Az Ig génátrendeződés Háromféle változás játszódik le a molekula szerkezetét tekintve: •B sejtek fejlődése alatt: VDJ átrendeződés (rekombináció) •IgH izotípusváltás rekombináció (CSR) •Szomatikus hipermutáció (SM)
Véletlenszerű- e a génátrendeződés? The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984 Niels K. Jerne, Georges J.F. Köhler, César Milstein
Niels Jerne: primer repertoár saját antigénekre korlátozott, ezt követi az antigén által indukált szelekció
A génszegmentek véletlenszerű átrendeződése Az embrionális génátrendeződés genetikailag „korlátozott”, nem véletlenszerű, (pl. bizonyos Vb gének nagyobb gyakorisággal, mint mások, 12/23 RSS-rekombináz kölcsönhatási preferenciák)
Hatékony szelekció – limitált diverzitás Széles felismerési repertoár – maximális diverzitás
Antigén felismerő receptorok sokfélesége limitált kódoló DNS ?? Aminosav analízis: Ig molekula N terminális része sokféle, C terminális szekvencia azonos Egy gén – egy polipeptid ?? Deyer és Benett 1965: 2 gén: variábilis és konstans Niels Jerne: 1984 Nobel Díj: "for theories concerning the specificity in development and control of the immune system” Susumu Tonegawa 1987 Nobel Díj "for his discovery of the genetic principle for generation of antibody diversity” Az embrionális, vagy nem limfoid szövetből nyert Ig gének szerkezete eltér az ellenanyagot termelő tumor sejtekben (myeloma) található Ig gének szerkezetétől.
Könnyű lánc Embrionális (germline) DNS
Figure 4-2
Nehéz lánc
Szomatikus rekombináció D-J átrendeződés Szomatikus rekombináció V-J vagy V-DJ átrendeződés Transzkripció Elsődleges RNS átirat Splicing
mRNS Transzláció Polipeptid lánc
Egy klónra jellemző repertoár- egyedi V-D-J rekombináció
Emberi Ig könnyű és nehéz lánc lókuszainak embrionális szerveződése a genomban
L: leader peptid, a fehérje irányítása (extracelluláris fehérje) 3 külön lókusz, 2, ill. 3 génszegmens több kópiában, majd a konstans doméneket kódoló gének, H lánc: 9 C gén, ezeken belül 5 vagy 6 exon
DJ szegmensek: H lánc, J szegmensek: L lánc
V szegmensek
Minden rekombinálódó V, D és J génszegmentumot nem kódoló régiók határolnak: konzervált heptamer és nonamer szekvenciák csatlakoznak a kódoló szekvenciákhoz, ezek között 23, vagy 12 nukleotid hosszú nem konzervált szekvencia (spacer). Szerepe: RAG hozzáférés bitosítása.
Rekombinációs szignál szekvencia (RSS), ezt ismerik fel és ehhez
kötődnek a RAG1 és RAG2 fehérjék
RAG gének csak a fejlődő limfocitákban fejeződnek ki
A könnyűlánc V és J génszegmenseinek rekombinációja 4 lépésben 1. Szinapszis
A RAG1-RAG2 fehérje komplex kötődik a 12 és a 23 bp spacer-res RSS-hez
Újabb fehérjék (Ku, DNS függő protein kinázok) csatlakoznak a hajtűhöz és az elhasított RSS végekhez
RAG1:RAG2 RAG1:RAG2
A fehérjekomplexek kötődnek egymáshoz, közelitve a szegmenseket
2. Dupla szálhasítás
A DNS hajtűk kinyílnak, a TdT újabb nukleotidokat ad a végekhez , illetve az exonukleázok eltávolítanak nukleotidokat
A DNS elhasad, a gén szegmensek végén hajtű struktúra jön létre
RAG: rekombinációt aktiváló enzim komplex TdT: terminális deoxinukleotidil transzfeáz
3. Kódoló végek módosítása
4. A DNS ligáz összekapcsolja a génszegmensek végeit Szignál vég Kódoló vég
Csatlakozás (NHJ: Nonhomolog end joining)
A VDJ rekombináció lépései: 1. Rag1/Rag2: VDJ rekombináz. Rag2: más fehérjékhez kapcsol
1
Génszegmensek megfelelő helyzetben tartása.
2. Rag1: hasítás egyik szálon szabad 3’OH másik szál, kovalens kötéshajtű
2
Szignál vég: blunt end
3
3. KU70, KU80 DNS-PK kötődése, aktiválja Artemis endonuleázt hajtű felnyílik
4
(DNS-PK hibás SCID-ben)
4. TdT, DNS ligáz IV, kódoló végek csatlakozása
Hogyan befolyásolja a Rag mutációja a kódoló és szignál végek kapcsolódását?
Rag hiányában sem B sem T sejtek nem fejlődnek ki.
