AZ APOPTÓZIS SZABÁLYOZÁSA TERMÉSZETES ÉS MESTERSÉGES ANYAGOKKAL
Barna Gábor
Témavezető: Dr. Kopper László egyetemi tanár Konzulens: Dr. Sebestyén Anna tudományos munkatárs Programvezető: Dr. Kopper László egyetemi tanár
Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Patológia Tudományok Doktori Iskolája
Budapest 2005
TARTALOMJEGYZÉK 1. ÖSSZEFOGLALÁS – Magyar
3. oldal
ÖSSZEFOGLALÁS – Angol
4. oldal
2. BEVEZETÉS
5. oldal
2.1. A halálreceptor út
5. oldal
2.2. Kaszpázok, mint az apoptózis központi résztvevői
10. oldal
2.3. Az apoptózis mitokondriális útja
13. oldal
2.4. Sejthalált kiváltó természetes és mesterséges anyagok
26. oldal
3. CÉLKITŰZÉSEK
29. oldal
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
30. oldal
5. EREDMÉNYEK
45. oldal
3.1. TGFβ1 hatása HT58 sejtekre
45. oldal
5.2. Retinoidok hatása HT58 sejtekre
54. oldal
5.3. A Bcl-2 család fehérjéinek konformáció és mennyiségi változása a cisplatin indukálta apoptózis során
65. oldal
6. MEGBESZÉLÉS
69. oldal
7. LEGFONTOSABB ÚJ MEGFIGYELÉSEK ÉS MEGÁLLAPÍTÁSOK 78. oldal 8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
80. oldal
9. RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK
81. oldal
10. IRODALOMJEGYZÉK
83. oldal
2
1.ÖSSZEFOGLALÁS A sejthalál program (apoptózis) az egyik legfontosabb homeosztázist fenntartó szabályozó
folyamat
az
élőlényekben.
Az
apoptózis
szabályozási
zavarai
betegségekhez vezethetnek. Az apoptózis patológiás esetekben növekedhet (pl. neurodegeneratív
betegségekben)
vagy
csökkenhet
(pl.
daganatos
megbetegedésekben). A sejthalál normális menetének és mértékének visszaállítása értékes eszköz lenne a daganatos betegségek gyógyítása során. Célunk az volt, hogy pontosabban megismerjük bizonyos természetes és mesterséges anyagok által kiváltott apoptózis folyamatát, fókuszálva leginkább az apoptotikus mechanizmusokra és reakciókra, beleértve a két fő apoptotikus utat. Kísérleteink során azt vizsgáltuk, hogy az exogén TGFβ1 képes apoptózist előidézni egy TGFβ1-et termelő B-lymphoma sejtvonalon, melynek sejtjei érzéketlenek a saját TGFβ-jukra. Megállapíthatjuk, hogy az exogén TGFβ1 képes apoptózist indukálni ezekben a sejtekben a mitokondriális apoptotikus út, a kaszpázok, a reaktív oxigéngyökök segítségével.
Elmondhatjuk,
hogy
a
HT58
sejtek
endogén
TGFβ1-re
való
érzéketlenségének hátterében nem az apoptotikus út működésképtelensége áll, mivel exogén TGFβ1 hatására ez a folyamat aktiválható. Kísérleteink további részében összehasonlítottuk egy természetes és egy mesterséges retinsav apoptózist kiváltó hatását B-sejt eredetű lymphoma sejtvonalakon. Összehasonlító vizsgálataink alapján megállapíthatjuk, hogy mindkét retinsav a mitokondriális jelátviteli utat használja kaszpázfüggő (természetes retinsav), illetve kaszpázfüggetlen apoptózist (mesterséges retinsav) indukálva. Végül a Bak konformáció változásait vizsgáltuk cisplatin kezelés során melanomasejtvonalakban. Megállapíthatjuk, hogy a Bak különböző mértékben aktiválódik a cisplatin hatására a vizsgált sejtvonalakban. Ezek az eredmények felhívják a figyelmünket arra, hogy hogyan használjuk megfelelően a természetes vagy mesterséges apoptózist indukáló szereket daganatos sejtek kezelése során.
3
SUMMARY The cell death programm (apoptosis) is one of the most important regulatory function to maintain the homeostasis in a living organism. In some diseases this regulation is damaged, the rate of apoptosis pathologically increased (e.g. neurodegenerative diseases) or decreased (e.g. cancer). In cancer the restoration of normal rate of cell death could be a valuable tool to manage tumor growth. Our goal was to study apoptosis induced by natural or synthetic drugs, focusing on the mechanism of actions, including the two main apoptotic pathways. The apoptotic effect of exogenous TGFβ1 was studied in a TGFβ1 producing Blymphoma cell line (HT58) which cells were insensitive to their endogenous TGFβ1. It has been shown that exogenous TGFβ1 induces apoptosis in HT58 cells increasing mitochondrium permeability by reactive oxigen species and activating caspases. In this case the apoptotic machinery of TGFβ1 in HT58 cells was intact because exogenous TGFβ1 was able to induce apoptosis, deregulating survival signals. In another set of experiments we compared the apoptotic effect of two retinoids, a natural and its synthetic analogue in B-lymphoma cells. It is concluded that both retinoids induced apoptosis via mitochondrial pathway, in caspase-dependent or caspase-independent way, respectively. Finally we studied the conformational changes in Bak molecule during cisplatin treatment in melanoma cell lines. It turned out that Bak is activated differently in various melanoma cell lines. These results call the attention to the optimal use of apoptosis induction in tumor cells, using either physiological regulators or artificial compounds.
4
2. BEVEZETÉS A soksejtű szervezeteknek szükségük van arra, hogy megszabaduljanak az életműködésük során feleslegessé vált, az életfolyamatokat akadályozó vagy azokra veszélyes sejtektől; ez leggyakrabban a ”programozott sejthalál” révén valósul meg. A programozott sejthalál vagy apoptózis általánosan jellemző az eukarióta élőlényekre. Mind a növényeknél, mind az állatoknál megfigyelhető jelenség, bár különböző élőlényeknél különböző morfológiával fordul elő, melynek hátterében speciális biokémiai változások állnak. Az emlős sejtekben az apoptózisnak két fő jelátviteli
útja
van.
Az
egyiknél
külső
jelek,
halálligandok-halálreceptorok
kapcsolódásának hatására indul el az eseménysor: a külső út vagy halálreceptor út. A másik a belső út, amikor külső ligand kapcsolódása nélkül - belső sejtkárosodás után aktiválódik a mitokondriális út. 2.1. A halálreceptor út A halálreceptorok az evolúció legmagasabb szintjén jelennek meg; eddig csak az emlősökben sikerült kimutatni őket. A halálligandok specifikus receptorukkal Halálligandok
Extracelluláris tér
Halálreceptorok
FasL
Intracelluláris tér Fas/CD95/APO-1 DcR3 DR4/TRAILR1
TRAIL
DR5/TRAILR2 DcR1/TRAILR3 DcR2/TRAILR4 DR3L
DR3
?
DR6 TNFR1/CD120a
TNF Ciszteingazdag motívum
haláldomén
1. ábra Halálreceptorok és ligandok kapcsolódása (1)
5
Transzmembrán régió
összekapcsolódva indítják el az apoptózishoz vezető jelátviteli utat. A halálreceptorok és a halálligandok fontos szerepet játszanak a szöveti homeosztázis fenntartásában, elsősorban talán az immunrendszer működésében. A fehérjecsalád elsőként felfedezett tagja a tumornekrózis faktor (TNF) volt, melynek hatását már korábban ismerték, azonban a gént csak 1985-ben klónozták (2). Ezután következett a FAS/APO-1 receptor kimutatása (3), amit később a család többi tagjainak felfedezése követett (1. ábra). 2.1.1.A halálreceptorok szerkezete és működése A halálreceptorok a TNF-receptor családba tartoznak. Sejtfelszíni receptorok, melyek különféle szövetekben a sejtek túlélését vagy halálát szabályozzák. Fontos szerepük van az immunrendszerben, ahol a felesleges T- és B-sejtek kiszelektálása általuk jön létre. A TNF-receptorcsalád tagjai az I-es típusú transzmembrán glikoproteinek közé tartoznak, melyek ciszteinben gazdag extracelluláris doménnel
rendelkeznek.
Legtöbbjükben található egy homológ citoplazmatikus fehérjerész [haláldomén, (death domain, DD)] (4), ezen keresztül közvetítik az apoptotikus jelet a sejt belseje felé. (DR1-6) (5). Ehhez kapcsolódhatnak adapter fehérjék hasonló régiójukkal, így egy 1. Táblázat A halálreceptorok, ál-halálreceptorok és a hozzájuk kapcsolódó ligandok, jeltovábbító molekulák Receptorok
Alternatív elnevezések
Kötődő partner
TNFR1
p55-R, CD120a, DR1
TNF-α, TRADD, MADD, SODD
FAS
CD95, Apo-1, DR2
FASL, FADD, DAXX, FAIM, FAF
DR3
Apo-3, Wsl-1, TRAMP, LARD
DR3L (TWEAK), FADD, SODD
DR4
Apo-2, TRAIL-R1
TRAIL
DR5
TRAIL-R2, TRICK2
TRAIL, FADD
DR6
?
DcR1
TRAILR3
TRAIL
DcR2
TRAILR4
TRAIL
DcR3
TR6
FASL, LIGHT
6
nagy, jeltovábbító fehérje-komplex alakul ki (death inducing signaling complex, DISC) (1. Táblázat). A szabályozás részei az ál-halálreceptorok [csalétek, decoy receptorok, (DcR13)], melyek teljes extracelluláris doménnel rendelkeznek, de az intracelluláris doménjük csonka vagy hiányzik (6). Az ál-receptorok megkötik ugyan a ligandokat, de nem közvetítik a jelet, így csökkentik az apoptózis bekövetkezésének valószínűségét. A halálreceptorok általános jellemzője, hogy aktiválódásukhoz több receptornak kell összekapcsolódnia: homotrimerek vagy multimerek képződnek. A ligandok ugyancsak trimer formában találhatóak, ezek keresztkötik a receptorokat, és ezzel összekapcsolódásra kényszerítik őket (5). 2.1.2. A halálligandok szerkezete és működése A halálligandok a II-es típusú transzmembrán glikoproteinek, melyeket különböző proteázok hasíthatnak az extracelluláris térben, így szolúbilissá válhatnak (5). A TNF-α és a FASL esetében a mátrix-metalloproteázok, a TRAIL esetében cisztein proteázok végzik ezt a hasítást. A membránkötött és szolúbilis ligandoknak eltérő lehet a biológiai hatása. A FASL esetében a szolúbilis forma kevésbé hatékony az apoptózis indukálásában, mint a membránkötött. A TNF-α esetén a szolúbilis forma a TNFR1-hez kötődik, míg a membránkötött a TNFR2-höz. 2.1.3. A receptorközvetített sejthalálprogram elemei A halálreceptorok és ligandok kapcsolódása után különböző jelátvivő fehérje aktiválódik: a haláldomén és a haláleffektordomén fehérjék, a kaszpázok, a foszfolipázok, a MAP-kinázok, az NF-κB aktivációs kaszkád fehérjéi, valamint aktív gyökök is termelődnek. A legteljesebb képpel a TNFR1 esetében rendelkezünk. A különböző receptorok eltérő utakat aktiválnak, ezért a hatás tekintetében nagy különbségek adódhatnak az egyes szövetek és sejtek között is. A receptorok aktiválódása után a jel adaptermolekulákon keresztül jut az iniciátor molekulákig (iniciátor kaszpázok, kinázok, szfingomyelináz), amelyek
7
aktiválják a megfelelő effektorokat. A különböző jelátviteli utak során aktiválódhat a sejthalál mechanizmusa, de bármilyen meglepő, olyan jelek is kialakulhatnak, melyek a sejt szaporodását, túlélését segítik elő (7, 1). 2.1.4. Haláldomén és haláleffektor domén fehérjék A DISC kialakításában fontos szerep jut a receptorokhoz kötődő, DD-t tartalmazó adapter fehérjéknek [pl. TNFR-associated death domain (TRADD), Fasassociated death domain (FADD)]. Ezekhez kapcsolódhatnak más fehérjék is [pl. receptor-interacting protein (RIP), prokaszpáz-8 (FLICE)], melyek különböző jelátviteli utak részei lehetnek (NF-κB aktiváció, JNK aktiváció, apoptózis). A FADD a haláldoménen kívül tartalmaz egy haláleffektor domént [death effector domain (DED)] is (8), amely az ún. CARD (caspase recruiting domain) fehérjecsaládba tartozik. Ezek a fehérjeszerkezetek a kaszpázok egymáshoz és más adapterfehérjékhez való kapcsolódását teszik lehetővé. A FADD-hoz a homológ DEDen keresztül prokaszpáz-8 kapcsolódhat (ritkán prokaszpáz-10), ennek hatására konformációváltozáson mennek keresztül, amely autóaktivációt vált ki (9). Az aktiválódott kaszpáz-8 effektor kaszpázok hasításával indíthatja el az apoptózist. A DISC-ben gátló fehérjék is találhatók [pl. c-FLIP (FLICE inhibitory protein)]. A cFLIP a kaszpáz-8-cal nagyfokú homológiát mutat, de az aktív centrumából hiányzik az enzimaktivitáshoz szükséges cisztein. A FADD-hoz kötődve gátolja a prokaszpáz-8 aktiválódását (10). Mivel található benne egy kaszpáz-8 hasítóhely, szubsztrátja lehet az aktív kaszpáz-8-nak, de enzimaktivitás hiányában nem tud további molekulákat aktiválni, így az enzimkaszkádot megszakítja. A szerin-treonin-kináz RIP haláldoménje segítségével kapcsolódhat mind a halálreceptorokhoz, mind az adapterfehérjékhez, míg a kináz doménje és a "TNFRassociated factor-2" (TRAF2) segítségével aktiválja az "NF-κB-inducing kinase"-t (NIK) (11), ami az NF-κB sejtmagba való transzlokálódásáért felelős. A RIP szerepet játszik a kináz útvonalak (ERK, p38 és JNK) TNF-receptor általi aktiválásában is (12). A
RIP-hez
kapcsolódó
RAIDD/CRADD
(RIP-associated
Ich1/CED3
homologous protein with death domain) CARD doménje a kaszpáz-2-vel kapcsolatba kerülve szintén közvetítheti az apoptotikus jelet (13).
