Az ischaemiás-reperfúziós agyi károsodás korai fázisának vizsgálata szövettani, neurokémiai és funkcionális módszerekkel

Az ischaemiás-reperfúziós agyi károsodás korai fázisának vizsgálata szövettani, neurokémiai és funkcionális módszerekkel Doktori értekezés

Benedek Angéla Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Mátyus Péter, tanszékvezető egyetemi tanár, D.Sc. Konzulens:

Dr. Szénási Gábor, biológiai tudományok kandidátusa EGIS Gyógyszergyár Nyrt., Preklinikai Kutatási Főosztály

Hivatalos bírálók: Dr. Tímár Júlia, egyetemi docens, az orvostudomány kandidátusa Dr. Zelles Tibor Ph.D., tudomámyos főmunkatárs Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Gyires Klára, tanszékvezető egyetemi tanár Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Kecskeméti Valéria, egyetemi tanár Dr. Perjési Pál, tanszékvezető egyetemi tanár

Budapest 2008

Tartalomjegyzék ÖSSZEFOGLALÓ .....................................................................................................................................4 SUMMARY.................................................................................................................................................5 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ...................................................................................................................6 1.

BEVEZETÉS.....................................................................................................................................8 1.1. 1.2. 1.3.

AZ ISCHAEMIÁS-REPERFÚZIÓS AGYI KÁROSODÁS KIALAKULÁSA ...............................................8 AZ ISCHAEMIÁS-REPERFÚZIÓS AGYI KÁROSODÁS MODELLEZÉSE .............................................13 NEUROPROTEKTÍV SZEREK KUTATÁSA .....................................................................................14

2.

CÉLKITŰZÉSEK...........................................................................................................................19

3.

MÓDSZEREK ................................................................................................................................20 3.1. KÍSÉRLETI ÁLLATOK ................................................................................................................20 3.2. AZ A. CEREBRI MEDIA MŰTÉTI ELZÁRÁSA (MCAO) .................................................................20 3.3. TRIFENIL-TETRAZOLIUM KLORID FESTÉS (TTC).......................................................................23 3.3.1. In vivo módszer...................................................................................................................24 3.3.2. In vitro módszer ..................................................................................................................24 3.3.3. Evanskék festés ...................................................................................................................25 3.4. HISZTOLÓGIAI ÉS IMMUNHISZTOKÉMIAI FESTÉSI MÓDSZEREK .................................................25 3.4.1. Luxol Fast Blue festés.........................................................................................................25 3.4.2. Toluidinkék festés ...............................................................................................................25 3.4.3. Fluoro-Jade festés ..............................................................................................................25 3.4.4. Gliális savas fehérje kimutatása.........................................................................................26 3.4.5. Elektronmikroszkópos vizsgálat..........................................................................................26 3.4.6. Tirozin-hidroxiláz enzim kimutatása ..................................................................................26 3.5. A CORTICOSTRIATÁLIS DOPAMINERG RENDSZER NEUROKÉMIAI VIZSGÁLATA ..........................27 3.5.1. A dopamin és a dopamin metabolitok szöveti koncentrációjának meghatározása HPLC módszerrel .........................................................................................................................27 3.5.2. Jelzett dopamin felszabadulásának vizsgálata komplex agyszelet készítményben..............29 3.6. A SZENZOMOTOROS DEFICIT VIZSGÁLATA................................................................................35 3.6.1. Neurológiai skálák..............................................................................................................35 3.6.1.1. Reglődi-féle skála ..........................................................................................................35 3.6.1.2. Hunter-féle skála............................................................................................................35 3.6.1.3. Garcia-féle skála............................................................................................................35 3.6.1.4. Bederson-féle skála........................................................................................................36 3.6.2. Funkcionális tesztek............................................................................................................43 3.6.2.1. Lépéshiba mérése (foot fault).........................................................................................43 3.6.2.2. Egyensúlyozás (beam balance) ......................................................................................44 3.6.2.3. A lokomotoros aktivitás vizsgálata ................................................................................45 3.6.3. Korrelációs vizsgálatok ......................................................................................................46 3.7. TESTTÖMEG MÉRÉS ..................................................................................................................46 3.8. STATISZTIKAI ÉRTÉKELÉS ........................................................................................................46

4.

EREDMÉNYEK .............................................................................................................................48 4.1. TTC FESTÉSSEL KAPOTT EREDMÉNYEK ....................................................................................48 4.2. HISZTOLÓGIAI ÉS IMMUNHISZTOKÉMIAI ELEMZÉS EREDMÉNYEI ..............................................54 4.3. A CORTICOSTRIATÁLIS DOPAMINERG RENDSZER NEUROKÉMIAI VIZSGÁLATA ..........................63 4.4. NEUROLÓGIAI VIZSGÁLATOK ...................................................................................................71 4.4.1. Különböző neurológiai vizsgálati módszerekkel kapott eredmények..................................71 4.4.2. A funkcionális tesztekkel kapott eredmények ......................................................................77 4.4.2.1. Egyensúlyozás (beam balance) ......................................................................................77 4.4.2.2. Lépéshiba (foot fault).....................................................................................................77 4.4.2.3. A lokomotoros aktivitás vizsgálata ................................................................................77

2

4.4.2.4. Testtömeg-mérés ............................................................................................................79 4.4.3. Korrelációs vizsgálatok ......................................................................................................79 4.4.3.1. Neurológiai skálák összértékeinek korrelációs vizsgálata.............................................79 4.4.3.2. Neurológiai skálák egyes paramétereinek korrelációs vizsgálata .................................81 4.4.3.3. Lépéshiba és egyensúlyozás korrelációs vizsgálata.......................................................81 4.4.3.4. Neurológiai skálák és a funkcionális tesztek korrelációs vizsgálata .............................81 5.

MEGBESZÉLÉS ............................................................................................................................82 5.1. 5.2. 5.3. 5.4.

A TTC FESTÉSSEL KAPOTT EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE .......................................................82 HISZTOLÓGIAI ÉS IMMUNHISZTOKÉMIAI ELEMZÉS EREDMÉNYEINEK MEGBESZÉLÉSE ..............86 A CORTICOSTRIATÁLIS DOPAMINERG RENDSZER NEUROKÉMIAI VIZSGÁLATÁVAL KAPOTT EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE ...................................................................................................90 NEUROLÓGIAI VIZSGÁLATOKKAL KAPOTT EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE ...............................95

6.

KÖVETKEZTETÉSEK .................................................................................................................99

7.

ÖSSZEFOGLALÁS......................................................................................................................101

IRODALOMJEGYZÉK ........................................................................................................................102 SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE..............................................................................................117 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉHEZ KAPCSOLÓDÓ KÖZLEMÉNYEK ..............................................................117 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉHEZ KAPCSOLÓDÓ EGYÉB PUBLIKÁCIÓK .....................................................117 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉHEZ KÖZVETLENÜL NEM KAPCSOLÓDÓ KÖZLEMÉNY...................................119 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉHEZ KÖZVETLENÜL NEM KAPCSOLÓDÓ EGYÉB PUBLIKÁCIÓK .....................119 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS................................................................................................................120

3

Összefoglaló Témavezető: Dr. Mátyus Péter MTA doktor, egyetemi tanár Semmelweis Egyetem, Szerves Vegytani Intézet Gyógyszertudományok Doktori Iskola A stroke gyógyszeres kezelésére eddig tett erőfeszítések kudarca részben azzal magyarázható, hogy egy klinikai vizsgálat elindításához elegendő és megfelelően alátámasztott állatkísérletes adatok köre nehezen körvonalazható. Kísérleteink során arra kerestük a választ, hogy a preklinikai gyakorlatban alkalmazott néhány módszer mennyire pontosan tükrözi az ischaemiás-reperfúziós (IR) károsodás mértékét. Az EGIS Gyógyszergyár Preklinikai Kutatási főosztályán az IR agyi károsodást 1 órás középső agyi artéria elzárást követő különböző reperfúziós idő elteltével trifenil-tetrazólium klorid (TTC) festéssel és szövettanilag vizsgáltuk patkányban. A TTC festéssel elhaltnak tartott agyrégiók idegműködését radioaktívan jelzett dopamin segítségével mértük corticostriatális agyszeletben, in vitro. A stroke-os állatok szenzomotoros károsodását 4 ismert neurológiai skála alapján értékeltük, és a gerendán való egyensúlyozás (beam balance), a lépéshiba (foot fault), és a lokomotoros aktivitás tesztekkel egészítettünk ki. Az intrakardiális perfúzióval és az agyszeletben elvégzett TTC festés eredménye mind az agykéregben és a striatumban, mind a core és a penumbra tekintetében szignifikánsan különbözött egymástól. Az intrakardiális TTC perfúzió után az elhaltnak tekinthető agyszövet térfogata a reperfúzió korai időszakában átmenetileg lecsökkent. 24 órás reperfúziós időnél a TTC festéssel nekrotikus agyszövetben az asztrociták elpusztultak, de a kiterjedt károsodás ellenére számos morfológiailag ép idegsejt, az EM képen ép mitokondriumok is láthatók voltak. A szöveti dopamin tartalom lecsökkent, és a dopamin turnover megnőtt az agykéregben és a striatumban, de a dopaminerg idegvégződések részben megtartották működésüket. A neurológiai skálák hasonló súlyosságúnak mérték a stroke-on átesett patkányok szenzomotoros deficitjét. A gerendán való egyensúlyozás (beam balance), a lépéshiba (foot fault), és a lokomotoros aktivitás

tesztek

nem

alkalmasak

a

neurológiai

skálák

helyettesítésére.

Összefoglalásként megállapítható, hogy az ischaemia-reperfúzió következtében kialakuló patológiás folyamatokról csak több, egymást kiegészítő módszerrel lehet hiteles képet adni.

4

Summary Under the supervision of Professor Péter Mátyus, D.Sc. Semmelweis University, Department of Organic Chemistry Doctoral School of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences The failure of efforts to develop a drug for the treatment of stroke can be explained, in part, by the difficulty of delineating sufficient and firm animal data required for establishing the initiation of a clinical stroke trial. Our aim was to study how precisely the ischaemic-reperfusion damage (IR) is reflected by the methods routinely applied in the preclinical practice. At Division of Preclinical Research of EGIS Pharmaceuticals Plc, we evaluated the IR damage of brain tissue using triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and histological analysis in rats after a 1-hour middle cerebral artery occlusion followed by different reperfusion periods. Neuronal function of the territory judged infarcted by TTC staining was investigated by the help of corticostriatal brain slice with radioactively labelled dopamine, in vitro. The animals underwent in vivo assessment applying 4 different neurological scales, which were completed with foot fault, beam balance, locomotor activity tests. The results of TTC staining performed by transcardiac perfusion or in brain slices were different in the cortex and striatum, and considering the size of the core and penumbra. After transcardiac TTC staining the infarct volume temporarily decreased during the early reperfusion period. At 24 hours of reperfusion astrocytes died within the area judged infarcted by TTC staining, and despite extensive tissue damage, several morphologically viable neurons and intact mitochondria were observed. Dopamine content decreased and dopamine turnover increased in the infarcted striatum, but dopaminerg nerve terminals retained functional activity. All neurological scales scored sensorimotor deficit similarly in rats after stroke. Beam balance, foot fault and locomotor activity tests can not substitute for neurological scales. Taken together, the pathological process in consequence of an ischaemia-reperfusion challenge can be accurately assessed using a number of complementary methods.

5

Rövidítések jegyzéke [3H] 86/609/EEC a. ACA ACE ACI ACM AMPA ANOVA ATP AUC B BB clat. COMT d DOPAC DPM EDTA EM FF G GABA GAD GFAP H HPLC HSP-70 HVA IL-1β Ip. IR K+ KA LFB LTP M M (X) MAO MCAO

Trícium Az Európai Gazdasági Közösség (European Economic Community) által a tagországok számára kiadott rendelkezés a kísérleti- vagy egyéb tudományos célból felhasznált állatok védelméről, 1986. Verőér, artéria, arteria Elülső agyi artéria, arteria cerebri anterior Külső nyaki artéria, arteria carotis externa Belső nyaki artéria, arteria carotis interna Középső agyi artéria, arteria cerebri media (middle cerebral artery) α-amino-3-hidroxil-5-metil-isoxazol-propionát, α-amino-3-hydroxy-5methyl-isoxazol-propionic acid Varianciaanalízis, Analysis of Variance Adenozin-trifoszfát, adenosine triphosphate Csúcs alatti terület, area under the curve Bederson-féle skála Egyensúlyozás (gerendán), beam balance Kontralaterális, contralateralis (MCAO helyével ellentétes oldalon, intakt állatok esetén bal oldalnak felel meg) Katechol-O-metiltraszferáz, catechol-O-methyl-trasferase Átmérő, diameter 3,4-dihidroxi-fenilecetsav; 3,4-dihydroxy-phenyl-acetic acid Radioaktív bomlások száma percenként, desintegration per minute Etiléndiamin-tetraecetsav, Edetic acid Elektronmikroszkópos felvétel Lépéshiba, foot fault Garcia-féle skála gamma-amino-vajsav, gamma-amino-butyric acid Glutaminsav-dekarboxiláz, glutamic acid decarboxylase Gliális savas fehérje, glial fibrillary acidic protein Hunter-féle skála Nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia, high performance liquid chromatography 70 kilodalton molekulatömegű hősokkfehérje, heat shock protein Homovanillinsav, homovanillic acid Interleukin-1-béta Hashártyák közé, intraperitoneális Ischaemiás-reperfúziós Kálium ion Kainát, kainic acid Luxol Fast Blue festés Hosszú távú potenciáció, longterm potentiation Mol Mikroszkópos elemzéshez használt nagyítás, magnification Monoamino-oxidáz enzim, monoamine-oxydase Középső agyi artéria elzárása, middle cerebral artery occlusion

6

MRI n NAD(P) NAD(P)H NMDA NO p PCA PID PET R r ROS rpm rtPA SEM STAIR TH TNFα TRS TTC UV ilat.

Mágneses rezonanciás képalkotás, magnetic resonance imaging elemszám Nikotinsav-adenin-dinukleotid-foszfát, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (oxidált forma) Nikotinsav-adenin-dinukleotid-foszfát, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (redukált forma) N-metil-D-aszpartát, N-metil-D-aszpartát, N-methyl-D-aspartate acid Nitrogén-monoxid, nitric oxide Statisztikai valószínűség, probability Hátulsó agyi artéria, arteria cerebri posterior, posterior cerebral artery Depolarizációs hullámok, peri infarct depolarisation Pozitron emissziós tomográfia Reglődi-skála Korrelációs koefficiens reaktív oxigén gyökök, reactive oxygen species percenként elfordulások száma, revolutions per minute Rekombináns szöveti plazminogén aktivátor, recombinant tissue plasminogen acitivator Átlagtól való eltérés, standard error of the mean Stroke Therapy Academic Industry Roundtable Tirozin-hidroxiláz Tumor nekrózis faktror-alfa, tumor necrosis factor alpha Immunhisztokémiai reakció előhívását elősegítő oldat, target retrieval solution Trifenil-tetrazolium klorid, triphenyl-tetrazolium chloride Ultraibolya, ultraviolet Ipszilaterális, ypsilateralis (az MCAO helyével megegyező oldal, intakt állatok esetén jobb oldalnak felel meg)

7

1. Bevezetés Napjainkban a stroke világszerte megoldatlan problémát jelent mind mortalitási szempontból, mind a neuroprotektív kezelés lehetőségei és az egészségügyi kiadások szemszögéből. Az stroke esetek mintegy 85%-a ischaemia eredetű. Az agyi ischaemia kisebb részben a kiserek betegsége (lypohyalinosis) eredményeképpen alakul ki; nagyobb részben a nagyerek megbetegedése (arteriosclerosis, atherothrombosis) vagy a szívből, nagyerekből az agyba érkező embolus következtében jön létre 1. A betegség előfordulási gyakorisága magas (mintegy 50/100 000 fő), amely országonként jelentős eltéréseket mutat. A jelenség hátterében összetett társadalmi, szociális és egészségügyi okok feltételezhetők. A betegség kezelésére alkalmas eszközök jelenleg korlátozottak 2. 1.1.

Az ischaemiás-reperfúziós agyi károsodás kialakulása

Az időszámításunk szerinti II. századból származó orvosi beszámolók szerint az akkori orvosok úgy hitték, hogy a szélütés megelőzhetetlen és gyógyíthatatlan. A XVI században a betegséget Isten csapásának gondolták. Vélhetően az angol megfelelője, a „stroke”( = csapás) szintén innen, az „Isten csapása” kifejezésből származik. A stroke általánosan elfogadott megjelölése annak a heveny fellépésű klinikai tünetegyüttesnek, amelynek hátterében agyi infarktus, agyállományi vagy szubarachnoideális vérzés áll 3. Az agyszövet fokozott anyagcsereigénye és érzékenysége az oxigén ellátás csökkenésére (anoxia, hypoxia) a keringés összetett szabályozását igényli, amely magában foglalja az agyi erek átmérőjének fizikai, kémiai és idegi szabályozását. A szabályozás fontos eleme az autoreguláció, ezáltal az egyes agyi területek vérellátása (regionális agyi véráramlás) állandó marad az artériás középnyomás változásának széles határai között. Az agyi keringést az a. carotis, az a. vertebralis és az a basilaris biztosítja, amelyek kraniális ágai az agyalapon elhelyezkedő érgyűrűben (circulus Willisi) találkoznak (1. ábra). A nagyerek szűkülete nyomán megnyílnak a kollaterális keringés útjai,

8

elsősorban extrakraniális/intrakraniális kollaterális rendszer, az a. ophthalmica, az a. communicans anterior, és az a. communicans posterior 4. 1. ábra. Az agyalapi artériás gyűrű (circulus Willisi) szerveződése

A két a. vertebralis az a. basilarisban egyesül. Az a. basilarisból két a. cerebri posterior ered, amelyeket egy-egy a. communicans posterior köt össze a megfelelő oldalon lévő a. carotis internával. A két a. carotis internából kiágazó a. cerebri anterior az a. communicans anterior segítségével zárja a kört. Az a. carotis interna az a. cerebri media, az a. cerebri anterior és az a. chorioidea ágakra oszlik. Az ábrán látható, hogy a kétoldali artériákat összekötő ágak vékonyak, ezért az összeköttetés ellenére az agy vérkeringése nagyrészt féloldali 1. Minél gazdagabb egy terület kollaterális-hálózata vagy annak agykérgi szerveződése, annál kevésbé nyilvánulnak meg az agyi ér elzáródása következtében kialakuló tünetek 5. Ilyen módon, mivel a striatum távolabb helyezkedik el az agy felszínén lévő

9

kollaterális kapcsolatok helyétől, ezért ebben a régióban nagyobb mértékű szövetkárosodás várható, mint az agykéregben 6. Azonban az agykéreg vérátáramlása általában nagyobb, mint a fehérállományé, ezért érzékenyebben reagál a vérátáramlás csökkenésére 7. A keringési zavar súlyosságát és az agyműködés fennmaradásának lehetőségét három egymástól független tényező határozza meg: az érelzáródás mértéke, annak időtartama, valamint az adott területre jellemző abszolút agyi véráramlás értéke 8,9. Az ionegyensúly fenntartásához az agyszövet folyamatos oxigén- és energiaellátást igényel, ezért az adenozin-trifoszfát (ATP) koncentrációjának már kismértékű csökkenése is jelentősen befolyásolja a regionális agyi véráramlást 1. Az agy átlagos vérátáramlása egészséges embereknél nyugalomban 50 ml/perc 100 g agyszövetre számítva. Az agyi véráramlás csökkenése különböző mértékben érinti az agyszövet metabolikus folyamatait. Amennyiben az agyi vérátáramlás 40 ml/100g/perc alá süllyed, lecsökken a fehérjeszintézis. 30 ml/100g/perc alatt a szövet vegyhatása savas irányba tolódik el. Ha a vérátáramlás 15-20 ml/100g/perc alá csökken, kialakul az energiahiány és megkezdődik az anaerob glikolízis. Az ionegyensúly 10-12 ml/100g/perc alatti vérátáramlás esetén felborul

10,11

. A véráramlás-csökkenés mértéke

alapján az érintett agyi szövet felosztható core és penumbra területekre. A véráramláscsökkenés fókuszpontjában (core) a véráramlás értéke mindössze 5-10 ml/100g/perc, míg az azt hagymahéjszerűen körülölelő területen (penumbra) a véráramlás 10-35 ml/100g/perc között változik 12. Enyhe vagy rövid ideig tartó agyi keringési zavar az oxigén- és glükóz-ellátás időleges elégtelensége miatt átmeneti neuronális működési zavart okoz. Tartósan fennálló agyi ischaemia esetén - amennyiben hosszabb ideig fennálló ischaemiás prekondícionálás nem áll fenn - a core területén a sejtek elhalása, a penumbra területén apoptózis kezdődik el 13. A sejtek irreverzibilisen károsodnak, amennyiben több mint 4 percig az agyi vérellátás 8-10 ml/100g/perc, az oxigén-felhasználás 65 μmol/100g/perc alá süllyed (infarktusküszöb)

1

. A penumbra jelenti a neuroprotektív beavatkozási

10

lehetőségek, azaz a sejtkárosodás folyamatának felfüggesztésére irányuló kezelés alkalmazásának célpontját 14. Az agyi erek elzáródásával kialakuló ischaemiás agyi károsodás a sejtek anyagcsereváltozásának összetett folyamatait indítja el (2. ábra), amelyek térben és időben átfedik egymást (3. ábra) 15-18. A vérellátás megszűnésével kialakuló oxigén- és energia-ellátási zavar az ATP képződésének csökkenésében, és a Na/K pumpa működési zavarában nyilvánul meg. Az ionegyensúly eltolódása a preszinaptikus idegsejtek depolarizációjához, és ezáltal nagymennyiségű glutamát felszabadulásához vezet. A glutamát az N-metil-D-aszpartát (NMDA), az α-amino-3-hidroxil-5-metil-isoxazol-propionsav (AMPA) és a kainsav (KA) receptorokat izgatva indítja el a sejtkárosító események sorozatát (excitotoxicitás). A glutamát és a K+ szint emelkedése az ischaemiás terület középpontjából kiinduló depolarizációs hullámok (peri-infarct depolarization, PID) keletkezését eredményezi. Az ionok intracelluláris koncentrációjának emelkedése az extracelluláris térből folyadék beáramlását vonja maga után (citotoxikus oedema). A megemelkedett Ca2+ koncentrációnak kiemelt szerepe van az ischaemiás kaszkád kialakulásában, mert számos enzimrendszert hoz működésbe. A foszfolipázok, proteázok és nitrogénmonoxid szintetáz enzimek aktivációjával oxigén- és nitrogéntartalmú szabad gyökök (reactive oxygen species, ROS) keletkeznek, amelyek a membránok (lipolízis), a mitokondriumok és a sejt örökítőanyagának károsodását okozzák (oxidatív stressz). A gyulladásos mediátorok képződése a mikroglia sejtek aktivációjához és a fehérvérsejtek kiáramlásához vezet. A károsodott területen a kapillárisok endotélsejtjeinek sérülése miatt a szorosan záró endotélium réteg (vér-agy gát) áteresztővé válik a nagy molekulasúlyú szérum fehérjék számára (pl. albumin), amelyet a folyadéknak az erekből történő kiáramlása követ (vaszkuláris/vazogén oedema). A reperfúzió a reaktív oxigén gyökök képződésének további növelésével súlyosbítja az ischaemia által érintett sejtek életfolyamatainak zavarát, és vezet a sejt apoptotikus vagy nekrotikus elhalásához 19,20

.

11

2. ábra. Agyi ischaemia során kialakuló sejtkárosító kaszkád

A vérellátás megszűnésével kialakuló oxigén- és energia-ellátási zavar az ATP képződésének csökkenését és a Na/K pumpa működési zavarát okozza. A megemelkedett Ca2+ koncentráció számos enzimrendszert hoz működésbe. A reperfúzió a reaktív oxigén gyökök képződésének további növelésével súlyosbítja

12

az ischaemia által érintett sejtek életfolyamatainak zavarát. A folyamatok a sejt apoptotikus- vagy nekrotikus elhalásához vezetnek 19. 3. ábra. Agyi ischaemia során lezajló folyamatok

Az agyi ischaemia patomechanizmusa több egymásba fonódó folyamatot foglal magában. A vérellátás csökkenését követően az excitotoxicitás és az infarktus fókuszpontjából induló depolarizációs hullámok jelenléte válik dominánssá, amelyek

órákkal

később

kialakulásához vezetnek

20

a

gyulladásos

és

az

apoptotikus

folyamatok

. (PID-peri-infarct depolarization, depolarizációs

hullámok) 1.2.

Az ischaemiás-reperfúziós agyi károsodás modellezése

A stroke humán megbetegedés, állatkísérletes modellezése általában mikrosebészeti beavatkozást igényel. Egy-egy modell az összetett etiológiájú és különböző típusú folyamat egy-egy elemének megjelenítésére alkalmas, pl. egy artéria elzáródása következtében kialakult ischaemia, a reperfúzió vagy az embolizáció

21

. Az elmúlt

években az agyi ischaemia modellezésére számos permanens és tranziens agyi ischaemia kiváltására alkalmas módszer került kidolgozásra rágcsálókban 22-27. Az ischaemiás stroke gyakori megnyilvánulási formája a középső agyi artéria (a. cerebri media) elzáródása, amelynek fő tünetei az arcon, kezeken vagy a felső végtagokon megjelenő ellenoldali érzéskiesés és bénulás, beszédképtelenség (aphasia), féloldali vagy mindkét szemen jelentkező látótérkiesés (homonym hemianopia). A kiterjedt

13

szöveti

károsodás

eredményeképpen

kialakuló

oedema

és

a

koponyaűri

nyomásfokozódás gyakran vezet az agytörzs beékelődéséhez, halálhoz vagy rokkantsághoz

2,28,29

. Kísérletes munkánk során a humán fokális agyi ischaemia

modellezésére alkalmas

30

a. cerebri media filamentummal történő elzárásának (middle

cerebral artery occlusion, MCAO) módszerét választottuk.

1.3.

Neuroprotektív szerek kutatása

Az elmúlt években számos irányelv és szakmai nyilatkozat jelent meg, amelyek klinikai vizsgálatokon alapuló evidenciákat és ajánlásokat közölnek. Mindezek figyelembe vételével, az akut ischaemiás stroke oki kezelésére csak a tünetek jelentkezését követő első három órában – az úgynevezett terápiás ablakon belül – van mód rekombináns szöveti plazminogén aktivátor (rtPA) intravénás beadásával történő thrombolysis biztonságos alkalmazására. Ezt követően a kezelési lehetőségek a tünetek jelentkezése után 48 órán belül beadott acetilszalicilsavra és a korai antikoaguláns terápiára korlátozódnak 31,32. A stroke kutatás jelentőségét az indokolja, hogy az akut ischaemiás stroke kezelése ezen eszközök használatával jelenleg nem megoldott 33,34, mert: -

a

preventív

terápiában

alkalmazott

acetilszalicilsavval

végzett

trombocita

aggregáció gátlás ugyan hatásos, de hatása kismértékű. Mégis jelenleg nagy népegészségügyi jelentősége van, mert viszonylag sok beteg kezelhető vele. -

a thrombolysis jól szelektált betegeknél hatásosnak bizonyult, de csak a stroke betegek 1-3 %-nál alkalmazható. Az alkalmazásával elért rekanalizációs arány alacsony 36

35

és a betegek nagy részében csak részleges funkcionális javulás jön létre

.

A stroke kezelésére alkalmazható egyéb, az agyi ischaemia-reperfúzió következtében kialakuló

patológiás

folyamatot

befolyásoló

szerek

(neuroprotektív

kezelés)

hatékonysága - a biztató állatkísérletes eredmények ellenére - a klinikai vizsgálatok során nem igazolódott. Mintegy 920 vegyülettel kapott állatkísérletes eredmények és a körülbelül 115 elvégzett sikertelen klinikai vizsgálat után szükségszerűnek tűnik a klinikai és preklinikai kutatás módszertanának felülvizsgálata 37.

