intravénás adása a szív elő- és utóterhelését csökkenti (13). Szívinfarktus indukciója izoproterenollal a szívfrekvencia emelkedését okozza, amelynek hatására csökken a diasztolés telődés ideje, ezáltal a myocardium vérellátása, és iszkémia alakul ki. A cinaciguat kezelés hatására a csökkenő utóterhelés és vazodilatáció miatt javul a myocardium oxigénellátása és csökken az oxigénszükséglete. 4. ábra. A cinaciguat kezelés hatása a plazma cGMP (A), cAMP (B) és miokardiális cGMP (C) szintekre izoproterenol indukálta akut szívinfarktusra. Az értékek átlag±SEM vannak ábrázolva. *p<0,05 vs. kontroll, #p<0,05 vs. izoproterenol

A cinaciguat előkezelés hatása a miokardiális infarktust követő kardiális diszfunkcióra Kimutattuk, hogy izoproterenollal indukált akut miokardiális infarktus során csökken a szív szisztolés teljesítménye, továbbá megfigyelhető az ejekciós frakció

A CINACIGUAT ELŐKEZELÉS HATÁSA A MIOKARDIÁLIS INFARKTUST KÖVETŐ MIOKARDIÁLIS SZÖVETKÁROSODÁSRA

A cinaciguat kezelés hatására az izoproterenol okozta szívizomzat-károsodás mérséklődött, amelyet a gyulladásos infiltráció és az intersticiális ödéma mértékének csökkenése bizonyít. Az elégtelen oxigén- és/vagy glükózellátottság miatt a cardiomyocyták sejtmembránja permeábilissá válik, amely a sérült területről nekroenzim-felszabadulást eredményez a véráramba (14). A szívizomelhalás markereként vizsgált plazma LDHszint az izoproterenollal kezelt csoportban cinaciguat kezelés hatására mérséklődött. Kísérleteink során a ß-ak-

Cardiologia Hungarica 2012; 42 : 11

Barnucz és munkatársai: Az NO-cGMP-PKG-rendszer gyógyszeres befolyásolása

5. ábra. A cinaciguat génexpressziókra kifejtett hatása izoproterenol indukálta szívinfarktus után patkányokban. ANP (A), COX-2 (B), TGFß1 (C), ß-aktin (D) GAPDH-hoz viszonyított relatív expressziója. Az értékek átlag±SEM vannak ábrázolva. *p<0,05 vs. kontroll, #p<0,05 vs. izoproterenol

tin (a citoszkeleton egyik fő alkotóeleme) mRNS-expressziója jelentősen emelkedett az „izoproterenol” csoportban és jelentősen csökkent a cinaciguat előkezelés hatására. Ezen megfigyeléseink alapján arra következtetünk, hogy a ß-aktin mRNS-expresszió változása fontos mediátora a sérült myocardium strukturális változásainak.

Az sGC-kezelés kardioprotektív hatása iszkémiás károsodás során Miokardiális infarktus állatkísérletes modelljében az ANP génexpressziója emelkedett és erős korrelációt mutat a diasztolés falfeszüléssel (15–17). Kísérleteink során jelentős ANP mRNS-emelkedést figyeltünk meg az izoproterenol és a cinaciguat plusz izoproterenol csoportnál, amelyből a végdiasztolés falfeszülés növekedésére következtethetünk. Az emelkedett ANPexpresszióval párhuzamosan változó plazma cGMPszintek hátterében az aktivált ANP-receptorok cGMPtermelése állhat, amelynek állatkísérletes és humán vizsgálatokban is kardioprotektív hatása merült fel (18, 19). Szívelégtelenségben emelkedett cGMP-koncentráció mutatható ki az extracelluláris folyadékterekben