8
A halálreceptor-halálligand kötődést követően kialakuló DISC hatására aktiválódhatnak az iniciátor kaszpázok (kaszpáz-2, -8, -10), melyek továbbíthatják az apoptotikus jelet a többi effektor kaszpáz, pl. kaszpáz-3 felé. Megfigyelték, hogy egyes sejtvonalakban a mitokondrium szükséges ahhoz, hogy a FasL által kiváltott apoptózis teljes mértékben végbemenjen (14). Ezekben a sejtekben a kaszpáz-8 mennyisége elégtelen ahhoz, hogy aktiválja az effektor kaszpázokat, viszont képes arra, hogy beindítsa a mitokondriális apoptotikus utat, amelynek segítségével megvalósulhat az aktiváció. Ezek a II. típusú sejtek (15), míg azokat, amelyek a halálreceptorokon keresztül a mitokondriumtól függetlenül is képesek apoptózist indukálni, I. típusú sejteknek nevezik (2. ábra). FasL
TNF
NIK
1 p50 κ p65 B
Ceramid
CrmA FADD Kaszpáz-8
MEKK1
FADD
Kaszpáz-10 FADD
Kaszpáz-2
Kaszpáz-8
RAIDD
RIP
Fas
FLIP
Kaszpáz-9
Kaszpáz -3 Kaszpáz -6 Kaszpáz -7
Effektor Kaszpázok
ProAPAF-1 Kaszpáz-9
Cyto c Cyto c
TRAF2
TRADD
SODD
TNFR DD
Bid ProAPAF-1 Kaszpáz-9
IAP
JNKK
tBid dATP
p50 p65
Smac
JNK/SAPK
NF-κB
Endonukleázok
Túlélési szignálok DD
Bcl-2
kináz
CARD kaszpáz
DED
DNS Fragmentáció
Smac
Apoptózis
2. ábra A TNFR és a Fas által használt jelátviteli útvonalak
9
Cyto c
2.2. Kaszpázok, mint az apoptózis központi résztvevői Az apoptózis effektor folyamatainak nagyon fontos résztvevői a kaszpázok. 2.2.1 A kaszpázok fajtái A kaszpázoknak számos tagjáról bebizonyosodott, hogy központi szerepet játszanak az apoptózisban, iniciátorként és effektorként egyaránt. Az eddig azonosított 14 emlős kaszpáz szerepe sokféle, résztvesznek az apoptózisban, valamint a gyulladásos folyamatokban. Bár a család összes tagjának (2. Táblázat) pontos funkciója nem ismert, a legtöbbnek az apoptózissal kapcsolatos szerepe már elfogadottnak látszik. 2. Táblázat
A kaszpáz család tagjai (16-21) # gyulladásos, * apoptotikus kaszpázok
Kaszpáz
Egyéb név
Feltételezett szubsztrát
kaszpáz 1#
ICE, CED-3
pIL-1β, pYama, PARP, pNEDD2, pIC aktin
kaszpáz 2*
ICH-1, NEDD-2
pNEDD2, PARP
kaszpáz 3*
CPP32, Yama, apopain
pCPP32, PARP, PKCδ, DNS-PK, SREBP-1,-2, pRb, Rho-GDI, fodrin, I-CAD, gelsolin
kaszpáz 4#
ICErelII, TX, ICH-2
pICE, pTX, PARP
kaszpáz 5#
ICErelIIi, TY, ICH-3
kaszpáz 6*
Mch2
PARP, laminok
kaszpáz 7*
Mch3, ICE-LAP3, CMH-1
PARP, kaszpáz 6, HnRNP -C1, -C2
kaszpáz 8*
FLICE1, MACH1, Mch5
pICE-like, pCPP32- like
kaszpáz 9*
ICE-LAP6, Mch6
PARP
kaszpáz 10*
FLICE2, Mch4
PPARP, pICE-like, pCPP32
kaszpáz 11# egér
pICE, (19)
kaszpáz 12*
Endoplazmás retikulumot ért stressz során kialakuló apoptózisban játszik szerepet
kaszpáz 13*
ERICE
kaszpáz 14
Keratinociták szerepe
10
fejlődésében
van
Szekvenciaelemzésekből és biokémiai tesztek alapján a kaszpázokat két nagy családba sorolják őket: 1.) gyulladásos folyamatokban szerepet játszó (# jelölt) (kaszpáz-1, -4, -5, -11, -13) 2.) apoptotikus folyamatokban szereplő (* jelölt) (kaszpáz-3, -6, -7, -8, -9, -10, -12). A kaszpáz-13 a szekvenciahomológia alapján az első családba tartozik, míg hatás alapján a másodikba. 2.2.2. A kaszpázok szerkezete A kaszpázok aminosav szerkezete hasonló (22). Mindegyik proenzim formában (zymogén) expresszálódik (30-50 kDa), amely 3 doménből (NH2-terminális prodomén, valamint egy nagy (kb. 20 kDa) és egy kis (kb. 10 kDa) alegység) áll, és proteolítikus aktiváláskor - melyet sokszor egy másik kaszpáz végez - a két alegység egy heterodimert alkot. 2.2.3. A kaszpázok aktiválódása A kaszpázok előalakjai nem teljesen inaktívak, az aktív forma kb. 1-2 %-ával működnek. A haláldoménnel, illetve CARD-dal rendelkező szabályozó fehérjék segítik az aktiválódásukat. Segítségükkel elegendő közelségbe kerülnek egymáshoz, ahogy a kaszpáz-8 esetében láttuk, és hasítani képesek egymást. A DISC-en kívül még a mitokondrium közelében található apoptoszómánál találtak ilyen fehérjekomplexet. Az apoptoszómában az Apaf-1 az ATP és a citokróm-c kötés hatására szabaddá váló CARD-ja kötni tudja a prokaszpáz-9 molekulákat, melyek szintén autokatalítikus hasítással aktiválódnak (23). A többi kaszpáz aktiválására a legelfogadottabb elképzelés a kaszkád-modell, amelyben az iniciátor kaszpázok aktiválják a végrehajtó kaszpázokat (3. ábra). 2.2.4. A kaszpázok szubsztrátjai A kaszpázok igen specifikus proteázok, mindig az aszparaginsav után hasítanak és legfeljebb a szomszédos 4 aminosav határozza meg a különböző kaszpázok
11
specificitását (P1-P4). A különböző enzimeknek más-más a hasítási szekvenciájuk, ezzel magyarázható, hogy sokféle folyamatban vesznek részt (2. Táblázat 3. oszlop). A szubsztrátok között találunk DNáz gátlót (ICAD) (24), a Bcl-2 család antiapoptotikus tagjait (25), szerkezeti fehérjéket (laminok, gelsolin) (26) és kinázokat (FAK, PAK2, DNS-PK) (3. ábra). Ez mind hozzájárul a sejtalkotók degradálódásához és a sejt apoptotikus testekre való széteséséhez. Granzyme B
FasL
Perforin
Fas FADD
Kaszpáz-10
Kaszpáz-7
CrmA
Kaszpáz-13 Kaszpáz-9
Xiap clAP1 clAP
dATP
Kaszpáz-6
Kaszpáz-8
Hasitás
ProKaszpáz-9 APAF-1 Cyto c APAF-1 Cyto c ProKaszpáz-9
Kaszpáz-3
Kaszpáz-4 Kaszpáz-12
ER stressz
SREBP Cyto c
PARP
Mitokondrium
ER
Laminok
I
C A
DNS Fragmentáció
C A D
I
CAD
D
CAD HMG1 Topo II HMG2
Apoptózis
3. ábra A kaszpázok aktiválódása és néhány szubsztrátja
2.2.5. A kaszpázok szabályozása A kaszpázok működésének szabályozása más proteolítikus rendszerekéhez hasonlóan (pl. véralvadás, komplementrendszer) meglehetősen komplex, tartalmaz szabályozó proteázokat, kofaktorokat, visszajelzéseket, küszöbértékeket. A szabályozás egyik részét az jelenti, hogy a kaszpázok proenzim formában termelődnek és aktiválásukhoz egy proteolítikus hasítás szükséges. A szabályozás másik részét a sejtben jelenlevő gátlófehérjék adják, melyek meggátolják az enzimek működését, illetve
12
aktiválódásukat. Ezek azonosításában nagy szerep jutott a vírusokkal folytatott kísérleteknek. Három különböző osztályba tartozó vírusgátlót találtak: a CrmA-t (27), a p35-t (28), és az IAP fehérjecsaládot (29). A Cowpox vírus CrmA proteinje a serpin családba tartozik, hatásos (Ki < 1 nM) gátlószere az iniciátor és a gyulladásban szerepet játszó kaszpázoknak. A Baculovirus p35 fehérje a kaszpázok aktív helyére kötődik és főképp az apoptotikus kaszpázokat (kaszpáz-1, -3, -6, -7, -8, -10) képes gátolni (30). Az IAP fehérjék sok tagot számláló családot alkotnak és ezekből több megtalálható az emlősökben is. Mindegyik fehérje tartalmaz 1-3 speciális BIR (Baculovirus IAP repeats) domént, ami egy klasszikus cinkujj motívum. Az apoptózisgátlást a BIR doménnek a kaszpázok aktív centrumába való kötődése teszi lehetővé. Képesek a kaszpáz-3, -7, -9-t gátolni. Ezenkívül ubiquitin-ligáz tulajdonsággal is rendelkeznek és résztvehetnek a sejtciklus szabályozásban és a jeltovábbításban is (31). Vannak olyan gátlófehérjék, melyek az iniciátor kaszpázok aktiválódásában játszanak szerepet. A c-FLIP a kaszpáz-8 aktiválódását gátolja, míg az ARC (apoptosis repressor with caspase recruitment domain) a szív- és harántcsíkoltizomban gátolja a kaszpáz-2 aktivitását, valamint a kaszpáz-8-cal és a CED-3-mal képes komplexet alkotni (32). Mesterséges
kaszpázgátlószereket
is
kifejlesztettek,
amelyek
főként
peptidalapúak. Aszparaginsav-α-aldehidek és -α-ketonok (reverzibilis, átmeneti állapot analógok pl. zVAD-fmk) és az aszpartil-diazo-metánok, aszpartil-halo-metánok, aszpartil-acil-oxi-metánok (irreverzibilis inhibitorok, affinitás jelzők) lehetnek hatékony gátlói a kaszpázoknak (33). 2.3. Az apoptózis mitokondriális útja A mitokondrium, mint energiatermelő központ nélkülözhetetlen szerepet játszik az eukariótasejtek életében. A mitokondrium azonban nemcsak a sejt életében, hanem a halálában is fontos szerephez jut. Hogyan lehetséges ez? A nekrózisként ismert sejtelhalást a mitokondrium károsodása, az oxidatív foszforiláció elégtelensége, az ATP-hiány okozza. Ezzel ellentétben egyesek szerint a mitokondrium a sejt Pandóra-szelencéje (34), mivel olyan fehérjéket tartalmaz, melyek a citoplazmába kerülve elindítói, sokszor elengedhetetlen résztvevői lehetnek az
13
apoptotikus folyamatnak. Ezek között a fehérjék között találhatók pl. a prokaszpázok, az apoptózis indukáló faktor (AIF), az adenylát-kináz 2, vagy pl. a légzési láncban is résztvevő citokróm-c (kaszpáz aktivátor is), a Smac/Diablo (nemrégen felfedezett kaszpáz koaktivátor) és néhány hősokk fehérje (Hsp10, Hsp60). E fehérjéknek a citoplazmába kerülését pedig más, a Bcl-2 családba tartozó mitokondriális fehérjék szabályozhatják, serkenthetik vagy gátolhatják. Mi több, ezeknek a fehérjéknek a működését számos külső vagy belső jel befolyásolja (4. ábra). Végül a pro- és az antiapoptotikus jelek, és az általuk kiváltott események hatásának eredője dönti el, hogy a mitokondriummembrán
áteresztővé
válik-e.
A
mitokondriális
membrán
permeabilitásának fokozódása szükséges ugyanis az apoptózist kiváltó fehérjék kiszabadulásához, és ettől függ, hogy a programozott sejthalál mitokondriális útja elindul-e vagy sem.
alkilálás dimerizáció
ceramid
sugárzás
foszfatázok: kalcineurin, PP1α
Bax JNK/SAPK
kinázok: Akt/PKB, RSKS
Bid
Bcl-xl
PTPC
Bax
? ?
DNSkárosodás p53
forbolészter PKCδ
Hsp70 Bcl-2
? forbolészter Ca
aktiválás
kaszpáz-7 Bad
++
kaszpáz-8 közvetített Bid hasítás
Bim
? TR3
citokróm-c
NGF
mikrotubuluskárosodás
retinoidszármazékok
4. ábra A mitokondriumot elérő jelek A mitokondriumot számos irányból érhetik el olyan jelek, melyek a citokróm-c kiáramlását okozhatják. A jelek részint a mitokondrium átmeneti permeabilitási póruskomplexét stimulálják, részint a Bcl-2 család tagjaival lépnek kapcsolatba és így okozzák a citokróm-c kiáramlását (35).
14
2.3.1. Mitokondrium: az apoptotikus jelek integrátora Az előzőekben láthattuk, hogy a halálreceptorokon keresztül kiváltott apoptózisban a mitokondrium leginkább csak jelerősítő szerephez jut, míg a kemoterápiás szerek hatására főleg a mitokondriális apoptotikus út aktiválódik. Ezekben a folyamatokban a proaptototikus jelek a mitokondriumban összegződnek és a citokróm-c kiszabadulásával indul el a valódi apoptotikus folyamat, a kaszpáz-kaszkád működése. Központi kérdés tehát, hogy mi váltja ki a citokróm-c kiszabadulását. A daganatellenes terápia sokszor irányul a sejt genomiális DNS-ének károsítására és ezáltal az apoptotikus program beindítására. A DNS-károsodás hatására sok folyamat elindulhat, de az apoptózis szempontjából a p53-nak jelentős szerepe van. A p53 sejthalált válthat ki transzaktivációs képességével, és közvetlen jelutakon keresztül (36). Számos gén aktiválódik p53 hatására, melyek bizonyítottan szerepet játszanak az apoptózisban, de nem mindegyik közvetíti egyértelműen az apoptotikus hatást (pl. a BAX, a Fas/APO-1/CD95 receptor, a KILLER/DR5 receptor), míg néhány más génnek nem egyértelmű az apoptózishoz való pozitív vagy negatív viszonya. A p53 indukálta gének közül mind a BAX, mind a PIG3 terméke a mitokondriumon fejti ki hatását. Míg a Bax fehérje pórusformáló képességével előidézheti a citokróm-c kiáramlását a mitokondriumból, addig a PIG3 terméke oxidatív gyökök indukálásával a mitokondrium enzimrendszerében okozhat kárt, illetve kinyithatja a permeabilitási pórust (PTP). A p53 viszont nemcsak más gének aktiválásával, hanem önmaga is képes szabályozni a mitokondrium belső membránjának depolarizációját (37). A Bcl-2 fehérjecsalád anti-apoptotikus tagjai (Bcl-2, Bcl-xL ) gátolni képesek a p53-nak a mitokondriumra kifejtett hatását. Igen sok – akár halálreceptor, akár citotoxikus szerek által kiváltott – apoptotikus folyamatban figyelhető meg ceramidképződés. A ceramid útvonalnak egyik legjelentősebb tagja a GD3-gangliozid, az α-2,8-szialil-transzferáz (ST8) terméke, amely az endoplazmatikus retikulumban (ER) és a Golgi-készülékben található (38). Az enzim
-
és
így
a
mitokondriumdepolarizáció
GD3-szintézis
-
megakadályozható
gátlásával (39).