14

A neuroprotektív vegyületek preklinikai kutatása számos ponton eltér a humán vizsgálatoktól, amelyek megnehezítik az állatkísérletes adatok értelmezését klinikai körülmények között

38

. Alapvető eltérések mutatkoznak abban, hogy a preklinikai

gyakorlatban általában fiatal, egészséges, többnyire hím, rágcsálókon standardizált, mesterséges agyi ischaemia létrehozása történik, amelynek következtében egy jól körülhatárolható területen jön létre a szöveti károsodás. Ezzel szemben a humán vizsgálatokba bevont egyének többnyire idősebbek, rizikófaktorok és alapbetegségek által érintett, gyakran szekunder stroke-n átesett férfiak és nők. Az állatkísérletekben a vizsgálandó szert leggyakrabban intraperitoneális injekció formájában adják be. A dózisok és az így elért vérszintek gyakran magasabbak, mint a betegek által tolerálható dózis. Randomizált, vak, többkarú állatkísérletes protokoll ritkán fordul elő. A kialakult stroke tünettana összetett és változatos, magában foglalja neurológiai tünetek (émelygés, fejfájás, látászavar, szédülés, görcsök, eszméletvesztés), motoros és szenzomotoros deficit (kézremegés, koordinációs zavar, részleges bénulás) és magasabb agykérgi

központok

funkciózavarának

(emlékezetkiesés,

demencia,

delírium,

beszédzavar, térbeli- és időbeli dezorientáció, koncentrációcsökkenés vagy intellektuális változások) kialakulását. A klinikai vizsgálatok elvégzését nemzetközi rendelkezések szabályozzák, ezért differenciál diagnosztikai vizsgálatok elvégzése szükségszerű a betegek vizsgálatba történő bevonása előtt

39

. Humán stroke esetek neurológiai vizsgálata a diagnózis és a

terápiás irányelvek szerint elvégzendő kezelési terv (treatment plan) kiválasztásának alapja, ezért standardizált neurológiai skálák alkalmazása kívánatos

40

. Az elvégzett

klinikai stroke vizsgálatok során a vizsgált szerek hatékonyságát a funkcionális paraméterek (Barthel Index), a napi aktivitás (módosított Rankin-skála) vagy a mozgáskorlátozottság mértékének értékelése (Glasgow Outcome Scale) alapján történik. A neurológiai deficit megállapítására számos egyéb skála is elfogadott, így pl. a Scandinavian Stroke Scale, a Canadian Neurological Scale, a National Institute of Health Stroke Scale vagy az Unified Stroke Scale szerepel a vizsgálat protokolljától függően 39,41.

15

Ezzel szemben, a preklinikai kísérletek során alkalmazott protokollok jelentős eltéréseket mutatnak. Egyaránt előfordul az egyszerű, gyorsan kivitelezhető trifeniltetrazolium klorid (TTC) festés; a szövettani vizsgálat és a képalkotó eljárások (agyi véráramlás, MRI) alkalmazása is

42

. A szenzomotoros funkciók vizsgálatára számos

skála ismeretes az irodalomban, így pl. a permanens 28,43-47 és tranziens agyi ischaemia 27,48-51

esetén. Egyes, az irodalomban leírt skálák külön hangsúlyt fektetnek bizonyos

paraméterek, mint a szenzoros funkciók

52

; a mozgászavar és az orientáció

53-55

, az

enyhe elváltozások kimutatására 56 vagy az elhalálozás súlyozott figyelembevételére 57. Az intellektuális- és a kognitív funkciók vizsgálata az állatkísérletekben korlátozott, ezért a magasabb agyi központok elváltozásainak követésére többnyire a passzív avoidance teszt, a nyolckarú labirintus vagy a Morris-féle vízi labirintus teszt használatos. A preklinikai kísérletek során egy vegyület neuroprotektív hatékonyságát elsődlegesen a létrehozott infarktus-terület (penumbra) csökkenése vagy a szenzomotoros tünetek javulása jelenti. Ezzel szemben a stroke betegek rehabilitációjának szempontjából az agyi infarktus kiterjedése és annak elhelyezkedése a döntő jelentőségű, és kevésbé az adott ér vérellátási területének jellegzetességei

58,59

. A klinikai vizsgálatokban a

vizsgálandó szer hatékonyságát a betegség tüneteinek csökkenése, az életminőség javulása, vagy a szekunder stroke megelőzése alapján ítélik meg 19,38,42. A stroke többszintű és integrált kutatási megközelítést igényel, azonban a klinikai vizsgálat elindításához elegendő és megfelelően alátámasztott állatkísérletes adatokkal szemben támasztott követelmények nehezen definiálhatók

60

. A napjainkban

befejeződött az NXY-059 szabadgyök fogó tulajdonságú molekulával végzett klinikai vizsgálatok negatív tanulságai alapján Donnan szerint a neuroprotektív vegyületek kutatási menete a 4. ábra szerint körvonalazható 38. A humán vizsgálat menetéhez hasonló preklinikai módszertani sor kidolgozását számos tényező megnehezíti. Ismeretes, hogy az ischaemiás-reperfúziós agyi károsodás patomechanizmusa eltér az agykéregben és a fehérállományban 61. Következésképpen a

16

neuroprotektív szerek támadáspontja is különböző lehet, pl. az AMPA receptor antagonista hatású anyagok inkább a fehérállományban képesek csökkenteni az infarktus területét 62. A neves egyetemi és gyógyszergyári kutatókat tömörítő nemzetközi munkacsoport (STAIR, Stroke Therapy Academic Industry Roundtable) kidolgozta az alapvető ajánlásokat. A munkacsoport megállapításai szerint a klinikai vizsgálat elindítását szerteágazó, legalább két egymástól független laboratórium által feltárt ismeretek alapján célszerű kezdeményezni 63. 4. ábra. Neuroprotektív vegyületek hatékonyságának elemzése

Az ábra az ischaemiás stroke kezelésére tervezett szer humán vizsgálatának javasolt lépéseit foglalja össze. Az állatkísérletes adatok alapján neuroprotektív

17

hatékonysággal rendelkező vegyület további vizsgálatát a humán agyi szeletek alkalmazásával

célszerű

folytatni,

amelyben

a

glia-idegsejt-endotélsejt

kölcsönhatás vizsgálható. Ezt követően meg kell vizsgálni a vegyület agyi penetrációjának mértékét, pl. pozitron emissziós tomográfia (PET) segítségével. Mielőtt a ténylegesen stroke-on átesett betegek bevonásával tervezett vizsgálat megkezdődne, a vegyület hatékonysága újszerű humán ischaemiás modellek alkalmazásával, pl. carotis endarterectomia, szív bypass műtét, vagy a. carotis tágítás során kialakult perioperatív stroke kockázat-csökkentésével válhatna elemezhetővé 38. Az

ischaemiás-reperfúziós

károsodás

korai

fázisában

elvégzett

vizsgálatok

létjogosultságát indokolja, hogy az excitotoxikus-oxidatív kaszkád befolyásolására kifejlesztett neuroprotektív szerek vizsgálata csak ekkor végezhető el

50

, és

elengedhetetlen alkotója a későbbi életminőség javulást célzó szekvenciális terápia kidolgozásához

56

. Mindezek figyelembe vételével, kísérleteink során az 1 órás a.

cerebri media elzárása és 24 óra reperfúzió következtében a striatum és az agykéreg területén kialakult szövetkárosodást és annak többszintű következményeit vizsgáltuk hisztológiai, neurokémiai és in vivo funkcionális módszerekkel.

18

2. Célkitűzések

Kísérleteink során a farmakológiai gyakorlatban alkalmazott módszerekkel mért szöveti és funkcionális elváltozásokat hasonlítottuk össze 1 órás a. cerebri media elzárást követő 0-24 óra reperfúziós idő elteltével patkányban. A következő kérdésekre kerestünk a választ: Alkalmas-e a TTC festés az agyi infarktus megbízható kimutatására? 1. Befolyásolja-e a TTC festéssel kapott eredményeket, ha a TTC festéket agyszeletben, in vitro vagy intrakardiálisan, in vivo alkalmazzuk? 2. A TTC festéssel nekrotikusnak tekinthető agyszövet hisztológiai módszerekkel is annak tekinthető-e? 3. Vannak-e működő dopaminerg idegvégződések a TTC festéssel elhaltnak ítélt területeken komplex agykéreg-striatum agyszelet preparátumban, in vitro mérve? Helyettesíthetőek-e a funkcionális elváltozások mérésére kifejlesztett skálák egyszerűen kivitelezhető funkcionális tesztekkel? 1. Mennyire egységesek az agyi ischaemia-reperfúzió okozta funkcionális elváltozások mérésére kifejlesztett skálák eredményei? 2. Helyettesíti-e vagy kiegészítheti-e a technikailag viszonylag könnyen kivitelezhető egyensúlyozás (beam balance) és/vagy a lépéshiba (foot fault) teszt az összetett neurológiai skálák alkalmazását? 3. Van-e hatása az ischaemiás-reperfúziós károsodásnak a patkány lokomotoros aktivitására?

19

3.

Módszerek 3.1. Kísérleti állatok

Kísérleteinkhez hím, 250-300 g súlyú, Sprague–Dawley (Charles River Kft., Magyarország) fajtához tartozó patkányokat használtunk

64,65

. Az állatokat standard

körülmények között (12 órás napszaki megvilágítás, légkondicionált helyiség, 23±2 °C hőmérséklet, 60±20 % relatív páratartalom), polikarbonát ketrecekben (4 állat/ ketrec, 40 cm x 27 cm x 25 cm) helyeztük el, ahol a vizet és a táplálékot folyamatosan biztosítottuk. A kísérletek megtervezését és annak végrehajtását a 86/609/EEC direktívával összhangban lévő, helyi Etikai Bizottság hozzájárulásával végeztük el.

3.2. Az a. cerebri media műtéti elzárása (MCAO) Az a. cerebri media műtéti elzárását Longa és munkatársai által kifejlesztett módszer 27 kismértékű módosításával

66

hajtottuk végre. A koponya megnyitása nélkül végzett a.

cerebri media elzárás célja a klinikai körülmények között kialakuló súlyos, progresszív jellegű thrombo-embóliás stroke modellezése. A műtét ideje alatt (kb. 5 perc) és a filamentum eltávolításának ideje (kb. 3 perc) alatt arcmaszkkal történő éteres altatást alkalmaztunk. Az éter kiválasztását az indokolja, hogy neuroprotektív hatása nem ismeretes a szakirodalomban, ellentétben más anaesthetikumokkal (pl. izofluran, sevofluran, propofol, pentobarbital). A műtéti eljárás során az állatot háton fekvő helyzetbe helyezzük el a műtőasztalon, és a fejét rögzítjük. A nyak középvonalában ejtett metszés után feltárjuk az a. carotis communist, az a. carotis externát és az a. carotis internát; majd mikroklippel zárjuk az a. carotis interna extrakraniális ágát. A filamentumot a jobb oldali a. cerebri internába illesztjük, amely ágleadás nélkül éri el a koponyaalapot. Ezután a sziklacsont „S” alakú görbületén („carotis siphon”) áthaladva a sella turcica mellett vezetjük a filamentumot addig, amíg az a. cerebri media proximális szakaszát el nem érjük (az a. carotis communis kettéválásától számított kb. 21–22 mm távolságban) (5. ábra).

20

5. ábra. Az a. cerebri media műtéti elzárása filamentum módszerrel

Az agyvelő agyalapi felszíne és az a. carotis internán át az a. cerebri media eredéséig vezetett filamentum útja. (ACA - a. cerebri anterior, ACP - a. cerebri posterior, ACM - a. cerebri media.) Az alkalmazott filamentum egy egyszálú, lekerekített végű, poli-L-lizinnel bevont (0,1%, Sigma) műanyag szál (4.0, d = 0,21 mm, Byron). A poli-L-lizin egy polikationos polimerizált aminosav molekula, amely erősen kötődik a szilárd felületekhez. A bevonat elősegíti a filamentum tapadását az érfalhoz, és csökkenti a vérkeringéstől elzárt agyi terület variabilitását 49,67. Az okklúzió eredményeképpen a filamentum megakadályozza az a. carotis interna, valamint az a. cerebri anterior és a. cerebri media által ellátott agyi területek vérellátását (6. ábra)

68

. Az a. cerebri media elzárásának következtében a műtött állatokon

ellenoldali paretikus tünetek, mint féloldali érzéskiesés, végtaggyengeség, bénulás, valamint testtartási- és mozgáskoordinációs zavarok alakulnak ki. A szenzomotoros deficit elsősorban a mellső végtagon jelentkezik, mert a hátsó végtagokkal szemben a mellső lábak egyoldali, keresztezett beidegzést kapnak a primer mozgatókéregből.

21

Az érintett erek véráramlását 60 perces okklúziót követően a filamentum kíméletes eltávolításával állítjuk vissza (reperfúzió). A reperfúzió időtartama az alkalmazott kísérleti protokoll függvényében változik 0-tól 24 óráig. 6. ábra. Az a. cerebri media által ellátott agyi területek az agyvelő koronális metszetén

Az agyvelő koronális metszete kb. a bregmától számított 0.2 mm távolságban anterior irányban, ahol a féloldali ischaemia-reperfúzió által közvetlenül érintett területek sötét színnel jelöltek. A számok az a. cerebri media által ellátott területeket jelzik (1, 3 – striatum laterális része; 2, 4 – prefrontális kéreg). Az ACM okklúziónak alávetett állatok esetén tapasztalt elváltozások pontosabb megítélése érdekében szükségessé vált intakt és álműtött állatok bevonása is. Intaktnak tekintettük azokat az állatokat, amelyeket csak a műtét során alkalmazott kb. 5 perces éteres altatásnak vetettünk alá, de műtéti beavatkozást nem végeztünk. Az álműtött állatok esetén az altatás mellett elvégeztük az a. carotis ágainak feltárását és egy rövid filamentumot vezettünk az ACI-ba, azonban az ACM eredésének elzárására nem került sor. A műtét ideje alatt az állatok testhőmérsékletét állandó értéken (37 °C) tartottuk fűtőpad segítségével. A perioperatív időszakban bekövetkező testhőmérséklet változások követését rektális hőmérőzéssel végeztük.

22

3.3. Trifenil-tetrazolium klorid festés (TTC) A TTC festés célja az ischaemiás-reperfúziós károsodás mértékének meghatározása az élő

sejtek

mitokondriumában

dehidrogenázok aktivitása alapján

jelen 69

lévő

szukcinát-dehidrogenáz

és

egyéb

. Az átalakulás folyamatát a 7. ábra és 8. ábra

szemlélteti. 7. ábra. A TTC redukciója trifenil-formazánná

Az enzimatikus átalakulás során a vízben oldható, sárga színű TTC festék oxigén jelenlétében vörös színű, vízben oldhatatlan formazán-csapadékká alakul. 8. ábra. A tetrazólium sók átalakulása

A tetrazólium klorid sók redukciója az elektron mediátor (pl. glukóz) oxidációjával párhuzamosan történik, mialatt a dehidrogenáz enzim kofaktorának (NAD vagy NADP) redukciója és az enzim szubsztrátjának oxidációja megy végbe (http://www.serva.de). A TTC-vel nem festődő, csaknem fehér területek mutatják az IR által érintett, károsodott régiókat, amely felosztható teljesen fehér (core) és halvány rózsaszín (penumbra) területekre. Az ép területeken lévő enzimatikusan aktív sejtek dehidrogenáz enzimei képesek átalakítani a TTC festéket, ezért a kialakuló formazán csapadék piros színűre festi a szöveteket 70.

23

A TTC festést kétféle módon valósítottuk meg: 3.3.1. In vivo módszer Az állatokat pentobarbital (60 mg/kg, ip.) injekció beadásával altattuk el, majd a mellkas megnyitása után intrakardiálisan 4 % TTC (Sigma-Aldrich) vizes oldatot juttattunk a keringésbe bolusban. Az állatokat 30 perc elteltével dekapitáltuk, majd 8% formaldehid-foszát puffer elegyében (pH = 7) fixáltuk az agyvelőket 24 óráig. A fixálás után 1 mm vastagságú koronális metszeteket készítettünk agyi mátrix eszköz (Braintree Scientific Co., USA) segítségével. 3.3.2. In vitro módszer Az állatokat pentobarbital ip. injekció beadásával altattuk el, majd dekapitáltuk őket és a jégen lehűtött agyvelőkből 1 mm vastagságú koronális metszeteket készítettünk vibratom kés segítségével. A metszetek festése 2 % TTC vizes oldatban történt standard körülmények között (30 perc, 37 °C). A megfestett koronális metszeteket 8% formaldehid-foszát puffer elegyében (pH = 7) fixáltuk 24 óráig. A metszetek értékelése számítógépes képfeldolgozó szoftver (Digi Cell 4.0) használatával történt. A metszetek képpontjainak értékelése során, ha egy pont négy szomszédja ugyanolyan színű volt a terület épnek vagy core területnek volt jelölhető a szoftver segítségével, míg ha ez nem teljesült, akkor azt penumbrának tekintettük. A károsodott térfogat mértékegysége mm3, amelyet a teljes agytérfogat százalékos arányában adtunk meg. A károsodott térfogatot korrigáltuk az érintett oldali arteria cerebri media okklúzió eredményeképpen létrejött oedema nagyságával 71 a következők szerint: Oedema index = ilat. hemispherium térfogata (mm3) clat. hemispherium térfogata (mm3) Korrigált károsodott térfogat (mm3) = a károsodott térfogat az adott régióban (mm3) oedema index

24

3.3.3. Evanskék festés Az Evanskék festék fiziológiás körülmények között az érpályán belül maradó festék, a szövetek közötti térben való megjelenése az erek endotéliumának károsodására utal. Az Evanskék (Sigma-Aldrich) vizes oldatát (300 mg/kg/5ml) intrakardiálisan juttattuk be a pentobarbitál (60 mg/kg, ip.) segítségével előzetesen elaltatott állatba. Annak igazolására, hogy a TTC festék, az Evanskék festékhez hasonlóan képes eljutni az MCAO útján elzárt majd reperfundált agyi területre, az Evanskék festék alkalmazása után 1 perccel a TTC 4 %-os vizes oldatát juttattuk be a keringésbe, szintén intrakardiálisan. A metszetetek értékelése 1:1 nagyítással történt 72. 3.4. Hisztológiai és immunhisztokémiai festési módszerek 3.4.1. Luxol Fast Blue festés A Luxol Fast Blue (LFB) festés az idegi elemek vizsgálatára alkalmas festési módszer. Az idegsejtek axonját borító myelin hüvelyek foszfolipid tartalmuk alapján megkötik a festéket, amelynek eredményeképpen a myelin elemek zöldeskék színűre, az idegsejtek liláskék színűre festődnek. A LFB festéshez a 8%-os foszfát puffert tartalmazó formaldehid (pH = 7) elegyben rögzített agyszövet mintákat felszálló alkoholsorral víztelenítettük, majd paraffinba ágyaztuk. A paraffinba ágyazott blokkból 4-8 μm vastagságú metszeteket készítettünk és Klüver-Barrera szerint festettünk meg 72. 3.4.2. Toluidinkék festés A toluidinkék egy szintetikusan előállított bázikus jellegű, tiazin-típusú festék, amely metakromáziával festi a sejtmagot kék, a citoplazma bazofil elemeit halványkék színűre. A műgyantába ágyazott blokkból, Reichert ultramikrotom segítségével kb. 1 μm (félvékony) vastagságú metszeteket készítettünk, amelyeket toluidinkék festékkel (Reanal) festettünk meg 72. 3.4.3. Fluoro-Jade festés A Fluoro-Jade festést (FJ) egyre szélesebb körben használják a neuronális nekrózis kimutatására. A Fluoro-Jade

festéshez a paraffinos blokkból metszett 6-8 μm

25

vastagságú metszeteket használtunk, amelyeket deparaffinálást követően 0.001 %-os Fluoro-Jade (Histochem) 0.1 %-os ecetsavval készült oldatával Schmued szerint festettünk meg 73. 3.4.4. Gliális savas fehérje kimutatása A gliasejt alakjának fenntartásában szerepet játszó fehérje-jellegű intermedier filamentumok (glial fibrillary acidic protein, GFAP) megtalálhatók az asztrocitákban, az ependyma sejtekben, valamint a perifériás idegrendszerben lévő szatellita sejtekben és a Schwann sejtekben. A paraffinba ágyazott blokkból készített, 4-8 μm vastagságú metszetek deparaffinálása után a szöveti antigéneket gyári TRS-ben (target retrieval solution, DAKO), túlnyomáson történő főzéssel tártuk fel. A szöveti peroxidázt 3%-os hidrogén-peroxid oldattal gátoltuk. A nem specifikus háttérfestődés csökkentésére szarvasmarha szérum albumint (DAKO) alkalmaztunk. Az 1:300 arányban hígított primer GFAP Ab-4 nyúl poliklonális antitesttel (Lab Vision, USA) 45 percig inkubáltuk a metszeteket nedves kamrában 72. A reakció előhívásához EnVision® + diaminobenzidin rendszert (DAKO) használtunk a gyári előírás szerint. 3.4.5. Elektronmikroszkópos vizsgálat A vizsgálandó agyi szövetből 2 mm x 2 mm méretű kockákat vágtunk, amelyeket 4 %os foszfát puffer-formaldehid elegyben (pH = 7), majd 1 % ozmium-tetroxid oldatban fixáltunk. A szöveti mintákat felszálló alkoholsorral víztelenítettük és Durcupan műgyantába

(Fluka,

Svájc)

ágyaztuk

be.

A

metszeteket

Reichert

Ultracut

ultramikrotommal készítettük. Az ultravékony metszeteket ólom-citráttal és uranilacetáttal kontrasztosítottuk. Az elektronmikroszkópos felvételek értékelése JEOL JEM1011 elektronmikroszkóppal történt. 3.4.6. Tirozin-hidroxiláz enzim kimutatása A dopamin-bioszintézis meghatározó lépése az L-3,4-dihidroxi-fenilalanin képződése tirozinból, amelyet a tirozin-hidroxiláz (TH) enzim katalizál. A paraffinba ágyazott blokkból 4-8 μm vastagságú metszeteket készítettünk. A metszetek deparaffinálása után a szöveti antigéneket gyári TRS-ben (target retrieval

26

solution; DAKO), túlnyomáson történő főzéssel tártuk fel. A szöveti peroxidázt 3%-os hidrogén-peroxid oldattal gátoltuk. A nem specifikus háttérfestődés csökkentésére szarvasmarha szérum albumint (DAKO) alkalmaztunk, majd 1:4000 arányban hígított nyúl tirozin-hidroxiláz enzim antitesttel (Chemicon, USA) 45 percig inkubáltuk nedves kamrában 74. A reakció előhívásához EnVision® + diaminobenzidin rendszert (DAKO) használtunk a gyári előírás szerint. 3.5. A corticostriatális dopaminerg rendszer neurokémiai vizsgálata

3.5.1. A dopamin és a dopamin metabolitok szöveti koncentrációjának meghatározása HPLC módszerrel A nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiával (HPLC) történő mérés során a corticostriatális agyi szeletben lévő szöveti dopamin és metabolitjainak (9. ábra) mennyiségét vizsgáltuk. 9. ábra: Dopamin szintézise és metabolizmusa

A dopamin szintézisének kiindulópontja és egyben a folyamat sebesség meghatározó lépése a tirozin aminosav átalakulása 3,4-dihidroxi-L-fenilalaninná (L-DOPA), amelyet a tirozin-hidroxiláz enzim katalizál. Ezt követően a DOPAdekarboxiláz enzim a L-DOPA-ból egy karboxil-csoport eltávolításával képzi a dopamint. A felhasználatlan L-DOPA a katechol-O-metiltranszferáz (COMT) enzim

segítségével

3-metildopává

és

vanillinsavvá

bomlik.

A

dopamin

lebontásában a COMT enzimek mellett részt vesz a monoamino-oxidáz (MAO)

27

enzim is. A dopamin lebontásának leggyakrabban kimutatott végtermékei a 3,4dihidroxi-fenilecetsav (DOPAC) és a homovanillinsav.

HPLC méréshez sikeres a. cerebri media elzáráson átesett állatokból

75

származó

agyszeleteket használtunk, amelyekben in vitro TTC festéssel szöveti károsodást mutattunk ki. A corticostriatális agyi szeletek agykérgi és striatális részéből standard eszközzel azonos nagyságú (2 mm átmérőjű korong) szöveti mintákat vettünk ki. A kivett mintákat lemért tömegű Eppendorf edénybe helyeztük. Az egyes minták súlyának kiszámítása után homogenizáló puffert mértünk az Eppendorf edényekbe a várt agyi koncentrációtól függő hígítás elérésére (az ACM okklúziónak megfelelő oldali minta esetén 200-szoros, ellenoldali minta esetén 400-szoros hígítás). A hígításhoz használt homogenizáló puffer összetétele: 240,55 ml desztillált víz; 7,2 ml 70% perklórsav; 1 ml 0,1 M Na2S2O5; 1,25 ml 0,1 M Na-EDTA; 0,5 ml 0,25 M izoproterenol, belső standardként. A hígított mintákat ultrahangos roncsoló segítségével homogenizáltuk, majd nagyteljesítményű centrifugával (20 perc, 20 000 rpm, 4°C) ülepítettük

76

. A mérésekhez a felülúszót

használtuk fel. Az elválasztás Perkin Elmer-típusú, fordított fázisú (LiChroCART 250-4 Purospher STAR RP-18e; szemcseméret: 5µm) oszlopon történt. A mozgófázishoz használt puffer összetétele: 75 mM NaH2PO4; 2,8 mM oktán-szulfonsav Na-sója; 50 µM Na-EDTA; pH = 2,6 (H3PO4-val beállítva). A pufferhez 10% acetonitrilt adtunk a vizsgálandó anyagok elválasztásának elősegítésére. Az injektált térfogat 20 µl volt, kézi injektálással (Rheodyne injektor). Az elválasztás után a minta először egy UV-detektorba, majd az amperometriás detektorba (Decade, Antek Leyden)

áramlik, itt az ún. spacer térben az átáramló

folyadék egy vékony filmet képez. Az amperometriás detektor (elektródpotenciál: 660 mV, erősítés:5 nA) az oszloppal azonos termosztált térben foglal helyet. Az elektródok között indukálódó árammennyiség mérése állandó elektródpotenciál mellett történt. A módszer kimutatási határát előzetesen megvizsgáltuk, amely alapján a vizsgált szöveti koncentrációk mérését megbízhatónak ítéltük. A mérés pontosítása érdekében

28

belső standard alkalmazása vált szükségessé, ezért 0,25 nM/ml izoproterenolt adtunk a homogenizáló pufferhez. A HPLC módszerrel meghatározott dopamin és metabolitok szöveti tartalmát nmol/g szövet egységben adtuk meg. A dopamin szintézisére utaló dopamin turnover nagyságát a következőképpen számoljuk: Dopamin turnover = DOPAC (nmol/g) + HVA (nmol/g) dopamin (DA, nmol/g)

3.5.2. Jelzett dopamin felszabadulásának vizsgálata komplex agyszelet készítményben Az a. cerebri media műtéti elzárása során a frontoparietális agykéreg és a striatum károsodik. Az agykéreg piramidális sejtjeiből induló és a striatum GABAerg idegsejtjein végződő afferens pálya (corticostriatális pálya) részét képezi a bazális ganglion kör pályarendszereinek (10. ábra). Az alkalmazott komplex agyszelet magában foglalja a corticostriatális pályát 77. 10. ábra. Striatum pályarendszerei a bazális ganglionok rendszerében fiziológiás körülmények között

29

A bazális ganglionok rendszerét a putamen és a nucleus caudatus (striatum), valamint a globus pallidus, a nucleus subthalamicus és a substantia nigra magok alkotják. Az agykéregből érkező információk a striatum közvetítésével jutnak el a törzsdúcokba, majd a bazális ganglionok által feldolgozott információt a thalamus közvetíti az agykéregbe. A bazális ganglion kör ún. direkt és indirekt pályarendszerekből áll, amelyek elsődleges transzmitterei a glutamát, a gammaamino-vajsav (GABA) és a dopamin. A corticostriatális összeköttetések szigorú topográfiai rend szerint a striatum különböző helyein végződnek, ennek megfelelően működésük jelentősen eltér egymástól. Ezen összetett rendszerben a striatum integratív szerepét a zölddel jelzett afferens és a pirossal jelzett efferens pályák jelzik78. Az ACM okklúzión átesett, és a műtét sikerességére utaló tüneteket

75

mutató állatokat

24 órás reperfúzió elteltével, guillotine segítségével dekapitáltuk. A koponyából eltávolított agyvelőt 4°C hőmérsékletű, oxigenizált Krebs-bikarbonát puffert tartalmazó üvegedénybe helyeztük. A kisagy lemetszése után az agyvelőt középen, hosszanti irányban zsilett pengével kettévágtuk, majd kimetszettünk egy agyszövet darabot az

30

ACM okklúziónak megfelelő oldalon. A szelet metszési síkját a bulbus olfactorius felső pontját és a chiasma opticumot összekötő egyenes határozza meg

77,79

. Ezt az egyenest

követve két darab, 400-600 μm vastagságú agyi szeletet metszettünk ki, az egyikből a kromatográfiás méréshez vettünk ki szöveti mintát (3.5.1. fejezet) a másikból, pedig ék alakú kimetszést végeztünk. Az ék alakú metszés első vonala az oldalsó agykamra és a bazális felszín mediális középpontját köti össze, a második metszésvonal az elsővel párhuzamosan, attól 2 mm távolságban, laterális irányban haladt. Az így nyert preparátum összefüggő szeletként foglalja magában a prefrontális agykérget, a corpus callosum és a striatum egy részét (11. ábra). A radioaktív dopamin felszabadulás mérését mindig az elsővel párhuzamosan vágott és nem TTC-vel festett corticostriatalis szeletben végeztük. 11. ábra. Az agykéreg és a striatum pályarendszereinek elhelyezkedése és a corticostriatális szelet metszési síkjának iránya