(plazma, vizelet). A cGMP feltételezhetően a sejtmembránon át áramlik ki a plazmába, ha az intracelluláris cGMP-szint jelentősen megemelkedik (cinaciguat), vagy a sejtmembrán integritása károsodik (iszkémia, infarktus), s a plazma cGMP-szint e két tényező hatásainak eredőjeként értékelhető (20–22). A „cinaciguat” csoportban (intakt sejtmembrán) a szívizom emelkedett cGMP-szintjének jeleit mutattuk ki. Az sGC-enzim aktiválása kardioprotektív hatással rendelkezik, amely több jelátviteli úton valósul meg, az érhatások (vazodilatáció) mellett a cardiomyocyták cGMP jelátviteli útján is hat (5). A COX-2 mRNS csak miokardiális stressz, mint például az iszkémia során expresszálódik a cardiomyocytákban és nem expresszálódik az egészséges szívizomzatban (23). Az „izoproterenol” csoportban jelentősen emelkedett a COX-2 mRNS-tartalom és cinaciguat előkezelés hatására csökkent, feltehetőleg mérsékli a proinflammatorikus citokinek felszabadulását és az iszkémiás „gyulladás” létrejöttét. A TGFß az iszkémia során, lokálisan termelődő citokin, amely miokardiális infarktust követően „upregulálódik” és részt vesz a károsodások kialakulásának közvetítésében (24). Kísérleteink során jelentősen

Cardiologia Hungarica 2012; 42 : 12

Barnucz és munkatársai: Az NO-cGMP-PKG-rendszer gyógyszeres befolyásolása emelkedett TGFß1-expressziót figyeltünk meg, mely cinaciguat kezelés hatására csökkent. Korábbi publikációkkal megegyezően feltételezzük, hogy a cGMP által aktivált útvonal hatással van a TGFß1-jelátvitelre, a cGMP által mediált TGFß expressziógátláson át (25). Miokardiális infarktus során nagy mennyiségben szabadulnak fel szabad gyökök, amelyek fokozott oxidatív stresszhez, így emelkedett TBARS-szinthez vezetnek. Izoproterenol okozta infarktust követően a plazma TBARS-szintje emelkedett, amely cinaciguat kezeléssel csökkent, bizonyítva az oxidatív stressz mértékének mérséklődését. Korábbi tanulmányok bizonyították, hogy a COX-2 képes reaktív oxigén gyökök termelésére (26). A cinaciguat kezelés a COX-2 expresszióját csökkentette, ezáltal is mérsékelhette a szabadgyök képződést. Oxidatív stresszel és szabadgyökfelszabadulással járó különböző kórállapotokban az

intracelluláris cGMP-szint emelkedése a szövetkárosodás mértékét csökkentette (27).

Következtetések Vizsgálataink alapján megállapíthatjuk, hogy az sCGaktivátor cinaciguat kardioprotektív hatással rendelkezik izoproterenol által indukált akut miokardiális infarktus kísérletes patkánymodelljében. Kísérleteink során a cinaciguat kezelés javította a szívműködést, a hisztopatológiai elváltozásokat, mérsékelte az oxidatív stressz mértékét, a nekroenzim-felszabadulást, továbbá csökkentette a COX-2, TGFß és ß-aktin mRNSexpressziót. A szolubilis guanilát-ciklázt aktiváló gyógyszeres kezelés új terápiás lehetőséget jelenthet az iszkémiás szívbetegségek megelőzésében és kezelésében.

Irodalom 1. Moro MA, Russel RJ, Cellek S, et al. cGMP mediates the vascular and platelet actions of nitric oxide: confirmation using an inhibitor of the soluble guanylyl cyclase. Proc Nat Acad Sci USA 1996; 93: 1480–1485. 2. Stasch JP, Schmidt PM, Nedvetsky PI, et al. Targeting the hemeoxidized nitric oxide receptor for selective vasodilatation of diseased blood vessels. J Clin Invest 2006; 116: 2552–2561. 3. Munzel T, Genth-Zotz S, Hink U. Targeting heme-oxidized soluble guanylate cyclase: solution for all cardiorenal problems in heart failure? Hypertension 2007; 49: 974–976. 4. Feelisch M. The use of nitric oxide donors in pharmacological studies. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 1998; 358: 113–122. 5. Evgenov OV, Pacher P, Schmidt PM, et al. NO-independent stimulators and activators of soluble guanylate cyclase: discovery and therapeutic potential. Nat Rev Drug Discov 2006; 5: 755–768. 6. Stasch JP, Schmidt P, Alonso-Alija C, et al. NO- and haemindependent activation of soluble guanylyl cyclase: molecular basis and cardiovascular implications of a new pharmacological principle. Br J Pharmacol 2002; 136: 773–783. 7. Rona G. Catecholamine cardiotoxicity. J Mol Cell Cardiol 1985; 17: 291–306. 8. Wexler BC. Myocardial infarction in young vs. old male rats: pathophysiologic changes. Am Heart J 1978; 96: 70–80. 9. Chagoya de Sanchez V, Hernandez-Munoz R, Lopez-Barrera F, et al. Sequential changes of energy metabolism and mitochondrial function in myocardial infarction induced by isoproterenol in rats: a long-term and integrative study. Can J Physiol Pharmacol 1997; 75: 1300–1311. 10. Korkmaz S, Radovits T, Barnucz E, et al. Pharmacological activation of soluble guanylate cyclase protects the heart against ischemic injury. Circulation 2009; 120: 677–686. 11. Szabo G, Soos P, Mandera S, et al. INO-1001 a novel poly(ADPribose) polymerase (PARP) inhibitor improves cardiac and pulmonary function after crystalloid cardioplegia and extracorporal circulation. Shock 2004; 21: 426–432. 12. Kass DA, Maughan WL, Guo ZM, et al. Comparative influence of load versus inotropic states on indexes of ventricular contractility: experimental and theoretical analysis based on pressure-volume relationships. Circulation 1987; 76: 1422–1436. 13. Boerrigter G, Costello-Boerrigter LC, Cataliotti A, et al. Targeting heme-oxidized soluble guanylate cyclase in experimental heart failure. Hypertension 2007; 49: 1128–1133. 14. Sabeena Farvin KH, Anandan R, Kumar SH, et al. Effect of

