Az IPD3 gén genetikai térképezése és szerepének vizsgálata a szimbiotikus kapcsolatok kialakításában Medicago truncatula-ban Doktori értekezés tézisei
Horváth Beatrix
Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar Biológia Doktori Iskola A Doktori Iskola vezetője: Prof. Dr. Erdei Anna, MTA rendes tagja Klasszikus és Molekuláris Genetika Doktori Program A Doktori program vezetője: Prof. Dr. Orosz László, MTA rendes tagja Témavezető: Dr. Kaló Péter, PhD. tudományos főmunkatárs
Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, Gödöllő
2013
Bevezetés A pillangósvirágú (Fabaceae) növények családjának tagjai az egyik legfontosabb termesztett növények közé tartoznak. Jelentős fehérje, keményítő és olajforrásként szolgálnak az emberi táplálkozásban és az állatok takarmányozásában egyaránt. Előnyös tulajdonságuk, hogy képesek szimbiotikus kapcsolatok kialakítására a talajban élő mikroorganizmusokkal, amely által kedvezőtlen körülmények mellett is megfelelő mennyiségű nitrogénhez, foszforhoz, vízhez és mikroelemekhez jutnak. A legalaposabban tanulmányozott folyamatok a szimbiotikus nitrogénkötő kapcsolat és az arbuszkuláris mikorrhiza gombával kialakított szimbiotikus kölcsönhatás. Vizsgálatukat két modellnövény, a Medicago truncatula, valamint Lotus japonicus genetikai és genomikai eszköztárának kifejlesztése teszi lehetővé (1). A biológiai nitrogénkötés leghatékonyabb formája az endoszimbiózis, amelynek során a gazdanövény gyökerén egy speciális új szerv, az úgynevezett szimbiotikus gümő fejlődik. A gyökér gümőben zajlik a baktériumok által végzett nitrogén redukció és a megkötött nitrogén asszimilációja. A szimbiotikus gümőket morfológiájuk alapján két típusra lehet elkülöníteni. A melegebb éghajlati öveken élő pillangósvirágúakra (pl. Lotus japonicus, szójabab) jellemző determinált gümőben a sejtosztódás a gümő organogenezise során egy korai állapotban leáll, ezért ezek nem tartalmaznak merisztémát. A mérsékeltégövi pillangósokra jellemző (pl. Medicago truncatula, lucerna, borsó) indeterminált gümőben a merisztematikus sejtek megmaradnak, és folyamatos osztódással hozzák létre a gümő újabb sejtjeit. Az indeterminált gümő sejtjei fejlődési programjuk során a gümő egyes differenciálódási zónáin haladnak keresztül (2). A szimbiotikus nitrogénkötő kapcsolat a két partner közötti többszörös jelcserét követően jön létre, valamint a szimbiotikus kölcsönhatás során a rhizobium és a növény folyamatos kommunikációja zajlik (3). A növény gazda specifikus flavon és izoflavon vegyületeket bocsát ki a rizoszférába, amelyek indukálják a rhizobiumokban a nodulációs faktorok (NF, Nod faktor) termelését (4). A NF-t a növény gyökérszőr sejtjeinek plazmamembránján lévő NF receptorok érzékelik, amelyek M. truncatulaban az NFP és a LYK3, L. japonicusban pedig az NFR1 és NFR5 fehérjék. A NF kötődése a növényi receptorokhoz egy jelátviteli útvonalat (Nod faktor szignál útvonal) indít el a növényben (5), aminek eredményeként elkezdődik a gümőkezdemény kialakulása és a különböző gümő specifikus gének expressziója, illetve ezekkel párhuzamosan beindul a fertőzési folyamat. A szignálút több eleme is nélkülözhetetlen a mikorrhiza szimbiotikus kapcsolat kialakulásában (6). A szimbiotikus szignál útvonal egyik kulcsszereplője a CCaMK (DMI3) fehérje, amelynek feltehetően a NF kötődése által kiváltott kalcium oszcillációs jel dekódolásában van szerepe. Korábbi kísérletek során a CCaMK fehérje interakciós partnereként azonosítottak egy IPD3-nak elnevezett fehérjét (7), amelynek funkciójáról eddig kevés információ állt rendelkezésünkre. 2
A szignálútvonal elemeinek felderítésére gyakran alkalmazott megközelítés a klasszikus genetikai analízis, amelynek során egy mutáns fenotípust okozó genetikai hibát azonosítanak. Ezzel a módszerrel, a nitrogénkötő kapcsolatban hibát szenvedett mutáns növények vizsgálatával eddig mintegy 30 szimbiotikus növényi gént azonosítottak, amelyek segítségével sikerült feltérképezni a rhizobium által elindított NF szignálútvonal elemeit, valamint a fertőzési és gümőképződési folyamatokban szerepet játszó gének közül számosat (8).
