Az ioncsatorna fehérjék szerkezete, működése és szabályozása. A “patch-clamp” technika
Panyi György
2014. November 12.
Mesterséges membránok ionok számára átjárhatatlanok
Iontranszport a membránon keresztül: transzport fehérjékre van szükség!
extracelluláris
citoszolikus
zárt ATP ADP+Pi
ATP-függő pumpa 100-103 ion/s
nyitott
ioncsatorna 107-108 ion/s
transzporter 102-104 ion/s
Nettó töltés átjutása a membránon ÁRAM
Két csatorna szimultán nyitása
Membránpotenciál
nyitott zárt
Az egyedi ioncsatorna áramok néhány pA (10-12 A) nagyságrendűek Az egyedi ioncsatorna vezetőképesség (G=I/U) nagyságrendje néhányszor 10 pS (10-12 S, S:Siemens)
Az ioncsatornák integráns (transzembrán) fehérjék
Nobel Díj, Kémia, 2003
Roderick MacKinnon for structural and mechanistic studies of ion channels
Crystal structure of the voltage gated potassium channel, S5-S6
Peter Agre, for the discovery of water channels
Az ioncsatorna egyszerűsített működési modellje: a membránon keresztül érő hidrofil pórus
hajtóerő + nyitott kapu ionáram
Az elektrokémiai gradiens és a vezetőképesség határozza meg az ionáram nagyságát és irányát egyensúly esetén →nincs nettó áram
[K+]
o=5
mM
Em
Em=EK I = G (Em–EK)= 0 Em≠EK
[K+]i=140 mM + RT [K ] i EK = − ln + = −89 mV zF [K ] o
T= 37
oC,
z=1
I = G(Em–EK)= 0
I = G(Em–EK) ≠ 0
Em<EK
Em>EK
I<0, sejtbe irányuló K+ áram
I>0, sejtből kifelé folyó K+ áram
Az ioncsatornák osztályozása
Kapuzás szerint
Szelektivitás alapján
megfelelő “inger” hatására bekövetkező konformáció változás a fehérjében, mely a csatornák különböző állapotaihoz vezet (pl. zárt, nyitott , inaktivált állapotok).
csak bizonyos fajta ion (vagy ionok) számára átjárható a pórus (pl. nagy szelektivitású, kis szelektivitású, és nem szelektív csatornák).
Kapuzás I. A csatornák felosztása a nem vezető (zárt) és vezető (nyitott) állapot közötti átmenetet kiváltó inger alapján:
feszültség kapuzott a membránpotenciál megváltozása (pl. idegsejtek depolarizáció aktiválta K+ és Na+ csatornái).
ligand kapuzott a ligand bekötődése az extracelluláris oldalon (p.l ideg-izom kapcsolatban az acetikolin receptor).
i.c hírvivő molekula által kapuzott a ligand bekötődése az intracelluláris oldalon (pl a Ca2+ aktiválta K+ csatorna).
membrán feszülés által kapuzott (“stretch gated”) a membrán feszülése (pl. limfociták térfogatszabályzásában Cl– csatornák nyitása).
Kapuzás II. Az ioncsatornák lehetséges kapuzási állapotai: -funkcionális állapotok (vezető, nem-vezető) -szerkezeti állapotok (pl. zárt, nyitott, inaktivált) Ny (O) /vezető ∆Em I /nem-vezető 0.5 pA
Z (C) /nem-vezető O C +50 mV -120 mV
100 ms
I
A feszültség kapuzott ioncsatornák főbb szerkezeti elemei pórust alkotó S5-S6 hurok extracelluláris
α α
citoszolikus
K+
α
α
feszültség érzékelő NH2
négy alegység együtt alkot egy funkcionáló csatornát
pórust kialakító domén: konduktancia Feszültség érzékelő domén: a membránpotenciál változás érzékelése
pórust alkotó S5-S6 hurok szelektivitási szűrő: a csatorna ion szelektivitásáért felelős
extracelluláris
S4
S6
S6
S4
citoszolikus S4-S5 kapcsoló
kapu
Kapuzás III. A feszültség szenzor azonosítása egy pozitív töltéssel kevesebbet tartalmazó feszültség szenzor
feszültség szenzor Nyitásiopen valószínűség probability
1.0 0.8 0.6 0.4
WT R368Q
0.2 0.0 -100
-50
0 test potential (mV)
50
100
Membrán potenciál (mV)
Kapuzás IV. az inaktivációért felelős domain azonosítása
Current
a.) vad típusú K+ csatorna Wild-type
b.) mutáns K+ csatorna
Current
Deletion mutant Δ6-46
Zagotta et al. 1990
Az ioncsatornák osztályozása szelektivitás alapján Nagy szelektivitású csatornák, négy alegység: K+, Na+, Ca2+, Cl-
Kis szelektivitású csatornák, öt alegység: Acetilkolin receptor, csak kationokra specifikus
Nem szelektív csatornák: Gap junction csatorna (hat alegység)
A szelektivitást biztosító mechanizmusok Szelektivitási szűrő
–– –
–– 20Å
kálium pórus ion hurok
K+ K+
K+
üreg pórus
méret alapján:
töltés alapján:
ami nem fér be a pórusba az nem megy át a csatornán
a nem megfelelő töltésű ion nem mehet át
specifikus kölcsönhatások alapján: a megfelelő méretű és töltésű ionok közötti válogatás
Töltés alapján szelektál a nikotinerg acetilkolin receptor (ligand kapuzott ion csatorna) pórus
filter extracell.