squalene on tissue defense system in isoproterenol-induced myocardial infarction in rats. Pharmacol Res 2004; 50: 231–236. 15. Shimoike H, Iwai N, Kinoshita M. Differential regulation of natriuretic peptide genes in infarcted rat hearts. Clin Exp Pharmacol Physiol 1997; 24: 23–30. 16. Schultz JE, Witt SA, Nieman ML, et al. Fibroblast growth factor-2 mediates pressure-induced hypertrophic response. J Clin Invest 1999; 104: 709–719. 17. Buttrick PM, Kaplan M, Leinwand LA, et al. Alterations in gene expression in the rat heart after chronic pathological and physiological loads. J Mol Cell Cardiol 1994; 26: 61–67. 18. Yang XM, Philipp S, Downey JM, et al. Atrial natriuretic peptide administered just prior to reperfusion limits infarction in rabbit hearts. Basic Res Cardiol 2006; 101: 311–318. 19. Kitakaze M, Asakura M, Kim J, et al. Human atrial natriuretic peptide and nicorandil as adjuncts to reperfusion treatment for acute myocardial infarction (J-WIND): two randomised trials. Lancet 2007; 370: 1483–1493. 20. Fujio N, Ohashi M, Nawata H, et al. Relationship between atrial natriuretic polypeptide and cyclic 3'5'-guanosine monophosphate in human plasma. J Lab Clin Med 1987; 109: 706–710. 21. Michel JB, Mercadier JJ, Galen FX, et al. Urinary cyclic guanosine monophosphate as an indicator of experimental congestive heart failure in rats. Cardiovasc Res 1990; 24: 946–952. 22. Hamet P, Pang SC, Tremblay J. Atrial natriuretic factor-induced egression of cyclic guanosine 3':5'-monophosphate in cultured vascular smooth muscle and endothelial cells. J Biol Chem 1989; 264: 12364–12369. 23. Shinmura K, Xuan YT, Tang XL, et al. Inducible nitric oxide synthase modulates cyclooxygenase-2 activity in the heart of conscious rabbits during the late phase of ischemic preconditioning. Circ Res 2002; 90: 602–608. 24. Thompson NL, Bazoberry F, Speir EH, et al. Transforming growth factor beta-1 in acute myocardial infarction in rats. Growth Factors 1988; 1: 91–99. 25. Saura M, Zaragoza C, Herranz B, et al. Nitric oxide regulates transforming growth factor-beta signaling in endothelial cells. Circ Res 2005; 97: 1115–1123. 26. O'Banion MK. Cyclooxygenase-2: molecular biology, pharmacology, and neurobiology. Crit Rev Neurobiol 1999; 13: 45–82. 27. Dias-Junior CA, Souza-Costa DC, Zerbini T, et al. The effect of sildenafil on pulmonary embolism-induced oxidative stress and pulmonary hypertension. Anesth Analg 2005; 101: 115–120, table of contents.

Cardiologia Hungarica 2012; 42 : 13