Célkitűzés Munkánk során célul tűztük ki Medicago truncatula - Sinorhizobium meliloti modellrendszerben azoknak a szimbiotikus nitrogénkötés folyamatában szerepet játszó növényi géneknek azonosítását, amelyeknek szerepük van a gümősejtek baktériumok általi inváziójában, a rhizobiumok differenciálódásában, a szimbiotikus gümő fejlődésében és a hatékony nitrogénkötésben. A gének azonosítását a folyamatban hibát szenvedett M. truncatula mutáns vonalak gümő morfológiai és genetikai vizsgálatával, a mutáció genetikai térképezésével végezzük. Előzetesen nyolc gümőt képző, de hatékony nitrogénkötésre nem képes (Fix -) mutáns növény gümő fenotípusainak elemzését végeztük el, amelyből doktori értekezésemben a gümőképződés egy igen korai fázisában bekövetkezett meghibásodást mutató ipd3-1 vonal eredményeit mutatom be. A vizsgálatok során a következő feladatokat terveztük elvégezni: 1.
Az ipd3-1 mutáns vonal szimbiotikus nitrogénkötő fenotípusának jellemzése mikroszkópos vizsgálatokkal, amely segítségével megállapíthatjuk, hogy a szimbiotikus gümő kialakulásának mely szakaszában történt meghibásodás.
2.
Az ipd3-1 vonalban a mutációt szenvedett gén azonosítása térképzésen alapuló klónozással.
3.
Annak bizonyítására, hogy valóban a mutáns fenotípusért felelős gént izoláltuk, komplementációs tesztet végzünk.
4.
Az IPD3 gén funkciójának vizsgálata, amely által megállapíthatjuk a szimbiotikus folyamatokban betöltött szerepét.
Anyagok és módszerek Növényi anyagok Kísérleteinkhez a Medicago truncatula ssp. truncatula (Jemalong genotípus, A20 genotípus) és Medicago truncatula ssp tricycla (R108 genotípus) vad típusú növényeket használtuk. Az ipd3-1 mutáns vonalat a John Innes Centre, Norwich UK intézetben állították elő M. truncatula Jemalong genotípusú növényből a genomban random módon deléciót eredményező gyors neutron besugárzással, az ipd3-2 vonalat pedig Tnt1 inszerciós mutagenezissel a Noble 3
Foundation (Ardmore OK, USA) kutatóintézetben hozták létre. Az IPD3 gén genetikai térképezéshez használt F2 szegregáló populációt ipd3-1 és A20 vad típusú M. truncatula vonalak keresztezéséből származó F1 hibridnemzedék önbeporzásából állítottuk elő. A mutáció öröklődésének vizsgálatához visszakeresztezett (BC) populációt állítottunk elő az ipd3-1 mutáns és Jemalong növények keresztezésével. A növények nevelése hosszúnappalos fényperiódussal (16 óra nappal 24ºC/8 óra éjszaka, 20ºC) SANYO MLR-350 típusú növénynevelő kamrákban történt, fertőzésüket a kísérletektől függően különböző rhizobium baktérium törzsekkel végeztük. ipd3-1 és -2 vonal gümő fenotípusának mikroszkópos jellemzése A gümők fejlődését és a bakteriális fertőzés folyamatának nyomon követését, valamint a gümő felépítésének vizsgálatát S. meliloti 1021 hemA::LacZ (pXLGD4) markergént konstitutívan expresszáló baktérium törzzsel végeztük el (9). A gümőkből 70 µm vastag metszeteket készítettünk, ezután a baktériumok megjelenítését a minták X-Gal szubsztrát tartalmú festőoldattal történő kezeléssel végeztük és Olympus BX41M típusú fénymikroszkópon vizsgáltuk. A baktérium megjelenítését a gümő egyes zónáiban Olympus Fluoview FV1000 típusú konfokális lézer scanning mikroszkópon is elvégeztük a metszetek nukleinsavhoz kötődő zölden fluoreszkáló SYTO13 festést követően (10). IPD3 gén mutációjának azonosítása térképezésen alapuló génizolálással Az F2 térképező populáció egyedeinek szimbiotikus fenotípusát B1 