AZ ÉLELMISZEREKBEN TALÁLHATÓ ALLERGÉN FEHÉRJÉK ANALITIKÁJÁNAK AKTUÁLIS KÉRDÉSEI
Bugyi Zsuzsanna, Schall Eszter, Hajas Lívia, Török Kitti, Tömösközi Sándor BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék
Hungalimentaria 2017
Terítéken az élelmiszerek és csomagolóanyagaik 2017. április 26-27. Budapest
AZ ÉLELMISZER-ALLERGIÁRÓL ÁLTALÁBAN ÉLELMISZEREKKEL SZEMBEN JELENTKEZŐ TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK
TOXIKUS (mindenkit érint)
NEM TOXIKUS (csak az érzékeny egyéneket érinti)
ELSŐDLEGES TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK
Immunmediált reakciók (ALLERGIÁK)
FEHÉRJÉK
IgE-mediált reakciók (KLASSZIKUS ALLERGIÁK)
MÁSODLAGOS TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK
Nem immunmediált reakciók (INTOLERANCIÁK)
Sejtmediált reakciók (pl. cöliákia)
Ortolani et al. 2001, Taylor et al. 2001, Jackson 2003, http://bestotcallergymedicine.com/wp-content/uploads/2015/08/Symptoms-of-food-allergy.jpg
DIÉTA 2
KAPCSOLÓDÓ SZABÁLYOZÁS 1169/2011 (2000/13/EC, 2003/89/EC, 2006/142/EC, 2007/68/EC)
glutént tartalmazó gabonák • rákfélék • tojás • hal • mogyoró • szója • tej
1169/2011 (41/2009, Codex Stan. 118-1979 rev. 2008)
•
diófélék • zeller • mustár • szezámmag • csillagfürt • puhatestűek • kén-dioxid •
• Élelmiszerallergia • Nincs határérték • Zéró tolerancia az allergénforrásra
•Gluténmentes: <20 ppm glutén •Nagyon alacsony gluténtartalmú: 20-100 ppm glutén
• Cöliákia • Határérték gluténre
3
ANALITIKAI MÓDSZEREK
https://www.neb.com/~/media/NebUs/Page%20Images/Applications/DNA%20Amplification%20and%20PCR/pcr.jpg, http://dmd.nihs.go.jp/latex/allergenomics-e.gif, http://cdn.rasayanika.com/wp-content/uploads/compare/categories/5.jpg, http://www.gmotesting.com/images/Genetic-ID-Strip-4412-2.aspx?width=250&height=417, http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/2d/Antibody.svg/2000px-Antibody.svg.png
4
AZ ALLERGÉNANALITIKAI SPECIFIKUS KÉRDÉSEI • Több kiváltó fehérje és epitóp • Egyéni kiváltó dózisok változékonysága
Fogyasztók
Fehérjék
• Antitest és célfehérje választás (toxikus vagy nem-toxikus fehérje) • Mintaelőkészítés • Fehérje polimorfizmus (epitóp mennyiség vs. fehérje mennyiség) • Feldolgozott, komplex mátrixok analízise • Nincs általánosan elfogadott referencia anyag és módszer
Analitikai módszertan
• Fehérjék sokfélesége • GxE változékonyság • Feldolgozás által kiváltott fehérjemódosulások
Denery-Papini et al. 1999, Wieser 2000, Valdés et al. 2003, Hishenhuber et al. 2006, Bermudo Redondo et al. 2005, Kerbach et al. 2009, Takács et al. 2010
5
CÉLKITŰZÉSEK
Mátrixhatás Mintaelőkészítés hatásai
Feldolgozás hatásai
ELISA módszerek összevetés
Referenciaanyag-jelöltek fejlesztése
GxE változékonyság hatása
Hibák modellezése és az analitikai bizonytalanság becslése
6
REFERENCIAANYAG-JELÖLT MODELLTERMÉK FEJLESZTÉSE Recept
Száraz alapanyagkeverék
módosítása1
*
Gliadin oldat vagy tejpor vagy tojáspor vagy szójaliszt
Homogenizálási módszer fejlesztése
Porkeverék allergén fehérjével/gliadinnal
*
Tészta
Modelltermékek Fejlesztése (RM jelölt) Sütemény
*
Fagyasztva szárított tészta
*
Analízis (ELISA)
1(Scaravelli
et al. 2008, Bugyi et al. 2012, Török 2014)
7
KÍSÉRLETEK ELISA kitek összehasonlítása
Feldolgozás hatása
• 7 db ELISA kit • ELISA
• 10 és 50 ppm gliadin-tartalmú
• SDS-PAGE • SE-HPLC
o Porkeverék o Tészta o Sütemény GxE változékonyság
•36 búzafajta
• Különböző évek
• 2 ELISA kit • HPLC • egyéb
• Glutén • Egyedi fajta • Fajtakeverékek
8
ELISA ÖSSZEHASONLÍTÓ VIZSGÁLAT
Bugyi et al. 2013
9
Mért gliadinkoncentráció (ppm)
FELDOLGOZÁS HATÁSA- ELISA 60
Nyers tészta
50
Sütemény
• Hődenaturáció?