Habár
a
ceramid-indukálta a
ceramidfüggő-út
kinázokon/foszfatázokon keresztül is befolyásolhatja a mitokondriumot, mégpedig az
15
AKT-aktivitás szabályozásán és a Bad fehérje foszforilálásán keresztül (40), de bizonyos hatásokhoz a GD3 nélkülözhetetlen. Láthattuk, hogy igen sok apoptotikus folyamatban a mitokondrium főszerepet kap, mint a folyamat elindítója. A most következőkben megismerhetjük azokat a mechanizmusokat, amelyek segítségével az apoptotikus folyamat a mitokondriumtól elindulhat. 2.3.2. A mitokondrium szerkezete és morfológiai változásai az apoptózis alatt A mitokondrium két membránnal, egy külső burkoló és egy igen nagy felületű, betüremkedésekben gazdag belső membránnal rendelkezik. A mitokondriumok sejten belül elszórva helyezkednek el, de bizonyos jel hatására ez az eloszlás megváltozhat. Apoptotikus jelek következtében (pl. TNF által indukált apoptózis) a mitokondriumok kondenzációja és a mag köré rendeződése figyelhető meg. Ez a mozgás valószínűleg kinezin közvetített transzportnak köszönhető, melyet feltételezhetően a Bax proapoptotikus fehérje termelődése előz meg (41). Szerepet játszik-e a mitokondriumok kondenzációja a citokróm-c kibocsátásban? Mi lehet a célja a mag köré rendeződésnek: a magas ATP szint fenntartása, vagy segíti az AIF-nek (Apoptosis Inducing Factor) a mitokondriumból a sejtmagba történő transzlokációját? Ezeknek a kérdéseknek a tisztázása még további kutatásokat igényel. 2.3.3. A Bc1-2 fehérje család A sejthalál mechanizmusainak vizsgálata során sok szabályozó - serkentő és gátló - molekulát találtak a kutatók. Ezek között fedezték fel azt a fehérjecsaládot, melynek tagjai fontos szerepet játszanak az apoptózis folyamatában. Az első fehérje, a bcl-2 (18q21), melyet a B-sejtes follikuláris lymphomákban azonosítottak (a 18-as kromoszóma egy darabjának transzlokációja a 14-es kromoszómára, bcl – B cell lymphoma), és amelyről az egész család a nevét kapta, a sejthalált gátolja (42, 43). Ennek a fehérjének a felfedezése egyben az onkogének új családját nyitotta meg, melyek a proliferáció serkentése helyett a sejthalált gátolják.
16
Antiapoptotikus tagok BCL-2 BCL-XL BCL-W MCL-1 A1/BFL-1 BOO/DIVA NR-13 E1B-19K BHRF1 KS-BCL-2 ORF16 LMW5-HL
BH4
Emlős
BH3 BH1 BH2 TM
Virális
C. elegans
CED-9
Pro-apoptotikus tagok BAX BAK BOK/MTD BCL-XS BID BAD BIK/NBK BLK HRK BIM/BOD NIP3 NIX/BNIP3 EGL-1
Emlős
Csak BH3-mal rendelkezők
C. elegans
5. ábra A Bcl-2 fehérje család tagjai (44)
A bcl-2 család fehérjéinek mindegyike tartalmazza a bcl-2 homológ (BH) fehérjedomének egyikét (BH1-BH4). Ezeket a motívumokat helixek alkotják, amelyekkel a fehérjék képesek homo- és heterodimerek alkotására. A család tagjai két nagy csoportba sorolhatók aszerint, hogy az apoptózist gátolják (antiapoptotikus) vagy serkentik (proapoptotikus) (5. ábra). A proapoptotikus családon belül találunk olyanokat, melyek csak a BH3 doménnel rendelkeznek.
2.3.3.1. A Bcl-2 család antiapoptotikus tagjai Az antiapoptotikus tulajdonsággal rendelkezőknek általában legalább három BH doménjük van. Az antiapoptotikus hatásukat zömmel úgy fejtik ki, hogy a proapoptotikus tagokkal heterodimereket alkotnak, mégpedig a különböző térszerkezetű BH3 domének kötődése révén, így a proapoptotikus tagok esetleges pórusformálását megakadályozzák (45). Ugyanez fordítva is igaz. A proapoptotikusak lekötik az
17
antiapoptotikusokat. A fehérjék heterodimerizációját másodlagos kötőerők: hidrofóbhidrofil kölcsönhatások, és elektrosztatikus erők biztosítják (46). A Bcl-2 család tagjai, főleg az antiapoptotikus hatásúak, általában a különböző sejtorganellumok (mitokondrium, endoplazmatikus reticulum és a sejtmag) külső citoplazmatikus membránjában találhatóak (47, 48). Ezt a membránba történő beépülési képességüket a legtöbbjükben megtalálható transzmembrán doménnek köszönhetik, amelyet általában a C terminális végen 20 hidrofób aminosav alkot. 2.3.3.2. Proapoptotikus családtagok A proapoptotikusak (pl. Bid, Bax, Bad, Bim) a citoplazmában vagy a citoszkeletonhoz kötve találhatók, és megfelelő stimulus hatására vándorolnak valamelyik sejtorganellumba, általában a mitokondrium külső membránjába (48-52). Itt a család más tagjaihoz kötődve, azok aktivitását befolyásolva szabályozzák a citokrómc kiáramlását. A citokróm-c kiáramlását sokféle elmélet magyarázza. Valószínűleg mindegyik igaz, mert e folyamatok különböző sejttípusokban különbözőképpen játszódhatnak le. A citokróm-c kibocsátásához elengedhetetlen a mitokondriális membránok – a külső és/vagy a belső – áteresztőképességének nagymértékű növekedése. A belső membrán áteresztővé válása, úgy tűnik, kevésbé általános jelensége az apoptózisnak, mint a külsőé; bár a citokróm-c külső membránon való kijutását többnyire a belső mitokondriális membrán depolarizációja követi (a ∆Ψm csökken), jelezve, hogy a belső membrán is valamiképpen résztvevője a folyamatnak. A citokróm-c kibocsátással foglalkozó elméletek két nagy csoportba sorolhatók: •
a citokróm-c a külső mitokondriummembrán valamilyen pórusán, csatornáján keresztül jut ki a citoplazmába (6. ábra A);
•
a mitokondriális mátrix duzzadása okozza a külső membrán felszakadását és így jut ki a citokróm-c a citoplazmába. (6. ábra B). A folyamatokban a Bcl-2 család tagjai, a VDAC (feszültség függő anion
csatorna), az ANT (adenin nukleotid transzlokátor) játszhatnak fontos szerepet.
18
A.
Bax/VDAC csatorna
Bax csatorna B.
ADP
ATP
VDAC
PTP
VDAC záródás
anyagok < 1,5 kDa
Citokróm-c
lipid-fehérje csatornák
H2O, oldott anyagok
PTP nyílás
6. ábra A citokróm-c kibocsátás különböző formái A.) Pórusok általi kibocsátás (35) B.) A mátrix duzzadása miatt a külső membrán felszakad
2.3.4.1. „Póruselmélet” 1. A Bcl-2 család tagjai közül a Bcl-2, a Bcl-xL, a Bax és a hasított Bid fehérje képesek pórus formálására. A pórusformáló képesség lehetőségét a Bcl-xL fehérje háromdimenziós szerkezetének bakteriális toxinokhoz, pl. a diphtheria toxinhoz való hasonlósága vetette fel. A fehérjék membránba való beépülése pH-függő folyamat. Emiatt a pórusformáló képesség miatt lehetséges, hogy ezek a fehérjék csatornákat képezzenek a mitokondrium külső membrájában. A probléma az, hogy egyedül nem elég nagyok ahhoz, hogy átérjék a kettős lipidmembránt. A Bax fehérje esetében viszont kimutatták, hogy oligomereket alkothat és ezek már képesek nagy vezetőképességű csatornát alkotva átérni a membránt, elősegítve a citokróm-c kiszabadulását (53). 2. A VDAC a külső mitokondriális membránban található és rajta keresztül zajlik az ATP/ADP csere. Kimutatták, hogy Bcl-2 és polianionok hatására a VDAC olyan pórust formál, ami csak igen kis részecskeméretű oldott anyagokat (< 5 kDa) enged át. Viszont a Bax vagy a Bak hatására a csatorna áteresztőképessége megnő és a
19
citokróm-c kiszabadulhat a membrán közötti térből. A kísérletekből egyértelműen kiderült, hogy itt a póruskomplex központi magja a VDAC és nem a Bax vagy a Bak. Ebben
az
esetben
valószínű,
hogy
a
Bcl-2
típusú
fehérjék
a
VDAC
konformációváltozását indukálják (54). Azt találták, hogy a hasított Bid a VDAC pórus zárását okozza, és így idézi elő a mitokondrium működésének gátlását (55). 3. A Bax és a tBid nemcsak egymással és a VDAC-vel, hanem lipidekkel is kapcsolatba léphetnek, így olyan lipid vagy lipid-fehérje pórusokat hozhatnak létre, amelyek elég nagyok ahhoz, hogy a két membrán közötti fehérjéket a citoplazmába engedjék (56). 2.3.4.2. „Duzzadás elmélet” 1. Azokban a modellekben, ahol a külső membrán felszakadását a mitokondriális mátrix duzzadása idézi elő, jelentős szerepet kap az ANT fehérje. Ez a molekula a belső membránban található és végzi az ATP/ADP cserét a mátrix és a membránok közötti térrel. Az ANT sokféle mitokondriummembrán-permeabilitást szabályozó molekulával létesíthet kapcsolatot. Ilyen a VDAC, a ciklofillin D, Bax, Bak, Bc1-2, a Bc1-xL, valamint néhány virális fehérje, mint a Pul37X (citomegalovírus apoptózis gátló fehérjéje) és a Vpr (HIV-1 apoptózis indukáló fehérjéje) (57). 2. A külső membrán felszakadását, a mátrix duzzadását a belső membrán hiperpolarizációja is kiválthatja. A hiperpolarizáció hatására töltések áramlanak a külső membránhoz, ahol a VDAC is található. Ez a fehérje a feszültség növekedésének hatására bezáródik, így megakadályozhatja az ATP/ADP cserét, előidézve a mátrix duzzadását. Ezt a folyamatot a Bcl-2 és a Bcl-xL gátolhatja (57). Ezekben az elméletekben a mitokondriális membránok permeabilitásának változása és ezzel a citokróm-c kiszabadulása lehet, hogy eltérő módon, de mégis hasonló molekulák részvételével zajlott le. Úgy tűnik, hogy ezek a fehérjék mind egy hatalmas enzimkomplex, a permeabilitási átmeneti póruskomplex (PTPC) részei, illetve e köré szerveződnek (7. ábra).
20
2.3.4.3. Permeabilitási átmeneti póruskomplex Az átmeneti permeabilitási póruskomplex (PTPC) a mitokondrium belső és külső membránjának találkozásainál alakulhat ki, a VDAC és az ANT részvételével. Hozzájuk kapcsolódik a külső membránban található benzodiazepin perifériális receptor (BPR), a két membrán közötti térben a kreatin-kináz (CK), a külső membrán citoplazma felöli részén a VDAC-hoz kapcsolódó hexokináz II (HK), a mátrix irányából a ciklofillin D, valamint a Bax és Bcl-2 (58). víz, oldott anyagok
citoplazma
HK BPR
Külső membrán
VDAC
membránok közötti tér
CK ANT ciklofillin D
belső membrán mátrix
zsírsavak, Ca++, Bax, Bak ROS, NO
ciklosporin A bongkrekát
7. ábra Az átmeneti permeabilitási póruskomplex felépítése A komplex felépítésében részt vesz az adeninnukleotid-transzlokátor (ANT) és a feszültségfüggő anioncsatorna (VDAC). Hozzájuk kapcsolódik a külső membránban a benzodiazepin perifériális receptor (BPR), a kreatin-kináz a membránok közötti térben. A VDAC-hoz kapcsolódik a hexokináz II (HK) a külsőmembrán citoplazma felől és az ANT-hoz a ciklofillin D, valamint a Bax és a Bcl-2. Egyes anyagok (bongkrekát, ciklosporin A) gátolják a pórus nyitását, míg a Bax, a Bak, a VPR, a Ca++, a GD3, a zsírsavak, a ROS és a NO elősegítik azt. (35)
A PTPC működését sokféle anyag befolyásolhatja (7. ábra), melyek hatásai sejttípusonként eltérőek lehetnek, ami azt jelzi, hogy a PTPC szabályozása is sejttípustól függ (59). A PTPC nyitását előidézhetik a a mitokondrium működése során is keletkező reaktív oxigéngyökök (ROS). Petrosillo és mtsai kimutatták, hogy ROS hatására peroxidálódhat a cardiolipin (a mitokondriumban található foszfolipid), és ennek
21
hatására válik le a citokróm-c a mitokondrium belső membránjáról, ami az első lépése az apoptózis során bekövetkező citokróm-c kibocsátásnak (60). Sokféle mechanizmust láthattunk, amelyek során a mitokondriumból a citokróm-c és egyéb anyagok kiszabadulhatnak. Némely csak a külső membrán permeabilizálódásának fokozódásával, némely a belső membrán áteresztőképességének növekedésével is jár. Utóbbi esetekben természetesen a légzési lánc működése is leáll. A kérdés ekkor az, hogy vajon egy kaszpázaktivációval járó apoptózis vagy egy bioenergetikai /redoxkatasztrófa történik-e. Ezt a mitokondrium és a glikolízis által termelt ATP mennyisége dönti el. 2.3.5. A mitokondrium és a kaszpázok kapcsolata A citokróm-c kibocsátása, azért is fontos jelenség, mert ennek a molekulának a segítségével történhet meg az apoptózis effektor molekuláinak, a kaszpázoknak az aktiválása, amelyek azután befejezik az apoptotikus programot, feldarabolják a sejtet apoptotikus testekké. A citokróm-c a citoplazmában egy másik kulcsfaktorral, az Apaf-1-gyel és dATP-vel vagy ATP-vel együtt alkotja az apoptoszómát. Ennek a nagy, többtagú DISChez hasonló enzimkomplexnek, az előbb említett molekulákon kívül tagja még a prokaszpáz-9 is. A komplex feladata az utóbbi aktiválása és ennek segítségével a kaszpázkaszkád elindítása (23). Az apoptoszómának a kialakulását gátolhatják hősokk-fehérjék, valamint a Bcl-2 és a Bcl-xL is. A Hsp90 az Apaf-1-hez, a Hsp27 a citokróm-c-hez, a Hsp70 pedig az Apaf-1-hez vagy a prokaszpáz-9-hez kötődve gátolja a komplex kialakulását (61-64). A kaszpázok apoptoszómán keresztüli aktivációját az apoptózist gátló fehérjecsalád (IAP család) tagjai, beleértve az XIAP-t is, képesek gátolni. Az IAP okozta gátlás viszont kiküszöbölhető egy mitokondriális fehérje, a Smac/Diablo (second mitochondria-derived activator of caspases/direct IAP binding protein with Low p1) segítségével, amely a citokróm-c-vel egyidőben juthat ki a mitokondriumból, és a sejtet az IAP-k gátlása révén az apoptózisra érzékennyé teszi (65). Az előbb leírt mechanizmus alapján a citokróm-c kibocsátás és a kibocsátás módjától függő mitokondriumdepolarizáció előbb következik be, mint a kaszpázok,
22
főként az effektor kaszpázok aktivációja. Sok korábbi kísérletben, amikor a kaszpázok aktiválódásának idejét próbálták meghatározni, azt az eredményt kapták, hogy a kaszpázok aktivációja még a mitokondrium előtt bekövetkezik. Ezekben az esetekben ugyanis a kaszpázok gátlásával a mitokondrium depolarizáció is gátolható volt. Később vetődött fel az az elképzelés, mely szerint a mitokondrium és a kaszpázok egy „öngerjesztő”, egymást pozitívan erősítő kör részei (66). Ezt támogatják azok a kísérleti eredmények is, melyek arról számolnak be, hogy egy kezdeti, alacsony szintű citokrómc kibocsátás elindíthatja a kaszpáz-9 és -3 aktiválódását, de még nem történik meg a depolarizáció. Egy későbbi esemény során viszont nagy mértékű citokróm-c kiáramlás már depolarizációt okoz. Az utóbbi kaszpázgátlókkal gátolható volt, míg a korábbi nem. Tehát a kaszpázok okozták a nagymértékű citokróm-c kiáramlást és a mitokondrium depolarizációját (67). Milyen molekulákon keresztül fejtették ki hatásukat a kaszpázok? A kaszpáz-3 aktiváció
után
kimutatták
Bcl-2
hasítását
(ezzel
az
antiapoptotikus
hatás
proapoptotikussá válik), más kísérletekben pedig prokaszpáz-8 és Bid aktiválását is. Feltételeznek még más citoplazmatikus faktort is, amely a kaszpázok hasítása révén vezet a mitokondrium depolarizációjához és a citokróm-c kiáramlásához. Elmondhatjuk tehát, hogy a mitokondriumdepolarizációt okozó tényezők közé tartoznak a kaszpázok is, bár az általuk előidézett események, így a mitokondriumdepolarizáció is az apoptózis folyamatának inkább a későbbi történései közé tartozik. Az eddig leírtakban a mitokondriumból kiszabaduló citokróm-c aktiválta a kaszpázokat. Kiderült, hogy ezeknek az enzimeknek az eloszlását is szabályozhatja a mitokondrium, ugyanis a mitokondriális prokaszpáz-2 és -9 a PTPC nyílása után kerül ki a citoszolba (68). A prokaszpáz-3-nak szintén van citoplazmatikus és mitokondriális előfordulása és a Bcl-2 szabályozza ezek aktiválódását. Chandra és mtsai (69) kimutatták, hogy prokaszpáz enzimek többsége kikerül a mitokondriumból, és a citoplazmában aktiválódik. Az aktív enzimek egy része viszont (aktív kaszpáz-3, -9) a mitokondriumba szállítódik és aktiválja az ott levő prokaszpázokat.