rhizobium törzzsel történő fertőzést követő harmadik héten értékeltük ki. Az egyedek genotípusainak meghatározásához szükséges totál növényi DNS-t ZenoGene DNS tisztító kittel vontuk ki egy darab M. truncatula frissen szedett összetett levélből. Az IPD3 lókusz durva térképhelyének megállapítása érdekében az F2 egyedek genotípusait mikroszatellit markerekkel határoztuk meg. A finomtérképezéshez és kromoszómasétához a régióban azonosított BAC klónok kódoló szekvenciára tervezett intron targeting markereket használtunk. A genotípus adatokat színtérképbe (11) rendeztük és értékeltük ki. Hosszpolimorfizmusok kimutatására agaróz gélelektroforézist és SSCP-t használtunk. A mutáns fenotípus kialakítását okozó hét jelölt gén szekvencia analíziséhez a géneket a Primer Premier 5.5. programmal exonokra tervezett PCR primerpárokkal fedtük le. A mutáció azonosítása a mutáns és vad típusú növényekből származó cDNS templát között fragmenthossz különbséget mutató primerpárral kapott fragment mutáns allélból való szekvenálásával határoztuk meg.
4
Komplementációs teszt Az IPD3 mutáns allélek komplementációját Agrobacterium rhizogenes által közvetített szőrös gyökér (hairy root) transzformációs rendszerben végeztük (12). A komplementációs konstrukciókat Gateway klónozó technológiával hoztuk létre (Invitrogene), amelyek a következők
voltak:
pK7WG2D-üres
vektor,
35S::IPD3cDNS-3’UTR-pK7WG2D,
pIPD3::IPD3cDNS-3’UTR-pK7WG2D. A komplementációs tesztet elvégeztük a L. japonicus IPD3 ortológ CYCLOPS génnel is, mely konstrukciót (pCYCLOPS::CYCLOPS-pCAMBIA 1301) M. Hayashi (Osaka University, Japan) bocsátotta rendelkezésünkre (13). A három hetes transzformált növényeket S. meliloti 1021 pXLGD4 (hemA::LacZ) és S. meliloti CSB357 (nifH::uidA) törzzsel fertőztük. A fertőzés után öt héttel a transzformáns gyökereket a vektorokon lévő GFP és dsRED markergének segítségével Olympus SZX12 típusú fluoreszcens sztereo mikroszkópon azonosítottuk, majd megvizsgáltuk a transzformáns gyökereken képződött gümők fenotípusát, valamint a gümők struktúráját is metszeteik X-Gal, illetve GUS festését követően. Spontángümőzési teszt Az IPD3 gén NF szignálútban való helyének megállapítása érdekében végeztük el a spontángümőzési tesztet a fent már említett A. rhizogenes transzfomációs rendszerben. A DMI3 gén kalcium és kalmodulin kötő doménjének deléciója egy funkciónyeréses, folyamatosan aktív kinázt eredményez, amely rhizobium baktérium jelenléte nélkül nitrogénmentes tápközegben spontán gümő kialakulását eredményezi. A CCaMK csonkolt változata csupán a kináz domént tartalmazza (CCaMK 1-311) (14). A DMI3 1-311*-pKGW-R transzformációs klónt Erik Limpens (Wageningen University) bocsátotta rendelkezésünkre (15). A gümők struktúrájának elemzését toluidinkék-festést követően végeztük el. Génexpressziós vizsgálatok A génexpressziós vizsgálatokhoz szükséges totál RNS-t növényi gyökerekből izoláltuk, a cDNS szintézisét pedig 1 µg totál RNS kivonatból Superscript III Reverse Transcriptase Kit-tel (Invitrogen) oligo dT primerekkel hajtottuk végre. A kvantitatív real-time PCR-ben a DNS szintézis folyamatát SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich) és Maxima SYBR Green Master Mix (Fermentas) kittek segítségével vizsgáltuk. A reakciókat 40x higított cDNS templáton 100 nM végkoncentrációban használt Primer premier 5.5 programmal tervezett gén specifikus primerekkel végeztük. A szemikvantitatív PCR-t a fent leírt módon szintetizált cDNS mintákon 400 nM végkoncentrációban használt génspecifikus primerekkel végeztük. Ezen vizsgálatokhoz az öt napig nevelt növényeket S. meliloti 1021 baktérium törzzsel fertőztük. Nod faktor indukálta génexpressziós vizsgálatok esetében pedig az öt napig növekedett növényeket 10 5