A szelet metszési síkját a bulbus olfactorius felső pontját és a chiasma opticumot összekötő egyenes határozza meg 77,79. A kimetszett szeleteket 1 ml hideg Krebs-bikarbonát puffert tartalmazó kémcsőbe helyeztük folyamatos oxigén átbuborékoltatás mellett. Ezt követően a kémcsöveket 37 °C hőmérsékletű vízfürdőbe helyeztük. A pufferhez 370 kBq [3H] jelzett dopamint (10 μl/cső) adtunk. A jelzett dopamin specifikus aktivitása 38 Ci/mM. A tríciált dopamin koncentrációja a töltés alatt megközelítőleg 260 nM volt. A jelzett dopamin szöveti raktárakba történő felvételére 45 percet biztosítottunk folyamatos karbogén (93-95 % oxigén és 5-7 % szén-dioxid keveréke) átbuborékoltatás mellett. Az izotópfelvétel után

31

a szeletek karbogenizált Krebs-bikarbonát puffert tartalmazó perfúziós kamrába kerültek (12. ábra). 12. ábra. A kétrészes perfúziós kamra képe

Az agyszeletet egy kétrészes perfúziós kamrában helyeztük el, ahol a szelet agykérgi és striatális részeit egy szilikon zsírral bekent fal választja el egymástól. Az elválasztó fal kialakítása megakadályozza a két szöveti részt tartalmazó folyadék keveredését, de lehetővé teszi az ingerületátvitelt az agykérgi részről a striatumra. Az agykéreg az ingerlő elektródák között helyezkedik el 77. Az alkalmazott puffer összetétele: 118 mmol/l NaCl; 4,7 mmol/l KCl; 1,25 mmol/l CaCl2; 1,2 mmol/l NaH2PO4; 1,2 mmol/l MgCl2; 25 mmol/l NaHCO3, 11,5 mmol/l glükóz. Áramlási sebesség: 1 ml/perc, amelyet perisztaltikus pumpával hoztunk létre. Az első 30 percben a kamrában lévő agyszeletet folyamatosan perfundáltuk, mialatt a kifolyó folyadékot folyamatosan eltávolítottuk a rendszerből (ekvilibrációs periódus). Ezt követően automata frakció-kollektorral 3 percenként gyűjtöttük a mintákat (frakció). Az első 30 darab minta gyűjtése a kísérlet ingerlésmentes periódusa alatt történt, ezután a 31. frakció gyűjtése alatt az agyszelet agykérgi részén elektromos téringerlést végeztünk. Az alkalmazott elektromos ingerlés jellemzői: 40 V, 20 Hz, 2 ms impulzus szélesség (alternáló +/- 1-1 ms), ingerlési idő: 3 perc. A 41. minta gyűjtésének ideje alatt 40 mM KCl tartalmú Krebs-bikarbonát pufferrel perfundáltuk a preparátum striatumot tartalmazó részét a puffer NaCl koncentrációjának arányos csökkentése

32

mellett. A KCl oldattal történő perfúzió célja a szövet életképességének és válaszképességének ellenőrzése és hogy a cortikális és stritális térrészt sikerült-e teljes mértékben izolálni. Striatális KCl perfúzió hatására csak akkor nő meg az agykéregben a dopamin felszabadulás, ha a KCl oldat átjut az agykérget tartalmazó térrészbe. Kísérleteink értékelése során olyan sikeres ACM okklúzión átesett állatok

75

agyi

szeleteiből származó adatokat dolgoztuk fel, amelyek esetén KCl perfúzió hatására ingerlési csúcsot kaptunk és in vitro TTC festéssel a szöveti károsodás kimutatható volt. A kísérlet végén, az agyszövetben visszamaradt izotóppal jelzett neurotranszmitter radioaktivitásának megállapítása céljából az agyszeletet kivettük a perfúziós kamrából és a corpus callosum magasságában kettévágtuk. Az agykérgi és a striatális részeket előzetesen lemért súlyú Eppendorf edényekbe helyeztük és külön-külön 400 μl 0.1 M sósavat adtunk hozzá. A szöveteket 30 másodpercig ultrahangos roncsoló segítségével homogenizáltuk, és 30 perc elteltével a homogenizátumot asztali centrifugával (10 000 rpm, 10 perc) ülepítettük. A felülúszóból 200 μl-t 2 ml Packard Ultima gold szcintillációs folyadékkal kevertünk össze 79. A radioaktivitás mértékét Packard folyadék-szcintillációs β-számláló segítségével határoztuk meg Bq/g egységben a következők szerint: Bq/g = (DPM/60)/ szöveti tömeg (g) DPM = radioaktív bomlások száma percenként A csúcs alatti területet (AUC, area under the curve) kiszámítását a következő módon végeztük: az elektromos ingerlés által létrehozott csúcsot alkotó mintákban lévő radioaktív izotóp radioaktivitásának összegéből kivontuk az ingerlést megelőző és az azt követő 3-3 mintában lévő radioaktív izotóp radioaktivitásának átlagát (13. ábra).

33

13. ábra. [3H] jelzett dopamin felszabadulása a corticostriatális szelet agykérgi és striatális részéből az egyes frakciókban

Az első 30 darab minta gyűjtése a kísérlet ingerlésmentes, nyugalmi periódusa alatt történt. Ezután a 31. frakció gyűjtése alatt az agyszelet agykérgi részén elektromos

téringerlést

végeztünk.

Az

elektromos

ingerlés

hatására

az

agykéregben és a striatumban elsősorban radioaktívan jelzett dopamin szabadult fel, amelynek radioaktivitását az elvezetett folyadékban mértük

80,81

. A

corticostriatális szelet agykérgi (kék) és striatális (zöld) részéből felszabadult [3H] jelzett dopamin változása a kísérlet alatt.

34

3.6. A szenzomotoros deficit vizsgálata Az ischaemiás-reperfúziós (IR) károsodás által okozott szenzomotoros deficitet 1 órás a. cerebri media elzárását követően 24 óra reperfúzió elteltével vizsgáltuk, amelyhez négy különbözőképpen differenciált és súlyozott skálát alkalmaztunk. 3.6.1. Neurológiai skálák A

kiválasztott

neurológiai

skálák

alapja

a

testtartási

rendellenességek

és

mozgáskoordinációs zavarok vizsgálata, valamint az izomtónus csökkenés, a szenzoros funkciók, a spontán mozgásaktivitás és az általános állapot értékelése. 3.6.1.1. Reglődi-féle skála A Reglődi-féle skála

53

növekvő pontszámokkal értékeli az ischaemiás agyi károsodás

következtében kialakult szenzomotoros deficitet 16 vizsgálati paraméter tekintetében (1. táblázat). Vizsgálataink során a skálába épített többféle beállítással szereplő egyensúlyozás vizsgálatát nem végeztük el, a többi skálával való összehasonlíthatóság érdekében. Az így a módosított Reglődi-féle skála használatával az agyi ischaemiareperfúziónak alávetett állatok esetén maximálisan 31 pont, a neurológiai elváltozásokat nem mutató állatok (intakt) esetén 0 pont volt adható. 3.6.1.2. Hunter-féle skála A Hunter-féle skála

82

10 db vizsgálati paraméter alapján ítéli meg a neurológiai

elváltozások mértékét (1. táblázat). Minél kevésbé látható a neurológiai deficit, annál magasabb pontszámot kap a sérült állat. A skála maximális pontszáma 21. 3.6.1.3. Garcia-féle skála A Garcia-féle skála

83

egy 6 vizsgálati paraméterből álló vizsgálati skála, amelyben az

agyi ischaemia tüneteinek megjelenése csökkenő pontszámokkal értékelhető (1. táblázat). A skála maximális pontszáma 18.

35

3.6.1.4. Bederson-féle skála A Bederson-féle skála

75

a legnagyobb múlttal rendelkező neurológiai skála, amelyet

később Hunter és munkatársai kibővítettek

82

, ezáltal a skála differenciáltabbá vált. A

skála jellegzetessége, hogy 5 kumulatív vizsgálati paramétert értékel. A neurológiai deficittel rendelkező állat esetén maximálisan 5 pont adható. A skála paraméterei a következők: 0- az állat nem mutat kóros neurológiai tüneteket; 1- az állat nem tudja kinyújtani teljes mértékben a bal mellső lábát; 2- az állat kevésbé válaszol a farok enyhe meghúzására a bal mellső lábának megmozdításával, mint a jobb oldali mellső lábával; 3- az állat spontán mozog, körben jár, vagy forog (14.ábra, A.); 4- az állat kevéssé érzékeli környezetét, és csak akkor mozog, ha ösztönözzük rá pl. enyhén meghúzzuk a farkát, vagy hanghatás alkalmazása; 5- az állat egyáltalán nem mozog. Az állatokat nappal vizsgáltuk, ugyanazt a sorrendet követve mindegyik skála alkalmazásánál. A vizsgálatok során az IR csoportban kapott adatok hitelességét előzetesen intakt állatokban mért adatokhoz hasonlítottuk. Az állatok neurológiai vizsgálatát olyan kolléga segítségével végeztük, aki nem volt tájékoztatva az egyes neurológiai skálák összetételéről. 1. táblázat. Alkalmazott neurológiai vizsgálati skálák és az egyes vizsgálati paraméterekre adható pontszámok a tünetek jellege szerint

36

Reglődi-féle skála Spontán mozgásaktivitás vizsgálata. (1 perc) 0-1 - Normális vagy enyhén csökkent explorációs viselkedés. 2- Az állat explorációs viselkedése nem folyamatos. 3- Az állat csak ösztönzés hatására mozog. 4- Az állat nem mozog, de az izomtónusa megtartott. 5- Az állat nem mozog és izomtónusa csökkent.

1. Mozgásaktivitás Hunter-féle skála Mozgásaktivitás értékelése. 0- Az állat egyáltalán nem mozog. 1- Az állat bizonytalanul, támolyogva jár. 2- Az állat fiziológiás mozgásaktivitást mutat.

Garcia-féle skála Spontán mozgásaktivitás vizsgálata a ketrecben (5 perc). 0 - Az állat nem mozog. 1- Az állat nem áll fel, a ketrecében keveset mozog.

2. Testtartási rendellenességek az állat farkánál fogva felemelt helyzetében Reglődi-féle skála Hunter-féle skála Garcia-féle skála Az állatot a farkánál fogva Az állatot a farkánál fogva Az állatot a farkánál fogva felemeljük az asztalról. A felemeljük az asztalról. A felemeljük az asztalról. A mellső lábak helyzetét testtartását és végtagok helyzetét és értékeljük. elmozdulásának irányát elmozdulását értékeljük. 0- Az állat mellső lábait értékeljük. 0- Az állat nem mozgatja teljesen ki tudja nyújtani. 1- Az állat csak egyik bal mellső lábát. 1- Az állat mellső lábait irányába képes elfordulni 1- Az állat a bal mellső és kevésbé tudja nyújtani. (14. ábra, B.). hátsó lábát kevésbé 2- Az állat mellső lábait 2- Az állat mindkét irányba mozgatja. nem tudja nyújtani. képes elfordulni. 2- Az állat a bal oldali mellső és hátsó lábát Az állatot a farkánál fogva mozgatja, de lassabban, felemeljük az asztalról. Az mint a jobb oldalon. állat testtartását 3- Az állat mindegyik lábát értékeljük. azonos mértékben 0- Az állat mindkét irányba mozgatja. képes elfordítani a mellkasát. 1- Az állat egyik irányba kevésbé képes elfordítani a mellkasát. 2- Az állat az egyik irányba nem képes elfordítani a mellkasát (14.

37

ábra, B.). 3. Mozgási rendellenességek, mozgáskoordinációs zavarok álló helyzetben Reglődi-féle skála Hunter-féle skála Garcia-féle skála Az asztalra helyezett állat Az állatot az asztalra Az asztalra helyezett állat mozgását és annak irányát helyezzük, és a mozgását egyik majd másik oldalát értékeljük. értékeljük. tompa eszközzel 0- Az állat egyenes 0- Az állat forog (14. ábra, megérintjük, majd az állat vonalban jár. A.). reakcióját, fejmozgását 1- Az állat a végtagi parézis 1- Az állat egyenesen jár. értékeljük. irányában halad. Az állatot egy 45 ° 1- Az állat nem reagál az 2- Az állat a végtagi parézis dőlésszögű lejtőre érintésre. irányában, nagy körben helyezzük fejjel lefelé. A 2- Az állat csak lassan forog lejtőn való elmozdulását reagál az érintésre. 3 - Az állat mindkét 3- Az állat járásában az értékeljük. egyenes járás és a forgás 0- Az állat nem mozdul, oldalon vizsgálva azonos az érintés váltakozik. fejjel lefelé nézve marad a mértékben irányába fordítja fejét. 4- Az állat forog és/vagy lejtőn. egyéb testtartási 1- Az állat megfordul és rendellenességek is elindul felfelé a lejtőn 30 láthatók, pl. hason csúszik másodpercnél több idő alatt 5- Az állat forog (14. ábra, 2- Az állat megfordul és A.). elindul felfelé a lejtőn 15Az állatot egy 45 ° 30 másodpercen belül dőlésszögű lejtőre 3- Az állat megfordul és helyezzük fejjel lefelé. A elindul felfelé a lejtőn 15 lejtőn való elmozdulását másodpercen belül. értékeljük. A állatot hátára fektetjük a 0- Az állat megfordul, és tenyerünkben. Majd az fel tud menni a lejtőn. állat hasra történő 1- Az állat nem képes átfordulását értékeljük. felmenni a lejtőn. 0 -Az állat nem tud Az asztalra helyezett állat visszafordulni farkát enyhén meghúzzuk 1- Az állat vissza tud (3x). A mozgáskoordinációs fordulni hason fekvő zavar megjelenését helyzetbe. értékeljük. 0- Nincs elváltozás. 1- Enyhe elváltozás. 2- Súlyos mozgáskoordinációs zavar. Az asztalra helyezett állat hátát kitérítjük az egyik, majd a másik oldalra (3x). A mozgáskoordinációs zavar megjelenését értékeljük.

38

0- Nincs elváltozás. 1- Enyhe elváltozás.

39

4. Mellső és hátsó lábak használata Reglődi-féle skála Hunter-féle skála Garcia-féle skála Mellső láb használatának Az állatot az asztal szélére Az állatot farkánál fogva értékelése. helyezzük, a szélével annyira emeljük fel az 0- Nincs elváltozás. merőlegesen úgy, hogy feje asztalról, hogy még azt 1- Enyhe asszimetria a két az asztal széléről kissé éppen elérje mellső mellső láb használata lelógjon. (Ekkor az intakt lábaival, és lépni tudjon között. A mellső láb állat a mellső lábaival rajta. 2- A bal mellső lábát nem megpróbálja elkapni az használatát értékeljük. használja. asztallap alsó részét.) A 0- Az állat nem használja a Hátsó láb használatának mellső láb használatát bal mellső lábát. 1- Az állat a bal mellső értékeljük. értékelése. 1- Az állat csak egyik lábát lábát kevésbé használja. 0- Nincs elváltozás. 2- Az állat a bal mellső 1- Enyhe aszimmetria a két érinti az asztalhoz. hátsó láb használata között. 2- Az állat mindkét lábát az lábát kevésbé nyújtja ki, mint a jobb mellső lábát. 2- A bal oldali hátsó lábát asztalhoz érinti. nem használja. Az állatot farkánál fogva 3- Az állat mindkét lábát az 2-Súlyos felemeljük az asztalról, asztalhoz érintve, azokat mértékben mozgáskoordinációs zavar. hogy még azt éppen elérje. azonos A mellső láb használatát használja. értékeljük. 1- Az állat csak egyik mellső lábát nyújtja ki az asztal felé. 2- Az állat mindkét mellső lábát nyújtja ki az asztal felé.

40

5. Izomtónus szimmetriája, izomerő Reglődi-féle skála Hunter-féle skála Garcia-féle skála Az állatot az asztalra Kontralaterális reflex Az állatot farkánál fogva helyezzük, majd egyik majd értékelése. annyira emeljük fel az másik oldalról 0- A reflex kiváltható. asztalról, hogy még azt megpróbáljuk kitéríteni az 1- A reflex nem váltható ki. éppen elérje mellső egyenes helyzetéből. Az Az állatot bordázott lábaival, és lépni tudjon oldalirányú eltolás ellen gerendára helyezzük úgy, rajta. A mellső láb kifejtett ellenállást hogy mellső lábaival meg használatát értékeljük. értékeljük. tudjon kapaszkodni. A 0- Az állat nem használja a 0Az állat megtartja kapaszkodás mértékét bal mellső lábát. magát egyenesen. 1- Az állat a bal mellső értékeljük. 1- Az állat kevésbé tudja 0- Az állat nem tudja magát lábát kevésbé használja. magát megtartani megtartani 2- Az állat a bal mellső egyenesen. 1- Az állat csak lóg a lábát kevésbé nyújtja ki, 2- Az állat a jobb oldali gerendán. mint a jobb mellső lábát. eltolás hatására nem tudja 2- Az állat csak egyik 3- Az állat mindkét lábát az magát megtartani, eldől. mellső lábát tartja a asztalhoz érintve, azokat azonos mértékben Az állatot a ketrec rácsos gerendán. falán engedjük 3- Az állat mindkét mellső használja. lábát a gerendán tartja és Az állatot a ketrec rácsos megkapaszkodni (Fiziológiás esetben az felhúzza magát és felhúzza falán engedjük megkapaszkodni állat ekkor mind a négy magát a gerendára. lábát használva felmászik a (Fiziológiás esetben az állat ekkor mind a négy ketrec falán.) A lábát használva felmászik a kapaszkodás mértékét értékeljük. ketrec falán.) Miután az 0Az állat erősen állat megkapaszkodott kapaszkodik a ketrec rácsos farkánál fogva falához mindkét mellső megpróbáljuk a ketrec lábával. Az eltávolításnak falától eltávolítani. A ellenáll. kapaszkodás mértékét 1- Az állat csak egyik értékeljük. lábával kapaszkodik a 1- Az állat nem tud megkapaszkodni a ketrec ketrec rácsos falához. Az eltávolításnak kevésbé tud rácsos falán. 2- Az állat megkapaszkodik ellenállni. a rácsos falon, de megtartani magát nem tudja. 3- Az állat könnyen megkapaszkodik a rácsos falon, és erősen tartja magát.

41

Reglődi-féle skála Az állatot függőlegesen kézbe fogjuk és a mellső lábak talpait egy pálcával megérintjük. A fogási reflex mértékét értékeljük. 0- A fogási reflex látható. Az állat mellső láb talpának érintésére a talpát becsukja és megfogja a pálcát mindkét mellső lábával. 1- A fogási reflex csak egyik mellső láb esetén látható. Az állatot függőlegesen kézbe fogjuk és a mellső lábak talpait egy hegyes tűvel enyhén megérintjük. A tapintási reflex mértékét értékeljük. 0- A tapintási reflex látható. Az állat mellső lábát elrántja a tűtől. 1- A tapintási reflex csak egyik mellső láb esetén látható.

Reglődi-féle skála

-

6. Szenzoros funkciók Hunter-féle skála

-

7. Általános állapot Hunter-féle skála Általános állapot értékelése. 0- Az állat lesoványodott, legyengült, izomtónusa lecsökkent. 1- Az állat külseje ápolatlan, pl. piszkos a szőre, összehúzza magát. 2Az állat szőrzete gondozott, éber, a környezete iránt érdeklődik.

42

Garcia-féle skála Az állat szempilláit tompa tárggyal végigsimítjuk és az állat reakcióját értékeljük. (A szempillák érintésére irányuló mozdulatot az állat hátsó része felől indítjuk, ezáltal elkerüljük az állat látóterébe történő belépést). A szenzoros funkció mértékét értékeljük. 1- Az állat nem reagál a szempillák érintésére. 2- Az állat csak lassan reagál a baloldali szempillák érintésére. 3Az állat azonos mértékben reagál a szempillák érintésére mindkét oldalon. Fejét elfordítja a szempilla érintésének hatására.

Garcia-féle skála

-

14. ábra. Az a. cerebri media elzárása következtében kialakult jellegzetes tünetek

A: Forgás

B: Mellkas elfordítása

3.6.2. Funkcionális tesztek 3.6.2.1. Lépéshiba mérése (foot fault) A lépéshiba teszt során az állatot kb. 40 cm magasra emelt 20 cm x 20 cm méretű fémrácsra helyeztük, a rács lyukmérete 2,3 cm x 2,3 cm

84

. A fémrács alatt szivacsot

helyeztünk el az esetlegesen leeső állat sérülésének kiküszöbölése céljából. A mérés során azt számoltuk, hogy a szenzomotoros deficit következtében az állat melyik lába és hányszor csúszik át a rácspontok közötti lyukakon (15. ábra). Az intakt és álműtött állatok esetén lépéshiba nem volt kimutatható, ezért ezen eredményekkel nem számoltunk a későbbiekben. 15. ábra. Lépéshiba mérése

43

Az állatot kb. 40 cm magasra emelt, standard rácsméretű fémrácsra helyezzük, és azt számoljuk, hogy a szenzomotoros deficit következtében az állat melyik lába és hányszor csúszik át a rácspontok közötti lyukakon (lépéshiba). A mérés időtartama 2 perc. Az így kapott adatokból a lépéshiba indexet a következő módon számoljuk:

Ha a lépéshiba index értéke 0, akkor nincs aszimmetria a két oldalon lévő lábak között. Az állatot zajkeltéssel vagy érintéssel ösztönöztük a rácson való mozgásra, amennyiben aktivitása alapján azt szükségesnek ítéltük 84. 3.6.2.2. Egyensúlyozás (beam balance) Az egyensúlyozás (beam balance) teszt során az állatot egy 40 cm magasságban felfüggesztett érdes fa gerenda (d = 2,5 cm) közepére helyeztük (16. ábra), amely alatt egy szivacsot helyeztünk el az esetlegesen leeső állat sérülésének kiküszöbölése céljából. A fa gerendára helyezett állat igyekszik megkapaszkodni a gerendán és megtartani egyensúlyát. A szenzomotoros deficit következtében az állat érintett oldalon lévő mellső és hátsó lába lecsúszik a gerendáról, és elveszíti egyensúlyát

85

. Intakt és

álműtött állatok mindegyike fenn tudott maradni gerendán a vizsgálat 2x30 másodperce alatt, ezért ezen eredményekkel nem számoltunk a későbbiekben. 16. ábra. Egyensúlyozás

44

Az állatot egy 40 cm magasságban felfüggesztett érdes fa gerenda közepére helyezzük, és a gerendán eltöltött időt mérjük. A neurológiai deficit mértékétől függően végtagjaival kapaszkodik, és igyekszik fennmaradni a gerendán. A kísérlet során azt mértük, hogy az állat mennyi ideig képes fennmaradni a gerendán a kísérlet 30 másodpercéből. A egyensúlyozás mértékét (másodperc) a két mérés átlagából számoljuk 85. 3.6.2.3. A lokomotoros aktivitás vizsgálata Az állatot meghatározott méretű (41 cm x 41 cm x 30 cm), négyzet alapú, helyiségbe helyezzük (17. ábra). Az erős fény által okozott diszkomfort érzést derengő fény alkalmazásával csökkentettük. A vizsgálat időtartama 15 perc (3 x 5 perc) volt. Az állat mozgását az infravörös fénynyalábok megszakításából számolta a számítógép 87. Az állat mozgását a megtett út, az infravörös fénynyaláb megszakításainak száma, a mozgással eltöltött idő és a pihenéssel eltöltött idő jellemzi. A kísérletben részt vevő állatok mozgásának értékelésekor valamennyi paramétert figyelembe vettük. Az adatokat a megtett út függvényében ábrázoltuk, mértékegysége: inch. 17. ábra. A lokomotoros aktivitás mérése

Az állatot egy négyzet alapú helyiségbe helyezzük, ahol derengő fényt alkalmaztunk.

A

mozgásaktivitást

a

fénynyalábok segítségével regisztráltuk.

45

készülék

falába

épített

infravörös

3.6.3. Korrelációs vizsgálatok A neurológiai vizsgálatok során alkalmazott skálák eredményeinek összehasonlításakor normalizált értékekkel számoltunk:

Továbbá, a Hunter és Garcia-féle skálák esetén a normalizált pontértékeket tovább alakítottuk a következőképpen:

Az átalakítás célja, hogy mindegyik skála esetén 0 pont a fiziológiás neurológiai paraméterekkel rendelkező állat állapotára, az adott skála maximális pontszáma pedig az MCAO által okozott kóros neurológiai elváltozásokat mutató állat státuszára utaljon. A szenzomotoros funkciók vizsgálatát a gerendán való egyensúlyozás (beam balance) és lépéshiba (foot faults) tesztekkel egészítettük ki. 3.7. Testtömeg mérés A testtömeg mérés fontos vizsgálati paraméter az állat fizikális állapotának megítéléséhez. Az állatok tömegének mérését a műtéti beavatkozás előtt és 1 nap elteltével végeztük el asztali mérleg segítségével (2201 típusszámú mérleg, Sartorius). 3.8. Statisztikai értékelés A kísérletsorozat értékelése során alkalmazott statisztikai módszereket a kísérlet jellegétől függően választottuk ki (TTC festés és lokomotor aktivitás vizsgálat: ANOVA, Duncan post hoc teszt; HPLC mérés és corticostriatális szelet technika:

46

ANOVA, Tukey-Kramer post hoc teszt; neurológiai skálák korrelációja: Pearson korreláció). A számításokhoz Statistica 6.0 programot használtunk.

47

4.

Eredmények

4.1.

TTC festéssel kapott eredmények

Az intakt kontroll állatok esetén sem oedemát, sem az agyi szövetek károsodására utaló festődési jelet nem láttunk. A statisztikai feldolgozás során kizárólag az egymást követő időpontokban mért core és penumbra térfogatát hasonlítottuk össze mind az agykéregben, mind a striatumban. Ezen kívül az in vitro és in vivo festéssel kapott core és penumbra értékeket hasonlítottuk össze egymással, az agykéregben és a striatumban egyaránt. 4.1.1. Az in vivo TTC festéssel kapott eredmények -

A két egymást követő időpontban mért károsodott térfogatok (core és penumbra) összehasonlítása (19. ábra):

Az in vivo TTC festés esetén már a 60 perces MCAO végén, a filamentum eltávolításakor jelentős térfogatú core és penumbra régió látható mind az agykéregben (48.6 mm3, 77.8 mm3), mind a striatumban (63.2 mm3, 53.5 mm3). Ezt követően az agykéregben a core térfogata 0 és 1 óra között csökken, 1 és 16 óra reperfúzió idő között nem változik, majd a core térfogata 16 és 24 óra reperfúzió idő között ugrásszerűen megnő. Az agykéregben a penumbra térfogata nem változik az egyes reperfúziós idők között. A striatumban a core térfogata 0 és 1, valamint 4 és 8 óra között csökken. A striatumban a penumbra térfogata csak 8 és 16 óra reperfúziós idő között csökken. -

A core és penumbra nagyságának összehasonlítása különböző reperfúziós időpontokban (19. ábra):

Az agykéregben mindegyik reperfúziós időnél vizsgálva szignifikánsan különbözik a core és a penumbra térfogata. Az agykéregben 16 órányi reperfúziós idő elteltéig a core mintegy 40-60%-a a penumbra térfogatának. A striatumban csak 8 és 24 óra reperfúzió elteltével különbözik a core és penumbra nagysága. 24 óra reperfúziós időnél a core és penumbra aránya megváltozik, ekkor a penumbra mindössze kb. ¼-e a core térfogatának mind az agykéregben, mind a striatumban.