23
2.3.6. A mitokondriumból kibocsátott toxikus faktorok – kaszpáz-függő és -független apoptotikus utak Mostanában egyre több közlemény jelenik meg, ahol a programozott sejthalál formája kaszpáz-független apoptózis, vagy kaszpáz-független nekrózis. A citokróm-c kibocsátása során a citokróm-c mellett sok más sejthalált indukáló faktor is kiszabadul a membránok közötti térből. Ezek között van a korábban említett IAP-gátló Smac/Diablo, az apoptózis-indukáló faktor (AIF), a DNS- létrát létrehozó Endonukleáz G és a szerinproteáz aktivitású Omi/HtrA2. Az oxidoreduktáz aktivitással is rendelkező AIF DNS-fragmentációt indukál kaszpázoktól
függetlenül.
A
mitokondriummembrán
depolarizációja
után
a
citoplazmába kerül, majd a sejtmagba transzlokálódik, ahol a kromatin kondenzációját idézi elő és nagyméretű DNS darabok (~50 kb) keletkeznek. A feltételezések szerint bizonyos magi nukleázok, pl. az Endonukleáz G játszik még szerepet ebben a DNS fragmentációban. A fent említett hatásokon kívül a mitokondrium depolarizációját, a citokróm-c
és
a
prokaszpáz-9
kibocsátását,
valamint
a
foszfatidil-szerin
plazmamembránban való kifordulását okozza (70). A Hsp70 nemcsak az Apaf-1-et képes kötni, hanem az AIF-hez kötődve gátolja annak apoptotikus hatását (71). Az apoptózis egyik első észlelési módja a DNS-létra kimutatása volt. Ezt a nukleoszómális darabolódást a CAD (caspase activated DNase) végzi, amelyet a kaszpázok aktiválnak az ICAD hasításával. Viszont az ICAD-knockout egerek esetén is találtak oligonukleoszómális DNS fragmentációt (72). Van Loo és mtsai kimutatták, hogy apoptotikus szignál hatására az Endonukleáz G a mitokondriumból kiszabadulva kaszpáz-független DNS-fragmentációt idéz elő (73). A mitokondrium apoptózist indukáló faktorai között van az Omi/HtrA2 fehérje is. Ez az 50 kDa-os szerin-proteáz homológiát mutat a bakteriális HtrA (high temperature requirement A) endoproteázzal, mely normál hőmérsékleten chaperon, míg magas hőmérsékleten proteázaktivitással rendelkezik (74). Az Omi szintén kettős aktivitással rendelkezik: citoplazmába való kerülése után az IAP-fehérjékhez kapcsolódik és gátolja a kaszpázokhoz való kötődésüket, így kaszpáz-függő apoptózist indukál (75). Ugyanez a fehérje szerin-proteáz aktivitásával pedig kaszpáz-független apoptózist indukál, eddig még ismeretlen módon.
24
Egyre több molekulát fedeznek fel, melyek résztvevői lehetnek egy kaszpázfüggetlen sejthalál folyamatnak. Chang és mtsai találták meg a WOX1 oxidoreduktáz fehérjét, mely a Bcl-2 expresszióját csökkenti, a p53 expresszióját/aktivitását növeli (76). Ez a fehérje is a mitokondriumban található, ahonnan kiszabadulva a sejtmagba transzlokálódik. Felfedezték az AIF-nek két homológját is: az AMID-ot (77) és a PRG3-at (78). Az AMID a külső mitokondriummembránban található és apoptózist indukál, ami független a kaszpázoktól, a p53-tól és a Bcl-2-től. A PRG3 viszont a citoplazmában található, p53- és kaszpáz-függő apoptózist okoz. 2.3.7. Programozott sejthalál – apoptózis vagy nekrózis? A sejthalálnak más formái is lehetnek az apoptózis mellett. Az egyik legjobban feltérképezett forma az apoptózis mellett a nekrózis. A nekrózis során a sejt megduzzad, a citoplazmában vakuolumok jelennek meg, a sejtmembrán felszakad, a DNS pedig darabolódhat, de véletlenszerűen, nem a nukleoszómák mentén. A programozott sejthalált sokáig az apoptózissal azonosították, de az utóbbi években megjelentek olyan közlemények, ahol a programozott sejthalálnak alternatív formáit is kimutatták. Bizonyos esetekben „apoptózisszerű sejthalálról” vagy „nekrózisszerű sejthalálról” beszélnek, mivel a sejtek morfológiájukban vagy az apoptózisra vagy a nekrózisra hasonlítanak, de egyes alkotóelemek hiányoznak a pontos besoroláshoz (79). Más esetekben pedig ugyanannak az anyagnak a segítségével nekrózist és apoptózist is sikerült kiváltani, függően a környezettől, a dózistól (80) vagy sejttípustól, mint a TNFα (81) és a TRAIL (82) esetében. A TNFα által kiváltott nekrózis során a RIP, a TRAF2 és a FADD közvetítette a nekrotikus jelet, ami a ROS felszabadulás után keletkezett. Az eredmények vizsgálata során kitűnik, hogy a sejtelhalálás során általában bizonyos proteázok aktiválódnak, amelyek a folyamatok végrehajtói. Ahogy az apoptózisban részben a kaszpázok játsszák a fő szerepet, addig a nekrózis során a szintén cisztein-proteáz kalpain aktiválódik és felelős számos fehérje darabolódásáért (83). Bizonyos kaszpáz-független sejthalál formák során pedig a lizoszómális katepszinek a felelősek a DNS-fragmentáció elindításáért (84).
25
2.4. Sejthalált kiváltó természetes és mesterséges anyagok Aktiválások-gátlások bonyolult, molekuláris rendszere tartja életben a sejteket, illetve megfelelő jelre elpusztítja azokat. Különböző betegségek során ez a szabályozás sérülhet, egyes tagok meghibásodása, túltermelése megakadályozhatja a normális működést. A daganatos megbetegedésekben az egyik fő probléma a sejthalál elmaradása,
gátlása,
míg
autoimmunbetegségekben,
AIDS-ben
vagy
néhány
idegrendszeri betegségben a túlzott mértékű sejthalál a betegség jellemzője. Ezeknek a betegségeknek a gyógyítása során fontos, hogy vissza tudjuk állítani a sejthalál normális menetét és mértékét. A kutatások nagy része arra irányul, hogy különböző anyagok segítségével sejthalált célzottan tudjunk előidézni vagy gátolni a beteg sejtekben, szervekben, ezzel elősegítve a gyógyulást. Az apoptózist befolyásoló anyagok lehetnek mesterségesek és természetes eredetűek. A pontos hatásmechanizmusuk megismerése szükséges ahhoz, hogy alkalmazásuk racionális legyen. 2.4.1. A transzformáló növekedési faktor béta 1 (TGFβ1) A TGFβ1 multifunkcionális citokin a TGFβ fehérje család tagja, amelybe több citokin is tartozik [TGFβ, activin, bone morphogenic factor (BMP)]. A TGFβ1 a sejtek növekedését, differenciálódását és apoptózisát befolyásolja. A TGFβ1 gátolja az immunrendszert (85), a T-lymphocyták, az NK-sejtek, a neutrofil granulocyták, a makrofágok és a B-sejtek proliferációját és funkcionális differenciációját. Számos megfigyelés támasztja alá, hogy a daganatsejtek TGFβ1-t expresszálva segítik elő saját növekedésüket a lokálisan kifejtett immunszupresszív hatással (86). A TGFβ1 hatását sejtfelszíni receptorokon keresztül (TGFβRI és TGFβRII) fejti ki, melyek a szerin/threonin-kináz receptorcsaládba tartoznak. A TGFβ1 TGFβRI-RIIhöz való kötődésének hatására a RII foszforilálja a RI-et, amely aktiválja a jelátvitelt végző Smad molekulákat (87). A Smadok felelősek azért, hogy a jel a receptoroktól a sejtmagba szállítódjon, ahol transzkripciós-faktorok segítségével „TGFβ-reszponzív” elemekhez kapcsolódnak és különböző gének átírását szabályozzák. A TIEG (TGFβ induced early gene) az egyik legelső a gének között, amit a TGFβ1 aktivál (88). Ez a fehérje 3 zinkujjmotívumot tartalmaz és transzkripciós faktorként működve gátolhatja
26
bizonyos gének kifejeződését, ezen keresztül pedig a sejtek növekedését, proliferációját gátolja, apoptózisukat indukálja (89). A TGFβ1 által kiváltott apoptózisnak a mechanizmusa még nem teljesen tisztázott. Hepatocitákban a TGFβ1 által kiváltott apoptózis ROS emelkedéssel és az antiapoptotikus Bcl-2 fehérjék expressziójának csökkenésével jár (90). Néhány lymphoma (pl. egyes CLL-ek) képes TGFβ1 termelésre, ugyanakkor elveszíti érzékenységét a TGFβ1-gyel szemben (91). 2.4.2. Retinoidok – természetes és mesterséges retinsavak A retinoidok természetes és mesterséges analógjai az A-vitaminnak, a sejtek differenciálódását, proliferációját és apoptózisát befolyásolják. Az all-transz-retinsav (ATRA) és mesterséges analógja, a N-(4-hydroxyphenil)-retinamide (fenretinid, 4HPR) hatékony daganatellenes szerek, használják pl. - az akut promyelocitás leukémia esetén, ahol az ATRA a daganatos sejtek differenciálódását segíti elő (92), míg neuroblasztoma kezelésében a 4HPR cytotoxikus hatását használják ki (93). Nemcsak antiproliferatív, hanem apoptotikus hatásuk is van, amit mind in vivo (94), mind in vitro [pl. emlőráksejteken, petefészekráksejteken, akut lymphoblasztos leukémia sejteken, (95-97)] igazoltak. Lymphoma sejteken viszont igen kevés vizsgálat történt a retinoidokat illetően. A retinoidok a hatásukat a specifikus retinoid/rexinoid receptorokon (RAR, RXR) keresztül fejtik ki. Bizonyos esetekben viszont kimutatták, hogy receptorfüggetlen is lehet a retinoidok hatása (98). Mind az ATRA, mind a 4HPR a mitokondriális apoptotikus utat használja, de különböző módon. Az ATRA akut myeloblasztos leukémia sejtekben csökkentette a Bcl-2 szintjét (99), míg HeLa sejtekben és izolált mitokondriumok esetén a ANT-hoz kötődve a mitokondriális PTP nyílását indukálta (100). A 4HPR a légzési lánc gátlásával növeli a ROS termelődést, valamint a Bcl-2 család fehérjéinek szabályozásával okoz PTP nyitást (101, 102). Ezek az események pedig a kaszpázkaszkád aktiválódását és DNS-fragmentációt indukálnak.
27
2.4.3. Cisplatin A cisplatint (cis-diammin-di-kloroplatinum(II), CDDP) bár már 25 éve használják a daganatellenes terápiában, molekuláris hatásmechanizmusa még mindig nem tisztázott. Az ismert, hogy a DNS-hez kötődik és interkaláló ágensként keresztköti a kettős spirált, ami a transzkripció és a DNS kettőződése során DNS-töréseket okoz (103). A DNS-sérülés hatására sok szignáltranszdukciós molekula aktiválódik (pl p53, p78, MAPK). Ha a törések nem javítódnak ki, akkor sejthalált indukáló jelek indulhatnak el. Kimutatták, hogy a sejt állapotától, illetve a szer koncentrációjától függően apoptózis vagy nekrózis következik be (104). Az apoptózis során a mitokondrium depolarizációját és a kaszpázok aktivációját figyelték meg. A CDDP hatását több faktor is gátolhatja: 1.) ha foszfolipidekhez kötődik, akkor csökken a sejtbe jutó molekulák mennyisége 2.) ha a sejtbe bejutó szer glutationhoz kötődik, akkor transzportfehérjék „kiszállítják” a sejtből 3.) ha gátolt a DNS-t javító és vizsgáló fehérjék működése 4.) ha az apoptotikus útvonalak hibásak/gátoltak (105). CDDP hatására a Bcl-2 szintje csökken (106), míg a proapoptotikus tagok változatlanok maradnak (107). Ez jelzi, hogy a rezisztenciának a magas Bcl-2 szint is oka lehet. Megfigyelték, hogy a JNK - a stressz aktiválta protein kináz (SAPK) útvonal tagja aktiválása szükséges a cisplatin indukálta apoptózishoz (108). A stockholmi Karolinska Intézetben kimutatták, hogy a 224 melanóma sejtekben a cisplatin által kiváltott apoptózisban a Bak molekula központi szerepet játszik (109). Ebbe a kutatásba kapcsolódtam be, amelynek során tovább vizsgáltuk különböző melanóma sejtvonalakban a Bak aktivációját és más fehérjékkel való kapcsolatát a cisplatin által kiváltott apoptózisban.