nM végkoncentrációban Nod faktort tartalmazó BNM tápoldattal kezeltük szobahőmérsékleten 16 órán át. ENOD11 korai nodulációs gén kifejeződésének vizsgálatát M. truncatula egész gyökerein GUS hisztokémiai festéssel is elvégeztük. Vad típusú pMtENOD11::GUS konstrukciót tartalmazó növényeket (16) ipd3-1 vonallal kereszteztük, majd kiválogattuk azon F2 egyedeket, amelyek hordozták a pMtENOD11::GUS riportergén konstrukciót és az ipd3-1 mutációt. A növényeket 1 nM Nod faktort tartalmazó folyékony BNM tápoldatban kezeltük 7 nappal a kiültetést követően 24 órán át sötétben. Ezután a gyökereket GUS festőoldattal festettük egy éjszakán át és Olympus SZX12 sztereo mikroszkópon értékeltük ki.
Eredmények A John Innes Centre (Norwich, UK) kutatóintézetben gyors neutron besugárzással mutagenizált Medicago truncatula Jemalong genotípusú növények között szimbiotikus nitrogénkötő kapcsolat kialakulásában hibát szenvedett növényeket kerestünk, amelyek közül nyolc Fix- mutáns növényt válogattunk ki és megállapítottuk, hogy a gümőfejlődés mely szakaszában szenvedtek meghibásodást. Kiválasztottuk a gümőképződés egy korai fázisában bekövetkezett meghibásodást mutató ipd3-1 mutáns vonalat, amelyek vizsgálati eredményei a következők voltak: 1. Az ipd3-1 mutáns nitrogénmentes táptalajon a rhizobium mikroszimbionta partner jelenlétében nitrogén éhezés tüneteit mutatta: sárgászöld leveleket, fejlődésben visszamaradt hajtásokat nevelt és fehér kis gömbölyű gümők képződtek rajtuk. A mutáns gümők számában szignifikáns növekedést állapítottunk meg a vad típushoz képest. Nyomon követve a mutáns gümő fejlődését a vad típushoz képest, az ipd3-1 esetében késést figyeltünk meg a gümő fejlődésében, valamint késést és meghibásodást a bakteriális fertőzésben. Nem volt megfigyelhető különbség a gyökerek hosszában, azonban megnyúlt infekciós régiót és szignifikánsan több gümőprimordiumot állapítottunk meg. A rhizobium fertőzést követően négy héttel két féle apró gümőtípust különítettünk el: (i) a mutáns gümőben az infekciós fonalak a gümő csúcsi részében csoportosulnak, (ii) a gümők 15-20%-a teljes egészében infekciós fonalakkal volt telítve. A fertőzést követő hatodik héten hosszúkás megnyúlt fehér gümők is megjelentek (5-10%), amelyekben megnyúlt infekciós fonalakkal telt inváziós zónát figyeltünk meg. Lézer-pásztázó konfokális mikroszkópon megállapítottuk az infekciós fonalak (IF) felhólyagosodott formáit a bennük rekedt baktériumokkal, amelyből arra következtettünk, hogy a mutációt szenvedett génnek szerepe van a baktériumok IF-ból való kiszabadulásában. 2. Egy második ipd3-2 allélt azonosítottak (Noble Foundation és University of Wisconsin, USA) egy Tnt1 inszerciós mutagenezissel előállított mutáns populációban. Megállapítottuk, hogy a 6