40 30
• Szerkezetmódosulás?
20
• Kölcsönhatás egyéb mátrixkomponensekkel?
10 0 1
2
3
4 ELISA kit
5
6
7
•Oldhatóság? •Immunaffinitás?
SDS-PAGE és HPLC 10
FELDOLGOZÁS HATÁSA- SDS-PAGE Redukáló körülmények
GF
Török et al. 2015
PK
NyT
S
Nem-redukáló körülmények
MT
GF
GF – gluténforrás PK – porkeverék NyT – nyers tészta S – sütemény MT – molekulatömeg
PK
NyT
MT
S
11
FELDOLGOZÁS HATÁSA- SE-HPLC
12
GXE VÁLTOZÉKONYSÁG 200 000
Mért gliadin koncentráció (ppm)
180 000 160 000
A kit B kit
140 000 120 000 100 000 80 000 60 000 40 000 20 000 0
13
GXE VÁLTOZÉKONYSÁG 2- RP-HPLC ALGL
α-gliadin
γ-gliadin
ω5-gliadin
ω1,2-gliadin
ωb-gliadin
HMW-GS
LMW-GS
100%
Részarány a teljes fehérjetartalomban
90% 80% 70% 60%
50% 40% 30% 20% 10% 0%
14
GXE VÁLTOZÉKONYSÁG 3- RP-HPLC 18 16
Búzafehérje [g/100 g]
14 12 10 8 6
4 2 0 Mv Magvas Mv Magvas Mv Magvas Mv (2011) (2012) (2014) Mazurka (2011)
ALGL
ω5-gliadin
ω1,2-gliadin
Mv Mazurka (2012)
α-gliadin
Mv Mv Mv Mv Yumai-34 Yumai-34 Yumai-34 Mazurka Verbunkos Verbunkos Verbunkos (2011) (2012) (2014) (2014) (2011) (2012) (2014)
γ-gliadin
ωb-gliadin
HMW-GS
LMW-GS
Diff. to CP 15
KÜLÖNBÖZŐ FAKTOROK HATÁSA AZ ELISA EREDMÉNYEKRE 2%
Factor Faktor11:(processing) feldolgozás
Factor (gliadin source) Faktor2 2: gliadinforrás
30%
1 fajta vs. keverék liszt
48% 9%
Faktor33:(harvest évjárat year) Factor
Faktor4 4: ELISAkit) kit Factor (ELISA 11% Replicates Párhuzamos mérések
ANOVA Relatív variancia komponensek 16
ÖSSZEGZÉS IMMUNANALITIKA
Lehetőségek
Korlátokhibaforrások
17
ÖSSZEGZÉS
GYÁRTÓK
KUTATÁS
FOGYASZTÓ
HATÓSÁGOK
KLINIKUM
18 http://www.bubblews.com/assets/images/news/1166722232_1392905918.png
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Tömösközi Sándor
Schall Eszter
Hajas Lívia
•BME Allergén csoport munkatársai és hallgatói • MoniQA Allergén Munkacsoport • Dr. Emmerich Berghofer (BOKU) • Dr. Peter Köhler (TUM) • MTA Agrártudományi Kutatóközpont •Diagnostic Innovations, ELISA Systems, Morinaga, Neogen, Romer Labs, Tepnel •MoniQA NoE (FOOD-CT-2006-036337) • MoniQA Association (www.moniqa.org)
Török Kitti
•"Minőségorientált, összehangolt oktatási és K+F+I stratégia, valamint működési modell kidolgozása a Műegyetemen" c. projekt (TÁMOP-4.2.1/B-09/1/KMR-2010-0002)
•„Régi búza genotípusok minőségének jellemzése és felhasználása a piacorientált nemesítésben” c. projekt (AGR_PIAC_13-1-20130074)
•
„Gluténmentes tészta minőségének javítása hemicellulóz hálózat kialakításával” c. projekt (OTKA-ANN 114554) 19
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!
http://media2.inktastic.com/thumbnail/697/744/114/114744697.1.png