28
3. CÉLKITŰZÉSEK Célkitűzésünk az volt, hogy pontosabban megismerjük bizonyos természetes és mesterséges anyagok által kiváltott apoptózis mechanizmusát. 3.1. Célkitűzéseink a TGFβ1 hatásának vizsgálata során •
A TGFβ1-et termelő B-lymphoma sejtekben, melyek érzéketlenek a saját TGFβjukra, TGFβ1 által indukálható-e az apoptózis?
•
Ha igen, akkor melyik apoptotikus jelátviteli út aktiválódik a TGFβ1 hatására Blymphoma sejtekben és ez hogyan befolyásolható,
•
TGFβ1 kezelés hatására történik-e sejtciklusgátlás a HT58 sejtekben?
3.2. Célkitűzéseink az ATRA és a 4HPR hatásának vizsgálata során •
Képesek-e a retinsavak apoptózist indukálni B-sejt eredetű lymphoma sejtekben?
•
Különböző apoptotikus mechanizmust használ-e az ATRA (természetes retinsav) és szintetikus analógja, a 4HPR?
3.3. Célkitűzések a Bak konformációváltozásának vizsgálata során •
Különböző melanoma sejtvonalakban cisplatin hatására aktiválódik-e a Bak?
•
A Bak-nak milyen aktivációs lépéseken kell keresztül mennie az apoptózis indukció során, és milyen tényezők befolyásolják az aktivációt?
29
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
4.1. A kísérletekben használt sejtvonalak
A TGFβ1 és a retinsavak hatásának vizsgálata során lymphoma sejtvonalakat használtunk: • HT58, B-sejt eredetű non-Hodgkin lymphoma (110); • BL41 EBV-negatív B-sejtes Burkitt-lymhpoma (ATCC number: CRL-2323) • BL41/95 a BL41 Epstein-Barr vírus fragmenttel transzfektált sejtvonal. A cisplatin hatásának vizsgálatánál melanoma sejtvonal volt a modell rendszer: •
AA, DFW humán metasztatizáló melanoma sejtvonalak. A stockholmi Carolinska Institute Radiumhemmet's Research laboratóriumban izolálták. A sejteket 37°C-on, 5% CO2-t tartalmazó termosztátban, RPMI 1640 (Sigma)
médiumban tenyésztettük, melyben 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco), L-glutamin (Sigma) és penicillin-streptomycin (Sigma) található. A retinoid kezelések során 3 %-os szérum koncentrációt használtunk. A kísérleteket 24 lyukú tálcán 2x106 sejt/lyuk sejtsűsűséggel végeztük. 4.2. A kísérletekben használt anyagok, kezelések A kísérletekben az apoptózis indukálásra sósavval aktivált TGFβ1-t (0,05-5 ng/ml) (R&D System), retinsavat (20-40 µM) (all-transz retinsav, ATRA) (Sigma), N(4-hydroxyphenyl)-retinamid-ot (3-10 µM) (fenretinide, 4HPR) (RW Johnson, Pharmaceutical Research Institute, Spring House, PA, USA), cisplatint (30-40 µM) [cisdiamminedichloro platinum (CDDP)] (Platinol, Bristol-Myer-Squibb), TRAIL (25-100 ng/ml) (Alexis) használtunk. A kaszpázok gátlására: általános kaszpázgátlót, z-VAD-fmk (50-100 µM) (Enzyme System Products, Bachem); specifikus kaszpáz-8 gátlót, z-IETD-fmk (50 µM) (Pharmingen, Becton Dickinson Co.), z-LETD-fmk (50 µM) (Biorad); specifikus
30
kaszpáz-9 gátlót, z-LEHD-fmk (50 µM) (Pharmingen, Becton Dickinson Co.) használtunk, melyeket az apoptózis indukáló szerek előtt fél órával adtunk. A gátlószereket és a retinoidokat dimetil-szulf-oxidban (DMSO) oldottuk, a többi apoptózis indukálószert vízben, víz alapú oldatban oldottuk. A kezelések során a kontrollokhoz a megfelelő oldószert hozzáadtuk. A halálligandok hatásának gátlására neutralizáló ellenanyagokat használtunk: TRAIL-R2Fc (100 ng/ml) (Alexis), monoklonális anti-humán TNFα (1 mg/ml) (Alexis), és Nok-1 (1 mg/ml) (anti-FasL antitest, Pharmingen). Az oxidatív stressz gátlására antioxidánsokat használtunk: N-acetil-cystein, NAC (5 mM) (Fluka Chemie AG Buchs); C-vitamin, L-Ascorbic-acid (Aldrich); 1Pyrrolidin-N-dithiocarbodithioicic-acid, PDTC (Aldrich); trolox, 6-Hydroxy-2,5,7,8tetramethylcroman-2-carboxylic acid (Aldrich). Ezeket az anyagokat fél órával az apoptózist indukáló anyagok adása előtt adtuk. 4.3. Áramlási citometria Kísérleteinkben FASCan (Becton-Dickinson) áramlási citométert használtunk, mely képes két fényszórási adat és 3 különböző fluoreszcenciatartomány érzékelésére. Ebben a citométerben a gerjesztést 488 nm-es 15 mW-os Argon ion lézer végzi. A fényszórási adatok a sejtek fizikai paramétereivel arányosak és a sejteknek a gerjesztő lézer előtt való áthaladásukkor keletkeznek. Az egyik érték az előre fényszórás (forward scatter, FSC), mely a sejtek nagyságával arányos. A másik érték az oldalt
10
40 30 10
20
SSC-Height -->
40 30
R1
20
SSC-H -->
50
50
60
60
fényszórás (side scatter, SSC), amely a sejtek granuláltságával arányos.
10
20
30
40
50
60
10
20
30
40
50
FSC-Height -->
FSC-H -->
HT58 sejtvonal Lizált vérminta 8.ábra Különböző populációk fényszórási tulajdonságai (FSC, SSC paraméterek) Pirossal a lymphocyta, zölddel a monocyta, kékkel a granulocyta populációt jelöltük.
31
60
Az értékelést különböző szoftverek segítségével végezhetjük. Itt bizonyos populációkat kijelölhetünk, melyeken az értékeléseket el akarjuk végezni, ahogy a 8. ábrán láthatjuk. Ezt a kijelölést elektromos kapuzással (R1) és színezéssel valósíthatjuk meg. 4.3.1. Apoptózis (subG1) és sejtciklus mérés Az apoptózis mérése többféleképpen történhet, függően attól, hogy az apoptotizáló sejtek melyik tulajdonságát szeretnénk kimutatni. Tekintettel arra, hogy vizsgálatainkban
tenyészetekből
kialakított
sejtszuszpenziókat
alkalmaztunk,
a
leghatékonyabbnak a DNS-fragmentáció áramlási citometriával való kimutatása bizonyult. Ennek során el tudjuk különíteni az élő, nem fragmentált DNS-sel rendelkező sejteket az apoptotizáló sejtektől, melyek az apoptózis során nukleoszomális DNSfragmentáción mennek keresztül. A sejteket a különböző kezelések után 70 %-os –20 oC-os etanolban fixáljuk. Ez denaturálja a sejtben a fehérjéket, így megőrződik a sejtek szerkezete, valamint permeabilizálja a sejtmembránt, ami lehetőséget ad olyan DNS-festékek bejutására, melyek az ép plazmamembránon képtelenek átmenni. Ezután a sejteket RNáz-t tartalmazó (100 µg/ml RNáz A) lúgos pH-jú puffer oldatban (200 mM-os dinátrium foszfát puffer, pH=7,8, citráttal beállítva) inkubáljuk. Ez a puffer segíti az RNS eltávolítását (melyhez a festékek ugyanúgy hozzákötődnének, mint a DNS-hez és így hamis eredményeket kapnánk), valamint az apoptózis során keletkezett kisméretű DNSdarabok sejtből való kiúszását. Így az apoptotizáló sejtek kevesebb DNS-sel rendelkeznek a mérés során, mint a normális DNS mennyiséggel rendelkező (pl. G1 sejtciklus fázisban levő) sejtek. A mérések során etidium-bromidot (5 µg/ml végkoncentrációban) használtunk, mely interkaláló DNS-festék, és a DNS-hez való kötődés után a fluoreszkáló tulajdonsága sokszorosára nő. A pusztult sejtek a kevesebb DNS-tartalom miatt, kisebb fluoreszcenciát mutatnak, mint a G1 fázisos sejtek: subG1 populáció (9. ábra A).
32
1100
300 100
500
S fázis
200
700
Number
G2 fázis
subG1 populáció
100
300
Number
900
G1 fázis
A.
10
1
10
2
10
3
10
B.
4
10
30
50
70
FL2-Height 48h D2 -->
90
110
140
170
200
230
FL2 Area -->
9. ábra DNS-fragmentáció (A) és sejtciklus mérés (B) során kapott hisztogrammok
A mérés során nemcsak a fluoreszcenciamagasságot (FL2 Height) használjuk fel, hanem tároljuk az FL2 Area (görbe alatti terület) és Width (jelszélesség) értékeket is, amelyek segítségével sejtciklus elemzést is végezhetünk. Az apoptózis mérés során logaritmikus erősítést használunk, hogy mind a normális, mind a pusztuló sejteket megjeleníthessük a skálán, míg a sejtciklus elemzésnél lineáris erősítést, hogy a sejtciklus minden fázisát részletesen láthassuk (9. Ábra B). Ahhoz, hogy azokat a sejteket vizsgáljuk, melyekre a kísérlet során kíváncsiak vagyunk, megfelelő kapuzásokat kell alkalmaznunk. A DNS-fragmentáció vizsgálata során az FSC – FL2 Height diagrammon állítunk fel egy kaput (10. ábra A), míg a sejtciklus értékeléséhez a legjobb segítséget az FL2 Area (FL2 A) – FL2 Width (FL2 W) diagrammon készített kapu nyújtja (10. ábra B). A kapuzások után kapott diagrammonokon (9. ábra) újabb kapuk segítségével
60
10
4
meghatározhatjuk a különböző populációkat (pl. subG1). 50
R1
40 10
10
1
20
30
FL2-W -->
2
10
FL2-H -->
10
3
R2
A.
10
1
10
2
FSC-H -->
10
3
10
4
B.
10
20
30
40
50
60
FL2-A -->
10. ábra Különböző kapuzási módszerek DNS-fragmentáció és sejtciklus mérése során A.) A subG1 populáció meghatárzásához a kapuzás az FSC Height (FSC H)- FL2 Height (FL2 H) dot ploton. B.) A sejtciklus meghatározásához a kapuzás az FL2 Area (FL2 A) – FL2 Width (FL2 W) dot ploton
33
4.3.2. Apoptózis és nekrózis mérése egyidőben A nekrózis során a plazmamembrán áteresztővé válik a különböző DNS festékek (pl. propidium-jodid, PI) számára. Ez az apoptózisban csak igen későn történik meg, (ún. szekunder nekrózis). Vitális festéseknél (az élő sejtekhez adunk DNS festéket, ami az áteresztő plazmamembránt mutatja ki) a festődött sejteknél nem dönthető el egyértelműen, hogy azok nekrózisban vagy apoptózisban pusztultak el. Ha ilyen festés után a sejteket etanollal fixáljuk és megpróbáljuk a fragmentált DNS darabokat kivonni belőlük, mint a subG1 mérés során, akkor megfigyelhető, hogy sokkal kevesebb DNS darab kerül ki a sejtekből, illetve eltérő fényszórási tulajdonságokkal rendelkeznek azok a sejtek, melyek előzőleg PI-ot vettek fel. Ezeket a jelenségeket használja ki ez a mérés. A minták előkészítése: A kezelt sejtekhez PI-ot adunk 10 µg/ml végkoncentrációban és 15 percig inkubáljuk őket szobahőmérsékleten, majd 70 %-os –20 oC-os etanolban fixáljuk. Ezután a további lépések megegyeznek a subG1 mérésre való előkészítéssel. A mérés során a nekrotikus populációnak változik a fényszórása. Ezeknek a sejteknek a DNStartalma megegyezik az élő sejtekével, de csökken az FSC vagy SSC értékük. Ennek alapján el lehet őket különíteni az élő sejtektől és az apoptotikus sejtektől is, melyek 10 4
kevesebb DNS-sel rendelkeznek, mint az élők (11. ábra).
R1
10 3
R2
10 1
10 2
FL2-H -->
R3
10 1
10 2
10 3
10 4
FSC-H -->
11. ábra Apoptózis és nekrózis kimutatása egyidőben Az élő sejtek pirossal, a nekrotikus sejtek zölddel, a fragmentált DNS-sel rendelkező sejtek kékkel jelölődnek az ábrán. A vízszintes tengelyen az FSC értékek, a függőleges tengelyen az FL2 fluoreszcencia értékek láthatóak.
34
4.3.3.1. Mitokondrium depolarizáció mérése A mitokondrium depolarizáció fontos lépése az apoptózisnak, ezért az apoptózis vizsgálata során lényeges ennek az eseménynek a kimutatása, időbeli lejátszódásának nyomonkövetése. Vizsgálataink során többféle festéket is kipróbáltunk, hogy összehasonlítsuk érzékenységüket, tulajdonságaikat. A felhasznált festékek: •
DiOC6 – 3,3’dihexil-oxa-carbocianin-jodid (Sigma) (400-1,25 nM)
•
CMTMRos – klorometil-tetrametilrosamin (MitoTracker Orange, Molecular Probes) (400-6 nM)
•
JC1
–
5,5’,6,6’tetrakloro-1,1’,3,3’-tetraetil-benzimidazolil-carbocianin-jodid
(Molecular Probes) (20-1,25 µM) •
Rhodamin 123 – 2-(6-amino-3-imino-3H-xanthen-9il)-benzoesav-metil-észter (Sigma) (10-0,3 µM)
A festékek működése: A DiOC6 lipofil festék, mely a polarizált membránokhoz kapcsolódik és zölden (FL1) fluoreszkál. Nagyobb koncentrációban a plazmamembránhoz és az ER-hez ugyanúgy kötődik, mint a mitokondriumhoz, míg alacsony koncentrációban alkalmazva csak a mitokondrium belső membránjához kötődik, mert ez a legpolarizáltabb membrán a sejtben. A depolarizáció során a festék kioldódik a sejtből, így csökken a sejtek zöld fluoreszcenciája. A CMTMRos mitokondriumszelektív festék, mely enyhén tiol-reaktív klorometil-csoportot tartalmaz. A mitokondriumba kerülve kötődik a tiol csoportokhoz, és narancssárgán fluoreszkál (FL2). A klorometil-csoport biztosítja, hogy a festék a mitokondriumban
maradjon
a
sejtek
fixálása
után.
Érzékeny
a
mitokondriumdepolarizációra még fixálatlan sejtekben. A JC1 a mitokondrium membránpotenciáljára érzékeny cianin festék. Két fajta fluoreszcenciát mutat: monomer formában (kis koncentrációban vagy alacsony potenciál esetén) zöld fluoreszcenciával (FL1), aggregátum formában [nagyobb koncentráció (0,1 µM) vagy magas potenciál esetén] piros fluoreszcenciával (FL2) világít. Depolarizáció esetén a sejtek piros fluoreszcenciája csökken, míg a zöld fluoreszcencia nő.