gümőfejlődés az ipd3-2 vonalban korábbi stádiumban leállt; bár a gyökérben a kortikális sejt osztódása elindult (gümőkezdemény kialakulása), nem tudtunk infekciós fonalakat azonosítani a gyökér mélyebben fekvő sejtjeiben, amely jelezte az IF képződésében történt meghibásodást. 3. Az infekciós folyamat és a gümőfejlődésre vonatkozó mikroszkópos vizsgálataink eredményét kvantitatív qRT-PCR és szemikvantitatív PCR-el is alátámasztottuk. A vizsgált késő-korai marker gének csökkent aktivitást mutatnak, a késői gének jelentős része pedig nem expresszálódott, ami alapján kijelenthetjük, hogy a szimbiotikus marker gének kifejeződése az
ipd3-1
mutánsban
összhangban
van
a
mikroszkópos
vizsgálatokból
levont
következtetéssel, azaz az ipd3-1 mutáns a nitrogénkötő szimbiózis kialakulásának kezdeti szakaszában szenvedett hibát. 4. Elvégeztük az ipd3-1 és ipd3-2 alléltesztjét, amelyben az összes F1 utód Fix- szimbiotikus fenotípust mutatott, így megállapítottuk, hogy a két mutáns vonal alléljei egymásnak. 5. Meghatároztuk a mutáció öröklésmenetének típusát. Az F2 térképező populáció szegregációs aránya (328 Fix+ / 130 Fix-) egygénes recesszív öröklésmenetet mutatott. 6. Térképezésen alapuló génizolálással megállapítottuk a mutáns lókusz térkép pozícióját az 5. kromoszóma felső karján ENOD40 és MtB93 genetikai markerek között. Ezt követő finomtérképezés során az F2 térképező populáció kiterjesztésével két BAC klónnal (mth43n15 és mth4-28c15) lefedett genomi régióra sikerült szűkíteni a mutáció lehetséges helyét. A két BAC klónon azonosított két határoló markerek (BRL és GTP) közötti genomi szakaszt szekvencia analízisnek vetettük alá. Hét jelölt gént fedtünk le oligonukleotid primerekkel és hajtottunk végre genomi és cDNS templáton PCR reakciót az ipd3-1 mutánson. Az IPD3 génen egy primerpárral végzett amplifikáció esetében deléciót azonosítottunk az IPD3 transzkriptben. Szekvencia analízissel megállapítottuk a negyedik exon utolsó bázispárjának cseréjét és az azt követő intronból 6 bázispár kivágódását. A negyedik exon és intron határát érintő deléció hibás mRNS érési folyamatot („splicing”) okozott, amelynek következtében az IPD3 transzkriptumból a negyedik exon hiányzott. 7. Annak érdekében, hogy bizonyítsuk valóban az IPD3 gén mutációja okozta a mutáns fenotípust, mind két mutáns allélben sikeres komplementációs tesztet végeztünk. Ezen kívül az MtIPD3 ortológ LjCYCLOPS-al való komplementáció is menekítette a mutáns fenotípust az ipd3-1 mutánsban. 8. A vad típusú növénnyel ellentétben az ENOD11 korai nodulációs gén kifejeződése GUS hisztokémiai festéssel vizsgálva az ipd3-1 mutánson nagyon gyenge
NF indukálta
pMtENOD11::GUS aktivitást mutatott. Az ENOD11 gén kifejeződése az ipd3-1 növényen
7
kisebb gyökér régiót érintett, valamint a GUS festés intenzitása mindig gyengébb volt a vad típusnál. 9. Kvantitatív qRT-PCR-el az ENOD11 gén mellett NIN és HAP2 korai nodulációs gének kifejeződését is vizsgáltuk ipd3-1, ipd3-2 és egy időközben Ovchinnikova és mtsai (2011) által azonosított ipd3-3 allélen 16 órás NF kezelés és rhizobium fertőzés hatására is 1, 8, 14 nap elteltével. NF kezelés hatására a NF által indukálódó ENOD11, NIN és HAP2 gének expressziója jelentős csökkenést mutatott a három ipd3 allélben a vad típushoz képest. Rhizobium fertőzés hatására szintén a gének expressziójának csökkenését figyeltük meg, azonban ennek mértéke nem volt megegyező az összes génnél. 10. Az ipd3-1 és ipd3-2 mutáns spontángümőzési tesztjében gümőszerű struktúrák fejlődését nem tudtuk kimutatni, csupán a kontrollként használt dmi3 esetében. A spontán gümők toluidinkék festésével bizonyítottuk, hogy valóban spontán gümők képződtek, valamint a gümők nem tartalmaznak baktériumokat.