48

19. ábra. A core (■) és penumbra ( ) térfogata az agykéregben és a striatumban in vivo TTC festés alkalmazásával

agykéreg

károsodott szövet térfogata %

30

***

20 ###

*

10

### ###

###

0 1 n=14 n=16

4 8 16 24 n=13 n=10 n=12 n=22

striatum

30 károsodott szövet térfogata %

###

*

0 reperfúzió időtartama, óra

##

20

*

*

10

#

*

0 reperfúzió időtartama, óra

*

0 n=14

1 n=16

4 n=13

#

8 16 n=10 n=12

24 n=22

(Összehasonlítás módja: Két egymást követő időpont között kapott károsodott térfogatok összehasonlítása: *; core és penumbra nagyságának összehasonlítása különböző reperfúziós időpontokban: #. A szignifikancia szintek jelölése: *, #

49

p<0,05; ## p<0,01; ***, ### p<0,001; Adatok: átlag±SEM, agytérfogat %; Statisztikai módszer: ANOVA, Duncan post hoc teszt) 4.1.2. Az in vitro TTC festéssel kapott eredmények -

Két egymást követő időpont között kapott károsodott térfogatok (core és penumbra) összehasonlítása (20. ábra):

A 60 perces ACM okklúzió végén közvetlenül és 1 órás reperfúziós idő elteltével csak igen gyenge, a TTC festéssel rózsaszín területként látható penumbra jellegű szöveti károsodás volt kimutatható az agyszeletben. Ezt követően, a 4 órás reperfúziós idő elteltével mind az agykéregben, mind a striatumban kismértékű, de jól elkülöníthető fehér színű core látható, a penumbra tovább növekszik. A korábbi reperfúziós időhöz mérten a core térfogatok nem növekedtek szignifikáns mértékben, azonban az agykéregben a penumbra térfogata szignifikáns mértékben növekedik 1-4 óra és 8-16 óra reperfúziós idő elteltével. 20. ábra: A core (■) és penumbra ( ) térfogata az agykéregben és a striatumban in vitro TTC festés alkalmazásával

agykéreg

károsodott szövet térfogata %

30

20

* # ##

10 *

#

#

0 reperfúzió időtartama, óra

0 n=10

1 n=16

4 n=12

50

8 16 n=12 n=12

24 n=15

striatum

károsodott szövet térfogata %

30

20

10 ** ###

### ###

###

0 reperfúzió időtartama, óra

0 n=10

1 n=16

4 n=12

8 16 n=12 n=12

24 n=15

(Összehasonlítás módja: Két egymást követő időpont között kapott károsodott térfogatok összehasonlítása: *; core és penumbra nagyságának összehasonlítása különböző reperfúziós időpontokban: #. A szignifikancia szintek jelölése: *, # p<0,05; **, ## p<0,01; ### p<0,001; Adatok: átlag±SEM, agytérfogat %; Statisztikai módszer: ANOVA, Duncan post hoc teszt) -

A core és penumbra nagyságának összehasonlítása különböző reperfúziós időpontokban (20. ábra):

Az agykéregben és a striatumban szignifikánsan különbözik a core és penumbra nagysága minden időpontban. A core és penumbra egymáshoz viszonyított aránya változik: ez az arány 4 óra reperfúzió elteltével 1:4, míg a reperfúzió későbbi fázisában megközelítőleg az arány csökken az agykéregben és a striatumban egyaránt. 4.1.3. Az in vitro és in vivo TTC festési módszer eredményeinek összevetése A két festési módszerrel kapott eredmények teljes mértékben eltérő festődési dinamikát mutatnak (21. ábra). Mind az agyi régiók (agykéreg, striatum) tekintetében, mind a festődés jellegében (core, penumbra) szignifikáns különbségek mutathatók ki az in vitro és in vivo TTC festés eredményei között (2. táblázat).

51

21. ábra. Az in vivo és in vitro TTC festéssel kapott koronális agyszeletek az MCAO után különböző, reprezentatív időpontokban In vitro festés

In vivo festés

Az agy egy-egy koronális metszete a bregmától számított kb. 0,2 mm távolságban anterior irányban. A TTC festéssel fehérnek látszó core és a rózsaszín penumbra területek változása az 1 órás a. cerebri media elzárása után közvetlenül és 1, 8, 24 óra reperfúziós idő elteltével. 2. táblázat. Az in vitro és in vivo TTC festés eredményeinek összehasonlítása (Szignifikancia szintek jelölése: ** p<0,01; *** p<0,001; Adatok: átlag±SEM, agytérfogat %; Statisztikai módszer: ANOVA, Duncan post hoc teszt) agykéreg in vitro 0 óra n=10 1 óra n=16 4 óra n=12 8 óra n=12 16 óra n=12 24 óra n=15 in vivo 0 óra n=14 1 óra n=16 4 óra n=13 8 óra n=10 16 óra n=12 24 óra n=22

core 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 1.14 ± 0.52 3.99 ± 1.12 5.57 ± 0.91 8.47 ± 1.90

5.80 3.39 3.70 2.88 3.89 20.09

core ± 0.37 ± 0.69 ± 0.65 ± 0.54 ± 0.24 ± 0.46

penumbra 1.14 ± 0.40 0.90 ± 0.24 5.03 ± 0.36 7.52 ± 0.98 11.77 ± 1.71 14.98 ± 1.61 agykéreg penumbra *** 9.28 ± 0.38 ** 8.58 ± 0.15 8.10 ± 0.77 6.53 ± 0.82 7.37 ± 0.63 *** 5.34 ± 0.41

52

0.00 0.00 0.86 2.11 2.27 3.92

*** ***

*** ***

7.54 3.99 5.28 3.08 2.65 4.71

striatum core ± 0.00 ± 0.00 ± 0.21 ± 0.59 ± 0.85 ± 0.61 striatum core ± 0.45 *** ± 0.66 *** ± 0.48 *** ± 0.52 ± 0.12 ± 0.22

penumbra 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 3.50 ± 0.55 3.99 ± 0.74 5.03 ± 0.55 7.20 ± 1.65 penumbra 6.38 ± 0.37 *** 3.99 ± 1.36 *** 5.32 ± 0.86 6.73 ± 0.68 3.77 ± 0.51 1.26 ± 0.24 ***

Az in vitro festéssel nem tapasztalunk számottevő elváltozást a reperfúzió kezdetén, ezért a 0 és 1 órás reperfúziós időpontokban az in vivo festéssel mért szöveti károsodás szignifikánsan nagyobb volt. A reperfúzió későbbi időpontjait tekintve, a kép összetett: míg 8 órás reperfúzió elteltével hasonló kiterjedésű a core és a penumbra nagysága mindkét agyi régióban, ezzel szemben 4 óránál a striatum core és 16 óránál az agykéregben mért penumbra különböznek egymástól. 24 óra reperfúziós elteltével, bár a teljes károsodott terület nagysága (mindkét agyi régióban mért core és penumbra összege) nem különbözik a két festés esetén (34,6 % és 31,4 %), de a striatumban mérhető penumbra kivételével a core térfogata nagyobb, a penumbra térfogata pedig kisebb az in vivo TTC festés után. 4.1.4. Evanskék festés Annak vizsgálatára, hogy vajon a TTC eljut-e a korábban a véráramlástól elzárt területekre, Evanskék festést alkalmaztunk (22. ábra). Az Evanskék eljut az a. cerebri media vérellátási területére a reperfúziót követően. 22. ábra. Evanskékkel és TTC-vel megfestett koronális metszetek a 1 óra reperfúzió elteltével

A kép felső részén egy festetlen (natív) és mellette a 4 % TTC-vel in vivo megfestett agyszelet látható. A kép alsó részén Evanskékkel és TTC-vel egyaránt megfestett agyszeletek láthatók. Az Evanskék megfesti a TTC-vel nem festődő agyi területeket.

53

4.2.

Hisztológiai és immunhisztokémiai elemzés eredményei

Hisztológiai és immunhisztokémiai vizsgálataink célja a TTC festéssel fehérnek látszó core, azaz károsodottnak ítélt területek szövettani vizsgálata. Hogy képet kapjunk az egyes sejttípusok károsodásának progressziójáról az a. cerebri media által ellátott agyi területeken, többféle morfológiai módszert alkalmaztunk párhuzamosan. 4.2.1. TTC festéssel elhaltnak ítélt agyi területek morfológiai vizsgálata a reperfúziós idő előrehaladásával 4.2.1.1. 0 óra reperfúzió A vizsgált állatok mindegyikében a kialakult oedema következményeként az agykamrák méretének jelentős csökkenése volt tapasztalható. Az a. cerebri media elzárásával ellentétes (kontralaterális) oldalon enyhe fokú oedemát és néhány degenerálódott idegsejtet láttunk az érintett oldalon (ipszilaterális) tapasztaltakhoz képest, egyéb elváltozás nem volt kimutatható. Az okklúzió végén a kéreg- és a fehérállományban körülírt kisebb területen az idegsejtek egy részének citoplazmájában mikrovakuolizáció, máshol az idegsejtek zsugorodása (sötét neuronok), perineuronális vakuolizáció és a neuropilben oedema (status cribrosus) ismerhető fel. 4.2.1.2. 1 óra reperfúzió A fent leírt elváltozások az okklúziót követő reperfúzió első órájában kiterjedtebben mutatkoznak, így nagyobb számú sötét neuron és súlyosabb oedema figyelhető meg (23. ábra. A., B.). Az ellenoldali agykéreg szövettani képéhez hasonlítva a kondenzálódott sejtmagok és az azokat körülvevő duzzadt citoplazmatikus elemek jellegzetes, kagylószerű formát képeznek (23. ábra. B.). Ellentétben az idegsejteken látható viszonylag enyhe elváltozásokkal, az asztrociták az IR károsodás fókuszpontjában a károsodás egyértelmű jeleit mutatják. Jellemzően, a citoplazmatikus elemek

54

fragmentálódtak, a sejtmagban lévő kromatinállomány töredezetté válik, a sejtmag membránja fellazul, valamint a GFAP diffúziója megindul az extracelluláris tér felé (24. ábra. A., B.). Az elektronmikroszkópos felvételek alapján a citoplazma elektrondenz elváltozásainak hátterében a durva felszínű endoplazmás retikulum (DER) felszínéről leváló riboszómák (25. ábra. A.) figyelhetők meg. A károsodás központi részén az agyi kapillárisok helyenként trombotizáltak, és körülöttük duzzadt asztroglia sejtek láthatók (25. ábra. B.). A neuropilben lévő vakuolumok megfelelnek az asztrociták duzzadt talprészeinek, valamint a vakuolizált preszinaptikus idegvégződéseknek (25. ábra. C.). 4.2.1.3. 8 óra reperfúzió Az 1 órás ACM okklúziót követő 8 óra reperfúzió után a károsodás kiterjedtebben jelentkezik a kéreg- és a fehérállományban egyaránt. A neuropilben nagyfokú vakuolizáción kívül már a demyelinizáció is megjelenik (23. ábra. C., D.). A GFAPtartalmú asztrociták károsodásának jelei tovább súlyosbodnak (24. ábra. C.). A károsodott terület középpontjában számos elhalt idegsejt mellett az idegsejtek többségének citoplazmájában csak enyhe kromatolízis látható, a gliatalpak erősen megduzzadtak és a perivaszkuláris tér kitágult (25. ábra. D.). Helyenként a sejtoldódás jeleit mutató oligodendrociták láthatók (25. ábra. E.). 4.2.1.4. 24 óra reperfúzió 24 óra reperfúziós idő elteltével a károsodott sejtek még kiterjedtebben fordulnak elő és a korábban felismert sejtes elváltozások előrehaladottabb formában mutatkoznak. A neuropil vakuolizációja, lízise az elhalás centrális részén kifejezett (23. ábra. E., F.). A GFAP-tartalmú asztrociták szinte teljes mértékben szétesnek (24. ábra. D.). Az elektronmikroszkópos felvételek segítségével fellazult agyi kapillárisokat (25. ábra. F.), valamint erősen zsugorodott, jellegzetesen sötét színű, ún. dark idegsejteket figyelhetünk meg (25. ábra. G.). A 25. ábra, H. egy erősen nekrotizált idegsejt sejtmagja körül több morfológiailag épnek tekinthető mitokondriumot mutat. A neurodegeneráció jelei egyaránt kivehetők mind az agykéregben, mind a striatumban az ellenoldali régiókhoz viszonyítva. Azonban a nagyszámú elhalt idegsejt mellett nyomokban sötét színnel látható élő idegsejt is jelen van (26. ábra. A-D.).

55

23. ábra. Általános morfológiai áttekintés képei

A: Ellenoldalon lévő agykéreg,

B: IR agykéreg,

1 óra reperfúzió,

1 óra reperfúzió,

LFB, M: 250 X

LFB, M: 250 X

C: Ellenoldalon lévő agykéreg,

D: IR agykéreg,

8 óra reperfúzió

8 óra reperfúzió

Toluidinkék, M: 1200 X

Toluidinkék, M: 1200 X

56

E: Ellenoldalon lévő agykéreg,

F: IR agykéreg,

24 óra reperfúzió,

24 óra reperfúzió,

LFB, M: 250 X

LFB, M: 250 X

57

24. ábra. Asztrociták kimutatása

A: Ellenoldalon lévő agykéreg,

B: IR agykéreg,

1 óra reperfúzió,

1 óra reperfúzió,

GFAP, M: 250 X

GFAP, M: 250 X

C: IR agykéreg,

D: IR agykéreg,

8 óra reperfúzió,

24 óra reperfúzió,

GFAP, M: 250 X

GFAP, M: 250 X

58

25. ábra: Elektronmikroszkópos felvételek

A: DER, idegsejt,

B: Agyi ér keresztmetszete,

1 óra reperfúzió

asztrocita, 1 óra reperfúzió

M: 4000 X

M: 10000 X

C: Asztrocita, idegsejt,

D: Agyi ér keresztmetszete,

1 óra reperfúzió

asztroglia, 8 óra reperfúzió

M: 4000 X

M: 10000 X

59

E: Oligodendrocita,

F: Agyi kapilláris,

8 óra reperfúzió

24 óra reperfúzió

M: 15000 X

M: 10000 X

G: Idegsejt, asztrocita

H: Idegsejt mitokondrium,

24 óra reperfúzió

24 óra reperfúzió

M: 10000 X

M: 15000 X

60

26. ábra: A neurodegeneráció célzott kimutatása

A: Ellenoldalon lévő agykéreg,

B: IR agykéreg,

24 óra reperfúzió,

24 óra reperfúzió,

FJ, M: 250 X

FJ, M: 250 X

C: Ellenoldalon lévő striatum,

D: IR striatum,

24 óra reperfúzió,

24 óra reperfúzió,

FJ, M: 250 X

FJ, M: 250 X

61

4.2.2. Striatális tirozin-hidroxiláz enzim kimutatása 24 óra reperfúziós idő után Az EGIS Preklinikai Kutatási Főosztályán korábban elvégzett elemzések kimutatták, hogy a glutamát és GABA rendszerek részben működőképesek maradnak 1 órás MCAO és 24 órás reperfúziós idő elteltével

88

. Jelen vizsgálataink során a bazális ganglion

rendszer harmadik legfontosabb neurotranszmitterének működését tanulmányoztuk a striatumban lévő dopaminerg terminálisok szelektív kimutatására alkalmas tirozinhidroxiláz enzim immunhisztokémia alkalmazásával (27. ábra). A tirozin-hidroxiláz enzimmel kimutatott dopaminerg ternimálisokat jelző barna foltok a terminálisok közelében dezorganizáltan és helyenként aggregálódva jelennek meg az ellenoldali striatum képéhez viszonyítva. A dopaminerg terminálisok súlyosan károsodtak az ischaemia-reperfúzió eredményeképpen, azonban helyenként morfológiailag ép idegvégződések mutathatók ki. 27. ábra. Tirozin-hidroxiláz enzim kimutatása a striatumban

A: Ellenoldalon lévő striatum,

B: IR Striatum,

tirozin-hidroxiláz enzim,

tirozin-hidroxiláz enzim,

24 óra reperfúzió

24 óra reperfúzió

M: 500 X

M: 500 X

62

4.3. A corticostriatális dopaminerg rendszer neurokémiai vizsgálata 4.3.1. A dopamin és a dopamin metabolitok szöveti koncentrációjának meghatározása HPLC módszerrel A szöveti dopamin és a dopamin metabolitok szöveti koncentrációjának mérésekor olyan állatokat vizsgáltunk, amelyek esetén a jobb oldalon elvégzett MCAO sikeres volt 75

és in vitro TTC festéssel kimutattuk a szöveti károsodást. Az intakt és álműtött állatok

esetén a dopamin és a dopamin metabolitok szöveti koncentrációi között nem találtunk különbséget, ezért az ischaemia-reperfúziónak alávetett csoportban (IR) kapott adatokat az intakt állatokban mért adatokhoz hasonlítottuk. Mind az intakt, mind az IR csoportba tartozó állatok agykérgében alacsony dopamin koncentráció mutatható ki, és kevés a metabolitok mennyisége is. Ehhez viszonyítva a striatumban

mintegy

100-szoros

mennyiségben

található

dopamin,

valamint

megközelítőleg 10-szeres mennyiségben mutatható ki DOPAC és HVA (28. ábra). -

A hemispheriumok közötti különbségek:

Az intakt állatokban nincs különbség a két hemispherium agykérgi és striatális dopamin, valamint a metabolitok koncentrációi között. Az IR állatokban a műtött (jobb) oldalon lévő agykéregben a dopamin és a DOPAC mennyisége szignifikáns mértékben lecsökkent. Az IR állatok striatumában viszont csak a dopamin mennyisége mutat szignifikáns változást az MCAO közvetlenül nem érintett (bal) oldalon mért értékekhez képest. -

A beavatkozás károsító hatása:

Az MCAO hatására mindkét oldali agykéregben szignifikánsan megváltozott a HVA szöveti koncentrációja. A striatumban az MCAO hatására a HVA koncentráció emelkedés nem volt szignifikáns a műtött (jobb) oldalon, azonban a dopamin mennyisége szignifikánsan csökkent mindkét oldali striatumban.

63

szöveti tartalom (nmol/g)XX

28. ábra. HPLC módszerrel mért dopamin és metabolitok szöveti koncentrációja agykéreg

3.5 3 2.5 2

#

1.5 1

**

0.5

#

**

0 agykéreg clat

agykéreg ilat

agykéreg clat

intakt n=6

szöveti tartalom (nmol/g)XX

#

agykéreg ilat

IR n=7 striatum

35 30 25 20

**

15

#

**

10

**

5 0 striatum clat

striatum ilat

intakt n=6

striatum clat

striatum ilat

IR n=7

Jelölések: Dopamin (■), DOPAC ( ), HVA (

), IR = 1 órás MCAO után 24 óra

reperfúzió elteltével. (Összehasonlítás módja: hemispheriumok között: #, beavatkozás károsító hatása, intakt-IR: *; Szignifikancia szintek jelölése, # p<0,05; ** p<0,01; Adatok: átlag±SEM, nmol/g; Statisztikai módszer: ANOVA, TukeyKramer post hoc teszt) A dopamin és metabolitjainak egymáshoz viszonyított arányából a dopamin turnover számítható ki, amelyet a 29. ábra mutat.

64

29. ábra. A HPLC módszerrel mért dopamin és metabolitjainak aránya (dopamin turnover) az agykéregben és a striatumban. (Jelölés: IR = 1 órás MCAO után 24 óra reperfúzió elteltével. Összehasonlítás módja: hemispheriumok között: #, beavatkozás károsító hatása, intakt-IR: *; Szignifikancia szintek jelölése, #,* p<0,05; ## p<0,01; Adatok: átlag±SEM; Statisztikai módszer: ANOVA, Tukey-Kramer post hoc teszt) ##

100 80 60 40 *

20

*

*

striatum ilat

#

striatum clat

(DOPAC+HVA)/DA

120

intakt n=6

-

agykéreg ilat

agykéreg clat

striatum ilat

striatum clat

agykéreg ilat

agykéreg clat

0

IR n=7

A hemispheriumok közötti különbségek:

Intakt állatok esetén nincs szignifikáns különbség a jobb- és baloldal dopamin turnovere között. Azonban az ACM okklúzió után a jobb oldali (műtét által közvetlenül érintett) agykéregben és a striatumban szignifikáns mértékű növekedés tapasztalható az ellenoldalhoz viszonyítva. -

A beavatkozás károsító hatása:

A dopamin turnover az intakt állatokban agyi régiónként eltérőnek bizonyult. Az agykéregben igen nagy turnovert kaptunk, míg a striatumban alacsony a turnover értéke. Az IR csoportban lévő állatok esetén az agykéregre és a striatumra jellemző turnover különbsége jelentősen lecsökken az intakt állatok esetén tapasztaltakhoz képest. A beavatkozás károsító hatása az MCAO által közvetlenül nem érintett hemispheriumban

65

lévő (bal oldali) agykéreg kivételével, a turnover szignifikáns mértékben megnő mindegyik agyi régióban.

4.3.2. [3H]dopamin-felszabadulás vizsgálata komplex agyszelet preparátumban Kísérleti eredményeink értékelése során olyan, sikeres ACM okklúzión átesett 75 állatok agyszeleteit dolgoztuk fel, amelyek esetén a striatális KCl perfúzió hatására tríciált dopamin felszabadulást kaptunk és in vitro TTC festéssel kimutattuk a szöveti károsodást. Az intakt és álműtött állatokban nem kaptunk különbséget, ezért az IR után kapott adatokat az intakt állatokban mért adatokhoz hasonlítottuk. Az intakt állatokból származó, két hemispheriumból kimetszett agykéreg és striatum között nem találtunk különbséget, ezért a későbbiekben nem ábrázoltuk. A nyugalmi állapotban elvezetett radioaktív neurotranszmitter kiáramlás viszonylag alacsonynak tekinthető mind az intakt, mind az IR agyszelet esetén. Az agykéreg elektromos ingerlése tríciummal jelzett dopamint szabadít fel a striatumból a corticostriatális afferentáció közvetítésével (30. ábra). - Az elektromos téringerlés hatása: Mindhárom csoportból vett agykéregben és striatumban az elektromos ingerlés hatására szignifikáns mértékben növekedik meg a tríciummal jelzett dopamin kiáramlása. Az elektromos ingerlés hatása közvetlenül jelentkezik az agykéregben: a tríciummal jelzett dopamin felszabadulására jellemző csúcs az intakt agykéregben mintegy 23-szoros, míg az IR agykéregből megközelítőleg 16-szoros emelkedést okoz a radioaktív dopamin kiáramlásában (a jelenséget a kísérleti elrendezésből adódó, az elektromos ingerlés agykéregre kifejtett közvetlen befolyásoló hatásaként értékeljük.) Az intakt és az IR striatumokból megközelítőleg azonos, a nyugalmi értékéhez viszonyítva kb. 6-7-szeres emelkedés látható. - A beavatkozás károsító hatása: Az IR után az agykéregben és striatumokban szignifikánsan alacsonyabb a nyugalmi és az agykéreg elektromos ingerlése következtében felszabadult radioaktívan jelzett dopamin szintje az intakt állatokhoz viszonyítva.

66

30. ábra. A corticostriatális szeletből felszabadult tríciummal jelzett dopamin

60 *** 50

40 *** 30

20

###

###

**

**

###

10

###

* #

#

* #

#

agykéreg

striatum

intakt ilat n=13

agykéreg

striatum

IR clat n=8

agykéreg

elektromos Ingerlés

nyugalmi

elektromos Ingerlés

nyugalmi

elektromos Ingerlés

nyugalmi

elektromos Ingerlés

nyugalmi

elektromos Ingerlés

nyugalmi

elektromos Ingerlés

0 nyugalmi

Radioaktív izotóp aktivitása (kBq/g) frakciónkéntXXX

radioaktivitásának változása elektromos ingerlés hatására

striatum

IR ilat n=8

(Jelölés: IR = 1 órás MCAO után 24 óra reperfúzió elteltével, ilat = műtét által érintett oldalon, clat = ellenoldalon. Összehasonlítás módja: elektromos ingerlés hatása: *, beavatkozás károsító hatása: #; Szignifikancia szintek jelölése, *, # p<0,05; ** p<0,01; ***, ### p<0,001; Adatok: átlag±SEM, kBq/g; Statisztikai módszer: ANOVA, Tukey-Kramer post hoc teszt) Az elektromos téringerlés hatására kialakult tríciummal jelzett neurotranszmitter kiáramlást a 31. ábra szemlélteti. A striatumban szignifikánsan magasabb nyugalmi neurotranszmitter kiáramlást jelző alapvonallal találkozunk, mint az agykéregben. Az intakt és az IR ellenoldali preparátumok esetén az agykéregben mért alapvonal mintegy 20, illetve 50%-kal alacsonyabb a striatumban mérthez képest. Ezzel szemben az IR műtött oldali agyszeletek esetén az agykéregben mért alapvonal értéke mintegy 50 %kal meghaladja a striatumban mérhető alapvonal értékét. Az ingerlés hatására kiáramló

67

radioaktív izotóp mennyiségének növekedése mindkét agyi régióban és mindhárom csoport esetén szignifikáns. 31. ábra. A corticostriatális agyszeletből felszabadult tríciummal jelzett dopamin

Csúcs alatti terület nagysága (kBq/g) / ingerlésXXX

radioaktivitása a csúcs alatti terület alapján 60

50

40 ##

30

20 ***

***

10

***

***

#

##

0 agykéreg

striatum

agykéreg

intakt ilat n=13

striatum

IR clat n=8

agykéreg

striatum

IR ilat n=8

(Jelölés: IR = 1 órás MCAO után 24 óra reperfúzió elteltével, ilat = műtét által érintett oldalon, clat = ellenoldalon. Összehasonlítás módja: beavatkozás károsító hatása: *, agykéreg-striatum között: #; Szignifikancia szintek jelölése: # p<0,05; ## p<0,01; *** p<0,001; Adatok: átlag±SEM, kBq/g; Statisztikai módszer: ANOVA, Tukey-Kramer post hoc teszt) - A beavatkozás károsító hatása agyi régióként: Az ACM okklúzió azonos mértékben, mintegy 80%-kal csökkenti az ipszilaterális oldalon lévő agykéreg, valamint a kontralaterális oldalon lévő agykéregben és striatumban mérhető csúcs alatti terület nagyságát az intakt állatokhoz képest. A legnagyobb, mintegy 95%-os csúcs alatti terület csökkenést az ipszilaterális striatumban mértük az intakt állatokéhoz viszonyítva.

68

- Az agykéreg és striatum közötti különbségek: Az egyes agyi régiókból elvezethető jelzett dopamin mennyisége különböző. A kísérleti módszernek az agykéregben megjelenő közvetlen befolyásoló hatásaként az intakt csoportban megközelítőleg 2-szeres, szignifikáns mértékben alacsonyabb jelzett dopamin kiáramlással találkozhatunk a striatumban. Ez az arány hasonló a kontralaterális oldalról származó agyszelet esetén is, de az MCAO által közvetlenül érintett oldalon lévő agykéreg és striatum között már 5-szörös a különbség. A 3. táblázat összegzi, hogy a kísérlet kezdetén a szöveti raktárakba felvett [3H] dopamin mennyisége hogyan csökken a kísérlet során. 3. táblázat. A corticostriatális agyszelet által leadott és a kísérlet végén a szövetben visszamaradt tríciált dopamin mennyisége (Jelölés: IR = 1 órás MCAO után 24 óra reperfúzió elteltével; ilat = műtét által érintett oldalon, clat = ellenoldalon. Összehasonlítás módja: a beavatkozás károsító hatásának megállapítása az intakt állatban mért értékekhez képest: *, agykéregstriatum között: #. A szignifikancia szintek jelölése: # p<0,05; **, ## p<0,01, ***, ### p<0,001; Adatok: átlag±SEM, kBq/g. Statisztikai módszer: ANOVA, TukeyKramer post hoc teszt) agykéreg nyugalmi periódus alatt elektromos stimuláció alatt szövetben visszamaradt striatum nyugalmi periódus alatt elektromos stimuláció alatt szövetben visszamaradt

intakt ilat n=13

IR clat n=8

IR ilat n=8

72.69

±

9.93

15.21

±

2.75

***

36.50

46.47

±

7.05

8.70

±

1.59

***

10.70

738.04

±

92.18

244.33 ±

41.99

***

96.33

intakt ilat n=13

IR clat n=8

7.97

***

1.86

**

± 20.64

***

± ±

IR ilat n=8

154.74

±

31.67

#

28.75

±

5.62

***

20.05

±

4.74

***,##

27.56

±

4.83

##

4.28

±

1.18

**

2.49

±

0.64

***

2754.15 ± 469.46 ### 370.36 ±

78.52

***

178.64 ± 58.46

***

A kísérlet megkezdését követő 30 db 3 perces mintából mérhető, passzívan kiáramló jelzett dopamin mennyisége több mint az egyszeri elektromos ingerlés hatására, aktívan felszabaduló jelzett dopamin mennyisége mind az intakt, mind az IR szövetekben. - A beavatkozás károsító hatása:

69

A féloldali MCAO eredményeképpen kevesebb a nyugalmi periódus alatt kiáramló és az elektromos ingerlés hatására felszabaduló jelzett dopamin mennyisége, valamint a kísérlet végén a szövetekben visszamaradó jelzett izotóp mennyisége is. A csökkenés mértéke az ipszilaterális oldalon lévő régiókban nagyobb mértékű, mint az ellenoldali agykéregben és striatumban. - Az agykéregben és striatumban mért értékek összevetése: Az intakt állatokból származó striatumból a nyugalmi periódus alatt magasabb, és az elektromos ingerlés hatására alacsonyabb a jelzett dopamin kiáramlás, mint az agykéregből. Ez a tendencia megfigyelhető az IR csoportban kontraleterálisan is, de ipszilaterálisan nem. A striatumból történő nagyobb arányú jelzett dopamin kiáramlás ellenére, a kísérlet végén a striatumban visszamaradó radioaktív izotóp mennyisége magasabb marad az agykéregben detektálható radioaktivitásnál mind az intakt, mind az IR károsodásnak alávetett állatokban.