35
A Rhodamin 123 kationos fluoreszcens festék, amely a sejtbe való bejutása után az aktív mitokodriumba kerül, és zölden fluoreszkál (FL1). A depolarizáció során a sejtek zöld fluoreszcenciája csökken. A mitokondrium depolarizációját staurosporin, proteinkinázgátló (Sigma) (1 µM) vagy CCCP protonofór (100 µM) segítségével indukáltuk HT58 lymphoma sejtekben. A különböző festékek fluoreszcencia-változásait összevetettük a mintákon mért DNS-fragmentáció értékekkel (3. táblázat), valamint vizsgáltuk, hogy melyik festék esetén könnyebb elkülöníteni a normális és a depolarizált mitokondriummal rendelkező sejteket (fluoreszcencia csatornaszám különbség) (12. ábra). A Rhodamin123 festék esetében a mért fluoreszcencia a koncentráció függvényében változott. A fluoreszcencia csatornaszám különbség nem változott a koncentráció változásával, ezért a legmegfelelőbbnek a 10 µM-os koncentráció bizonyult. Itt elég nagy volt a fluoreszcenciája a festéknek a többi festékhez hasonló beállítások mellett.
36
3. Táblázat. A táblázatban a depolarizált mitokondriummal rendelkező sejtek mennyiségét láthatjuk %-os értékekkel Név
JC1
DiOC6
CMTMRos
Rhodamin123
subG1
(20 µM)
(10 nM)
(50 nM)
(10 µM)
sejtek
Kontroll
20
28
29
26,5
20,5
Staurosporin
55
74
70,5
41,5
66,5
A.
B. DiOC6 hígítás
CMTMRos hígítás 140
Meanx különbség
Meanx különbség
140
120
100
80
60
100
80
60 0
5
10
15
20
0
konc. (nM)
C.
100
200
300
400
konc. (nM)
JC1 hígítás
12. ábra Fluoreszcencia csatornakülönbség változása a mitrokondrium festékek hígítása során A. DiOC6 hígítás B. CMTMRos hígítása C. JC1 hígítása
140
zöld piros
120
Meanx
120
100
80
60 0
5
10
15
20
konc. (uM)
A 3. Táblázatban szereplő festékkoncentrációkat a hígítási sorokból határoztuk meg. A DiOC6 esetében a 10 nM-os koncentrációnál találtuk a legnagyobb csatornakülönbséget, míg a CMTMRos esetén 50 nM-os koncentráció volt a legmegfelelőbb. A JC1 esetén a koncentráció növelésével a zöld fluoreszcencia nem, míg a piros fluoreszcencia nőtt, ami kérdésessé tette, melyik koncentráció a megfelelő.
37
A
további
kísérletekben
a
DiOC6
festéket
használtuk
a
mitokondriumdepolarizáció kimutatására, míg immunfestéseknél a CMTMRos festéket, mivel ez fixálható festék és így tartósan lehet jelölni a mitokodriumokat. 4.3.3.2. A minták előkészítése mitokondriumdepolarizáció méréshez különböző festékekkel DiOC6 és CMTMRos festés: •
A kezelés után a sejtekhez DiOC6 festéket (végkoncentráció: 10 nM) vagy CMTMRos (végkonc.: 50 nM) adtunk. [DiOC6 esetében még propidium-jodidot (végkoncentráció: 10
•
g/ml) is adtunk a nekrotikus sejtek elkülönítésére]
15 perc sötétben való inkubálás után azonnal mértük a mintákat áramlási citométerrel.
JC1 és Rhodamin 123 festés: • A kezelés után a sejtekhez JC1 festéket (végkoncentráció: 20 µM) vagy Rhodamin 123 festéket (végkoncentráció: 10 µM) adtunk • 15 percig sötétben inkubáltuk, majd mosás után az üledéket 0,5 ml PBS-ben vettük fel és a mintákat áramlási citométerrel mértük. A DiOC6 mérés során propidium jodidot (PI) is adtunk a mintákhoz, így a depolarizált mitokondriummal rendelkező sejteket két populációra lehetett osztani annak alapján, hogy áteresztették-e már a PI-t vagy sem (13. ábra). Azok a sejtek, melyek már áteresztették ezt a vitális festéket, permeábilis plazmamembránnal rendelkeznek. Azt nem lehet megállapítani, hogy ezek a sejtek az apoptózis késői fázisában vannak-e (szekunder nekrózis), és ezért engedik be a PI-t, vagy ténylegesen nekrózissal pusztultak el.
38
4
10
3
2
10
R2 10
1
FL2-H -->
10
3
2
4
5 10
1
10
2
10
3
10
4
FL1-H -->
13. ábra Mitokondriumdepolarizáció mérése DiOC6 (FL1-H) és PI (FL2-H) segítségével Az 5-ös negyedben találhatóak az élő DiOC6 pozitív, PI negatív sejtek. A 4-es negyedben a depolarizált mitokondriummal, de ép plazmamembránnal rendelkező sejtek, a 2-es negyedben pedig a nekrotizált PI pozitív sejteket láthatjuk.
4.3.4. A reaktív oxigéngyökök kimutatása áramlási citometriával A reaktív oxigéngyökök (ROS) szabályozói és hírvivői az apoptózisnak. A mennyiségük illetve fokozott termelődésük áramlás citometriai meghatározására 2’-7’dikloro-dihidro-fluoreszcein-diacetát (H2DCF-DA) redox festéket használtunk. Ez a festék deacetilálódik a sejten belül, ami megakadályozza a kidiffundálódását, és érzékeny különböző típusú oxidatív anyagokra (H2O2, NO). Oxidáció hatására zöld fluoreszcenciája növekszik. A minták előkészítése és mérése: •
A mintákhoz 15 perccel a kezelés előtt H2DCF-DA-t adunk (végkoncentráció: 50 µM)
•
A kezelés végeztével azonnal mérhetjük a mintákat áramlási citométerrel
4.3.5. A Bak fehérje aktivációjának kimutatása immuncitokémiával és áramlási citométerrel A Bak fehérjének az aktivációját specifikus ellenanyagok segítségével mutattuk ki. A Bak fehérje esetében az N-terminális doménje ellen specifikus ellenanyagot (Ab1 clone, Oncogene Research Products), illetve a molekula BH-3 doménjére specifikus ellenanyagot [Santa Cruz, G-23 (Ab3)] használtunk.
39
A minták előkészítése és mérése: A sejtek 0,25 %-os paraformaldehid oldattal (5 perc) való fixálása után adtuk az elsődleges antitestet [anti-Bak (1:50) vagy az anti-kaszpáz-3-at (1:30)] és digitoninnal (100 µg/ml) inkubáltuk 30 percig. Az üledék PBS-sel történő mosása után az aktív kaszpáz-3 mérhető, míg a Bak esetén a mintákhoz anti-egér FITC másodlagos ellenanyagot adtunk (1:100 hígítás) és 30 perc inkubálás után a másodlagos ellenanyagot kimostuk és a mintákat áramlási citométerrel mértük. Mindkét esetben a fluoreszcencia (FL-1) növekedés a sejtekben az aktív molekulák számának növekedését jelzi. Negatív kontrollként ellenanyagmentes mintákat használtunk. 4.4. Western blot A különböző fehérjék mennyiségének változását western blot segítségével határoztuk meg. A sejteket a kezelés és mosás után 130 µl lízis pufferrel (150 mM NaCl, 50 mM TRIS/HCl pH= 7,05, 10 mM NaF, 10 % glycerol, 1 % NP40, 1 mM PMSF, 0,5 NaVanadát, 10 mg/ml leupetin) lizáltuk jégen, majd centrifugáltuk (20 percig 4 oC-on, 15000g)
és
a
felülúszó
fehérjetartalmát
Bradford-módszerrel
mértük.
A
fehérjekoncentrációk alapján a mintákból egyenlő mennyiségeket (10-20 µg) vittünk fel a gélre (12,5-15 %-os SDS-polyakrilamid). A transzfer során a fehérjéket PVDF membránra (BioRad) vittük fel Semi Dry blottoló készülék (Biorad) segítségével. Az elsődleges ellenanyagokkal [Bid, 1:1500 (Transduction Laboratories); Bcl-2, 1:500; Bax, 1:250; Bcl-xL, 1:1000 (DAKO, BD Pharmingen); Bak, 1:1000 (Upstate Biotech)] éjszakán át inkubáltuk membránokat. Biotinált másodlagos ellenanyag (Vectastain) adása után a kimutatáshoz Vectastain ABC Kit-et és ECL-Plus kemilumineszcens detektáló kit-et (Amersham Pharmacia Biotech) használtunk. A Bid ellenanyagot a Bid molekula 50-62 aminosav régiójára immunizálták. A kaszpáz-8 az 59., a 75. vagy a 98. aminosavnál hasítja a Bidet. A hasítás után a C-terminális fragment a mitokondriumba
40
vándorol, míg az N-terminális fragment degradálódik. Tehát abban az esetben, ha a kaszpáz-8 hasítja a Bid-et, az ellenanyaggal kimutatható Bid mennyisége csökken. A Bak fehérje mennyiségét nemcsak teljes sejt lizátumból, hanem izolált mitokondriumokból származó fehérje oldatból is meghatároztuk. 4.5. Mitokondriumizolálás és a fehérjék keresztkötése BMH1-gyel: A kezelés után a sejteket mitokondrium pufferbe raktuk (250 mM mannitol, 70 mM szaccharóz, 0,5 mM EGTA, 5 mM HEPES pH= 7,2, 0,1 mM PMSF), majd Dounce homogenizátorral jégen összetörtük (40 ütés). Ezután a sejtmagokat és az épen maradt sejteket centrifugálással (1000g, 10 perc, +4˚C) eltávolítottuk. A mitokondriumokat pedig a felülúszóból újabb centrifugálással (10000 g, 30 perc, +4˚C) nyertük ki. Ezt a mitokondrium/nehéz membrán frakciót HEPES pufferben (250 mM szaccharóz, 10 mM HEPES pH= 7,5, 2 mM KH2PO4, 5 mM Na-szukcinát, 25 mM EGTA, 0,1 mM PMSF) szuszpendáltuk, majd a fehérjék keresztkötéséhez 1,6-bis-maleimidohexane-t (BMH) (DMSO-ban oldva) adtunk az oldathoz 10 mM-os végkoncentrációban 30 percig. Eközben a mitokondriumoldat egy részét csak DMSO-val inkubáltuk kontrollként. A keresztkötési reakciót 2-merkaptoetanolt tartalmazó mintapufferrel állítottuk le. Az így kapott fehérje oldatot -20 ˚C-on tároltuk és western blot segítségével vizsgáltuk a fehérjék mennyiségi, illetve esetleges szerkezeti (keresztkötés lehetősége) változását. 4.6. Immunprecipitáció A fehérjék kapcsolódásának kimutatására immunprecipitációt használtunk. A mitokondriumizolálás után a nehéz membrán frakciót 100 µl NP40 pufferben [10 mM HEPES pH= 7,4, 150 mM NaCl, 0,1 % NP40, proteáz gátlók (PMSF 40 µg/ml, leupeptin, aprotinin 1 µg/ml)] oldottuk. Inkubálás után kivettünk kis mennyiséget fehérje koncentráció mérésre, majd a maradékhoz hozzáadtuk a megfelelő antitestet, amivel a precipitációt végeztük. Az ellenanyaggal való inkubáció után centrifugáltuk (10000 g, 5 perc) a mintákat és a felülúszóhoz hozzáadtuk az előkészített ProteinASepharose gyöngyöket (20 µl 50 %-os sűrű gyöngy oldat). Újabb inkubálás után
41
centrifugáltuk a mintákat és mostuk a gyöngyöket NP40 pufferrel. Ezután mintapuffert adtunk a mintákhoz és forraltuk azokat. Újabb centrifugálás után a felülúszót elválasztottuk a gyöngyöktől és western blottal kimutattuk a kötött fehérjéket. 4.7. Fehérjék lokalizációjának vizsgálata immuncitokémiával és konfokális mikroszkópiával A Bax fehérjének a citoplazmából a mitokondriumba való transzlokálódását, valamint az „apoptosis inducing factor” (AIF) és az Endonukleáz G mitokondriumból a citoplazmába való kiáramlását immuncitokémia segítségével határoztuk meg. A fehérjéket fluoreszcens ellenanyaggal mutattuk ki, míg a mitokondriumokat MitoTracker orange (CMTMRos) fluoreszcens festékkel jelöltük. A mintákat a jelölés után konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk. A minták előkészítése és vizsgálata: 1-1,5 millió sejthez CMTMRos festéket adtunk, majd sötétben inkubáltuk 15 percig. Ezután centrifugáltuk és 80 %-os –20 ˚C–os metanollal fixáltuk a sejteket. A PBS mosás után a mintákat blokkoltuk, majd hozzáadtuk az elsődleges ellenanyagot (Bax, 1:20 (DAKO); Endo G 1:30 (Sigma); AIF, 1:30 (MBL)). Az előhívást Vectastain ABC Kit és Avidin-FITC (Sigma) segítségével végeztük. Mosás után PBS-ben felvettük az üledéket, majd citocentrifugával tárgylemezre vittük és fluoreszcens fedőanyaggal (DAKO) lefedtük. A mintákat konfokális mikroszkóppal (Biorad, MRC1024) vizsgáltuk. A képeket Laser Sharp és Confocal Assistent szoftver segítségével készítettük. 4.8.
A
reaktív
oxigéngyökök
(ROS)
lokalizációjának
vizsgálata
konfokális
mikroszkóppal A reaktív oxigéngyökök a CeCl3-dal reakcióba lépve cérium-peroxid kristályokat képeznek. Ezek a kristályok konfokális mikroszkóppal reflect módban kimutathatóak. Más fluoreszcens festésekkel együtt jól használható a módszer a ROS lokalizációjának meghatározására.
42
A minták előkészítése és vizsgálata: A sejteket a kezelés és mosás után 0,9 %-os NaCl oldatban felvettük. CeCl3 oldatot (10 mM végkoncentrációban) adtunk a mintákhoz 15 percig. Ezalatt a mitokodriumokat DiOC6-tal (20 nM), a sejtmagot PI-vel (10 µg/ml) festettük meg. Az inkubálás után a mintákat konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk. 4.9. Molekuláris biológiai vizsgálatok 4.9.1. RNS izolálás
A sejtekből az RNS-t az Rneasy Total RNA kit (Quiagen) segítségével izoláltuk. A módszer lényege, hogy a megfelelő sejtek lizálása után a DNS-t roncsoltuk, az RNS-t egy filter segítségével megkötöttük és elválasztottuk a DNS-től és a fehérjéktől. 10-15 millió sejtből indultunk ki és az RNS-t (50-80 µg) 80 µl DEPC-cel kezelt vízben vettük fel. A kapott RNS koncentrációját és minőségét fotométerrel ellenőriztük.