Következtetések Az IPD3 fehérjét korábban élesztő két-hibrid rendszerben DMI3 interakciós partnereként azonosították a NF szignálútvonal elemeként (7). A Doktori értekezésben ipd3 mutáns allélek azonosítása és hibás szimbiotikus fenotípusa kerül bemutatásra. Az ipd3 vonalak mikroszkópos elemzése jelezte, hogy az IPD3 funkciója az IF növekedésében és a baktériumok infekciós fonalakból való kiszabadulásában van. A gümők fejlődésében komoly késést figyeltünk meg a mutánsokban, az infekció egy korai stádiumban rekedt meg. Az ipd3-1 mutáns az ipd3-2 vonalhoz képest fejlettebb gümőket képez, azonban a gümők egy esetben sem mutatták a baktériumok kiszabadulását a növényi sejtekbe, illetve a szimbioszóma kialakulását. A késő-korai és késői nodulációs gének gyenge vagy ki nem mutatható kifejeződése összefüggésben van a megfigyelt gümő képződéssel. Úgy gondoljuk, hogy a fenotípusos különbségek az ipd3-1 és ipd3-2 allélek közötti eltérő genetikai háttérből adódnak. Feltételezésünk szerint a Jemalong hátterű ipd3-1 mutáns tartalmazhat olyan egyéb genetikai komponenst, amely továbblendíti a gümő fejlődését, az R108 háttérben (ipd3-2 allél) ez a háttér komponens hiányzik, és így a gümőfejlődése korábban megrekedt. A korai nodulációs gének (ENOD11, NIN, HAP2) kifejeződésének a hiánya azt sugallta, hogy az IPD3 a NF indukálta szignálútvonalban tőlük feljebb helyezkedik el. A spontán gümőzési teszt lehetővé teszi más gének pozíciójának meghatározását a DMI3 génhez képest a NF jelátviteli útvonalban. Tehát, míg a szignálútban a DMI3 génhez képest fentebb működő, vagy azzal egy párhuzamosan futó szignálútban elhelyezkedő gének mutáns alléljaikban spontán gümőképződést eredményez, addig a DMI3 géntől lejjebb elhelyezkedő gének nem képesek a mutáns növényekben gümőfejlődését elindítani (14). A kísérlet eredményeként az ipd3-1 és ipd38
2 mutánsok esetében sem tudtunk spontán gümőképződést kimutatni. Ezen eredmények, illetve az itt be nem mutatott kollaborációs kísérlet alapján az IPD3 szerepét a DMI3/CCaMK fehérjével egy komplexben, a kalcium spiking és a korai nodulációs gének kifejeződését szabályzó NSP1 és NSP2 transzkripciós faktorok aktivációja között helyeztük el. Megállapítottuk, hogy az IPD3 gén nélkülözhetetlen a rhizobium és mikorrhiza szimbiotikus partnerek fertőzőképességének kialakításában a gazdanövény gyökerén.