70

4.4. Neurológiai vizsgálatok

4.4.1. Különböző neurológiai vizsgálati módszerekkel kapott eredmények A

négyféle

neurológiai

skála

alapja

a

testtartási

rendellenességek

és

mozgáskoordinációs zavarok vizsgálata, valamint az izomtónus csökkenés, a szenzoros funkciók, a spontán mozgásaktivitás és az általános állapot értékelése (1. táblázat). A vizsgálat hitelességét előzetesen intakt és álműtött állatok bevonásával ellenőriztük. Az intakt és álműtött állatok esetén szenzomotoros deficit nem volt mérhető. A 32. ábra a különböző neurológiai skálák eredményeit mutatja 1 órás ACM okklúziót követő 24 órás reperfúzió elteltével. 32. ábra. Különböző neurológiai vizsgálati eljárásokkal alkalmazásával kapott pontszámok 60 perces ACM okklúziónak és 24 órás reperfúziónak alávetett állatok esetén B

50% 80%

G

60%

H

60%

R 0

5

10

15

20

pont

(Adatok: átlag±SEM, a műtétnek alávetett állatok értékelése során kapott pontszámok az adott skálán adható maximális összpontszám %-ában kifejezve; n=41. H = Hunter-féle skála, G = Garcia-féle skála, R = Reglődi-féle skála) A Bederson-féle kumulatív skála szerint az állatok átlagosan 2,6 pontot kapnak, azaz a skála meghatározása szerint a műtétnek alávetett állatra jellemző, hogy: kevésbé válaszol a farok enyhe meghúzására a bal mellső láb megmozdításával, de spontán mozog, körben jár, vagy forog (14. ábra; A.). Az ilyen állapotú állat a Garcia-féle

71

skálán átlagosan mintegy 14 pontot, a Hunter-féle skálán 12 pontot és a Reglődi-féle skálán 19 pontot kap. Egy átlagos állapotú állat 60 perces MCAO után 24 órával az alkalmazott neurológiai skálák pontozási tartományának különböző hányadát fedi le: a Bederson-féle skálán mérve az értékelt állat átlagosan az adható pontok 50 %-át, míg a Garcia-féle skálán adható pontok 80%-át kapta. A mozgásaktivitás az állat explorációs aktivitására és a környezet iránti érdeklődésére utaló paraméter, amelyet mindegyik alkalmazott neurológiai skála értelmez, de eltérő mértékben súlyoz (33. ábra). Ugyanannak az állatnak az aktivitása a Garcia-skála kritériumai szerint 2,9 ponttal, a Hunter-féle skála szerint 1,3 ponttal és a Reglődi-féle skála szerint 1,95 ponttal értékelhető. 33.

ábra.

A

mozgásaktivitás

értékelése

különböző

neurológiai

skálák

alkalmazásával 60 perces ACM okklúziónak és 24 órás reperfúziónak alávetett állatok esetén GG mozgásaktivitás H

mozgásaktivitás

R

mozgásaktivitás

0

1

2

3

4

pont

(Adatok: átlag±SEM; n=41. H = Hunter-féle skála, G = Garcia-féle skála, R = Reglődi-féle skála) A testtartási rendellenességek vizsgálatát az állat felemelt helyzetében valamennyi skála magában foglalja, azonban eltérő rend szerint pontozza. A Garcia-féle skála a testtartási rendellenességek megítéléséhez a végtagok helyzetét veszi alapul, a Hunter-féle skála csak a mellkas elfordulására helyezi a hangsúlyt, míg a Reglődi-féle skála egyaránt pontozza a törzs és a végtagok helyzetét (34. ábra).

72

34. ábra. A testtartási rendellenességek az állat farkánál fogva felemelt helyzetében különböző neurológiai vizsgálati skálák alkalmazásával 60 perces ACM

G

végtagok helyzete

H

testtartás

H

G

okklúziónak és 24 órás reperfúziónak alávetett állatok esetén

testtartás R

R

mellső végtag helyzete

0

0.5

1

1.5

2

2.5

pont

(Adatok: átlag±SEM, pont; n=41. H = Hunter-féle skála, G = Garcia-féle skála, R = Reglődi-féle skála). A Reglődi skála 4-féle, a Hunter-skála 3-féle, a Garcia-skála pedig csak egyféle módon írja elő a mozgási rendellenességek, mozgáskoordinációs zavarok értékelését. A lejtőn való elmozdulás és a mozgás értékelése egyaránt szerepel a Hunter- és Reglődi-skálán, de különbözőképpen adható rájuk pont. A mozgászavar elsődlegesen az állatok forgó mozgásában nyilvánul meg (14.ábra, A.), ennek a rendellenességnek a létrejöttét a Hunter- és Reglődi-féle skála értékeli, azonban eltérő súlyozással ítéli meg ugyanazon állat esetén (átlagosan 3,7 és 0,2 pont) (35. ábra). 35. ábra. A mozgási rendellenességek, mozgáskoordinációs zavarok értékelése különböző neurológiai vizsgálati skálák alkalmazásával 60 perces ACM okklúziónak és 24 órás reperfúziónak alávetett állatok esetén

73

G

G mozgáskoordináció (fejmozgás) átfordulás

H

H

lejtőn való elmozdulás mozgás

R

R

mozgáskoordináció (eldöntés) mozgáskoordináció (farokhúzás) lejtőn való elmozdulás mozgás

0

1

2

3

4

5

pont

(Adatok: átlag±SEM, pont; n=41. H = Hunter-féle skála, G = Garcia-féle skála, R = Reglődi-féle skála) A mozgáskoordinációs zavarok megítélésére a kiválasztott skálák többféle módszert alkalmaznak. A Reglődi-féle skála kétszer akkora mértékben súlyozza az állat oldalirányú elmozdítására adott reakcióját, és feleakkora mértékben a lejtőn való elmozdulást, mint a Garcia-féle skála. A Hunter-féle skála önálló paraméterként szerepelteti a tenyérben történő visszafordulás paramétert. Tapasztalataink szerint az összes 1 órás ACM okklúziónak és 24 órás reperfúziónak alávetett állat minden esetben képes volt teljesíteni ezt a kritériumot. A Reglődi-féle skála a farok meghúzásával kiváltott egyensúlyzavart is vizsgálja, eredményeink szerint azonban csak igen kevés állat (1 állat) esetén okozott érzékelhető egyensúlyzavart ez a behatás. A mellső és hátsó végtagok használatát az alkalmazott skálák különböző beállítások mellett értékelik (36. ábra). A Reglődi-féle skála különbséget tesz a mellső és hátsó lábak tekintetében. Eszerint az állat végtagjai közül a mellső lábait képes kevésbé képes használni mozgása során, mint a hátsó végtagjait. A mellső láb funkciózavarát a különböző skálák eltérő mértékben súlyozzák. Ugyanaz a rendellenesség átlagosan kb. kétszerannyi pontot kap a 6 pontból álló Garcia-féle skálán, mint a 16 vizsgálati paramétert magában foglaló Reglődi-skálán. A Hunter-féle skála szétválasztja a mellső

74

láb használatára vonatkozó értékelést aszerint, hogy azt az állat felemelt helyzetében vagy az asztalon végezzük el. 36. ábra. A mellső és a hátsó lábak használatának értékelése különböző neurológiai vizsgálati skálák alkalmazásával 60 perces ACM okklúziónak és 24 órás reperfúziónak alávetett állatok esetén G

G

mellső láb használata

H

H

mellső láb használata (felemelt helyzetben) mellső láb használata (asztalon) hátsó láb használata

R

R

mellső láb használata

0

0.5

1

1.5

2

2.5

pont

(Adatok: átlag±SEM, pont; n=41. H = Hunter-féle skála, G = Garcia-féle skála, R = Reglődi-féle skála) Az izomtónus értékelése valamennyi vizsgálati skála részét képezi, azonban ugyanazon állat esetén különböző mértékben adódik a skálán adható maximális pontszámhoz (37. ábra). A Garcia-féle skála szerint csak a kapaszkodás mértékének megállapítása is elegendő egy agyi ischaemiának alávetett állat izomtónusának megállapítására, míg a Hunter- és Reglődi-skálák ezt kiegészítik az oldalnyomás mértékének mérésével. Az oldalnyomás megítélése eltérő: ugyanazon állat esetén a Hunter-féle és a Reglődi-féle skálán majdnem egy teljes egész pont a különbség az oldalnyomás ellen kifejtett ellenállás értékében, amely a Reglődi-skála esetén mintegy 3%-ban, a Hunter-féle skála esetében, pedig kevesebb, mint 1%-ban járul hozzá az 1 órás ACM okklúziónak és 24 órás reperfúziónak alávetett állat esetén adható összpontszámhoz. 37. ábra. Az izomtónus és az izomerő értékelése különböző neurológiai vizsgálati skálák alkalmazásával 60 perces ACM okklúziónak és 24 órás reperfúziónak alávetett állatok esetén

75

G

G

kapaszkodás

H

H

kapaszkodás

oldalnyomás kapaszkodás

R

R

oldalnyomás

0

0.5

1

1.5

2

2.5

pont

(Adatok: átlag±SEM, pont; n=41. H = Hunter-féle skála, G = Garcia-féle skála, R = Reglődi-féle skála) A szenzoros funkciók vizsgálatát csak a Garcia- és a Reglődi-féle skála írja elő, amelyeket különböző beállítások szerint és eltérő pontszámokkal értékelnek (37. ábra). A Garcia-féle skála előírt vizsgálati paraméterének értéke közel 15%-ban, a Reglődiféle skála esetén a kétféle szenzoros működést vizsgáló paraméter összesen mintegy 6%-ban járul hozzá a neurológiai skálán adható maximális pontszám értékéhez. 38. ábra. A szenzoros funkciók értékelése különböző neurológiai vizsgálati skálák alkalmazásával 60 perces ACM okklúziónak és 24 órás reperfúziónak alávetett állatok esetén G

G

szenzoros funkció (szempilla) szenzoros funkció (tapintási reflex)

R

R

szenzoros funkció (fogási reflex)

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 pont

(Adatok: átlag±SEM, pont; n=41. G = Garcia-féle skála, R = Reglődi-féle skála) Az állatok általános állapotára utaló megjelenést önálló vizsgálati paraméterként csak egy szerepelteti a kiválasztott skálák közül. A Hunter-skála szerint az állatok az 1 órás ACM okklúziót követő 24 órás reperfúzió elteltével mintegy 1,7 pontot kapnak.

76

4.4.2. A funkcionális tesztekkel kapott eredmények A szenzomotoros funkciók vizsgálatát az egyensúlyozás (beam balance), a lépéshiba (foot fault) tesztekkel, és a lokomotoros aktivitás vizsgálatával egészítettük ki 1 órás MCAO után 24 óra reperfúzió elteltével. 4.4.2.1.Egyensúlyozás (beam balance) Az állatok átlagosan 14 ± 1,7 másodpercig tudnak fennmaradni a gerendán (n=41). 4.4.2.2. Lépéshiba (foot fault) A lépéshiba teszt eredménye szerint erős deficit látható a bal mellső láb tekintetében (0,38 ± 0,04; n=41). 4.4.2.3. A lokomotoros aktivitás vizsgálata A vizsgálat során a megtett út nagysága az állat emocionális állapotát és környezetének feltérképezésére irányuló tevékenységét jellemzi, számára kellemes körülmények között. Az állatot nem befolyásoljuk, pl. erős fény alkalmazásával és viszonylag hosszú idő (15 perc) áll rendelkezésére a környezet megismerésére. A lokomotoros aktivitás tesztben résztvevő állatok neurológiai jellemzői megfelelnek a korábbi kísérleteinkben szereplő állatok esetén kapott adatoknak. A vizsgálatban résztvevő állatok a lokomotoros aktivitás és a túlélés szerint több csoportra oszthatók. A vizsgált 15 állat közül 1 állat esetén a megtett út és a megszakítások száma nagyon magas. 2 állat szinte alig mozog a vizsgálat 15 perce alatt, de túléltek. További 3 állat által megtett út a többi állat által megtett úthoz hasonló, de a későbbiekben elpusztultak. Tekintettel arra, hogy az állatok eltérő lokomotoros aktivitással rendelkeznek, de a neurológia vizsgálat alapján homogén csoportként jelennek meg, a későbbiekben mindegyik állat lokomotoros aktivitás adatával számoltunk. A környezet iránti érdeklődés intenzitásának vizsgálatakor (39. ábra) azt tapasztaltuk, hogy mindegyik csoportban lévő állat érdeklődése csökken az idő előrehaladásával. A legaktívabb periódus az első 5 perc, ekkor a csoportok között nincs szignifikáns különbség. A második 5 perces periódus alatt mindhárom csoportban kismértékben

77

csökken az explorációs aktivitás, de a csökkenés mértéke továbbra sem szignifikáns. A harmadik 5 perces periódus alatt már szignifikáns mértékben lecsökken az állatok mozgásaktivitása a beavatkozás jellegétől függetlenül. 39. ábra. Lokomotoros aktivitás változása intakt, álműtött és az ischaemiásreperfúziós inzultusnak alávetett állatok esetén 1000 900 megtett út (inch)

800 700 600 500 *

400 300 200

* *

100 0 intakt n=10

álműtött n=9

IR n=15

(Jelölés: IR = 1 órás MCAO után 24 óra reperfúzió elteltével. Adatok: átlag±SEM, inch. Összehasonlítás módja: megtett út hossza az első 5 percben mért értékhez viszonyítva. A vizsgálat periódusai: 0-5 perc (■), 5-10 perc ( ) és 10-15 perc ( ); Szignifikancia szint jelölése:* p<0,05; Statisztikai módszer: ANOVA, Duncan post hoc teszt.) Az 1 órás ACM okklúzión majd 24 órás reperfúzión átesett állatok esetén a 15 perc alatt mérhető lokomotoros aktivitás az intakt állatok esetén kapott értékhez viszonyítva szignifikánsan alacsonyabb (40. ábra). 40. ábra. Lokomotoros aktivitás változása intakt, álműtött és az ischaemiásreperfúziós inzultusnak alávetett állatok esetén a vizsgálat teljes ideje (15 perc) alatt

78

megtett út, 15 perc (inch)

2500 2000 1500

*

1000

***

500 0

intakt

álműtött

IR

(Jelölés: IR = 1 órás MCAO után 24 óra reperfúzió elteltével. Adatok: átlag±SEM, inch. Összehasonlítás módja: a beavatkozás károsító hatása, intakt állatokhoz viszonyítva. Szignifikancia szint jelölése: * p<0,05; Statisztikai módszer: ANOVA, Duncan post hoc teszt) 4.4.2.4. Testtömeg-mérés A szenzomotoros funkciók vizsgálata mellett elvégeztük a testtömeg-mérést is. A műtéti beavatkozást követő napon az állatok testtömeg-vesztése átlagosan 27,4 ± 3,6 g , amely mintegy 10 %-os csökkenésnek felel meg (n=41).

4.4.3. Korrelációs vizsgálatok

4.4.3.1. Neurológiai skálák összértékeinek korrelációs vizsgálata A neurológiai vizsgálati skálák összértékeinek korrelációs elemzése alapján megállapítható, hogy valamennyi skála az 1 órás ACM okklúziónak és 24 órás reperfúziónak alávetett állatok esetén hasonló mértékben ítéli meg a kialakult szenzomotoros deficit mértékét. Mindegyik vizsgált skála összpontszáma korrelált a többi skála összpontszámával, kivéve a Garcia- és a Bederson-féle skála esetén (41. ábra).

79

41. ábra. A vizsgálat neurológiai skálák összpontszámainak korrelációja ún. felhődiagramok formájában 60 perces ACM okklúziónak és 24 órás reperfúziónak alávetett állatok esetén

(Adatok: egyedi adatok; n=41. B = Bederson-féle skála, H = Hunter-féle skála, G = Garcia-féle skála, R = Reglődi-féle skála; Szignifikancia jelölése: p; Korrelációs koefficiens: r; Statisztika: Pearson korreláció)

80

4.4.3.2. Neurológiai skálák egyes paramétereinek korrelációs vizsgálata A különböző neurológiai skálák egyes paramétereinek és a skála összpontszámának korrelációs elemzésével arra kerestük a választ, hogy a skála egyes vizsgálati paramétereire adott pontszámok milyen mértékben befolyásolják az adott skála összpontszámát az 1 órás MCAO-nak és 24 órás reperfúziónak alávetett állatok esetén. Eredményeink alapján megállapítható, hogy a skálák összpontszáma a skálát alkotó paraméterek a Reglődi-féle skálán mintegy 75 %-ával, a Hunter-féle skálán 80%-ával, és a Garcia-féle skála esetén mintegy 85%-ával korrelál. A Bederson-féle kumulatív skála egyetlen paramétert pontoz, ezért korreláció nem vizsgálható. A korrelációs vizsgálatok szintén nem értelmezhetőek olyan paraméterek esetén, amelyeknél az állatok között nem tudunk különbséget tenni, pl. a tenyérbe helyezett állat átfordulása. 4.4.3.3. Lépéshiba és egyensúlyozás korrelációs vizsgálata Elvégeztük a lépéshiba és az egyensúlyozás tesztek eredményeinek egymáshoz hasonlítását. A két funkcionális teszt segítségével mért szenzomotoros deficit mértéke különbözik, azaz az 1 órás ACM okklúziónak és 24 órás reperfúziónak alávetett állatok esetén eltérő súlyosságúnak ítélik a kialakult szenzomotoros változásokat. 4.4.3.4. Neurológiai skálák és a funkcionális tesztek korrelációs vizsgálata A 60 perces ACM okklúziónak és 24 órás reperfúziónak alávetett állatok neurológai értékelése során kapott pontszámoknak a funkcionális teszteken kapott eredményekkel való összehasonlítása alapján azt kaptuk, hogy a lépéshiba eredménye nem mutat korrelációt egyetlen skála összpontszámával sem. Azonban az egyensúlyozás átlagos időtartama szignifikáns összefüggésben van: -

a Reglődi-féle skála szerint a mellső láb helyzetében látható testtartási rendellenességgel (r = 0,3491; p = 0,0254),

-

a Hunter-féle skálán szereplő bordázott gerendán való kapaszkodás (r = 0,4254; p = 0,006) és testtartás (r = 0,3261; p = 0,0577) tekintetében, és

-

a Garcia-féle skálán a végtagok helyzetének pontozásával (r = 0,3372; p = 0,0313).

81

5.

Megbeszélés

A neuroprotektív szerek kutatása során a mintegy 920 vegyülettel kapott pozitív állatkísérletes megállapítást követő, körülbelül 115 elvégzett klinikai vizsgálat sikertelensége után az agyi ischaemia patológiai folyamatának integratív megközelítése és a preklinikai kutatás módszertanának felülvizsgálata válik szükségessé. A klinikai vizsgálat elindításához elegendő és megfelelően alátámasztott állatkísérletes adatok nehezen körvonalazhatóak

37,60

. Kísérleteink során az agyi ischaemia-reperfúziós

károsodás esetén a preklinikai gyakorlatban alkalmazott módszerekkel mért elváltozásokat hasonlítottuk össze 1 órás a. cerebri media elzárást követő 24 óra reperfúziós idő elteltével patkányban. A kapott eredményeink alapján, reményeink szerint hozzájárulhatunk az akut stroke újszerű kezelési stratégiájának mielőbbi kifejlesztéséhez és az ischaemiás-reperfúziós agyi károsodás komplex, dinamikusan változó rendszerének további megismeréséhez. 5.1. A TTC festéssel kapott eredmények megbeszélése A TTC festés célja az ischaemiás-reperfúziós károsodás mértékének kvantitatív meghatározása

elsősorban

a

dehidrogenáz enzim aktivitása

sejtek 69

mitokondriumában

jelen

lévő

szukcinát-

, valamint kisebb mértékben egyéb dehidrogenázok

89

aktivitása alapján . Mivel a festés igen egyszerűen kivitelezhető és összetettebb előkészítést nem igényel, ezért a neuroprotektív vegyületek vizsgálatában az elsődlegesen alkalmazott eljárások egyike. A preklinikai gyakorlatban gyakran az első lépés a vizsgálandó vegyület hatékonyságának becslésére, minden további vizsgálati módszer elvégzése előtt. A neuroprotektív vegyületek hatékonyságát a core és a penumbra csökkentésének mértéke alapján ítélik meg, általában az agyi ischaemia után 24 óra reperfúzió elteltével. Irodalmi adatok szerint az egyes agyi képletek különbözőképpen festhetők meg TTCvel. A különbségek származhatnak az adott agyi terület domináns sejttípusának jellemzőiből, a régióra jellemző véráramlási sajátosságokból vagy a sejtanyagcsere mértékéből, így pl. az oligodendrocitákat nagy számban tartalmazó corpus callosum csak hosszabb inkubációs idő alatt képes felvenni és átalakítani a festéket

82

90

. Az

agykéreg érzékenyebb az ischaemiás károsodásra, mert az itt lévő sejteknek nagyobb a glukóz- és energiaigénye

91

. Az agykéreghez viszonyítva kevesebb mitokondrium

található az agyvelő fehérállományában

75,92

. Általában az érelzáródás miatt kialakult

abszolút véráramlás-csökkenés alacsonyabb a velőállomány kisagy felöli részében és a pyriform agykéregben, ezért a TTC-vel mérhető ischaemiás károsodás is kisebb lesz 93. Az in vivo TTC festés esetén már a 60 perces ACM okklúzió végén, a filamentum eltávolításakor jelentős mértékű core és penumbra régió tapasztalható az agykéregben és a striatumban. Ezt követően a core és a penumbra nagysága a reperfúzió időtartamának előrehaladásával fokozatosan csökkent, és minimumát 8-16 óra elteltével érte el (19. ábra). A TTC festékkel kimutatott szöveti károsodás ingadozó jellegét kimutatták már 2 órás agyi ischaemia esetén

75,94

és átmeneti jellegű változásokat figyeltek meg a

mitokondriális légzési lánc enzimei esetén is 95. In vitro TTC festéssel 60 perces MCAO végén közvetlenül és 1 órás reperfúziós idő elteltével csak igen alacsony, penumbra jellegű szöveti károsodás volt kimutatható az agyszeletben. Ezt követően mind az agykéregben, mind a striatumban jól elkülöníthető fehér színű core jelent meg és a penumbra tovább növekedett (20. ábra). Az in vitro TTC festés dinamikája nem ismert tranziens ischaemia esetén, de Li és munkatársai szerint 24 órás permanens agyi ischaemia után az in vitro TTC festés eredménye szoros korrelációt mutat a szukcinát-dehidrogenáz enzim aktivitásával 96. Megfigyeléseinkből két fontos következtetésre juthatunk. 1.) A TTC-vel nem festődő, az irodalomban nekrotikusnak gondolt agyszövet a szövettani feldolgozás eredményei szerint nem tekinthető teljesen nekrotikusnak az ischaemiat követő reperfúzió első 24 órájában. Mint azt később a szövettani eredmények diszkussziója során kimutatjuk, a TTC-vel nem festődő agyszövetben ép, vagy csak kismértékben károsodott neuronok láthatók, egyes sejtekben az EM-os feldolgozás ép szerkezetű mitokondriumokat is kimutatott. Mindezt figyelembe véve a TTC festés eredménye alapján csak azt mondhatjuk, hogy az agyszövet funkcionálisan működésképtelen, esetleg anyagcsere működése súlyosan károsodott vagy gátolt, de ez nem jelent a szövet teljes térfogatára vonatkozó szöveti nekrózist. 2.) Az előbbi okfejtésből következik, hogy az in vivo TTC festéssel a reperfúzió 0-4 órában mutatkozó agyszövet károsodás sem nekrózis, ennek

83

kialakulásához eleve több időre van szükség. A TTC átalakulás hiánya ebben az esetben azt mutatja, hogy a korábban ischaemiás agyszövet 4 órán belül nem nyeri vissza működőképességét. Ennek oka feltehetően egyrészről a no-reflow jelenség, tehát az elégtelen szöveti perfúzió. Másrészt az agyszövet folyamatosan intenzíven aktiválódik, ami feltehetően kimeríti a nem megfelelően perfundált szövet anyagcsere kapacitását, és magakadályozza a regenerálódást is. Az Evankék festéssel esetenként azt is kimutattuk, hogy a mikroembolizáció miatt a vérátáramlás teljesen leállhat a korábban ischaemiás agyszövet kisebb területein. Mindezek a megfigyelések arra utalnak, hogy az ischaemiareperfúziós modellekben a legcélravezetőbb neuroprotektív stratégia a vazokonstrikció oldása és a vérátáramlás javítása, lehetőleg szelektíven az ischaemiás területeken. Kérdéses, hogy hasonlóak-e a viszonyok a trombolitikus terápián átesett stroke-os betegekben. A szukcinát-dehidrogenáz enzim aktivitását képes megtartani akár egy 24 órás agyi ischaemiát követően az agyszövet 8 órás szobahőmérsékleten való tárolása után is

96

.

Dettmers és munkatársainak eredményei alapján a 6 órás agyi ischaemia után a TTC festéssel fehér területként látható károsodott és nem károsodott területeken mérve a respirációs enzimek aktivitása nem mutat különbséget 97. Ebből arra következtethetünk, hogy a szukcinát-dehidrogenáz enzim aktivitása egyike az utolsó enzimeknek, amelyek működése leáll az ischaemia következtében és egyéb respirációs enzimek még ellenállóbbak az agyi ischaemia károsító hatásának. A két festési módszer alkalmazásával mind az agyi régiók (agykéreg, striatum) tekintetében, mind a core és penumbra tekintetében szignifikáns különbségek mutathatók ki 24 óra reperfúziós idő után (21. ábra, 2. táblázat). Mindezek figyelembe vételével felvetődik a kérdés, hogy az in vivo TTC festéssel kapott jelentős, a 24 óra reperfúzió idején tapasztaltakkal összevethető mértékű szövetkárosodás hátterében állhat-e a festék akadályozott eljutása a korábban MCAO által közvetlenül érintett területekre. Igazoltuk, hogy az Evanskék eljut az a. cerebri media vérellátási területére a reperfúziót követően. Ebből arra következtetünk, hogy a perfúzió segítségével a TTC festék eljut a festéssel fehérnek látszó területekre is.

84

A két festés eredményei közötti különbség részben ismert, bár az alkalmazott kísérleti protokoll különbözött a miénktől

98

. Az eltérés oka az, hogy a kétféle, rutinszerűen

alkalmazott festési eljárás alapvetően különbözik egymástól. Az in vivo festés során a szöveti perfúzió útján, az erek közvetítésével jön létre a szövetek festődése. Ezzel szemben az in vitro festés során egy nyitott petri csészében alakul ki, ahol a festék diffúzió útján érintkezik a koronális metszettel, és mesterségesen tartjuk fenn a 37°C hőmérsékletet a festés 30 perce alatt. Az in vivo TTC festéssel mért core és penumbra arány helyességét alátámasztja a TTC festés és a penumbra célzott kimutatására alkalmas összehasonlító PET vizsgálat eredménye

99

18

F-fluoromisonidazollal végzett

. Azonban, hogy a TTC festéssel

megállapított szövetkárosodás (core és penumbra) hogyan tükröződik a szövettani módszerekkel vizsgált metszeteken, igen ellentmondásos. Az irodalomban megtalálható publikációk elsősorban az in vitro festési módszer megbízhatóságát kérdőjelezik meg. Arra figyelmeztetnek, hogy a TTC túlbecsüli a tényleges szöveti károsodás mértékét 75,100-102

. Rövid ideig tartó érelzárást vagy a. carotis leszorítást követően azonban az in

vitro TTC festés eredménye szoros korrelációt mutatott a HE festéssel kapott szövetkárosodás mértékével és az alkalmazott neurológiai skála eredményével

70

.