4.9.2. Reverz transzkripció (RT)
A reakciót 1 µg RNS-ből végezzük random primerekkel 42°C-on 1 óráig. Reakcióelegy (20 µl): 50 mM Tris-HCl, pH= 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPmix (50 µM/dNTP, Gibco-BRL), 5 mM DTT, 10 U Rnasin (Gibco-BRL), 2,5 µg random primer (Gibco-BRL), 200 U MMLV reverz transzrikptáz (Gibco-BRL).
4.9.3. Polimeráz láncreakció (PCR)
A PCR reakcióban 2,5 – 3 µl reverz elegyet (~ 0,075 µg össz-RNS-nek felel meg) használtunk templátként. Reakcióelegy (25 µl): 10 mM Tris HCl pH: 8,3; 50 mM KCl; 1 mM MgCl2; 0,2 dNTP; 1 U Red-Taq DNS polimeráz (Sigma), 0,8 pM specifikus primer.
43
A következő ciklusparamétereket alkalmaztuk:
28 vagy 30 ciklus
95 °C
5 perc
62 °C (SOD, kataláz) vagy 60°C (aktin, TIEG)
1 perc
72 °C
2 perc
92 °C
2 perc
72 °C
10 perc
Az alkalmazott primerek méretét, szekvenciáját és a termékek méretét a 4. Táblázat tartalmazza. A DNS (PCR fragmenteket) és az RNS minták méret szerinti elválasztását agaróz gélelektroforézissel végeztük (1 %-os agaróz TAE gél (RNS-nél MOPS puffer), etidium-bromid 1 µg/ml). A géleket UV-fény mellett, Eagle-Eye Videodensitometer (Stratagene) segítségével értékeltük ki. 4. Táblázat: Az alkalmazott primerek mérete, szekvenciája és a termékek mérete Primer neve TIEG SOD Kataláz β-actin
Szekvencia F: ACA-GGA-GAA-AAG-CCT-TTC-AGC R: TTT-TAC-ATC-ACC-ACT-GGC-TCC F: AGG-GCA-TCA-TCA-ATT-TCG-AG R: TCT-TCA-TTT-CCA-CCT-TTG-CC F: CCT-GAC-TAT-GGC-ATC-CGG R: TAG-TTG-GCC-ACT-CGA-GCA-C F: GTG-GGG-CGC-CCC-AGG-CAC-CA R: CTC-CTT-ATT-GTC-ACG-CAC-GAT-TTC
44
Termék mérete (bp) 328 355 386 538
5. EREDMÉNYEK Kísérleteinkben a mesterséges és a természetes - a szervezetben szabályozó funkcióval rendelkező - anyagok által kiváltott sejthalál/apoptózis tulajdonságait vizsgáltuk. 3.1. TGFβ1 hatása HT58 sejtekre
A. 30
Apoptózis (%)
25
TGFß1 24ó TGFß1 48ó
20
15
10
5 0
1
2
3
4
5
TGFß1 koncentrációja (ng/ml)
B. 60
Kontroll 0,5ng/ml TGFß1
Apoptózis (%)
50
40
30
20
10
0 0
20
40
60
80
Idő (óra) 24. ábra A TGFβ1 által kiváltott apoptózis koncentráció- (A) és időfüggése (B) HT58 sejtekben Az apoptózist (DNS-fragmentációt) áramlási citometriával mértük.
A TGFβ1 koncentrációtól függően okoz apoptózist a HT58 sejtekben. 0,05-5 ng/ml-es koncentrációtartományt alkalmazva kiderült, hogy koncentrációfüggő hatást az
45
alacsony dózisoknál sikerült kimutatni (14. ábra A). 0,5 ng/ml-es koncentráció felett gyakorlatilag nincs különbség a dózisok között, ezért a további kísérletekben 0,5-1 ng/ml-es koncentrációt használtunk. Az időfüggéses vizsgálatokban (14. ábra B) sikerült kimutatnunk, hogy a legnagyobb sejtpusztulás a TGFβ1 adását követő 48-72 óra között zajlik le. Ekkor az apoptózis mértéke megkettőződik (25 %-60 %). A továbbiakban a TGFβ1 hatásmechanizmusait vizsgáltuk 5.1.1. A halálreceptorok szerepe A laboratórium korábbi eredményeiből ismert, hogy a HT58 sejtek expresszálnak TNF-RI-t, DR5-t, valamint TRAIL-t, bár sem a ligandok, sem a receptorok szintje nem változott a TGFβ1 kezelés után. Ezután neutralizáló ellenanyagok segítségével vizsgáltuk a ligandok tényleges apoptózis-indukáló
60
kontroll antiTRAIL TGFß1 anti-TRAIL+TGFß1
Apoptózis (%)
50
40
30
20
10
0 0
20
40
60
80
Idő (óra) 15. ábra Az antiTRAIL neutralizáló ellenanyag nem csökkentette a TGFβ1 által kiváltott apoptózist Az apoptózist áramlási citometriával mértük. A TGFβ1 koncentrációja 1 ng/ml volt.
képességét. A TRAIL esetében TRAIL-R2Fc-t (Anti-TRAIL) (15. ábra), a TNF esetében anti-TNFα-t, míg a FasL esetében antiFasL/Nok-1-t használtunk. Az ábrán csak a TRAIL-R2Fc hatását mutatjuk. Egyik gátlóanyag sem csökkentette a TGFβ1
46
által okozott apoptózis mértékét, amiből arra következtethetünk, hogy a vizsgált halálligand-halálreceptor utak nem vesznek részt ebben a folyamatban. 5.1.2. Mitokondriumdepolarizáció és a kaszpázok aktivitása Az apoptózis másik fő útvonala a mitokondriumon keresztül zajlik. A mitokondrium membránjának depolarizálódása után kiáramló citokróm-c idézheti elő a kaszpázok aktiválódását és a DNS fragmentációját.
Mitokondriumdepolarizáció (%)
A. TGFß1 zVAD-fmk +TGFß1
60 50 40 30 20 10 0
0
20
40
60
80
60
80
Idő (óra)
B.
Kontroll TGFß1 zVAD-fmk zVAD-fmk+TGFß1
60
Apoptózis (%)
50 40 30 20 10 0
0
20
40
Idő (óra) 16. ábra Z-VAD-fmk hatása a TGFβ1 által kiváltott mitokondriumdepolarizációra (A) és apoptózisra (B) A apoptózist és a mitokondriumdepolarizációt áramlási citometriával mértük. A mitokondriumdepolarizáció mérésekor DiOC6 festéket használtunk. A TGFβ1 koncentrációja 1 ng/ml volt.
47
Kísérleteinkből kiderült (16. ábra A), hogy TGFβ1 hatására a HT58 sejtek mitokondriumai az idő függvényében depolarizálódnak. Ez a depolarizáció az általános kaszpázgátló (z-VAD-fmk) hatására csökkent, de nem szűnt meg és hasonló tendenciát mutatott,
mint
kaszpázgátló
nélkül.
Ebből
arra
következtethetünk,
hogy
a
mitokondrium- depolarizációban, valamint a TGFβ1 által kiváltott apoptózisban szerepe van a kaszpázoknak. Először az általános kaszpázgátló hatását vizsgáltuk meg a TGFβ1 által kiváltott apoptózisra (16. ábra B), majd a kaszpáz-3 aktiválódását (17. ábra). A 16. ábrán látható, hogy a z-VAD-fmk nagymértékben csökkentette a TGFβ1 által kiváltott apoptózist. Emellett sikerült kimutatni a kaszpáz-3, mint legjelentősebb
Kaszpáz-3 aktivitás (MFU)
20
15
10
5
0
0
20
40
60
80
Idő (óra) 17. ábra A kaszpáz-3 aktivitás növekedés TGFβ1 kezelés után A kaszpáz-3 enzim aktivitását fluoreszcens szubsztrát és fluoriméter segítségével határoztuk meg. A TGFβ1 koncentrációja 1 ng/ml volt.
effektor kaszpáz időbeli aktiválódását A kaszpáz-3 a legnagyobb aktivitásemelkedést 24 és 48 óra között mutatta. Ez lehet az az időintervallum, amely alatt a legtöbb sejt eljut ahhoz a ponthoz, amikor elindul az apoptózis végső, effektor fázisa. Tehát a folyamat kaszpázfüggő. Kérdés, hogy a kaszpázok milyen úton kapcsolódnak a mitokondriumdepolarizációhoz? Ennek megközelítésére két specifikus kaszpázgátlót alkalmaztunk: a kaszpáz-8gátlót (z-IETD-fmk, K8-I) és a kaszpáz-9-gátlót (z-LEHD-fmk, K9-I) (18. ábra). Az eredmények azt mutatják, hogy mind a kaszpáz-8, mind a kaszpáz-9 gátlószere csökkentette a TGFβ1 által okozott sejthalált, bár a kaszpáz-8-gátlásnak nagyobb volt a hatása. A két gátlószer együttes alkalmazása esetén nagyobb gátlást tapasztaltunk, bár
48
Kontroll K9-I K8-I TGFβ TGFβ+K8-I TGFβ+K9-I TGFβ+K8-I+K9-I
60 Apoptózis (%)
50 40 30 20 10 0
48 óra
72 óra
18. ábra Kaszpáz-8 (K8-I) és kaszpáz-9 (K9-I) gátlószerek hatása a TGFβ1 által kiváltott apoptózisra HT58 sejtekben Az apoptózist áramlási citometriával mértük. A TGFβ1 koncentrációja 1 ng/ml, a kaszpáz gátlószereké 50µM volt.
nem volt összeadódó a hatásuk. Ez azt jelzi, hogy mindkét iniciátor kaszpáz aktiválódik a TGFβ1 hatására. 5.1.3. A Bcl-2 család fehérjéinek vizsgálata
21 kDa
Bax
26 kDa
Bcl-2
23 kDa
Bid
43 kDa
Aktin Ko 12ó 24ó 48ó
29 kDa
Bcl-xL
43 kDa
Aktin Ko
2ó
4ó
16ó 24ó 48ó
19. ábra Néhány Bcl-2 család fehérje mennyiségének vizsgálata TGFβ1 kezelés során HT58 sejtekben western blot segítségével TGFβ1-t 1 ng/ml koncentrációban alkalmaztuk. A kimutatható Bid-nek csökkent a mennyisége.
A Bcl-2 család tagjai fontos szabályozói a citokróm-c kibocsátásnak. Ezért megvizsgáltunk néhány pro- és antiapoptotikus fehérje mennyiségének változását. A 19. ábrán láthatjuk, hogy a vizsgált fehérjék közül sem az antiapoptotikus Bcl2 és Bcl-xL-nek, sem a proapoptotikus Bax fehérjének nem változott a mennyisége.
49
Emellett ki tudtuk mutatni a Bid fehérje aktiválódását a TGFβ1 kezelést követően. A Bid ellenanyagot a Bid molekula 50-62. aminosav régiója ellen készítették. A kaszpáz-8 az 59., a 75. vagy a 98. aminosavnál hasítja a Bidet. A hasítás után a C-terminális fragment (proapoptotikus aktív forma) a mitokondriumba vándorol, míg az N-terminális fragment degradálódik. Tehát ha a kaszpáz-8 hasítja a Bid-et, akkor ellenanyagot használva western blottal az inaktív teljes Bid molekula eltűnését tapasztaltuk. Ez indirekt módon jelenti a Bid aktiválódását. A kaszpáz-8 aktivitását a korábbi kísérletekben sikerült kimutatnunk. A Bid képes önmaga, valamint a Bax oligomerizációjának elősegítésével depolarizálni a mitokondrium membránját. Ezért megvizsgáltuk a Bax lokalizációját a TGFβ1 kezelés alatt (20. ábra).
20. ábra Bax transzlokációja TGFβ1 kezelés hatására HT58 sejtekben A Bax fehérjét poliklonális anti-humán Bax festéssel (FITC) (zöld), a mitokondriumokat CMTMRos (piros) festéssel jelöltük. A.) kontroll sejtek B.) TGFβ1 kezelés után 24 órával C.) TGFβ1 kezelés után 48 órával. A TGFβ1 koncentrációja 1 ng/ml volt.
50
A kísérletek során azt tapasztaltuk, hogy a kontroll sejtekben a Bax fehérje a citoplazmában homogén eloszlásban található, de TGFβ1 kezelés hatására 24 óra után a mitokondriumba transzlokálódik. A kezelés után 48 órával a mitokondriumok már teljesen depolarizálódtak, ezért a piros szín eltűnt a sejtekből, valamint a sejtek zsugorodtak, ezért a mitokondriumok már nem mutatnak perifériás elrendeződést. 5.1.4. ROS keletkezése TGFβ1 hatására A mitokondrium depolarizációját okozhatja a ROS fokozott mennyisége is. Ezért vizsgáltuk, hogy TGFβ1 hatására keletkezik-e ROS. A H2DCF-DA festék segítségével mért adatokból kiderült, hogy a ROS által kiváltott fluoreszcencia a kezelés utáni 48 órában 1,5-szeresére növekedett. A ROS fejlődésnek a lokalizációját konfokális mikroszkóp és CeCl3 segítségével vizsgáltuk (21. ábra). ROS hatására CeCl3 kristályok keletkeznek a TGFβ1 kezelt sejtekben. A kristályok (kék) a még élő, TGFβ1 kezelt sejtekben (21. ábra B sor) PI
DiOC6
CeCl3
Mix
A.
B.
C.
21. ábra TGFβ1 hatására bekövetkező ROS fejlődés lokalizációjának kimutatása A mitokondriumot DiOC6 (zöld) festéssel, a ROS-t CeCl3 (kék) segítségével jelöltük. A sejteket konfokális mikroszkóp segítségével vizsgáltuk. A.) kontroll sejtek B.) TGFβ1 kezelés után 24 órával C.) TGFβ1 kezelés után 72 órával. A TGFβ1 koncentrációja 1 ng/ml volt.
51
egybeesnek a zölden festődő (DiOC6) mitokondriumokkal. A teljesen elpusztult nekrotizált sejtekben, melyek beengedik a PI-ot (piros), nagy mennyiségű ROS-t lehet kimutatni. Az eredményekből látszik, hogy a mitokondrium a fő forrása a ROS termelődésnek (21. ábra). A ROS szerepét antioxidánsok adásával is vizsgáltuk. Több antioxidánst használtunk, amelyek közül egyedül az N-acetil-cisztein (NAC, 5 mM) bizonyult hatásosnak (22. ábra). Mind 24 óra, mind 48 óra után csökkentette a TGFβ1 által indukált apoptózist. A többi antioxidáns nem csökkentette az apoptózist.
30
Apoptózis (%)
25 20
Kontroll NAC TGFß1 TGFß1+NA
15 10 5 0
24 óra
48 óra
22. ábra Az antioxidáns NAC hatása a TGFβ1 által kiváltott apoptózisra Az apoptózist (DNS-fragmentációt) áramlási citometriával mértük. A TGFβ1 koncentrációja 1 ng/ml, a NAC koncentrációja 5mM volt.
5.1.5. TGFβ1 célgének expressziója A TGFβ1 receptorain, valamint az elsődleges jelátviteli út elemein, a Smad TIEG 328 bp Kataláz 386 bp SOD 355 bp Aktin 538 bp Ko 0,5ó 2ó 4ó 48ó 72ó 23. ábra TGFβ1 kezelés után a TIEG, a SOD és a kataláz gén expressziójának vizsgálata RT-PCR-rel A kezelések során a TGFβ1 koncentrációja 1ng/ml volt.