Irodalomjegyzék 1. VandenBosch, K. A., Gray, S. (2003) Summarise of Legume Genomics Projects from around the Globe Commonuty Resources for Crops and Models. Plant Physiology 131:840-865. 2. Popp, C., Ott, T. (2011) Regulation of signal transduction and bacterial infection during root nodule symbiosis. Current Opinion in Plant Biology 4:458-467. 3. Murray, J. D. (2011) Invasion by Invitation: Rhizobial Infection in Legumes. Molecular Plant-Microbe Interactions 24:631-639. 4. Oldroyd, G. E. D. and Downie, J. A. (2008) Coordinating nodule morphogenesis with rhizobial infection in legumes. Annual Review of Plant Biology 59:519-546. 5. Jones, K. M., Kobayashi, H., Davies, B. W., Taga, M. E., and Walker, G.C. (2007) How rhizobial symbionts invade plants: the Sinorhizobium-Medicago model. Nature Reviews Microbiology 5:619-633. 6. Capoen, W. and Oldroyd, E. D. G. (2008) How CYCLOPS keeps an eye on plant symbiosis. PNAS 105:20053-20054. 7. Messinese, E., Mun, J. H., Yeun, L.H., Jayaraman, D., Rouge, P., Barre, A., Lougnon, G., Schornack, S., Bono, J. J., Cook, D.R., and Ané, J. M. (2007) A novel nuclear protein interacts with the symbiotic DMI3 calcium- and calmodulin-dependent protein kinase of Medicago truncatula. Molecular Plant-Microbe Interactions 20:912-921. 8. Kouchi, H. et al (2010) How Many Peas in a Pod? Legume Genes Responsible for Mutualistic Symbioses Underground. Plant Cell Physiology 51:1381-1397. 9. Boivin, C., Camut, S., Malpica, C., Truchet, G., and Rosenberg, C. (1990) Rhizobium meliloti genes encoding catabolism of trigonelline are induced under symbiotic conditions. Plant Cell 2:1157-1170. 10. Haynes, J., Czymmek, K., Carlson, C., Veereshlingam, H., Dickstein, R., and Sherrier, D. (2004) Rapid analysis of legume root nodule development using confocal microscopy. New Phytologist 163:661-668. 11. Kiss, G. B., Kereszt, A., Kiss, P., Endre, G. (1998) Colormapping: A Non-Mathematical Procedure For Genetic Mapping. Acta Biologica Hungarica 49:125-142. 12. Boisson-Dernier, A., Chabaud, M., Garcia, F., Bécard, G., Rosenberg, C., and Barker, D. (2001) Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions 14:695-700. 13. Yano, K., Yoshida, S., Muller, J., Singh, S., Banba, M., Vickers, K., Markmann, K., White, C., Schuller, B., Sato, S., Asamizu, E., Tabata, S., Murooka, Y., Perry, J., Wang, T., Kawaguchi, M., Imaizumi-Anraku, H., Hayashi, M., and Parniske, M. (2008) CYCLOPS, a mediator of symbiotic intracellular accommodation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105:20540-20545. 14. Gleason, C., Chaudhuri, S., Yang, T. B., Munoz, A., Poovaiah, B. W., and Oldroyd, G. E. D. (2006) Nodulation independent of rhizobia induced by a calcium-activated kinase lacking autoinhibition. Nature 441:1149-1152. 15. Ovchinnikova, E. et al (2011) IPD3 Controls the Formation of Nitrogen-Fixing Symbiosomes in Pea and Medicago Spp. Molecular Plant-Microbe Interactions 24:1333-1344. 16. Journet, E. P., El-Gachtouli, N., Vernoud, V., de Billy, F., Pichon, M., Dedieu, A., Arnould, C., Morandi, 9
D., Barker, D. G., and Gianinazzi-Pearson, V. (2001) Medicago truncatula ENOD11: A novel RPRPencoding early nodulin gene expressed during mycorrhization in arbuscule-containing cells. Molecular Plant-Microbe Interactions 14:737-748.