Kevesebb irodalmi adat szól az in vivo TTC festés által értékelt károsodás hisztológiai módszerekkel való korrelációjáról, inkább annak megbízhatóságát emelik ki

98,103

. A

festésnek az egyes agyi régiókban megjelenő sajátosságaira utal Park és munkatársainak elemzése. Ekkor 4 órás a. cerebri media elzárás után az in vivo TTC festés eredménye az agykéregben jól tükrözte szövettani eredményeket, de a striatum területén kisebb szövetkárosodást mért a HE festés eredményéhez viszonyítva 103. A jelentős eltérések ellenére, 24 óra reperfúzió elteltével az in vitro és in vivo festéssel kapott teljes károsodott térfogat nem különbözött szignifikánsan (2. táblázat). Ezért eredményeink megerősítik, hogy a TTC festés csak az ischaemiás-reperfúziós agyi károsodást követő 24-48 óra elteltével képes megbízhatóan jelezni a szövetkárosodás mértékét 70,75,98,104. A TTC festéssel és a szövettani módszerekkel kapott adatok ellentmondásos korrelációs megállapításai arra engednek következtetni, hogy a TTC festék inkább az ischaemia

85

által kiváltott oxigén- és energiahiányt képes jelezni, és a mitokondriumok működését csak közvetve mutatja

97

. Az IR által közvetlenül érintett szövetekben a

mitokondriumok először egy feltételezhetően egy intermedier állapotba kerülnek, amikor a mitokondrium már nem alkalmas a sejt igényeit megfelelően kielégíteni, de a TTC átalakításra még képesek. Mivel az oxigén- és energiahiány egyenes következménye az agyi vérellátás csökkenésének, ezért az ischaemia korai fázisában a TTC festés az agyi véráramlást jelző paraméternek tekinthető

98

. Ezt az elméletet

alátámasztja, hogy a TTC festéssel fehérnek látszó területek nagysága és az agyi véráramlás (0-10 ml/100g/perc) értékei szignifikánsan korrelálnak egymással

105,106

.A

szignifikáns korreláció kialakulását befolyásolhatja, hogy az MCAO felengedése után a korábban elzárt erek kórosan összehúzódnak (no reflow)

107

, valamint a gyorsan

kialakuló szöveti oedema a perfúziós nyomás csökkentése és a kapillárisok összenyomása útján tovább csökkenti az agyszövet vérátáramlását 108. Az agyvelőben létrejött szövetkárosodás mértéke nagymértékben befolyásolja a stroke kimenetelét. Agyi infarktusban a penumbra viszonylag állandó nagyságú héjként jelenik meg a core körül. Ezzel szemben a core változatos képet mutat

109

és a CT vizsgálatok

eredményei szerint, az ischaemia létrejötte után 24-36 órával sem végleges a károsodott agyi szövet nagysága. A behatást követő 1 hét elteltével a lézió tovább terjed a szubkortikális képletek felé

110

. A jelenség hátterében az agykérgi acidózis és a

kialakuló mitokondriális diszfunkció is szerepet játszik

95

. Ezért a TTC festés a

reperfúzió későbbi időszakában nem alkalmas az irreverzibilisen károsodott sejtek elkülönítésére, hanem inkább tekinthető az agyi inzultus egy független indikátorának 102

.

5.2.

Hisztológiai és immunhisztokémiai elemzés eredményeinek megbeszélése

A TTC festéssel elvégzett kísérleti eredményeink az a. cerebri media tranziens elzárása következtében kialakult fehér területként látható core nagyságának változását mutatták a reperfúziós idő előrehaladtával, a festési módszer alkalmazásától függően. Ezért hisztológiai és immunhisztokémiai vizsgálataink célja az in vivo TTC festéssel fehérnek látszó core terület morfológiai elemzése volt.

86

A keringési zavar súlyosságát és a kialakuló infarktus méretét három egymástól független tényező határozza meg: az érelzáródás mértéke, annak időtartama, valamint az adott területre jellemző abszolút agyi véráramlás értéke

8,9

. Az irodalmi megállapítások

szerint az a terület, ahol nagyszámban zsugorodott, sötéten festődő idegsejtek, valamint duzzadt, vakuolizálódott perineurális- és perivaszkuláris gliasejtek találhatók, szöveti infarktusnak tekinthető

111

. Lundy és munkatársai szerint a nekrotikus idegsejtekben a

fent leírt elváltozások mellett, a sejt örökítőanyagának feldarabolódása (nukleáris pyknosis) és citoplazmatikus eozinofília jellemző 70. Li és munkatársai által végzett HE szövettani vizsgálat kritériumai szerint az ischaemiás terület core régiójának tekintendő minden olyan terület, amely eozinofil háttér mellett elhalt sejteket tartalmaz. A vakuolizálódott, duzzadt sejteket magában foglaló szövet, pedig penumbrának nevezhető 112. Hisztológiai

és

immunhisztológiai

vizsgálataink

alapján

a

reperfúziós

idő

előrehaladtával növekszik a károsodott terület kiterjedése (23. ábra). Az agyi ischaemia által létrehozott szöveti károsodásnak a penumbra felé terjedésében valamennyi sejttípus részt vesz valamilyen módon, így pl. IL-1β és TNFα képzés útján hősokk-fehérjék (HSP-70) termelésével

114

113

, vagy

.

Az MCAO után 1 óra reperfúziós idő elteltével az idegsejtek citoplazmájában mikrovakuolizáció, máshol azok zsugorodása (sötét neuronok), perineuronális vakuolizáció, a neuropilben oedema (status cribrosus), valamint a GFAP tartalmú asztrociták károsodása ismerhető fel. Később az idegsejtekben és a gliasejtekben az elváltozások tovább súlyosbodnak, amelyek a sejtek nekrózisához, apoptózisához vezetnek (23-26. ábra). 24 órás reperfúzió elteltével a károsodott agyterületen nagy számban előforduló sötét idegsejtek citoplazmájában morfológiailag épnek tekinthető mitokondriumok láthatók (25. ábra., G). Lisczak és munkatársai kimutatták, hogy morfológiailag ép mitokondriumok voltak jelen a sejtpusztulás még azon fázisában is, amikor a sejtmag már dezorganizálttá vált 115 és csak igen hosszú ideig fennálló agyi ischaemia után lazul fel a szerkezetük

116

. Azonban az agykérgi mitokondriumokra jellemző, hogy eltérő

képet mutatnak az ischaemiás behatás természetétől függően. Ischaemia hatására a sejt

87

duzzadása miatt a mitokondrium mátrix jelentősen fellazul. Ezzel szemben, ha az ischaemiát reperfúzió követi, akkor a mitokondriumok kondenzálódnak, megnövekedik a mátrix sűrűsége és elektrodenz lerakódások jelennek meg bennük 117. Az ischaemia következtében az asztrociták talprészei megduzzadnak és a reperfúzió előrehaladtával a sejtek további duzzadása és lízise alakul ki (26. ábra). Kísérleti eredményeink szerint a GFAP-pozitív asztrociták pusztulása megelőzi az idegsejt szétesését (24. ábra). Garcia és munkatársai patkányban vizsgálták az a. cerebri media elzárásának szövettani következményeit, és azt tapasztalták, hogy 30 perccel az okklúzió kezdete után már elkezdődik az idegsejtek zsugorodása, de egyéb elváltozás 60 perces ischaemiát követően nem látható. Ezzel szemben az asztrociták duzzadása mellett szinte azonnal megindul a GFAP degenerációja is

118

. Az asztrociták az

idegsejteket támogató több fontos tulajdonsággal rendelkeznek. Részt vesznek a sejtkárosító kaszkád során felszabadult nagymennyiségű glutamát eltávolításában, amelyet a gliasejt a már sejtkárosító hatással nem rendelkező glutaminként tárol. Nagy mennyiségben tartalmaznak antioxidáns hatású glutationt és aszkorbinsavat, ezáltal részt vesznek reaktív szabad gyökök semlegesítésében. Szerepük megnyilvánul glukoneogenezisben, glikolízisben és az immunválaszban, valamint a neuronális növekedésben és a szinaptikus plaszticitásban

119

. Az asztrocitáknak az ischaemiás-

reperfúzió által létrehozott folyamatban betöltött összetett szerepe és fokozott érzékenységük az ischaemiás behatásokra még számos kérdés tisztázását igényli

120,121

.

Az asztrociták korai pusztulását okozhatja, hogy: azok metabolikus aktivitása fiziológiás körülmények között is magas terhelést jelent számukra

123

122

, és az ischaemiás folyamat fokozott

, amelyhez hozzájárulnak egyéb érzékenyítő tényezők, így

pl. a szöveti acidózis nagymértékben fokozza az asztrociták fogékonyságát a károsító hatásokkal szemben 124. A mikroglia sejtek kezdetben a szövetkárosító hatás közelében, később a közvetve érintett hippocampus, substantia nigra, thalamus területekre is kiterjedten jelennek meg 125, 126

. A mikroglia sejtek funkciója kettős, elsősorban immunreakciókban vesznek részt

és ezáltal egyaránt káros és védő hatást is kifejtenek 127. A mikroglia sejtek megjelenése a preoptikus területen együtt változik a testhőmérséklet megemelkedésével

63

. A

penumbra mikroglia sejtjeiben lévő nNOS aktivitása mintegy kétszerese a core

88

területéhez képest, amely kedvezőtlenül befolyásolja az állatok élettartamát 24 órával az IR behatást követően károsító hatásának

129

128

. Az oligodendrociták viszonylag ellenállnak az IR folyamat

.

Fluoro-Jade festéssel 24 óra reperfúzió elteltével a core területén a nagyszámú zsugorodott idegsejt mellett nyomokban élő idegsejtek láthatóak (26. ábra). A módszer IR behatást követően mintegy 12-16 óra elteltével alkalmas a degeneratív elváltozások vizsgálatára

73

. Használatával élő sejteket mutattak ki a hagyományos szövettani

módszerekkel elhaltnak ítélt agyi szövetekben 112 és fordítva, a TTC festés átalakítására képes szövetekben ténylegesen elhalt sejteket 130. A striatum egyike az agyi ischaemiára leginkább érzékeny szöveteknek, de ez az érzékenység differenciáltan jelentkezik. A neuropeptid-Y/szomatosztatin pozitív, glutaminsav-dekarboxiláz enzimet tartalmazó (GAD-pozitív) 131 és DARPP-32 (cAMPregulált foszfoprotein) negatív neuronok ellenállónak bizonyultak a globális agyi ischaemia által létrehozott károsító hatásnak, ellentétben DARPP-32 pozitív neuronokkal 120. A GABAerg neuronoknak az ischaemiás-reperfúziós agyi károsodással szembeni érzékenysége elhelyezkedésüktől függően is változik: így az agykéregben és a striatumban lévő interneuronok kevésbé

132

, a striatumban lévő GABAerg neuronok

pedig nagy számban tűnnek el a károsító inzultus után

120

. A striatum GABAerg

idegsejtjei érzékenyebben reagálnak az IR károsodásra, amelynek hátterében az NMDA receptorok jelenléte feltételezhető. Az itt lévő extraszinaptikus NMDA receptorok nagy arányban tartalmaznak a posztischaemiás- és az aktivitás-függő LTP kialakulásában fontos szerepet játszó ún. NR1 és NR2B alegységet 133. A kísérleteinkben alkalmazott a. cerebri media proximális ágának 60 perces elzárása a hemispherium méretéhez viszonyítva jelentős mértékű szöveti károsodást hoz létre, amelyet reperfúzió számottevően nem csökkentett még 24 óra elteltével sem (19. ábra). A szövetkárosodás nagysága arányosan növeli a késői, ún. másodlagos vaszkuláris zavarok visszamaradásának lehetőségét, amelyek gátolják a megfelelő agyi perfúzió kialakulását

93,134

. A másodlagos vaszkuláris zavarok kialakulásának valószínűsége 1-2

órás agyi ischaemia esetén kifejezett

112

. Vizsgálataink megerősítik a szakirodalomban

89

megismert tanulmányok megfigyeléseit, amelyek szerint az inkomplett ischaemiareperfúzió szintén károsító hatást jelent a sejtek számára 115. A korábban elvégzett kísérletek alapján a glutamát és GABA szöveti koncentrációjának jelentős csökkenése volt kimutatható mind az agykéregben, mind a striatumban 1 órás MCAO és 24 órás reperfúziós idő után

88

. Ehhez kapcsolódóan, jelen neurokémiai

vizsgálataink során a bazális ganglion rendszerben fontos moduláló szereppel rendelkező striatális dopaminerg terminálisokat vizsgáltuk, amelyeket szelektív tirozinhidroxiláz

enzim

immunhisztokémiai

reakcióval

mutattunk

ki

(27.

ábra.).

Eredményeink szerint a tirozin-hidroxiláz enzimek a dopaminerg ternimálisok körül dezorganizáltan jelennek meg az ellenoldali striatum képéhez viszonyítva. A striatális sejtek számának csökkenését követi a substantia nigra dopaminerg sejtjeinek elváltozása is, amelyek egyben fókuszát képezik a későbbi szöveti megújulásnak is. A dopaminerg sejtek számának és a tirozin-hidroxiláz enzim aktivitásának csökkenése az inzultust követően 2-3 nappal kezdődik és a károsodást követően kb. 7 nappal éri el minimumát

125,135,136

. Azonban az átmeneti aktivitás-csökkenés után a behatást követő

60 nappal már nem mutatható ki különbség a két hemispehriumban lévő substantia nigra szövettani képe között 137,138. A dopaminerg neuronok szerepe a károsodott terület kompenzációs mechanizmusaiban jelenleg aktívan kutatott terület 136,139,140.

5.3.

A corticostriatális dopaminerg rendszer neurokémiai vizsgálatával kapott eredmények megbeszélése

Az a. cerebri media a frontoparietális agykéreg és a striatum vérellátásáért felelős, amely képletek a bazális ganglion körhöz kapcsolódnak. A bazális gangion kör tagja a striatum (nucleus caudatus, putamen), globus pallidus, nucleus subthalamicus. A kör alkotói funkcionálisan egymásba fonódó pályarendszerekkel kapcsolódnak egymáshoz és elsősorban glutamát, GABA, valamint dopamin neurotranszmitterek útján, a thalamus közvetítésével befolyásolják az agykéreg működését 1. A HPLC mérés során a corticostriatális agyszeletben lévő szöveti dopamin és dopamin metabolit koncentrációt mértük olyan állatokban, amelyekben a műtéti MCAO elzárás

90

sikeres volt

75

, és in vitro TTC festéssel kimutattuk a szöveti károsodást. A kapott

eredményeket intakt állatokban mért adatokhoz hasonlítottuk, mert álműtött és intakt állatokból kapott eredmények között nem találtunk szignifikáns különbséget. Az agyi ischaemia által okozott excitotoxicitás elsődleges kiváltó oka a glutamát kiáramlása, amely a posztszinaptikus NMDA receptorok aktiválásával további neurotranszmitter felszabadulását segíti elő. Az ischaemia kialakulásakor a glutamát mellett nagymennyiségű dopamin szabadul fel, amelyek koncentrációja fokozatosan csökken a reperfúzió időtartamának előrehaladtával

141

. A felszabaduló dopamin

koncentrációjának emelkedése korrelál a reaktív oxigén gyökök megjelenésével. A szoros korreláció hátterében a felszaporodott dopamin autooxidáció útján történő átalakulása (enzimatikus utak telítődése) feltételezhető

142

. A striatum GABAerg sejtjei

szoros kölcsönhatásban vannak a substantia nigra dopamin metabolizmusával, így a striatumot érintő IR károsodás a tirozin-hidroxiláz enzim aktivitásának csökkenését okozza a pars compactában, azonban ez a változás GABA agonistával megelőzhető 137. A közelmúltban elvégzett, az agyi ischaemiát követően a striatális dopaminerg idegvégződésekből felszabaduló dopamin mennyiségének befolyásolására irányuló neuroprotektív kutatások számos fontos információt tártak fel, pl.: IR által okozott dopamin szint emelkedése a striatumban csökkenthető propofol

143

, monoamino-oxidáz

enzim gátló szer hatására 144, vagy hiperbarikus oxigén belélegeztetéssel 145. A dopamin koncentrációjának csökkenése korrelál az infarktus térfogat mérséklődésével. Hisztamin receptor antagonista hatására az agyi ischaemia által kiváltott striatális dopamin koncentráció tovább emelkedett, és ezzel párhuzamosan a hisztológiai kép is súlyosbodott 146. Eredményeink szerint az MCAO hatására mindkét oldali agykéregben szignifikánsan megemelkedett a HVA szöveti koncentrációja. Az MCAO hatására a striatális HVA mennyisége csak a műtött oldalon emelkedett meg, azonban a dopamin koncentrációja mindkét oldalon csökkent (28. ábra). Az intakt állatokban a turnover agyi régiónként eltérőnek bizonyult. Az agykéregben igen alacsony a dopamin szöveti koncentrációja, míg a striatumban alacsony a turnover (29. ábra), amelynek hátterében az autoreceptorok eltérő mintázata feltételezhető

91

147

. Az ellenoldalon megjelenő idegi

működészavar hátterében a corpus callosumban futó corticocortiális kapcsolatok sérülése

134

, valamint az agyi oedema és a reaktív szabad gyökök megjelenése

feltételezhető 148. A corticostriatális glutamáterg, GABAerg és dopaminerg transzmisszió módosul agyi ischaemia hatására

136,139,140

, ezért az MCAO által érintett agyi területek vizsgálatát in

vitro corticostriatális agyszeletben folytattuk. Kísérleti eredményeink értékelése során olyan sikeres ACM okklúzión átesett

75

állatok agyi szeleteiből származó adatokat

dolgoztuk fel, amelyek esetén KCl perfúzió hatására trícium felszabadulás jött létre a striatumban és in vitro TTC festéssel szöveti károsodást mutattunk ki. Korábban Hársing és munkatársai kimutatták

88

, hogy 1 órás a. cerebri media elzárást

követően 24 óra reperfúziós idő elteltével, bár jelentősen lecsökkent a szöveti glutamát és a GABA tartalom, azonban az in vitro corticostriatális szeletben mért radioaktívan jelzett GABA nagyobb arányban szabadult fel az MCAO által érintett striatumból, mint az intakt kontroll állatokból származó striatum esetében. A jelenség hátterében az ischaemiás-reperfúziós

behatás

következményeképpen

létrejött

kompenzatórikus

mechanizmusok jelenlétére következtettek. Hasonlóan ismert jelenség az idegsejtek károsodásával összefüggő kompenzatórikus neurotranszmitter felszabadulás, pl. a neurotoxinnal kiváltott állatkísérletes parkinsonizmus esetén 149. Meglepően, az intakt és az IR striatumból megközelítőleg azonos, a nyugalmi értékéhez viszonyítva kb. 6-7-szeres mértékben megnőtt a jelzett dopamin kiáramlás (30. ábra). A striatum tirozin-hidroxiláz enzim kimutatásából kapott eredmények alapján a striatumban végződő dopaminerg terminálisok károsodása mutatható ki 1 órás a. cerebri media elzárását követő 24 órás reperfúzió elteltével (27. ábra). Azonban a TTC festéssel fehér, vagy piros területként látható IR károsodásnak kitett agyi szeletek esetén a corticostiatális pálya elektromos ingerlése útján kiváltott csúcs alatti terület nagysága között nincs szignifikáns különbség (31. ábra). A dopaminerg neuronok jellegzetessége, hogy pl. a 24 órán belül létrehozott ismételt agyi ischaemia után a dopaminerg idegvégződésekből felszabaduló dopamin mennyiségében nincs különbség, amely a dopamin szintézisének, és a dopamint felszabadító mechanizmusoknak az IR behatással szembeni ellenálló-képességére hívja

92

fel a figyelmet

150

. Az ischaemia következtében a dopamin hirtelen nagymennyiségben

szabadul fel az akciós potenciáltól független módon, amely a dopaminerg idegsejtek működészavarát jelzi. Azonban a reperfúzió ideje alatt a szinaptikus résben felszaporodott dopamin koncentrációja visszatér a fiziológiás tartományba, amely az idegsejtek működészavarának átmeneti jellegére utal 151. A HPLC-vel mért (28. és 29. ábra), és a corticostriatális agyszeletben mért [3H]dopamin felszabadulás tekintetében nincs különbség az IR állatok ipszilaterális és kontralaterális striatuma között, mindkét hemispheriumban tapasztalható idegi működészavar a TTC festés eredményétől függetlenül (30. és 31. ábra). Hasonló jelenség megfigyelhető egyéb féloldali inzultusok esetén is, pl. a 6-hidroxi-dopaminnal kiváltott parkinsonizmus kapcsán 152, vagy féloldali agyi ischaemiát követően is az EEG jelek 153, és a neurotraszmitterek felszabadulásának 154 megváltozásában. Az ellen-oldali működészavar fennállását az inzultust követően 1 héttel is kimutatták. Az egyoldali, fokális agyi ischaemia által okozott ellenoldali működészavar ún. távoli (remote) hatásnak tulajdonítható, amely az infarktus méretével arányosan fordul elő. A jelenség hátterében az afferens neuronok konstitutív ingerlő/gátló hatásának megszűnése valamint a corpus callosumban futó corticocortiális kapcsolatok sérülése

148

,

134

feltételezhető. A hemispheriumok közötti kapcsolatokon túl, az agyi oedema, és a reaktív szabad gyökök megjelenése szintén közrejátszik az ellenoldali működészavar kialakulásában 148. Jelen kísérleteink során újabb ismereteket szereztünk a bazális ganglion kör agyi ischaemia-reperfúziót követő működéséről. A substantia nigrából a striatumba érkező dopaminerg idegi terminálisok esetén, bár a szövetkárosodás nyilvánvaló jelei láthatóak, a meglévő terminálisok válaszadó képessége megtartott. Ezáltal a striatum GABAerg sejtjein végződő dopaminerg ternimálisoknak a bazális ganglion körben betöltött fontos moduláló szerepe feltételezhetően hozzájárul a striatum integratív szerepének erősítéséhez és fenntartásához az ischaemia-reperfúzió korai fázisában (42. ábra).

93

42. ábra. Striatum pályarendszereinek sérülése az MCAO következtében

Az a. cerebri media elzárása a frontoparietális agykéreg és a striatum károsodását okozza. Az IR szövettani elváltozások kialakulásához és funkcionális zavar megjelenéséhez vezet. Az IR károsodás következtében a corticostriatális (zöld szaggatott vonal) és a striatumból induló pályák (piros szaggatott vonal) kisebb mértékben tudnak hozzájárulni a bazális ganglion kör megfelelő működéséhez, és az agykéreg megfelelő aktivitásának fenntartásához ezért kompenzatórikus idegi folyamatok lépnek életbe. A kompenzatórikus folyamatok része a striatalis GABAerg sejtek

88

megváltozása,

amelyek

, és a nigrostiatális dopaminerg terminálisok érzékenységének feltehetően

hozzájárulnak

károsító

folyamat

előrehaladásának mérsékléséhez. A dopamin többszintű kompenzatórikus aktivitása megnyilvánul a különböző agyi régiókban, az azokhoz befutó ingerületek szabályozásában, az információ átadásának fokozásában, valamint a dopaminerg terminálisok aktuális aktivitása alapján az agykérgi működés befolyásolásában.

94

5.4. Neurológiai vizsgálatokkal kapott eredmények megbeszélése A corticostriatális összeköttetések szigorú topográfiai rend szerint a striatum különböző pontjaihoz futnak, és az általuk szabályozott funkciók jelentősen eltérnek egymástól. A putamen elsősorban a vázizmok mozgását szabályozza, a nucleus caudatus pedig a szemmozgások szabályozásában, a kognitív funkciókban és a magatartás szervezésében fejti ki hatását. A striatum ventrális sejtcsoportjainak gazdag összeköttetései vannak az asszociációs és limbikus régiókkal, ezért az ún. limbikus működésekben (memória, érzelmek, viselkedés) van szerepük 1. Az a. cerebri media műtéti elzárása magában foglalja az a. carotis externa (ACE) leszorítását. Az irodalmi adatok szerint ACE leszorítása vagy végleges lekötése eredményeképpen az esetek 50%-ban alakul ki az ACE vérellátási területén szövettani elváltozás. A rágásban és nyelésben résztvevő izmok gyengülése következtében az állatok testsúlya mintegy 5%-kal alacsonyabb az ilyen elváltozást nem mutató ACM okklúzión átesett állatokhoz 155. A kiválasztott négyféle neurológiai skála alapja a testtartási rendellenességek és a mozgáskoordinációs zavarok vizsgálata, valamint az izomtónus csökkenés, a szenzoros funkciók, a spontán mozgásaktivitás és az általános állapot értékelése 53,75,82,83. A szenzomotoros funkciók vizsgálatára számos egyéb skála ismeretes az irodalomban permanens

28,43-47

, és tranziens agyi ischaemia esetén

27,48-51

. Az MCAO esetén

alkalmazott skálák kialakításának alapját a szövettani vizsgálat eredményeivel való összehasonlítás képezte. Bár a skálák alkalmazásával szignifikáns elváltozásokat mutattak ki az intakt és az IR állatok között, de az IR állatok neurológiai vizsgálatának eredménye és az infarktus terület nem korrelált egymással

75,44,45,156-160

. A fentiekből

arra következtethetünk, hogy a szenzomotoros deficit mértéke nem egyenes következménye az infarktus méretének. A jelenség hátterében egyéb agyi területek közreműködése feltételezhető: egyrészt morfológiailag épnek tekinthető szövetek, amelyek idegi funkcióikat tekintve károsodtak, illetve a hisztológiai megfigyelésbe közvetlenül nem bevont, azaz ischaemia által közvetlenül nem érintett területek által

95

közvetített neurológiai deficit kialakulása („covert injury”) korreláció keresése csak kisebb agyi régiók

163,164

161,162

. Továbbá, hogy a

, vagy egy-egy kiemelt elváltozás

43

esetén érdemes (pl. oedema mértéke) . Egyes, az irodalomban leírt skálák külön hangsúlyt fektetnek bizonyos paraméterek 52

értékelésére, így pl. a szenzoros funkciók

, térbeli orientáció

53

, mozgászavar

54

,

elhalálozás 55 vagy az enyhe elváltozások kimutatására 56. Mindezek a skálák hasznosak lehetnek egy-egy neuroprotektív vegyület célzott és specifikus hatékonyságának megállapítására. A stroke betegek esetében a tünetek változatos formában jelennek meg: fokozatait tekintve,

az

enyhe

szenzomotoros Kísérleteinkben

émelygéstől

tünetekkel,

így

kimutattuk,

a

hogy

az

eszméletvesztésig,

kézremegéstől a

négyféle

valamint

egészen

a

neurológiai

különböző

bénulásig skála

28,29

.

különböző

érzékenységgel méri az ugyanazon középsúlyos agyi ischaema-reperfúzónak alávetett állatok neurológiai jellemzőit (32. ábra). A kiválasztott skálák különböznek egymástól a vizsgálati paraméterek pontjaiban, azok számában és súlyozásában, valamint a skála összpontszámában (33-38. ábra). Az állat általános megjelenését csak a Hunter-féle skála pontozza, míg a szenzoros működéseket csak a Reglődi- és a Garcia-féle skála veszi számításba (38. ábra). Az alkalmazott skálák egyes vizsgálati paramétereinek befolyásoló hatása különbözőképpen érvényesül a skála összpontszámában. A leggyengébb összefüggést a Bederson-féle kumulatív skála esetén kaptuk, ekkor a skálán értékelt elváltozások 50%-ban korreláltak, míg a Garcia-féle

skála

vizsgálati

pontjai

mintegy

80%-ban

korreláltak

a

skála

összpontszámával. Vélhetően ezen összefüggések formálásában közrejátszik az IR állat állapotát nem kellőképpen érzékenyen értékelő paraméterek alkalmazása is, pl. a Reglődi-féle skálában a farok meghúzásával kiváltott egyensúlyzavar vizsgálata vagy Hunter-féle skála szerint értékelendő tenyérben történő átfordulás. Az 1 órás ACM okklúziót követő 24 órás reperfúzió esetén kialakult szenzomotoros deficitet a kiválasztott skálák többsége hasonlónak mérik, kivéve a Garcia- és Bedersonféle skála. Ekkor a két skála használatával mért szenzomotoros deficit különböző, amely vélhetően a két skála kevés számú és különböző paramétereiből adódik.