plazmamembrán citoszolikus
kapu
acetilkolin kötőhely
Specifikus kölcsönhatások a pórus és az ionok között I. röntgen krisztallográfiás kép a pórusról Szelektivitási szűrő
kálium pórus ion hurok
K+ K+
K+
üreg pórus
szelektivitási filter (GYGD)
a pórusban tartózkodó ionok
Specifikus kölcsönhatások a pórus és az ionok között II. A vízburok helyettesítése a szelektivitási szűrőben K+
szelektivitási szűrő
kálium pórus ion hurok
K+
Na+
: 0.95 Å
Hhyd=−322 kJ/mol Hhyd=−406 kJ/mol ion a szelektivitási szűrőben
K+
: 1.33 Å
K+
Na+
K+
Na+
K+
üreg pórus
ion vizes közegben
Hogyan tanulmányozhatók az ioncsatornák? Az ionáramok mérésével a patch-clamp technika alkalmazásával Rf Vki
Ip +
Im
Em
áram (pA)
600
Vtart
+30 mV aktiváció
+30 mV -10 mV
-50 mV -80 mV
400 200
-40 mV
inaktiváció
0 0
200
400 idő (ms)
600
800
1000
cell attached patch
whole cell
vákuum húzás
outside out patch
Patch pipetta a sejten ill. EM kép hőpolírozást követően
Sakmann, Nobel lecture, 1992, Neuron 8:613-629.
Az ioncsatornák főbb funkciói Membránpotenciál kialakítása és szabályozása nyugalmi potenciál p K [K]i + p Na [Na]i + pCl [Cl] o RT Em = − ln Fz p K [K] o + p Na [Na] o + pCl [Cl]i extracell.
citoszolikus
K+
Na+
Cl−
Az ioncsatornák főbb funkciói
akciós potenciál
+50
felszálló szár: depolarizáció 0
küszöb
−70
Vezetőképesség [mmho/(cm2)]
nyugalmi potenciál
Membránpotenciál (mV)
Membránpotenciál kialakítása és szabályozása
leszálló szár: repolarizáció Küszöb alatti ingerek
utó hiperpolarizáció
Na+ permeábilitás
K+ permeábilitás
Idő (ms)
Az ioncsatornák főbb funkciói Membránpotenciál kialakítása és szabályozása nyugalmi potenciál akciós potenciál
p K [K]i + p Na [Na]i + pCl [Cl] o RT Em = − ln Fz p K [K] o + p Na [Na] o + pCl [Cl]i extracell.
citoszolikus
Na+
K+
Cl−
Intracelluáris ionkoncentráció változások kialakítása [Ca2+]
emelkedés
i Az idegvégződés depolarizációjakor a feszültség-kapuzott Ca2+ csatorna (1) kinyílik, Ca2+ influx szinaptikus vezikula szekréció (2).
A.
Idegsejt akciós potenciál 1 2 4
3
5
Izomsejt Szarkoplazmatikus retikulum
Az ioncsatornák gyógyszerek támadáspontjai 1, pórus blokkolók
e.c.
gátlás
i.c.
gátlás
Az ioncsatornák gyógyszerek támadáspontjai 2, kapuzást módosító molekulák
e.c.
gátlás
i.c.
