AZ EMÉSZTÉS ÉLETTANA Az állati szervezetek testük felépítéséhez szükséges anyagokat és energiát táplálék formájában veszik fel. Táplálékuk minısége szerint lehetnek húsevık, növényevık és mindenevık. A táplálék megszerzésére kialakult módszerek és feldolgozására szolgáló szervek rendkivül nagy változatosságot mutatnak az állatvilágban. Mindazonáltal testfelépítéstıl és életmódtól függetlenül a szövetes állatok emészırendszerének mőködése öt részfolyamatra bontható: (1) táplálék felvétele, (2) raktározás, (3) elıemésztés, (4) végleges emésztés és (5) felszívás salakanyag eltávolítása.
Fehérjeemésztés kimutatása földigiliszta tápcsatornájában Anyagok és eszközök: földigiliszta, 10% etanol, bonctő, kisolló, csipeszek, filmnegatív, termosztát A kísérlet céljaira Lumbricus sp. vagy más nagy testő fajok egyedeit válasszuk. A földigiliszták táplálékát - hasonlóan más talajban élı férgekhez- a lenyelt
földben
lévı
szerves
törmelékek
és
apró
élılények
alkotják.
Emésztırendszerük tagozódását a ? ábra mutatja be. Táplálék megemésztéséhez szükséges enzimeket elsısorban középbél egysejtő mirigyei termelik. Az állatokat 10%-os alkoholban megöljük, vízzel lemossuk. Bonctálba helyezve a háti oldalt megnyitjuk, a bırizomtömlıt széthajtjuk és tőkkel rögzítjük. Megkeressük a tápcsatorna egyes szakaszait és megnyitjuk a gyomrot, középbelet. A szerveket egyegy kis filmkocka zselatinos (matt) oldalára helyezzük. A filmkockákat nedves szőrıpapírt
tartalmazó
petri
csészébe
rakjuk
és
kb.
fél
óra
hosszat
szobahımérsékelten vagy 37 C˚-on inkubáljuk. Hasonlítsuk össze a film felületén bekövetkezı változást a gyomor illetve középbél esetében! Megfigyelés: a film azon helyein, ahol a bélszakasz proteázokat tartalmaz, a zselatin elbomlik és a filmen átlátszó foltok keletkeznek. Tekintve, hogy a gyomor a táplálék mechanikai feldolgozását végzi, számottevı emésztés a középbél szakaszán várható.
ábra: A földigiliszta emésztırendszere
Amiláz kimutatása óriás csótány nyálából Anyagok és eszközök: csótány, éter, bonctő, kisolló, csipeszek, dörzsmozsár, 0.6% NaCl oldat, 0.1% keményítı oldat, Lugol oldat A csótány páros nyálmirigye az egész toron végighúzódva a potrohig lenyúlik (? ábra). A nyálmirigyek váladéka a győjtıhólyagokban raktározódik. Közel semleges kémhatású (pH 6.9) áttetszı folyadék, melynek amilázaktivitása jelentıs. Az amiláz kimutatásához a csótányt éterrel elbódítjuk, dekapitáljuk (éles borotvával levágjuk a fejét) és háti részével felfelé rögzítjük a bonctálon. A tor kitinlemezeit ollóval körbevágjuk és eltávolítjuk. Preparációs mikroszkóp alatt megkeressük
a
begy
két
oldalán
elhelyezkedı
nyálmirigyeket
és
a
győjtıhólyagokat. Ezeket kivágjuk és 1 ml fiziológiás (0.6 %) NaCl oldattal eldörzsöljük. Az így nyert szuszpenziót 1 ml fiziológiás sóoldattal kémcsıbe mossuk át és néhány csepp Lugol oldatot adunk hozzá, ami a keményítıvel kék színreakciót ad. Megfigyelés: Rövid idı múlva a kék színezıdés eltőnik, mert a nyálamiláz elbontja a keményítıt.