96

Az irodalomban fellelhető tanulmányok általában az infarktust csak nagyságában és kevésbé annak elhelyezkedését vizsgálták

165

. Egy adott ér vérellátási területén

kialakuló szövetkárosodás mértékét számos egyéb paraméter befolyásolhatja, így pl. a testhőmérséklet, az anaesthesia módja, az állattörzs, az állat életkora, az adott állat agyi kollaterális hálózata vagy az értékelő személye

53,159,166-168

. Mindezek a tényezők

lényegesen módosíthatják az állatkísérletes modellekben a kialakult szenzomotoros deficit mértékét is. Ezért a szenzomotoros funkciók vizsgálatára általánosan elfogadott és széles körben alkalmazott négyféle értékelési skálát folyamatos skálán értékelhető funkcionális tesztek eredményeivel vetettük össze. Vizsgálataink szerint (4.4.3. fejezet) az 1 órás ACM okklúziónak és 24 órás reperfúziónak alávetett állatok esetén a lépéshiba és egyensúlyozás tesztek eltérő súlyosságúnak ítélik a kialakult neurológiai változásokat. A neurológai skálák összpontszámainak

a

funkcionális

teszteken

kapott

eredményekkel

való

összehasonlítása alapján azt kaptuk, hogy sem a lépéshiba, sem az egyensúlyozás ideje nem korrelál egyetlen skála összértékével. Azonban az egyensúlyozás átlagos időtartama a Reglődi-féle skála szerint a mellső láb helyzetében látható testtartási rendellenesség és a Hunter-féle skálán szereplő bordázott gerendán való kapaszkodás és testtartás, valamint a Garcia-féle skálán a végtagok helyzetének tekintetében mutat szignifikáns összefüggést (41. ábra). Vizsgálataink eredménye tükrözi azt, hogy általában a neurológiai vizsgálatok során kapott adatoknak egyéb (hisztológiai vagy kognitív funkciók) mérés eredményeivel való szignifikáns korrelációja az ischaemiás-repefúziós károsodás korai fázisában csak speciális skálák alkalmazásával, pl. Mackay-féle skála vonatkozó teszt várható

160,168

169

29

, a mellső láb használatára

, vagy hosszabb ideig tartó kísérletben mért eredmények esetén

. A korrelációs elemzéseknél számolni kell a hosszabb ideig tartó vizsgálat

során megjelenő spontán felépülés befolyásoló hatásával

170

, amelyek megléte a

permanens agyi ischaemia modellek esetén szintén felismerésre került

171

. Valamint

azzal, hogy az a. cerebri media disztális okklúziójával ellentétben, a proximális szakasz elzárása eredményeként viszonylag rövid ideig kimutatható neurológiai változások jönnek létre 172.

97

A lokomotoros aktivitás mérése információt nyújt az állat explorációs tevékenységéről egy számára kellemes környezetben. Az irodalomban a lokomotoros aktivitás mérését az agyi ischaemia bekövetkezése után néhány nappal később

50

46

, 1 héttel

160

vagy hónapokkal

mérik az inzultus maradványtüneteinek megítélése céljából. Kísérleteink

során arra kerestük a választ, hogy vajon a neurológiai és in vivo funkcionális tesztekkel mért deficit mennyire tükröződik a tényleges explorációs aktivitás változásában. A lokomotoros aktivitás tesztben résztvevő állatok neurológiai jellemzői megfelelnek a korábbi kísérleteinkben szereplő állatok esetén kapott adatoknak. Azonban a vizsgálatban részt vevő állatok több csoportra oszthatók a lokomotoros aktivitás jellemzői és a túlélés szerint. Tekintettel arra, hogy az állatok eltérő lokomotoros aktivitással rendelkeznek, de a neurológia vizsgálat alapján homogén csoportként jelennek meg, a későbbiekben mindegyik állat lokomotoros aktivitás adatával számoltunk. Tapasztalataink szerint az eltérő lokomotoros aktivitás megjelenését a műtét során fellépő görcsrohamok

173

és emelkedett mozgásaktivitás (hipermotilitás)

44

befolyásolják. A mozgásaktivitás megfigyelését mindegyik neurológiai skála csak rövid ideig (néhány perc) írja elő, amely napszaki ingadozást is figyelembe véve tévesen ítéli meg az 1 órás ACM okklúziónak és 24 órás reperfúziónak alávetett állatok aktivitását (33. ábra). A lokomotoros aktivitás célzott vizsgálata segítségével kimutattuk, hogy a középsúlyos MCAO esetén csak a harmadik 5 perces periódus alatt csökken szignifikáns mértékben az állatok mozgásaktivitása, amelynek hátterében a műtéten átesett állatok elfáradása állt. A vizsgálat 15 perces időtartama alatt mért eredmények alapján mérhető különbség a kontroll állatokhoz képest (39. és 40. ábra).

98

6. Következtetések Vizsgálataink középpontjában az a. cerebri media műtéti okklúziójával létrehozott tranziens agyi ischaemiás károsodás állt, amely kiterjed a frontoparietális agykéreg és a striatum sejtjeire. Ezen összetett rendszer vizsgálatát 1 órás a. cerebri media elzárását követő 0-24 óra reperfúzió elteltével vizsgáltuk patkányban. 1.

Az a. cerebri media műtéti okklúziójával létrehozott tranziens agyi ischaemia után az in vivo (intrakardiális) és az in vitro (szeletben történő) TTC festés eredménye a 8 óránál rövidebb reperfúziós időknél markánsan különbözött; az in vivo festés esetében a károsodás térfogata átmenetileg csökkent a reperfúzió megkezdése után. A TTC festéssel szokásosan nekrotikusnak tekintett agyszövet számos morfológiailag életképesnek tekinthető idegsejtet foglalt magában. Tehát az ischaemiát követő korai reperfúziós időszakban a TTC formazánná redukálása valószínűleg akkor szűnik meg, amikor az agyszövet anyagcseréje átmenetileg vagy véglegesen leáll. A TTC festés nem alkalmas az irreverzibilis agyi károsodás pontos mérésére.

2.

Az 1 órás a. cerebri media elzárást követő 24 óra reperfúzió után a tirozinhidroxiláz

immunhisztokémia

kimutatta,

hogy

a

striatum

dopaminerg

idegvégződései jelentősen károsodtak. Az IR hatására a dopamin turnover fokozódott az azonos oldali agykéregben és striatumban, valamint az ellenoldali striatumban is. Az agykéreg elektromos ingerlése megközelítőleg azonos mennyiségű [3H]dopamint szabadított fel az intakt és az IR striatumból, vagyis a striatális dopaminerg idegvégződések működőképesek maradtak az ischaemiát követő korai reperfúziós időszakban a TTC-vel nem festődő agyszövetben is. 3.

Az ischaemia-reperfúzió szenzomotoros működésekre kifejtett befolyásoló hatását négyféle, az irodalomban elfogadott neurológiai módszerrel mértük, ezek eredményeit egymással, valamint a lépéshiba, az egyensúlyozás és a lokomotoros

aktivitás

tesztek

eredményeivel

hasonlítottuk

össze.

Megállapítható, hogy a vizsgált neurológiai skálák összértékei egymással jól

99

korreláltak, tehát az IR károsodás mértékét arányosan hasonló súlyosságúnak mérik. A lépéshiba, és az egyensúlyozás tesztek eredménye nem korrelált egyik neurológiai skála eredményével sem, tehát egyik teszt sem alkalmas a neurológiai skálák helyettesítésére.

100

7. Összefoglalás A stroke kutatás többszintű és integrált megközelítést igényel, azonban a klinikai vizsgálat elindításához elegendő és megfelelően alátámasztott állatkísérletes adatok nehezen körvonalazhatók. Kísérleteink során arra kerestük a választ, hogy a preklinikai gyakorlatban alkalmazott néhány módszer mennyire pontosan tükrözi az ischaemiásreperfúziós (IR) károsodás mértékét. Az EGIS Gyógyszergyár Nyrt. Preklinikai Kutatási Főosztályán az IR agyi károsodást 1 órás a. cerebri media elzárást követő különböző reperfúziós idő elteltével vizsgáltuk, patkányban. A károsodott agyszövetet trifenil-tetrazolium klorid (TTC) festéssel és szövettani vizsgálatokkal elemeztük. A TTC festéssel elhalt területként észlelhető agyi régiók idegi működését in vitro corticostriatális agyszeletben radioaktívan jelzett dopamin segítségével vizsgáltuk. In vivo, az állatok értékelését 4-féle ismert neurológiai skála összehasonlítása alapján végeztük el, amelyeket a gerendán való egyensúlyozás (beam balance), a lépéshiba (foot faults), és a lokomotoros aktivitás tesztekkel egészítettünk ki. Az TTC festés eredménye az alkalmazott eljárástól függően mind az agykéregben és a striatumban, mind a core és a penumbra tekintetében szignifikánsan különbözött. A TTC festéssel elhaltnak tekinthető agyszövet térfogata in vivo TTC festés után átmenetileg csökkent. A TTC festéssel nekrotikusnak tekintendő agyszövetben az asztrociták

teljesen

elpusztultak,

de

a

kiterjedt

károsodás

ellenére

számos

morfológiailag életképes idegsejt, az EM képen ép mitokondriumok is láthatók voltak. Az IR károsodás kiterjedt a striatum dopaminerg terminálisaira is, de a szöveti dopamin tartalom csökkenése ellenére a dopaminerg idegvégződések részben megtartották működésüket. A vizsgált neurológiai skálák hasonló súlyosságúnak mérik a stroke-os patkányok szenzomotoros deficitjét. A gerendán való egyensúlyozás (beam balance), a lépéshiba (foot fault), és a lokomotoros aktivitás tesztek nem alkalmasak a neurológiai skálák helyettesítésére. Összefoglalásként megállapítható, hogy az IR károsodás egy komplex, dinamikusan változó

rendszert

érint,

ezért

a

neuroprotektív

vegyületek

hatékonyságának

értékelésekor figyelembe kell venni az állat egészére kiterjedő változásokat. A rendszerben kialakult patológiás folyamatokról hiteles képet adni csak több egymást kiegészítő módszerrel lehetséges.

101

Irodalomjegyzék 1.

Szirmai I. Agyi vérkeringés zavarai. Neurológia, Medicina Könyvkiadó, Budapest, 2001: 284-336.

2.

Egészségügyi Minisztérium szakmai irányelve az akut isémiás stroke ellátásához. (2002) Egészségügyi Közlöny, 11: 1337-1342.

3.

Harcos P. Agyi érbetegségek, UCB Kiskönyvtár, UCB Magyarország, Budapest, 1997: 12-67.

4.

Debreczeni R. (2002) Az intracranialis nagyerek keringésének vizsgálata transcranialis Doppler-módszerrel. A szűkületek, spasmusok és a kollaterális keringés megítélése. Agyérbetegségek, 8: 15-20.

5.

Fisher M. (1997) Characterizing the target of acute stroke therapy. Stroke, 28: 866-872.

6.

Sato S, Nakagawa I, Katayama K, Kakemi M, Koizumi T. (1986) A kinetic study on chlorpromazine disposition and hypothermic response in rats. J Pharmacobiodyn, 9: 490-499.

7.

Derdeyn CP, Carpenter DA, Videen TO, Grubb RL Jr, Powers WJ. (2007) Patterns of infarction in hemodynamic failure. Cerebrovasc Dis, 24: 11-19.

8.

Acute Ischemic Stroke: New Concepts of Care. (1999) Genentech Inc., http://www. strokecenter.org/education

9.

Heiss WD, Graf R, Grond M, Rudolf J. (1998) Quantitative neuroimaging for the evaluation of the effect of stroke treatment. Cerebrovasc Dis, 8: 23-29.

10.

Mies G, Ishimaru S, Xie Y, Seo K, Hossmann KA. (1991) Ischemic thresholds of cerebral protein synthesis and energy state following middle cerebral artery occlusion in rat. J Cereb Blood Flow Metab, 11: 753-761.

11.

Marshall RS, Lazar RM, Pile-Spellman J, Young WL, Duong DH, Joshi S, Ostapkovich N. (2001) Recovery of brain function during induced cerebral hypoperfusion. Brain, 124: 1208-1217.

12.

Bandera E, Botteri M, Minelli C, Sutton A, Abrams KR, Latronico N. (2006) Cerebral blood flow threshold of ischemic penumbra and infarct core in acute ischemic stroke: a systematic review. Stroke, 37: 1334-1339.

102

13.

Charriaut-Marlangue C, Margaill I, Represa A, Popovici T, Plotkine M, Ben-Ari Y. (1996) Apoptosis and necrosis after reversible focal ischemia: an in situ DNA fragmentation analysis. J Cereb Blood Flow Metab, 16: 186-194.

14.

Fisher M. (2006) The ischemic penumbra: a new opportunity for neuroprotection. Cerebrovasc Dis, 21: 64-70.

15.

Ginsberg MD. (2003) Adventures in the pathophysilogy of brain ischemia: penumbra, gene expression, neuroprotection. The Thomas Willis Lecture. Stroke, 34: 214-223.

16.

Lin RCS. New concepts in cerebral ischemia, CRC Press, New York, 2002: 79113.

17.

Lipton P. (1999) Ischemic cell death in brain neurons. Physiol Rev, 79: 14311568.

18.

Pulsinelli WA. (1992) Pathophysiology of acute ischaemic stroke. Lancet, 339: 533-536.

19.

Wahlgren NG, Ahmed N. (2004) Neuroprotection in cerebral ischaemia: facts and fancies- the need for new approaches. Cerebrovasc Dis, 17: 153-166.

20.

Dirnagl U, Iadecola C, Moskowitz MA. (1999) Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci, 22: 391-397.

21.

Fukuda S, del Zoppo GJ. (2003) Models of focal cerebral ischemia in the nonhuman primate. ILAR J, 44: 96-104.

22.

Lee MY, Choi YS, Choi JS, Min DS, Chun MH, Kim ON, Lee SB, Kim SY. (2002) An immunohistochemical study of APG-2 protein in the rat hippocampus after transient forebrain ischemia. Brain Res, 924: 237-241.

23.

Gyertyán I, Gigler G, Simó A. (1999) The neuroprotective and hypothermic effect of GYKI-52466, a non-competitive alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4isoxazolepropionic acid-antagonist on histological and behavioural variables in the gerbil global ischemia model. Brain Res Bull, 50: 179-186.

24.

Zhang Z, Chopp M, Zhang RL, Goussev A. (1997) A mouse model of embolic focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab, 17: 1081-1088.

25.

Welsh FA, Sakamoto T, McKee AE, Sims RE. (1987) Effect of lactacidosis on pyridine nucleotide stability during ischemia in mouse brain. J Neurochem, 49: 846-851.

26.

Brint S, Jacewicz M, Kiessling M, Tanabe J, Pulsinelli W. (1988) Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem

103

occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. J Cereb Blood Flow Metab, 8: 474-485. 27.

Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, Cummins R. (1989) Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke, 20: 84– 91.

28.

Markgraf CG, Green EJ, Hurwitz BE, Morikawa E, Dietrich WD, McCabe PM, Ginsberg MD, Schneiderman N. (1992) Sensorimotor and cognitive consequences of middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res, 20: 238-246.

29.

Rogers DC, Campbell CA, Stretton JL, Mackay KB. (1997) Correlation between motor impairment and infarct volume after permanent and transient middle cerebral artery occlusion in the rat. Stroke, 28: 2060-2065.

30.

Meldrum BS. (1995) Cytoprotective therapies in stroke. Curr Opin Neurol, 8: 1523.

31.

Adams HP, del Zoppo G, Albers MJ, Deepak LB, Brass L, Furlan A, Grubb RL, Higashida RT, Jauch EC, Kidwell C, Lyden PD, Morgenstern LB, Quereshi AI, Rosenwasser RH, Scott PA, Wijdicks EFM. (2007) Guidelines for the early management of patients with ischemic stroke, 2007 AHA/ASA Guidelines Update. Circulation, 115: 478-534.

32.

Szegedi N. (2005) Az akut stroke Orvostovábbképző Szemle, 12: 58-63.

33.

Moher D, Schulz KF, Altman DG. (2001) The CONSORT statement: revised recommendations for improving the quality of reports of parallel-group randomised trials. Lancet, 357: 1191-1194.

34.

Fisher M, Gerriets T, Wessels C, Walberer M, Kostin S, Stolz E, Zheleva K, Hocke A, Hippenstiel S, Preissner KT. (2007) Extracellular RNA mediates endothelial-cell permeability via vascular endothelial growth factor. Blood, 110: 2457-2465.

35.

Mori E, Yoneda Y, Tabuchi M, Yoshida T, Ohkawa S, Ohsumi Y, Kitano K, Tsutsumi A, Yamadori A. (1992) Intravenous recombinant tissue plasminogen activator in acute carotid artery territory stroke. Neurology, 42: 976-982.

36.

Hacke W, Donnan G, Fieschi C, Kaste M, von Kummer R, Broderick JP, Brott T, Frankel M, Grotta JC, Haley EC Jr, Kwiatkowski T, Levine SR, Lewandowski C, Lu M, Lyden P, Marler JR, Patel S, Tilley BC, Albers G, Bluhmki E, Wilhelm M, Hamilton S, ATLANTIS Trials Investigators, ECASS Trials Investigators, NINDS rt-PA Study Group Investigators. (2002) Association of outcome with early stroke treatment: pooled analysis of ATLANTIS, ECASS, and NINDS rt-PA stroke trials. Lancet, 363: 768-774.

104

evidenciákon

alapuló

kezelése.

37.

O'Collins VE, Macleod MR, Donnan GA, Horky LL, van der Worp BH, Howells DW. (2006) 1,026 experimental treatments in acute stroke. Ann Neurol, 59: 467477.

38.

Donnan GA. (2008) The Feinberg lecture: a new road map for neuroprotection. Stroke, 39: 242-248.

39.

European Medicines Agency (2001) Points to consider on clinical investigation of medicinal products for the treatment of acute stroke. CPMP/EWP/560/98.

40.

Goldstein LB. (2006) Improving the Clinical Diagnosis of Stroke. Stroke, 37: 754755.

41.

Clinical trial database, National Institute of Health, http://clinicaltrials.gov

42.

Macleod MR, O'Collins T, Howells DW, Donnan GA. (2004) Pooling of animal experimental data reveals influence of study design and publication bias. Stroke, 35: 1203-1208.

43.

Tominaga T, Ohnishi ST. (1989) Interrelationship of brain edema, motor deficits, and memory impairment in rats exposed to focal ischemia. Stroke, 20: 513-518.

44.

Okada M, Tamura A, Urae A, Nakagomi T, Kirino T, Mine K, Fujiwara M. (1995) Long-term spatial cognitive impairment following middle cerebral artery occlusion in rats. A behavioral study. J Cereb Blood Flow Metab, 15: 505-512.

45.

van der Staay FJ, Augstein KH, Horváth E. (1996) Sensorimotor impairments in rats with cerebral infarction, induced by unilateral occlusion of the left middle cerebral artery: strain differences and effects of the occlusion site. Brain Res, 735: 271-284.

46.

Wahl F, Allix M, Plotkine M, Boulu RG. (1992) Neurological and behavioral outcomes of focal cerebral ischemia in rats. Stroke, 23: 267-272.

47.

Marston HM, Faber ES, Crawford JH, Butcher SP, Sharkey J. (1995) Behavioural assessment of endothelin-1 induced middle cerebral artery occlusion in the rat. Neuroreport, 6: 1067-1071.

48.

Aronowski J, Samways E, Strong R, Rhoades HM, Grotta JC. (1996) An alternative method for the quantitation of neuronal damage after experimental middle cerebral artery occlusion in rats: analysis of behavioral deficit. J Cereb Blood Flow Metab, 16: 705-713.

49.

Belayev L, Alonso OF, Busto R, Zhao W, Ginsberg MD. (1996) Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture. Neurological and pathological evaluation of an improved model. Stroke, 27: 1616-1622.

105

50.

Borlongan CV, Cahill DW, Sanberg PR. (1995) Locomotor and passive avoidance deficits following occlusion of the middle cerebral artery. Physiol Behav, 58: 909917.

51.

Sakai N, Yanai K, Ryu JH, Nagasawa H, Hasegawa T, Sasaki T, Kogure K, Watanabe T. (1996) Behavioral studies on rats with transient cerebral ischemia induced by occlusion of the middle cerebral artery. Behav Brain Res, 77: 181-188.

52.

Borlongan CV, Stahl CE, Redei E, Wang Y. (1999) Prepro-thyrotropin-releasing hormone 178-199 exerts partial protection against cerebral ischemia in adult rats. Neuroreport, 10: 3501-3505.

53.

Reglődi D, Tamás A, Lengvári I. (2003) Examination of sensorimotor performance following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res Bull, 59: 459-466.

54.

Borlongan CV. (2000) Motor activity-mediated partial recovery in ischemic rats. Neuroreport, 11: 4063-4067.

55.

Chen J, Li Y, Wang L, Zhang ZG, Lu D, Lu M, Chopp M. (2001) Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats. Stroke, 32: 1005–1011.

56.

Zausinger S, Hungerhuber E, Baethmann A, Reulen H, Schmid-Elsaesser R. (2000) Neurological impairment in rats after transient middle cerebral artery occlusion: a comparative study under various treatment paradigms. Brain Res, 863: 94-105.

57.

Mackay KB, Bailey SJ, King PD, Patel S, Hamilton TC, Campbell CA. (1996) Neuroprotective effect of recombinant neutrophil inhibitory factor in transient focal cerebral ischaemia in the rat. Neurodegeneration, 5: 319-323.

58.

Ng YS, Stein J, Ning M, Black-Schaffer RM. (2007) Comparison of clinical characteristics and functional outcomes of ischemic stroke in different vascular territories. Stroke, 38: 2309-2314.

59.

Bardutzky J, Shen Q, Henninger N, Schwab S, Duong TQ, Fisher M. (2007) Characterizing tissue fate after transient cerebral ischemia of varying duration using quantitative diffusion and perfusion imaging. Stroke, 38: 1336-1344.

60.

Spedding M. (2006) New directions for drug discovery. Dialogues Clin Neurosci, 8: 295-301.

61.

Stys PK. (2004) White matter injury mechanisms. Curr Mol Med, 4: 113-130.

62.

Gressens P, Spedding M, Gigler G, Kertész S, Villa P, Medja F, Williamson T, Kapus G, Lévay G, Szénási G, Barkóczy J, Hársing LG Jr. (2005) The effects of

106

AMPA receptor antagonists in models of stroke and neurodegeneration. Eur J Pharmacol, 519: 58-67. 63.

Fisher M, Hanley DF, Howard G, Jauch EC, Warach S, STAIR Group. (2007) Recommendations from the STAIR V meeting on acute stroke trials, technology and outcomes. Stroke, 38: 245-248.

64.

Aspey BS, Taylor FL, Terruli M, Harrison MJ. (2000) Temporary middle cerebral artery occlusion in the rat: consistent protocol for a model of stroke and reperfusion. Neuropathol Appl Neurobiol, 26: 232-242.

65.

Bardutzky J, Shen Q, Henninger N, Bouley J, Duong TQ, Fisher M. (2005) Differences in ischemic lesion evolution in different rat strains using diffusion and perfusion imaging. Stroke, 36: 2000-2005.

66.

Matucz E, Móricz K, Gigler G, Simó A, Barkóczy J, Lévay G, Hársing LG Jr, Szénási G. (2004) Reduction of cerebral infarct size by non-competitive AMPA antagonists in rats subjected to permanent and transient focal ischemia.Brain Res, 1019: 210-216.

67.

Bouley J, Fisher M, Henninger N. (2007) Comparison between coated vs. uncoated suture middle cerebral artery occlusion in the rat as assessed by perfusion/diffusion weighted imaging. Neurosci Lett, 412: 185-190.

68.

Ábrahám H, Somogyvári-Vigh A, Maderdrut JL, Vígh S, Arimura A. (2003) Rapidly activated microglial cells in the preoptic area may play a role in the generation of hyperthermia following occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Exp Brain Res, 153: 84-91.

69.

Lippold HJ. (1982) Succinic dehydrogenase activity in liver, kidney and brain of rat. Histochemistry, 75: 287-291.

70.

Lundy EF, Solik BS, Frank RS, Lacy PS, Combs DJ, Zelenock GB, D'Alecy LG. (1986) Morphometric evaluation of brain infarcts in rats and gerbils. J Pharmacol Methods, 16: 201-214.

71.

Britton P, Lu XC, Laskosky MS, Tortella FC. (1997) Dextromethorphan protects against cerebral injury following transient, but not permanent, focal ischemia in rats. Life Sci, 60: 1729-1740.

72.

Bancroft JD, Stevens A, Turner DR. Theory and practice of histological techniques, Churchill Livingstone, New York, 1996: 52-156.

73.

Schmued LC, Stowers CC, Scallet AC, Xu L. (2005) Fluoro-Jade results in ultra high resolution and contrast labeling of degenerating neurons. Brain Res, 1035: 24-31.

107

74.

Towle AC, Lauder JM, Joh TH. (1984) Optimization of tyrosine hydroxylase immunocytochemistry in paraffin sections using pretreatment with proteolytic enzymes. J Histochem Cytochem, 32: 766-770.

75.

Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M, Nishimura MC, Davis RL, Bartkowski H. (1986) Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke, 17: 472– 476.

76.

Mefford IN. (1981) Application of high performance liquid chromatography with electrochemical detection to neurochemical analysis: measurement of catecholamines, serotonin and metabolites in rat brain. J Neurosci Methods, 3: 207-224.

77.

Jurányi Z, Sziray N, Markó B, Lévay G, Hársing LG Jr. (2004) AMPA receptor blockade potentiates the stimulatory effect of L-DOPA on dopamine release in dopamine-deficient corticostriatal slice preparation. Crit Rev Neurobiol, 16: 129139.

78.

Haines D, The basal nuclei. Fundamental neuroscience. Churchill Livingstone, Phyladelphia, 2002: 405-423.

79.

Kawaguchi Y, Wilson CJ, Emson PC. (1989) Intracellular recording of identified neostriatal patch and matrix spiny cells in a slice preparation preserving cortical inputs. J Neurophysiol, 62: 1052-1068.

80.

Jurányi Z, Zigmond MJ, Hársing LG Jr.(2003) [3H]Dopamine release in striatum in response to cortical stimulation in a corticostriatal slice preparation. J Neurosci Methods, 126: 57-67.

81.

Cubeddu LX, Hoffmann IS, Ferrari GB. (1979) Metabolism and efflux of [3H]dopamine in rat neostriatum: presynaptic origin of 3,4[3H]dihydroxyphenylacetic acid. J Pharmacol Exp Ther, 209: 165-175.

82.

Hunter AJ, Hatcher J, Virley D, Nelson P, Irving E, Hadingham SJ, Parsons AA. (2000) Functional assessments in mice and rats after focal stroke. Neuropharmacology, 39: 806-816.

83.

Garcia, JH, Wagner S, Liu KF, Hu XJ. (1995) Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Statistical validation. Stroke, 26: 627-635.

84.

Bland ST, Pillai RN, Aronowski J, Grotta JC, Schallert T. (2001) Early overuse and disuse of the affected forelimb after moderately severe intraluminal suture occlusion of the middle cerebral artery in rats. Behav Brain Res, 126: 33-41.

85.

Ding Y, Zhou Y, Lai Q, Li J, Park H, Diaz FG. (2002) Impaired motor activity and motor learning function in rat with middle cerebral artery occlusion. Behav Brain Res, 132: 29-36.

108

86.

Zausinger S, Lumenta DB, Pruneau D, Schmid-Elsaesser R, Plesnila N, Baethmann A. (2003) Therapeutical efficacy of a novel non-peptide bradykinin B2 receptor antagonist on brain edema formation and ischemic tissue damage in focal cerebral ischemia. Acta Neurochir, 86: 205-257.

87.

Mineur YS, Belzung C, Crusio WE. (2006) Effects of unpredictable chronic mild stress on anxiety and depression-like behavior in mice. Behav Brain Res, 175: 4350

88.

Hársing LG Jr, Gigler G, Albert M, Szénási G, Simó A, Móricz K, Varga A, Ling I, Bagdy E, Király I, Sólyom S, Jurányi Z. (2004) Neurotransmitter release in experimental stroke models: the role of glutamate-GABA interaction. Adv Exp Med Biol, 541: 21-37.

89.

Liu Y, Schubert D. (1997) Cytotoxic amyloid peptides inhibit cellular 3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction by enhancing MTT formazan exocytosis. J Neurochem, 69: 2285-2293.

90.

Mathews KS, McLaughlin DP, Ziabari LH, Toner CC, Street PC, Hisgrove E, Bezzina EL, Stamford JA. (2000) Rapid quantification of ischaemic injury and cerebroprotection in brain slices using densitometric assessment of 2,3,5triphenyltetrazolium chloride staining. J Neurosci Methods, 102: 43-51.

91.

Pulsinelli WA, Brierley JB, Plum F. (1982) Temporal profile of neuronal damage in a model of transient forebrain ischemia. Ann Neurol, 11: 491-498.

92.

Isayama K, Pitts LH, Nishimura MC. (1991) Evaluation of 2,3,5triphenyltetrazolium chloride staining to delineate rat brain infarcts. Stroke, 22: 1394-1398.

93.

Sbarbati A, Reggiani A, Lunati E, Arban R, Nicolato E, Marzola P, Asperio RM, Bernardi P, Osculati F. (2000) Regional cerebral blood volume mapping after ischemic lesions. Neuroimage, 12: 418-424.

94.

Benedek A, Móricz K, Jurányi Z, Gigler G, Lévay G, Hársing LG Jr, Mátyus P, Szénási G, Albert M. (2006) Use of TTC staining for the evaluation of tissue injury in the early phases of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats. Brain Res, 1116: 159-165.

95.

Anderson RE, Tan WK, Meyer FB. (1999) Brain acidosis, cerebral blood flow, capillary bed density, and mitochondrial function in the ischemic penumbra. J Stroke Cerebrovasc Dis, 8: 368-379.

96.

Li F, Irie K, Anwer MS, Fisher M. (1997) Delayed triphenyltetrazolium chloride staining remains useful for evaluating cerebral infarct volume in a rat stroke model. J Cereb Blood Flow Metab, 17: 1132-1135.