Csak B és T sejtekben fejeződik ki és csak bizonyos fejlődési fázisban! Csak Go és G1 fázisban, osztódó sejtben nincs Rag!
Figure 4-8 A RAG komplex kötődik és hasítja az egyik DNS szálat a kódoló és a heptamer szekvencia között hajtűket eredményezve
A DNS szálak párosodása
A páratlan nukleotidokat elhasítja az exonukleáz A hajtűk kinyílása palindrom Pnukleotidokat eredményez
Az üres helyek feltöltése után a kódoló végeket csatlakoztatja a DNS ligáz Újabb nukleotidok beépülése – TdT közvetítésével
N: nem templát alapján hozzáadott nukleotid
Az Ig gének átrendeződésének lépései, sorrendje
Az érett, naív B sejtek felszínén azonos specificitású mIgM és mIgD jelenik meg
IgM
IgD B sejt
A RAG gének kiütése -> limfocita fejlődés megáll, súlyos kombinált immunhiány (severe combined immunodefficiency): SCID fenotípus
Allél exklúzió
Szomatikus hipermutáció - további variabilitás
6. nap Elszórt mutációk a V régióban
Figure 8-16. 4-9nap További mutációk felhalmozódása a V régióban
Negatív szelekció
A legjobb antigénkötő, legtöbb mutációt tartalmazó B sejtek fejlődnek tovább –> affinitás érés
Activation induced cytidine deaminase: AID-hiánya gátolja a szomatikus hipermutációt
A immunoglobulin repertoár sokféleségének kialalkulása négy folyamat eredménye: • Kombinatórikus diverzitás - könnyű és nehéz láncok V régiói, több kópia minden génszegmensből, ezek különböző kombinációi • Génszegmensek kapcsolódása által meghatározott sokféleség (VJ, VDJ) • Kombinatórikus diverzitás - a lehetséges H és L lánc párok kialakulása • Szomatikus hipermutáció az átrendeződött V régió génekben - negatív és pozitív szelekció, a legjobban kötődő receptorral rendelkező sejtek kiválogatódása • ~1011 lehetséges repertoár, de valójában ~109 klón
IgM és IgD
Alternatív splicing
Ig nehézlánc izotípusváltás
Izotípus váltás: rekombináció specifikus „switch”szignálok között
Figure 4-21
Izotípusváltás (Class-switch recombination - CSR) rekombináció/deléció mechanizmusával történik
S régió: CSR:GGGGT GAGCT,
CSR –nem tartalmaz konszenzus szekvenciát mint RSS, GC-ben van, de kivüle is,
Izotípus váltás (class switch recombination) •Minden CH gén 5’ végén van switch régió (S), kivéve Cd- az IgD alternatív splicing-gal jön létre
• S régió: repetitív szekvenciák – transzkripció indul • 5’ S régió-tól indul, fúzió 3’ S régióval, fúzió az intronban- nem befolyásolja a transzláció leolvasási keretét
•Activation induced cytosine deamináz (AID) – szükséges, (RAG nem) • AID: citidin specifikus mutátor •Csak B sejtekben van AID, AID hiányában (egér KO) nincs CSR! •In vivo: T sejtektől függő mechanizmus: CD40-CD40 ligandum kölcsönhatás •In vitro: LPS, citokinek hatására indukálható •Szabályozás: transzkripciós faktorok-I régió promoter kapcsolat
Az izotípusváltás mechanizmusa Nehézlánc gének IgM-et expresszáló sejtben
CD40L, citokinek
deléció Switch-rekombináció az S régióknál (Kettős szálú DNS törés)
Nehéz lánc gének IgA-t expresszáló sejtben
Switch-régió csira-vonal átirat
A kettősszálú DNS törés létrejöttének mechanizmusa a switch régiókban
Kódoló szál
R-hurok
Az AID C / U átalakulást indukál
Uracil glycosylase (UNG), APE: AP endonukleáz APE I: hasítja a bázishiányos helyet
Kettős szálú DNS törés a switch régióban
UNG: bázishiányt hoz létre
AZ AID-indukált DNS törés, mutáció és transzlokáció
izotípusváltás
hibajavítás
Uracil glycosylase (UNG), APE: AP endonukleáz
mutáció
transzlokáció
Az AID szerepe az SHM és az izotípusváltás során
Szomatikus hipermutáció
Izotípusváltás
Uracil glycosylase (UNG, green wedge), base excision repair (BER), mismatch repair proteins (MSH2/6)
A V-gének szomatikus mutációja H lánc V régiók
7. nap primer
14. nap primer
Másodlagos
Harmadlagos
Affinitás érés: szomatikus mutációk -- > szelekció
L lánc V régiók
A membránon kifejezett és a szekretálódó m lánc létrejöttének mechanizmusa
Primer RNS átirat
Poliadenilációs helyek
B-sejt differenciálódás
Nyugvó B-sejt transmembrán