ábra: Az óriás csótány emésztıkészüléke
Szénhidrátok, zsírok és fehérjék emésztése óriás csótány középbelében Anyagok és eszközök: csótány, éter, bonctő, kisolló, csipeszek, , 0.6% NaCl oldat, 0.1% keményítı oldat, Lugol oldat, Fehling I és II oldat, 1% NaHCO3, 1% NaOH, szinezett zselatinkockák
A gerinctelen állatok középbelében lévı emésztınedvben megtalálhatók mindazon enzimek, melyek a szénhidrátok, zsírok és fehérjék lebontását végzik. A lebontott tápanyagok felszívása is túlnyomórészt a középbélben történik. 1. Szénhidrátemésztés vizsgálata Kémcsıbe 2 ml felfızött 0.1%-os keményítıoldatot pipettázunk és beleteszünk két csótány hosszában felvágott középbelét és néhány csepp Lugololdatot. A kémcsövet 37 C˚-os termosztátba helyezzük, és 30 perc múlva megfigyeljük az oldat színváltozását. A szılıcukor jelenlétét Fehling próbával mutatjuk ki 2. Zsírok emésztésének vizsgálata Két kémcsıbe 3-4 ml 0.6 % NaCl oldatot, egy csepp növényi olajat, egy-két csepp fenolftalein és annyi 1% NaHCO3 oldatot teszünk, hogy rózsaszínő elszínezıdést kapjunk. Az egyik kémcsıbe a csótány felvágott középbelét tesszük, a másik kémcsı összehasonlításul szolgál. Az elegyeket 37 C˚-on 30 percig inkubáljuk. Hasonlítsuk össze a két reakcióelegy színét! Megfigyelés: a középbél zsírbontó lipázt termel, mely zsírsavakat hasít le a trigliceridekrıl. Ennek köszönhetıen a felszabaduló zsírsavak savas irányba tolják el az inkubációs elegy kémhatását, amit a fenolftalein színváltozása bizonyít. 3. Fehérjeemésztés vizsgálata Két számozott kémcsıbe 3-3 ml 0.6 %-os NaCl oldatot pipettázunk, és 1% NaOH oldattal enyhén meglúgosítjuk. Egyenlı nagyságú szinezett zselatin kockákat helyzünk mindkét csıbe. Az egyik kémcsıbe a kipreparált középbelet tesszük, míg a másik kémcsı kontrolként szolgál. Mindkét csövet 37 C˚-os termosztátba 60 percig inkubáljuk. Megfigyelés: a középbelet tartalmazó kémcsıben a proteázaktivitás következményeként a zselatinkocka elfolyósodik és eltőnik.
Az ember nyálának kémiai összetétele és fermentatív sajátságai Anyagok és eszközök: emberi nyál, pH papír, 1% ecetsav, 0.1M HCl, 0.01M FeCl3, 0.3 % NaCl, 0.01% keményítıoldatot, Lugol oldat, termosztát
A friss emberi nyál színtelen, enyhén savanyú vegyhatású folyadék. Napi mennyisége mintegy 1-1.5 l. A primer nyálban a kálium és bikarbonát ionok koncentrációja nagyobb mint a vérplazmában, a nátrium és klorid ionoké alacsonyabb. A nyálban megtalálható a mucin és a szénhidrátbontó enzim, az amiláz. Ezen kívül - fıleg dohányosoknál - a nyál tartalmazhat rodanid ionokat is. A vizsgálathoz szükséges nyálat úgy nyerünk, hogy a szájüreget 20 ml desztillált vízzel kétszer kiöblítjük. A nyál kémhatásának mérése Mérését indikátorpapírral vagy pH mérı készülékkel végezzük. A nyál pHja 6.2 és 7.4 között változik. A friss nyál kezdetben gyengén savas (pH 6.6-6.8). Állás közben CO2 távozik belıle, ezért gyengén lúgossá válik. Mucin tartalom kimutatása A nyál viszkozitását egy glikoprotein, a mucin okozza. A mucin már gyenge sav hatására is kicsapódik. 5-6 ml nyálhoz 5-6 csepp 1% ecetsavat adunk. Pelyhes csapadék keletkezik, amelyet leszőrve a nyál viszkozitása megszőnik. Rodanid (SCN-) ionok kimutatása A hígított nyálhoz pár csepp 0.1M sósavat és 0.01M ferriklorid oldatot adunk. Vörös színő ferrirodanid képzıdik. A rodanid ionok a dohányosok nyálában találhatók
meg
nagyobb
mennyiségben,
feltehetıen
a
cianidnyomok
méregtelenítésekor keletkeznek a májban és a nyállal ürülnek ki. Nyálamiláz kimutatása A keményítıbontó amiláz a nyál legfontosabb alkotórésze. Kimutatása úgy történik, hogy 2 ml 0.3% NaCl-ot tartalmazó 0.1% keményítıoldatot pipettázunk egy kémcsıbe, amihez 1 ml nyálat adunk. Az elegyet 37 C˚-os vízfürdıbe rakjuk, és 2 percenként mintát veszünk belıle. A mintákat fehér csempelapra visszük és Lugol-oldattal színreakciót végzünk. Megfigyelés: A jód reakció 10 perc múlva gyengül, majd eltőnik
A táplálék rétegződése a gyomorban 48 óráig éheztetett patkánnyal fekete, fehér és piros színő táplálékot etetünk (ételfestékkel megfestett). A táplálék elfogyasztása után a patkányt üvegbúra alatt
éterrel túlaltatjuk, a hasüreget megnyitjuk, a gyomrot a cardianál és a pylorusnál lekötjük és kivágjuk. Mélyhőtıben lefagyasztjuk, majd hosszirányban kettévágjuk. A metszés felületén jól látszik az egymás fölé rétegzıdött, különbözı színő táplálék.