A disszertációhoz kapcsolódó tudományos közlemények jegyzéke Tudományos cikkek: Beatrix Horváth, Li Huey Yeun, Ágota Domonkos, Gábor Halász, Enrico Gobbato, Ferhan Ayaydin, Krisztina Miró, Sybille Hirsch, Jongho Sun, Million Tadege, Pascal Ratet, Kirankumar Mysore, JeanMichel Ané, Giles E. D. Oldroyd and Péter Kaló Medicago truncatula IPD3 Is a Member of the Common Symbiotic Signaling Pathway Required for Rhizobial and Mycorrhizal Symbioses. Molecular Plant-Microbe Interactions 24:(11) pp. 1345-1358. (2011) Ágota Domonkos†, Beatrix Horváth†, John Marsh, Gábor Halász, Ferhan Ayaydin, Giles E. D. Oldroyd and Péter Kaló The identification of novel loci required for appropriate nodule development in Medicago truncatula BMC Plant Biology (2013) Könyvfejezet: Beatrix Horváth, Ágota Domonkos, Ferhan Ayaydin, Péter Kaló Identification of Medicago truncatula genes required for rhizobial invasion and bacteroid differentiation. Biological Nitrogen Fixation, szerk. Frans J. de Bruijn. Wiley/Blackwell Kiadó (2013) Poszterek: 1.
2.
3.
Beatrix Horváth, Gábor Halász, Ágota Domonkos, Ferhan Ayaydin, Krisztina Miró, John Marsh, Giles E. D. Oldroyd, Péter Kaló Isolation and analysis of ineffective nodulation mutants in Medicago truncatula. Gent at the 8th European Nitrogen Fixation Conference, Gent, 2008. Beatrix Horváth, Gábor Halász, Ágota Domonkos, Krisztina Miró, Ferhan Ayaydin, John Marsh, Enrico Gobbato, Sibylle Hirsch, Giles Oldroyd, Péter Kaló Isolation and analysis of ineffective nodulation mutants in Medicago truncatula. Model Legume Congress Asilomar Conference Grounds Pacific Grove, California, 2009. Beatrix Horváth, Gábor Halász, Krisztina Miró, Jeremy Murray, Ágota Domonkos, John Marsh, Michael Udvardi, Giles Oldroyd, Péter Kaló Two strategies to identify genes inviolved in the later stages of symbiotic nitrogen fixation. 8th International Symposium in the Series Recent Advances In Plants Biotechnology; New Develpoments In Green Gene Technology, Szeged, 2009.
Szakmai előadások tudományos konferencián: 4.
5.
6.
7.
Horváth Beatrix, Halász Gábor, Miró Krisztina, Domonkos Ágota, Ferhan Ayaydin, Kaló Péter Medicago truncatula szimbiotikus mutánsok jellemzése és egy mutációt szenvedett gén azonosítása. MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont, Genetikai Minikonferencia, Szeged, 2008. Horváth Beatrix, Domonkos Ágota, Halász Gábor, Miró Krisztina, Ferhan Ayaydin, Enrico Gobbato, Sibylle Hirsch, Giles Oldroyd, Kaló Péter Hogyan befolyásolja az IPD3 gén mutációja a szimbiotikus kapcsolatok kialakulását Medicago truncatulaban? Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, Tudományos napok, Gödöllő, 2008. (első előadói díj) Horváth Beatrix, Domonkos Ágota, Halász Gábor, Miró Krisztina, Ferhan Ayaydin, Enrico Gobbato, Sibylle Hirsch, Giles Oldroyd, Kaló Péter Hogyan befolyásolja az IPD3 gén mutációja a szimbiotikus kapcsolatok kialakulását Medicago truncatulaban? VIII. Magyar Genetikai Kongresszus, Nyíregyháza, 2009. Horváth Beatrix, Halász Gábor, Domonkos Ágota, Ferhan Ayaydin, Miró Krisztina, Jean-Michel Ané, Jeremy Murray, Giles E. D. Oldroyd, Kaló Péter A szimbiotikus gümő inváziójában és működésében résztvevő Medicago truncatula gének azonosítása kétféle megközelítéssel. IX. Magyar Genetikai Kongresszus, Siófok, 2011.
10