109

97.

Dettmers C, Hartmann A, Rommel T, Kramer S, Pappata S, Young A, Hartmann S, Zierz S, MacKenzie ET, Baron JC. (1994) Immersion and perfusion staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) compared to mitochondrial enzymes 6 hours after MCA-occlusion in primates. Neurol. Res, 16: 205-208.

98.

Hatfield RH, Mendelow AD, Perry RH, Alvarez LM, Modha P. (1991) Triphenyltetrazolium chloride (TTC) as a marker for ischemic changes in rat brain following permanent middle cerebral artery occlusion. Neuropathol Appl Neurobiol, 17: 61-67.

99.

Saita K, Chen M, Spratt NJ, Porritt MJ, Liberatore GT, Read SJ, Levi CR, Donnan GA, Ackermann U, Tochon-Danguy HJ, Sachinidis JI, Howells DW. (2004) Imaging the ischemic penumbra with 18F-fluoromisonidazole in a rat model of ischemic stroke. Stroke, 35: 975-980.

100. Okuno S, Nakase H, Sakaki T. (2001) Comparative study of 2,3,5triphenyltetrazolium chloride (TTC) and hematoxylin-eosin staining for quantification of early brain ischemic injury in cats. Neurol Res, 23: 657-661. 101. Taylor R, Luk YO, Chrn ST, Balentine JD, Hogan EL, Hsu CY, Charleston SC. (1987) Quantification of infarct area by triphenyltetrazolium chloride in rat stroke model. Neurology, 37: 82. 102. Cole DJ, Drummond JC, Ghazal EA, Shapiro HM. (1990) A reversible component of cerebral injury as identified by the histochemical stain 2,3,5triphenyltetrazolium chloride (TTC). Acta Neuropathol (Berl), 80: 152-155. 103. Park CK, Mendelow AD, Graham DI, McCulloch J, Teasdale GM. (1988) Correlation of triphenyltetrazolium chloride perfusion staining with conventional neurohistology in the detection of early brain ischemia. Neuropathol Appl Neurobiol, 14: 289-298. 104. Memezawa H, Smith ML, Siesjő BK. (1992) Penumbral tissues salvaged by reperfusion following middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke, 23: 552559. 105. Henninger KM, Sicard KF, Schmidt J, Bardutzky M Fisher. (2006) Comparison of Ischemic Lesion Evolution in Embolic Versus Mechanical Middle Cerebral Artery Occlusion in Sprague Dawley Rats Using Diffusion and Perfusion Imaging. Stroke, 37: 1283-1289. 106. Nabavi DG, Cenic A, Henderson S, Gelb AW, Lee TY. (2001) Perfusion mapping using computed tomography allows accurate prediction of cerebral infarction in experimental brain ischemia. Stroke, 32: 175-183. 107. Asiedu-Gyekye IJ, Vaktorovich A. (2003) The “no-reflow” phenomenon in cerebral circulation. Med Sci Monit, 9: 394-397.

110

108. Neumann-Haefelin T, Kastrup A, de Crespigny A, Yenari MA, Ringer T, Sun GH, Moseley ME. (2000) Serial MRI after transient focal cerebral ischemia in rats: dynamics of tissue injury, blood-brain barrier damage, and edema formation. Stroke, 31: 1965-1973. 109. Jovin TG, Yonas H, Gebel JM, Kanal E, Chang YF, Grahovac SZ, Goldstein S, Wechsler LR.(2003) The cortical ischemic core and not the consistently present penumbra is a determinant of clinical outcome in acute middle cerebral artery occlusion. Stroke, 34: 2426-2433. 110. Pantano P, Caramia F, Bozzao L, Dieler C, von Kummer R. (1999) Delayed increase in infarct volume after cerebral ischemia: correlations with thrombolytic treatment and clinical outcome. Stroke, 30: 502-507. 111. Siesjö BK. (1981) Cell damage in the brain: a speculative synthesis. J Cereb Blood Flow Metab, 1: 155-185. 112. Li F, Liu KF, Silva MD, Omae T, Sotak CH, Fenstermacher JD, Fisher M. (2000) Transient and permanent resolution of ischemic lesions on diffusion-perfusion imaging after brief periods of focal ischemia in rats: correlation with histology. Stroke, 31: 946-954. 113. Mabuchi T, Kitagawa K, Ohtsuki T, Kuwabara K, Yagita Y, Yanagihara T, Hori M, Matsumoto M, Chang D, del Zoppo DJ. (2000) Contribution of microglia/macrophages to expansion of infarction and response of oligodendrocytes after focal cerebral ischemia in rats. Stroke, 31: 1735-1743. 114. Weinstein PR, Hong S, Sharp FR. (2004) Molecular identification of the ischemic penumbra. Stroke, 35: 2666-2670. 115. Lisczak TM, Hedley-White ET, Adams JF, Han DH, Kolluri VS, Vacanti FX, Heros RC, Zervas NT. (1984) Limitations of tetrazolium salts in delineating infracted brain. Acta Neuropathol (Berl), 65: 150-157. 116. Rehncrona S, Mela L, Siesjő BK. (1979) Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke, 10: 437-446. 117. Solenski NJ, diPierro CG, Trimmer PA, Kwan A-J, Helms GA. (2002) Ultrastructural changes of neuronal mitochondria after transient and permanent cerebral ischemia. Stroke, 33: 816-824. 118. Garcia JH, Yoshida Y, Chen H, Li Y, Zhang ZG, Lian J, Chen S, Chopp M. (1993) Progression from ischemic injury to infarct following middle cerebral artery occlusion in the rat. Am J Pathol, 142: 623-635. 119. Swanson RA, Ying W, Kauppinen TM. (2004) Astrocyte influences on ischemic neuronal death. Curr Mol Med, 4: 193-205.

111

120. Zoli M, Grimaldi R, Ferrari R, Zini I, Agnati LF. (1997) Short- and long-term changes in striatal neurons and astroglia after transient forebrain ischemia in rats. Stroke, 28: 1049-1058. 121. Anderson MF, Blomstrand F, Blomstrand C, Eriksson PS, Nilsson M. (2003) Astrocytes and stroke: networking for survival? Neurochem Res, 28: 293-305. 122. Hertz L, Zielke HR. (2004) Astrocytic control of glutamatergic activity: astrocytes as stars of the show. Trends Neurosci, 27: 735-743. 123. Rossi DJ, Brady JD, Mohr C. (2007) Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia. Nat Neurosci, 10: 1377-1386. 124. Muyderman H, Wadey AL, Nilsson M, Sims NR. (2007) Mitochondrial glutathione protects against cell death induced by oxidative and nitrative stress in astrocytes. J Neurochem, 102: 1369-1382. 125. Huh Y, Jung JW, Park C, Ryu JR, Shin CY, Kim WK, Ryu JH. (2003) Microglial activation and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the substantia nigral region following transient focal ischemia in rats. Neurosci Lett, 349: 63-67. 126. Morioka T, Kalehua AN, Streit WJ. (1993) Characterization of microglial reaction after middle cerebral artery occlusion in rat brain. J Comp Neurol, 327: 123-132. 127. Dénes A, Vidyasagar R, Feng J, Narvainen J, McColl BW, Kauppinen RA, Allan SM. (2007) Proliferating resident microglia after focal cerebral ischaemia in mice. J Cereb Blood Flow Metab, 27: 1941-1953. 128. Vannucchi MG, Bizzoco E, Corsani L, Gianfriddo M, Pedata F, FaussonePellegrini MS. (2007) Relationships between neurons expressing neuronal nitric oxide synthase, degree of microglia activation and animal survival. A study in the rat cortex after transient ischemia. Brain Res, 1132: 218-227. 129. Mandai K, Matsumoto M, Kitagawa K, Matsushita K, Ohtsuki T, Mabuchi T, Colman DR, Kamada T, Yanagihara T. (1997) Ischemic damage and subsequent proliferation of oligodendrocytes in focal cerebral ischemia. Neuroscience, 77: 849–861. 130. Duckworth EAM, Butler TL, De Mesqiuta D, Collier SN, Collier L, Pennypacker KR. (2005) Temporary focal ischemia in the mouse: Technical aspects and patterns of Fluoro-Jade evident neurodegenaration. Brain Res, 1042: 29-36. 131. Gonzales C, Lin RC, Chesselet MF. (1992) Relative sparing of GABAergic interneurons in the striatum of gerbils with ischemia-induced lesions. Neurosci Lett, 135: 53-58.

112

132. Schwartz-Bloom RD, Sah R. (2001) Gamma-Aminobutyric neurotransmission and cerebral ischemia. J Neurochem, 77: 353-371.

acid(A)

133. Calabresi P, Centonze D, Bernardi G. (2000) Cellular factors controlling neuronal vulnerability in the brain: a lesson from the striatum. Neurology, 55: 1249-1255. 134. Neumann-Haefelin T, Witte OW. (2000) Periinfarct and remote excitability changes after transient middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab, 20: 45-52. 135. Goto S, Yamada K, Inoue N, Nagahiro S, Ushio Y. (1994) Increased expression of growth-associated protein GAP-43/B-50 following cerebral hemitransection or striatal ischemic injury in the substantia nigra of adult rats. Brain Res, 647: 333339. 136. Nakanishi H, Tamura A, Kawai K, Yamamoto K. (1997) Electrophysiological studies of rat substantia nigra neurons in an in vitro slice preparation after middle cerebral artery occlusion. Neuroscience, 77: 1021-1028. 137. Yamada K, Goto S, Yoshikawa M, Ushio Y. (1996) Gabaergic transmission and tyrosine hydroxylase expression in the nigral dopaminergic neurons: an in vivo study using a reversible ischemia model of rats. Neuroscience, 73: 783-789. 138. Soriano MA, Justicia C, Ferrer I, Rodríguez-Farré E, Planas AM. (1997) Striatal infarction in the rat causes a transient reduction of tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the ipsilateral substantia nigra. Neurobiol Dis, 4: 376-385. 139. Spatz M, Yasuma Y, Strasser A, Kawai N, Stanimirovic D, McCarron R. (1995) Modulation of striatal dopamine release in cerebral ischemia by L-arginine. Neurochem Res, 20: 491-496. 140. Nelson EL, Liang CL, Sinton CM, German DC. (1996) Midbrain dopaminergic neurons in the mouse: computer-assisted mapping. J Comp Neurol, 369: 361-371. 141. Maginn M, Kelly JP, Leonard BE. (1997) Protective effects of vanoxeamine (GBR 12909) against ischaemia-induced hyperactivity and neurodegeneration in the gerbil model of cerebral ischaemia. Pharmacol Biochem Behav, 56: 727-735. 142. Callaway JK, Lawrence AJ, Jarrott B. (2003) AM-36, a novel neuroprotective agent, profoundly reduces reactive oxygen species formation and dopamine release in the striatum of conscious rats after endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion. Neuropharmacology, 44: 787-800. 143. Wang J, Yang X, Camporesi CV, Yang Z, Bosco G, Chen C, Camporesi EM. (2002) Propofol reduces infarct size and striatal dopamine accumulation following transient middle cerebral artery occlusion: a microdialysis study. Eur J Pharmacol, 452: 303-308.

113

144. Suzuki T, Akaike N, Ueno K, Tanaka Y, Himori N. (1995) MAO inhibitors, clorgyline and lazabemide, prevent hydroxyl radical generation caused by brain ischemia/reperfusion in mice. Pharmacology, 50: 357-362. 145. Yang ZJ, Camporesi C, Yang X, Wang J, Bosco G, Lok J, Gorji R, Schelper RL, Camporesi EM. (2002) Hyperbaric oxygenation mitigates focal cerebral injury and reduces striatal dopamine release in a rat model of transient middle cerebral artery occlusion. Eur J Appl Physiol, 87: 101-107. 146. Adachi N, Terao K, Otsuka R, Arai T. (2002) Histaminergic H(2) blockade facilitates ischemic release of dopamine in gerbil striatum. Brain Res, 926: 172175. 147. Eilien G, Maloteaux JM, Geurts M, Hoogenberg K, Cragg S. (1999) Dopamine receptors--physiological understanding to therapeutic intervention potential. Pharmacol Ther, 84: 133-156. 148. Reinecke S, Lutzenburg M, Hagemann G, Bruehl C, Neumann-Haefelin T, Witte OW. (1999) Electrophysiological transcortical diaschisis after middle cerebral artery occlusion (MCAO) in rats. Neurosci Lett, 261: 85-88. 149. Snyder GL, Keller RW Jr, Zigmond MJ. (1990) Dopamine efflux from striatal slices after intracerebral 6-hydroxydopamine: evidence for compensatory hyperactivity of residual terminals. Pharmacol Exp Ther, 253: 867-876. 150. Decombe R, Bentué-Ferrer D, Allain H, van den Driessche J. (1993) Alteration of aminergic neurotransmitter release after two consecutive transient global ischaemias: an in vivo microdialysis study in rat. Neurol Res, 15: 192-197. 151. Akiyama Y, Ito A, Koshimura K, Ohue T, Yamagata S, Miwa S, Kikuchi H. (1991) Effects of transient forebrain ischemia and reperfusion on function of dopaminergic neurons and dopamine reuptake in vivo in rat striatum. Brain Res, 561: 120-127. 152. Ferré S, Fuxe K. (1992) Dopamine denervation leads to an increase in the intramembrane interaction between adenosine A2 and dopamine D2 receptors in the neostriatum. Brain Res, 594: 124-130. 153. Komatsumoto S, Greenberg JH, Hickey WF, Reivich M. (1995) Clinicopathological observations in middle cerebral artery occlusion in the cat. Neurol Res, 17: 120-128. 154. Hillered L, Kotwica Z, Ungerstedt U. (1991) Interstitial and cerebrospinal fluid levels of energy-related metabolites after middle cerebral artery occlusion in rats. Res Exp Med (Berl), 191: 219-225.

114

155. Dittmar MS, Fehm NP, Vatankhah B, Bogdahn U, Schlachetzki F. (2005) Adverse effects of the intraluminal filament model of middle cerebral artery occlusion. Stroke, 36: 530-532. 156. Kawamata T, Alexis NE, Dietrich WD, Finklestein SP. (1996) Intracisternal basic fibroblast growth factor (bFGF) enhances behavioral recovery following focal cerebral infarction in the rat. J Cereb Blood Flow Metab, 16: 542-547. 157. Mokudai T, Ayoub IA, Sakakibara Y, Lee EJ, Ogilvy CS, Maynard KI. (2000) Delayed treatment with nicotinamide (Vitamin B(3)) improves neurological outcome and reduces infarct volume after transient focal cerebral ischemia in Wistar rats. Stroke, 31: 1679-1685. 158. Quartermain D, Li Y, Jonas S. (2000) Enoxaparin, a low molecular weight heparin decreases infarct size and improves sensorimotor function in a rat model of focal cerebral ischemia. Neurosci Lett, 288: 155-158. 159. Schmid-Elsaesser R, Zausinger S, Hungerhuber E, Baethmann A, Reulen HJ. (1998) A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry. Stroke, 29: 2162-2170. 160. Nedelmann M, Wilhelm-Schwenkmezger T, Alessandri B, Heimann A, Schneider F, Eicke BM, Dieterich M, Kempski O. (2007) Cerebral embolic ischemia in rats: correlation of stroke severity and functional deficit as important outcome parameter. Brain Res, 1130: 188-196. 161. Jaspers, R. M. A., Block, F., Heim, C., Sontag, K.-H. (1990) Spatial learning is affected by transient occlusion of common carotid arteries (2VO): Comparison of behavioural and histopathological changes after ‘2VO’ and ‘four-vessel-occlusion’ in rats. Neurosci Lett, 117: 149-153. 162. Squire LR, Zola SM. (1996) Ischemic brain damage and memory impairment: A commentary. Stroke, 24: 1601-1602. 163. Yonemori F, Yamaguchi T, Yamada H, Tamura A. (1999) Spatial cognitive performance after chronic focal cerebral ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab, 19: 483-494. 164. Melani A, Pantoni L, Corsi C, Bianchi L, Monopoli A, Bertorelli R, Pepeu G, Pedata F. (1999) Striatal outflow of adenosine, excitatory amino acids, gammaaminobutyric acid, and taurine in awake freely moving rats after middle cerebral artery occlusion: correlations with neurological deficit and histopathological damage. Stroke, 30: 2448- 2455. 165. Warlow C. (2003) Stroke. Lancet, 362: 1211-1224.

115

166. Sutherland GR, Dix GA, Auer RN. (1996) Effect of age in rodent models of focal and forebrain ischemia. Stroke, 27: 1663-1668. 167. Yager JY, Wright S, Armstrong EA, Jahraus CM, Saucier DM. (2006) The influence of aging on recovery following ischemic brain damage. Behav Brain Res, 173: 171-180. 168. Yonemori F, Yamaguchi T, Yamada H, Tamura A. (1998) Evaluation of a motor deficit after chronic focal cerebral ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab, 18: 1099-1106. 169. Grabowski M, Brundin P, Johansson BB. (1993) Paw-reaching, sensorimotor, and rotational behavior after brain infarction in rats. Stroke, 24: 889-895. 170. Seitz RJ, Meisel S, Weller P, Junghans U, Wittsack HJ, Siebler M. (2005) Initial ischemic event: perfusion-weighted MR imaging and apparent diffusion coefficient for stroke evolution. Radiology, 237: 1020-1028. 171. Mariucci G, Tantucci M, Giuditta A, Ambrosini MV. (2007) Permanent brain ischemia induces marked increments in hsp72 expression and local protein synthesis in synapses of the ischemic hemisphere. Neurosci Lett, 415: 77-80. 172. Markgraf CG, Green EJ, Watson B, McCabe PM, Schneiderman N, Dietrich WD, Ginsberg MD. (1994) Recovery of sensorimotor function after distal middle cerebral artery photothrombotic occlusion in rats. Stroke, 25: 153-159. 173. Williams AJ, Tortella FC, Lu XM, Moreton JE, Hartings JA. (2004) Antiepileptic drug treatment of nonconvulsive seizures induced by experimental focal brain ischemia. J Pharmacol Exp Ther, 311: 220-227.

116

Saját közlemények jegyzéke Az értekezés témaköréhez kapcsolódó közlemények 1.

Benedek A, Móricz K, Jurányi Z, Gigler G, Lévay G, Hársing LG Jr, Mátyus P, Szénási G, Albert M. (2006) Use of TTC staining for the evaluation of tissue injury in the early phases of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats. Brain Res, 1116: 159-165. IF: 2,341

2.

Matucz E, Móricz K, Gigler G, Benedek A, Barkóczy J, Lévay G, Hársing LG Jr, Szénási G. (2006) Therapeutic time window of neuroprotection by noncompetitive AMPA antagonists in transient and permanent focal cerebral ischemia in rats. Brain Res, 1123: 60-67. IF: 2,341

3.

Gigler G, Móricz K, Ágoston M, Simó A, Albert M, Benedek A, Kapus G, Kertész S, Végh M, Barkóczy J, Markó B, Szabó G, Matucz E, Gacsályi I, Lévay G, Hársing LG Jr, Szénási G. (2007) Neuroprotective and anticonvulsant effects of EGIS-8332, a non-competitive AMPA receptor antagonist, in a range of animal models. Br J Pharmacol, 152: 151-160. IF: 3,825

Az értekezés témaköréhez kapcsolódó egyéb publikációk 1.

Benedek A, Móricz K, Gigler G, Hársing LG Jr, Szénási G, Mátyus P, Albert M. Fokális, ischaemiás-reperfúziós károsodás progressziójának szövettani vizsgálata patkányban. Semmelweis Egyetem PhD-napok, Budapest, 2004. (poszter)

2.

Benedek A. Analysis of the progression of focal cerebral damage induced by ischemia and reperfusion in rats. XXIV. Advanced Course of Medicinal Chemistry and “E. Duranti” Seminar for PhD students, Urbino, Italy, 2004. (poszter)

3.

Benedek A, Móricz K, Albert M, Gigler G, Hársing LG Jr, Szénási G, Mátyus P. Morphological and functional investigation of TTC-stained brain tissue in the early phase of reperfusion after transient focal cerebral ischaemia in rats. Giornate Dottorato, Mini-symposium organized by University of Milan and Semmelweis University, Milano, Italy, 2004. (előadás).

4.

Benedek A, Móricz K, Jurányi Z, Albert M, Gigler G, Hársing LG Jr, Mátyus P, Szénási G. Evaluation of early brain damage by TTC staining and histology after transient focal cerebral ischaemia in rats. 14th European Stroke Conference, Bologna, Italy, 2005. (poszter) Cerebrovasc Dis, (2005) 19: 116.

5.

Benedek A, Móricz K, Jurányi Z, Albert M, Gigler G, Hársing LG Jr, Mátyus P, Szénási G.A korai ischaemiás-reperfúziós agyi károsodás értékelése TTC festéssel

117

és szövettani módszerekkel. Magyar Élettani Társaság LXIX. Vándorgyűlése, Budapest, 2005. (poszter és előadás) - poszterkategória nyertes 6.

Benedek A, Móricz K, Hevesi Tóth B, Gigler G, Hársing LG Jr, Kéry Á, Szénási G. Antioxidant and neuroprotective effects of Epilobium parviflorum Schreb, Small Flowered Willow herb extract. Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság, Magyar Experimentális Farmakológia Tavaszi Szimpóziuma, Budapest, 2005. (poszter)

7.

Benedek A, Móricz K, Jurányi Z, Albert M, Gigler G, Hársing LG Jr, Mátyus P, Szénási G. Alkalmas-e a TTC festés a korai ischaemiás-reperfúziós agyi károsodás jellemzésére? Magyar Stroke Társaság és Neuroszonológiai Társaság VII. Konferenciája, Eger, 2005.- poszter kategória II. díj. Agyérbetegségek, (2005) 11: 10 (poszter és előadás)

8.

Benedek A, Nagy K, Móricz K, Gigler G, Szénási G, Mátyus P, Hársing LG Jr, Jurányi Z. [3H]Dopamine release in corticostriatal slices after transient cerebral ischemia in rats. International Brain Research Organisation Workshop - Magyar Idegtudományi Társaság XII. Konferenciája, Budapest, 2006. (poszter) Ideggyógy Sz, (2006) 59: 11.

9.

Gigler G, Móricz K, Albert M, Matucz E, Ágoston M, Simó A, Benedek A, Barkóczy J, Hársing LG Jr, Szénási G. Neuroprotective efficacy of EGIS-8332, a non-competitive AMPA antagonist in transient focal cerebral ischemia and multiple sclerosis tests in rats. Budapest Spring Neuropathology Conference, Budapest, 2004. (poszter)

10.

Móricz K, Gigler G, Albert M, Matucz E, Ágoston M, Simó A, Benedek A, Barkóczy J, Hársing LG Jr, Lévay G, Szénási G. Effects of EGIS-8332, an AMPA antagonist, in transient focal cerebral ischemia and multiple sclerosis in rats. 7th International Congress of Neuroimmunology, Venice, Italy, 2004. (poszter) J Neuroimmunol, (2004) 154: 86.

11.

Móricz K, Gigler G, Albert M, Benedek A, Ágoston M, Matucz E, Lévay G, Hársing LG, Szénási G. Az EGIS-8332, egy nem-kompetetív AMPA antagonista neuroprotektív hatása fokális agyi ischaemia és sclerosis multiplex modellben, patkányon. Magyar Idegtudományi Társaság XI. Konferenciája, Pécs, 2005. (poszter) Ideggy Szemle, (2005) 58: 68.

12.

Móricz K, Gigler G, Matucz E, Ágoston M, Benedek A, Lévay G, Hársing LG Jr, Szénási G. EGIS-8332: A terápiás ablak meghatározása patkányokon végzett permanens és tranziens fokális agyi ischaemia teszten. Magyar Stroke Társaság és Neuroszonológiai Társaság VII. Konferenciája, Eger, 2005. (poszter) Agyérbetegségek, (2005)11: 21 (poszter)

13.

Barkóczy J, Ling I, Simig G, Gigler G, Simó A, Benedek A, Móricz K, Ágoston M, Végh M, Kapus G, Kertész S, Lévay G, Hársing LG Jr, Szénási G. Neuroprotective effect of EGIS-11229, a 2,3-benzodiazepine type AMPA

118

antagonist. 230th American Chemical Society Meeting, Washington DC, USA, 2005. (poszter) 14.

Hársing LG Jr, Benedek A, Albert M, Jurányi Z. Release of [3H]dopamine in corticostriatal slices after transient middle cerebral artery occlusion in rats. Annual Meeting of the Society for Neuroscience, Washington, USA, 2006. (poszter)

15.

Szénási G, Benedek A, Nagy K, Móricz K, Albert M, Gigler G, Hársing LG, Jr., Jurányi Z. Survival of dopaminergic nerve terminals in the cortex and striatum after transient cerebral ischaemia followed by 24 hours of reperfusion in rats. 7th World Congress of Neuroscience, IBRO, Melbourne, Australia, 2007 (poszter)

Az értekezés témaköréhez közvetlenül nem kapcsolódó közlemény 1.

Kovács GG, Andó RD, Ádori C, Kirilly E, Benedek A, Palkovits M, Bagdy G. (2007) Single dose of MDMA causes extensive decrement of serotoninergic fibre density without blockage of the fast axonal transport in Dark Agouti rat brain and spinal cord. Neuropathol Appl Neurobiol, 33: 193-203. IF: 2,681

Az értekezés témaköréhez közvetlenül nem kapcsolódó egyéb publikációk 1.

Baranyi M, Milusheva E, Benedek A, Sperlágh B, Vizi ES. Change of different neurotransmitter concentrations in rat hippocampus tissue slices in an oxidative stress model. Magyar Idegtudományi Társaság VIII. Konferenciája, Debrecen, 2002. (poszter)

2.

Szénási G, Gigler G, Móricz K, Végh M, Wellmann J, Benedek A, Ágoston M, Simó A, Kapus G, Kertész S, Lévay G, Ling I, Barkóczy J, Simig G, Hársing LG Jr. Neuroprotective effects of EGIS-11229, a new 2,3-benzodiazepine type AMPA antagonist Magyar Stroke Társaság és Neuroszonológiai Társaság VII. Konferenciája, Eger, 2005. (poszter) Agyérbetegségek, (2005) 11: 28.

3.

Szénási G, Gigler G, Móricz K, Végh M, Benedek A, Ágoston M, Simó A, Kapus G, Kertész S, Lévay G, Ling I, Barkóczy J, Simig G, Hársing LG Jr. Neuroprotective effects of EGIS-11229 a novel AMPA receptor antagonist with improved metabolic stability. 18th European Neuropsychopharmacology Congress, Amsterdam, The Netherlands, 2005. (poszter) Eur Neuropsychopharmacol, (2005) 15: 642.

119

Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom Mátyus Péter professzor úrnak, aki figyelemmel kísérte tanulmányaimat, és felajánlotta számomra az EGIS Gyógyszergyár NyRt. és a Szerves Vegytani Intézet közötti együttműködésben való részvétel lehetőségét. Köszönöm Dr. Hársing László Gábor igazgató-helyettes úrnak, aki hozzájárult ahhoz, hogy az együttműködés keretében doktori tanulmányokat végezhessek a Preklinikai Kutatási Főosztályon és nagymértékben ösztönözte doktori munkámat. Szeretném megköszönni gyógyszergyári konzulensemnek, Dr. Szénási Gábornak, hogy az osztályán zavartalan körülmények között végezhettem munkámat. Elhivatottsága és a gyógyszerkutatásban szerzett szerteágazó tapasztalata hozzájárult ahhoz, hogy gyógyszer-fejlesztéssel foglalkozzam; és lelkesedése segített abban, hogy a munkám során fellépő kisebb nehézségeken mielőbb túllépjek. A közös munka során mindvégig igyekezett lehetőséget biztosítani arra, hogy saját elképzeléseimet valóra válthassam. Köszönettel tartozom továbbá Gigler Gábornak és Dr. Móricz Krisztinának, akik önzetlenül segítettek abban, hogy az elméleti síkon megalkotott tervek a gyakorlatban is kivitelezésre kerülhessenek. Köszönet illeti továbbá, Dr. Jurányi Zsoltot, Dr. Kovács Anikót, Dr. Gacsályi Istvánt és Dr. Albert Mihályt, akik az általuk vezetett kutatólaboratóriumokban zajló munkába mélyreható betekintést engedtek és eképpen fejleszthessem tudásomat. Köszönöm az EGIS Gyógyszergyár Nyrt. Preklinikai Kutatátási Főosztály valamennyi dolgozójának minden segítségét és támogatását. Végül, ebben a néhány sorban is szeretném megköszönni Szüleimnek és Férjemnek őszinte támogatásukat, valamint azt, hogy végigkísértek az idáig vezető úton és nyugodt családi környezetet biztosítottak.

120