ábra: A táplálék rétegzıdése a gyomorban
Az intenzív gyomorperisztaltika a táplálékfelvétel után csak percek múlva indul meg, és így csak a legelıször lenyelt táplálékrészek kerülnek érintkezésbe a gyomor nyálkahártyájával és a sósavas pepszinnel. A további táplálékrészek egy ideig még nem jutnak érintkezésbe a gyomornedvvel, így azokban zavartalanul folytatódik tovább a nyálemésztés mindaddig, amíg a meginduló perisztaltika következtében a gyomornedv nem inaktiválja a nyál-fermentumokat
Pepszin oldat fehérjebontó hatásának kimutatása Anyagok és eszközök: 5% pepszin, 0.5% HCl, szinezett zselatinkockák, termosztát A gyomornedv fehérjebontó pepszin enzimet tartalmaz. A pepszin inaktív pepszinogén formájában termelıdik a gyomornyálkahártya fısejtjeiben és a gyomornedv sósavtartalma hatására aktiválódik. A pepszin a fehérjéket albumozékra, peptonokra és polipeptidekre hasítja. Négy számozott kémcsıbe az alábbi ábrán látható módon összeállítjuk a reakció elegyeket.
ábra: A pepszin fehérjebontó hatásának vizsgálata
Tegyünk mindegyik kémcsıbe egy-egy zselatinkockát. A 1., 2., 3. kémcsöveket 30 percre 37 C˚-os vízfürdıbe helyezzük, a 4. kémcsövet azonban szobahımérsékleten hagyjuk állni. Hasonlítsuk össze a zselaitnkockák állapotát a négy különbözı kísérleti felállásban. Megfigyelés: Az 1. kémcsıben a pepszin sósav jelenlétében megemészti a fehérjét. A 2. kémcsıben a zselatin változatlan marad, mivel a pepszin mőködéséhez alacsony (pH 2) kémhatás szükséges. A 3. kémcsıben enzim hiányában nem játszódik le az emésztési folyamat. A 4. kémcsıbe szintén nem vagy csak kis mértékő változást tapasztalunk, bizonyítva ezzel, hogy a pepszin hatékony mőködéséhez testhımérséklet (37 C˚) szükséges.
Az epe összetételének vizsgálata Anyagok és eszközök: epe, szacharóz oldat, salétromsav Az epe folyamatosan termelıdik a májban. Étkezési szünetekben az epehólyagban
raktározódik,
ahol
nagy
mértékben
bekoncentrálódik.
Elektrolitösszetétele nagy mértékben hasonlít a plazma összetételéhez. Szerves anyagai nagy részét az epesavak (glikokolsav, taurokolsav) illetve azok nátrium sói, az epefestékek (bilirubin, biliverdin) és a koleszterin alkotják.
1. Epefestékek kimutatása 3 ml hígított epéhez néhány csepp szacharóz oldatot öntünk, és koncentrált kénsavat rétegzünk alá. Az érintkezés határán piros győrő keletkezik. A nádcukorból a kénsav hatására ugyanis oximetilfurfurol keletkezik, amely a kolsavval piros színő reakciót ad. 2. Epesavak kimutatása 1. Gmelin reakcióval: hígított epe alá salétromsavat rétegzünk. Az érintkezés határán színes, felülrıl lefelé nézve: zöld, kék, viola, piros és sárga győrők keletkeznek. Bizonyos idı eltelte után az egész oldat megsárgul. A salétromsav a bilirubint elıször biliverdinné (zöld), majd bilicianinná (kék) és biliprazinná (viola-piros), végül koletelinné (sárga) oxidálja. 2. Rosenbach reakcióval (a Gmelin reakció érzékenyebb módosítása): híg epét szőrıpapíron többször átszőrünk és üvegbottal salétromsavat cseppentünk rá. Mivel a szőrıpapír az epefestékeket abszorbeálja, a rácseppentett salétromsav körül színes győrők keletkeznek.
A hasnyál enzimatikus funkcióinak vizsgálata A hasnyálmirigy a táplálék valamenyi tápanyagának emésztéséhez szükséges enzimet termeli. A hasnyálmirigy enzimjei a duodenumban kerülnek érintkezésbe a béltartalommal, ahol optimális kémhatás (pH 8) és hımérséklet mellett (37 C˚) a táplálékkal bekerült valamennyi tápanyag bontását elkezdik. A hasnyál fehérjebontó enzimei a tripszin, kimotripszin, karboxipeptidáz. A nukleinsavak (RNS, DNS) bontását ribo,- és dezoxiribonukleázok végzik. Szénhidrátbontó enzime az amiláz, a lipideket pedig a lipáz bontja az epe segítségével. 1. Zsírbontás pankreas lipázzal Anyagok és eszközök: pankreas extraktum (készítése: sertés hasnyálmirigyet megtisztítunk és kvarchomokkal dörzsmozsárban homogenizáljuk. Az így nyert pépet kétszeres térfogatú 45%-os alkohollal szobahımérsékleten három napig extraháljuk. Végül a pépet többszörös gézrétegen átszőrjük és a szőrlethez néhány csepp toluolt adunk.), epe, olajemulzió (készítése: 5 ml olajhoz mililiterenként 6 csepp NaOH-ot hozzáadunk és jól összerázzuk), fenolftalein, cc. HCl, 0.1M NaOH
Öt megszámozott kémcsıbe az alábbi ábra alapján állítsuk össze a reakció elegyeket.
ábra: A hasnyál zsírbontó hatásának vizsgálata
A 2. számú kémcsıben lévı pankreas extraktumot felforraljuk, mielıtt az olajemulziót hozzáöntenénk. A kémcsövek tartalmát alaposan összerázzuk és az 1., 2., 3., 4. számú kémcsöveket 37 C˚-os vízfürdıbe tesszük egy óra hosszára. A 5. számú kémcsı szobahımérsékleten marad az inkubáció teljes ideje alatt. Az elegyeket 5 percenként összerázzuk és a 60 perc után a kémcsövek tartalmát titrálólombikba visszük át. Az üres csöveket 2 ml alkohollal átöblítjük, amit szintén a titrálólombikba öntünk. A reakció elegyeket 5 csepp fenolftalein hozzáadása után 0.1M NaOH oldattal maradó rózsaszínig titráljuk. Jegyezzük fel a szín megjelenéséhez szükséges NaOH mennyiségét és hasonlítsuk össze az értékeket! Megfigyelés: NaOH mennyiség értékei a kémcsövekben lévı szabad zsírsavak mennyiségével arányosak. Az 1. kémcsı esetében az epe emulgeálja a zsírokat és a környezeti feltételek (hımérséklet, pH) a legoptimálisabbak a lipáz számára ezért itt várható legnagyobb mennyiségben a zsírsavak felszabadulása. A 2-es számú kémcsıben hıvel inaktiváljuk a lipázt, ezért az 1. és 2. kémcsı titrálási eredményeinek különbsége a lipáz által felszabadított zsírsavak mennyiségével
arányos. A 3. kémcsıben epe hiányában, a 4. kémcsıben a savas kémhatásnak köszönhetıen, míg az 5. kémcsıben a nem megfelelı hımérsékletbıl adódóan a zsírok emésztése nem annyira hatékony, ezért a NaOH mennyiségek elmaradnak az 1. kémcsınél tapasztalthoz képest. 2. Keményítıbontás pankreas amilázzal Anyagok és eszközök: 0.1% keményítıoldat, pankreas extraktum, Lugol oldat, termosztát Kémcsıbe 5 ml 0.1%-os keményítıoldatot és 2 ml pankreas extraktumot pipettázunk. A kémcsı tartalmát összerázzuk és 37 C˚-os vízfürdıbe helyezzük. Kb. 10 percenként mintát veszünk az inkubációs elegybıl és néhány csepp Lugol oldatot
cseppentünk
bele.
Kontrollként
cseppentsünk
mellé
az
eredeti
keményítıoldatból és végezzük el a színpróbát azzal is. Megfigyelés: a keményítıtartalmú oldatok a Lugol-oldat hatására kékre színezıdnek. A pankreas extraktummal inkubált keményítı oldatban néhány perc múlva a színreakció csökken, jelezve a pankreas amiláz aktivitását. 3. A pankreasnedv fehérjebontó hatása Anyagok és eszközök: pankreas extraktum, zselatinkocka, 0.001M Na2CO3, cc. HCl, termosztát Három számozott kémcsıbe a következı anyagokat készítsük össze: az elsıbe 3 ml pankreaskivonat és 3 ml 0.001M Na2CO3 oldat, a másodikba 3 ml felforralt pankreaskivonat és 3 ml 0,001M Na2CO3 oldat, a harmadik kémcsıbe 3 ml pankreaskivonatot és 3 ml H2O, valamint pár csepp koncentrált HCl-ot. Mindhárom kémcsıbe zselatinkockákat helyezünk és a kémcsöveket 37 C˚-on inkubáljuk min. 30 percig. Állapítsuk meg a fehérjebontás intenzitását a három kémcsı esetében. Megfigyelés: a zselatinkocka elfolyosódása egyedül az elsı kémcsıben figyelhetı meg, mert a második kémcsıben a hı hatására, a harmadik kémcsıben a savas kémhatás miatt inaktiválódott enzimek nem képesek emésztést végezni.