52
molekulákon keresztül különböző gének szabályozását végzi. Megvizsgáltuk néhány oxidatív enzim (SOD, kataláz) és a TIEG gén expressziójának változását RT-PCR segítségével (23. ábra). A TIEG indukálhatja más enzimek pl. oxidatív enzimek kifejeződését, és a TGFβ1 rajta keresztül fejtheti ki génszabályozó hatását. A 23. ábrán látható, hogy a TGFβ1 kezelés hatására a TIEG mRNS-e termelődni kezdett, míg az oxidatív enzimek RNS szintjének mennyiségi változását egyértelműen nem tudtuk igazolni. 5.1.6. TGFβ1 sejtciklus gátló hatása HT58 sejtekre
A TGFβ1 az apoptózis indukció mellett képes a lymphoid sejtek proliferációját gátolni. A legtöbb sejtben a G1-S fázis átmenetet gátolja úgy, hogy a különböző ciklinfüggő-kináz-gátlófehérjék (p15INK4B, p16INK4A, p21CIP1, p27KIP1) expresszióját növeli (111). Ezek a gátlófehérjék a ciklinekhez, illetve a pRB-hez kapcsolódva megakadályozzák a sejtciklus továbbhaladását. Megvizsgáltuk, hogy HT58 sejtekben az
p21 p16
100
120
Kontroll (%)
Kontroll (%)
80
CDK4 CycD
140
60 40
100
80
20 60 0 0
10
20
30
40
50
0
Idő (óra)
10
20
30
40
50
Idő (óra)
24. ábra A p16, p21 és a CDK4, CycD expressziójának változása TGFβ1 hatására HT58 sejtekben A fehérjék expresszióját Western blot segítségével határoztuk meg.
exogén TGFβ1 fokozza-e ezeknek a fehérjéknek az expresszióját (24. ábra). Sem a p16INK4A, sem a p21CIP1 mennyisége nem növekszik, míg a CDK4 mennyisége igen. p27 nem található a HT58 sejtekben. A vizsgált fehérjék mennyiségi változásai összefüggnek azokkal a megfigyeléseinkkel, melyek szerint az exogén TGFβ1 hatására nem történt sejtciklusgátlás a HT58 sejtekben.
53
5.2. Retinoidok hatása HT58 sejtekre
Kísérleteinkben összehasonlítottuk egy természetes retinsav, az all-transzA. Kontroll 4HPR 3µM 4HPR 5µM 4HPR 10 µM
100
Apoptózis (%)
80 60 40 20 0 0
5
10
15
20
25
20
25
Idő (óra)
B. Kontroll ATRA 20µM ATRA 30µM ATRA 40µM
100
Apoptózis (%)
80 60 40 20 0 0
5
10
15
Idő (óra) 25. ábra A 4HPR (A) és az ATRA (B) átal kiváltott apoptózis idő és koncentráció függése HT58 lymphoma sejteken Az apoptózist áramlási citometriával mértük.
retinsav (ATRA) és mesterséges származékának, a fenretinidnek (4HPR) apoptotikus hatását HT58 lymphoma sejteken. Mindkét szer apoptózist indukált idő- és koncentrációfüggően (25. ábra). Kiderült, hogy az ATRA hatására az apoptózis gyorsan eléri az ún. plató fázist (6 óra után 30 µM-os koncentráció esetén), míg a 4HPR-nél ugyanez a folyamat lassabb. A 4HPR viszont sokkal hatásosabb volt, mert kisebb koncentrációban (5-10 µM) képes ugyanannyi sejtpusztulást előidézni, mint az ATRA
54
(30-40 µM). A kísérleteinkben olyan koncentrációt alkalmaztunk, ahol mindkét szer hasonló mértékű apoptózist indukált 24 óra alatt. 5.2.1. A kaszpázgátlók hatása a retinoidok indukálta apoptózisra
A kaszpázoknak a DNS-fragmentációban játszott szerepét különböző kaszpázgátlókkal vizsgáltuk. Mindegyik gátlószer csökkentette az ATRA által kiváltott DNSfragmentációt (26. ábra). Az ATRA esetében 24 óránál legjobban az általános kaszpázgátló, a z-VAD-fmk csökkentette a DNS-fragmentálódott sejtek mennyiségét (60 %-ról 30 %-ra), viszont a nekrotikus sejtek mennyisége is növekedett (5 %-ról 35 %-ra) (27. ábra B). 48 óránál mind a specifikus kaszpáz-8-gátló, z-IETD-fmk, mind a zVAD-fmk hatásosabb volt, mint a kaszpáz-9 gátló z-LEHD-fmk. A 4HPR esetén csak a z-VAD-fmk-nak volt csekély DNS-fragmentációt gátló hatása az alacsonyabb dózisoknál (85 %-ról 75 %-ra 5 µM-os koncentrációnál) (27. ábra A).
Apoptózis (%)
120
Ko
4HPR
ATRA
100 24h
80
48h
60 40
*
*
20 0 1
ATRA 20 µM 4HPR 5 µM IETD-fmk LEHD-fmk VAD-fmk -
2
+ -
3
4
5
6
7
8
+ + -
+ + -
+ +
+ -
+ + -
+ + -
9
+ +
26. ábra Kaszpázgátlók hatása az ATRA- és a 4HPR által indukált apoptózisra HT58 lymphoma sejtekben (24-48 óra) Az összes gátlószer csökkentette a DNS-fragmentációt az ATRA kezelt sejtekben, de nem a 4HPR kezelt sejtekben. A *-gal jelölt minták szignifikánsan különböznek a csak ATRA kezelt mintáktól (p< 0,05)
55
4HPR
A.
4HPR+zVAD
120 Sejtpusztulás (%)
100
*
80
Nekrózis
60
DNS fragmentáció
40
*
20 0
4HPR (µM) 0
3
5
8
0
ATRA
B.
3
5
8
ATRA+zVAD
120
Sejtpusztulás (%)
100 **
80
**
*
60
Nekrózis DNS fragmentáció
40 20 0
ATRA (µM)0 20
30 40
0
20 30
40
27. ábra A z-VAD-fmk hatása a 4HPR (A) és az ATRA (B) által indukált sejthalálra 24 óra kezelés után A sejtpusztulást (DNS-fragmentáció és a nekrózis) egyidejűleg mértük áramlási citométerrel. A *-gal jelölt értékek szignifikánsan különböznek a csak ATRA kezelttől (p<0,01), **-gal jelölteknél p<0,001.
5.2.2. A mitokondriumdepolarizációja retinoid kezelés után
A mitokondriumdepolarizáció az ATRA kezelést követően 2 órával már kimutatható volt és a 4. óráig növekedett (28. ábra A). A 4HPR hasonló hatása később (6 óránál) kezdődött, ötször alacsonyabb koncentrációt alkalmazva, végül ugyanazt a szintet érte el, mint az ATRA. Mivel a z-VAD-fmk csökkentette az ATRA által kiváltott DNS-fragmentációt, megvizsgáltuk vajon szerepe van-e a kaszpázoknak az ATRA által kiváltott mitokondriumdepolarizációban. A kísérleti eredmények azt mutatták, hogy a zVAD-fmk a mitokondriumdepolarizációt is csökkentette az ATRA kezelt sejtekben
56
Mitokondriumdepolarizáció (%)
A.
Kontroll 4HPR 5 µM ATRA 40 µM
50 40 30 20 10 0 0
2
4
6
8
10
12
Idő (óra) Mitokondriumdepolarizáció (%)
B.
40 35 30 25
2h
20
4h
15
*
10
6h
*
5 0
Kontroll ATRA ATRA Kontroll ATRA ATRA + 30 µM 40 µM 30 µM 40 µM zVAD + zVAD + zVAD 28. ábra Az ATRA és a 4HPR által kiváltott mitokondriumdepolarizáció C.) Mindkét szer mitokondriumdepolarizációt okoz, eltérően. D.) Ezt a folyamatot z-VAD-fmk gátolja az ATRA kezelt sejtekben. A *-gal jelölt értékek szignifikánsan különböznek a csak ATRA-val kezelt mintáktól. (p< 0,03). A mitokondriumdepolarizációt DiOC6 festékkel és áramlási citometriával mértük.
(28. ábra B). A 4HPR-nél nem vizsgáltuk a z-VAD-fmk hatását, mivel a DNSfragmentációnál sem tapasztaltunk jelentős hatást. 5.2.3. A Bcl-2 családtagok mennyiségének és aktivitásának változása
A mitokondriumdepolarizáció egyik oka az lehet, hogy a proapoptotikus Bcl-2 családtagok aktiválódnak és/vagy az antiapoptotikusak gátlódnak. Ezért megvizsgáltuk a Bcl-2 és a Bax fehérje mennyiségének változását. A Bcl-2 fehérje mennyisége
57
0 óra
4HPR 6 óra
0 óra
12 óra
ATRA 24 óra
48 óra
Bax
21 kDa
Bcl-2
26 kDa
Aktin
43 kDa
29. ábra A 4HPR és az ATRA a Bcl-2 fehérje szintjét csökkentette, míg a Bax szintjét nem változtatta meg A fehérjék mennyiségét anti-human Bcl-2, anti-human Bax ellenanyaggal western blottal mutattuk ki.
Mix
CMTMRos
BAX
A
B
C
D
E
30. ábra Az ATRA és a 4HPR a Bax fehérjének a citoplazmából a mitokondriumba történő transzlokációját indukálták A.) Kontroll B.) 4HPR kezelés (8 µM, 6 óra) C.) ATRA kezelés (40 µM, 6 óra) D.) 4HPR kezelés (8 µM, 16 óra) E.) ATRA kezelés (40 µM, 16 óra) A Bax fehérjét poliklonális anti-humán Bax festéssel (FITC) (zöld), a mitokondriumokat CMTMRos (piros)festéssel jelöltük.
58
csökkent, míg a Bax fehérje mennyisége nem változott a retinoid kezelés hatására (29. ábra). A Bax fehérje az aktiválódása után a mitokondriumba transzlokálódik. Ezt a folyamatot megvizsgáltuk a két retinsav kezelés után is (30. ábra). A képek azt mutatják, hogy a kontroll sejtekben a Bax homogénen eloszlik a sejtben, míg az ATRA hatására már 6 óra kezelés után a sejtek kb. 30 %-ában a Bax transzlokálódik a mitokondriumokba (30. ábra C). A 4HPR esetén a transzlokáció csak később (16 óra) és kisebb mértékben (10 %) nyilvánul meg (30. ábra D). 5.2.4. A reaktív oxigéngyökök termelődése
A proapoptotikus Bcl-2 családtagok mellett a ROS túltermelődése is lehet az oka a mitokondriumdepolarizációnak, amint azt az irodalom is megemlíti a retinsavak
B.
H2DCF-DA fluoreszcenciája (kontroll %)
A.
H2DCF-DA fluoreszcenciája (kontroll%)
esetében (101).
600 500 400
Kontroll
300
4HPR 3µM
200
4HPR 5µM
100
4HPR 8µM
0 15 perc
30 perc
60 perc
600 500 400
Kontroll
300
ATRA 30µM
200
ATRA 40µM
100 0 15 perc
30 perc
60 perc
31. ábra A 4HPR (A) és az ATRA (B) által kiváltott ROS szint emelkedés A retinoidok által kiváltott ROS emelkedés arányos a H2DCF-DA fluoreszcenciájával
59
A 4HPR hatására már igen hamar, 15 perccel a kezelés után kimutatható volt a ROS szint emelkedése. Ez az emelkedés a 4HPR koncentrációjával arányosan emelkedett (31. ábra A). Az ATRA nem változtatta meg a ROS termelését (31. ábra B). 5.2.5. Mitokondriális proapoptotikus tényezők változása
A z-VAD-fmk nem tudta gátolni a 4HPR által kiváltott DNS-fragmentációt. Ez azt jelzi, hogy a folyamat kaszpázfüggetlenül zajlik. Ezért megvizsgáltunk két kaszpázfüggetlen faktor (AIF, EndoG) változását, mitokondriumból való kijutását. A Mix
CMTMRos
Endo G
A
B
C
D
E
32. ábra Az Endonukleáz G transzlokációja retinoid kezelés hatására A.) Kontroll B.) 4HPR kezelés (8 µM, 6 óra) C.) ATRA kezelés (40 µM, 6 óra) D.) 4HPR kezelés (8 µM, 12 óra) E.) ATRA kezelés (40 µM, 12 óra) Az Endo G fehérjét poliklonális anti-humán Endo G festéssel (FITC) (zöld), a mitokondriumokat CMTMRos (piros) festéssel jelöltük.
60
kontroll sejtekben mindkét fehérje a mitokondriumokban tartózkodott (32. ábra A, 33. ábra A). Mindkét retinoid hatására az Endo G kiáramlott a mitokondriumból, bár az ATRA esetében ez elég későn és csak kis mértékben volt jellemző (32. ábra E). A 4HPR hatására már 6 óra kezelés után nagymértékű EndoG kiáramlást tapasztaltunk (32. ábra B). Az AIF lokalizációja nem változott egyik szer hatására sem. Mix
CMTMRos
AIF
A
B
C
D
E
33. ábra Az AIF transzlokációja retinoid kezelés hatására A.) Kontroll B.) 4HPR kezelés (8 µM, 6 óra) C.) ATRA kezelés (40 µM, 6 óra) D.) 4HPR kezelés (8 µM, 12 óra) E.) ATRA kezelés (40 µM, 12 óra) Az AIF fehérjét poliklonális anti-humán AIF festéssel (FITC) (zöld), a mitokondriumokat CMTMRos (piros) festéssel jelöltük.
61
5.2.6. A retinoidok hatása BL41 és a BL41/95 lymphoma sejteken
A két retinsav, az ATRA és a 4HPR hatását megvizsgáltuk a BL41 EBV-negatív Burkitt-lymhpoma és annak Epstein-Barr-vírusfragmenttel transzfektált variánsán, a BL41/95 sejtvonalon. C.
80
DNS fragmentáció (% )
70 60
40 30 20 10 0
10
15
20
80
60 50 40 30 20 10 0
25
Nekrózis (% )
60
40 30
10 15
20
0
25
Idő (óra)
25
30
10 10
20
40
20
5
15
50
20
0
10
Kontroll 4HPR 5µM 4HPR 8µM 4HPR 10 µM
70
50
0
5
Idő (óra)
80
Kontroll ATRA 30µM ATRA 40µM
60
0
D.
Idő (óra)
70
Nekrózis (% )
5
Kontroll 4HPR 5µM 4HPR 8µM 4HPR 10 µM
70
50
0
B.
80
Kontroll ATRA 30 µM ATRA 40 µM
DNS fragmentáció (% )
A.
0
5
10
15
20
25
Idő (óra)
34. ábra Az ATRA és a 4HPR által kiváltott DNS-fragmentáció (A, C) és nekrózis (B, D) BL41 sejteken A DNS-fragmentációt és a nekrózist áramlási citometriával mértük.
Mindkét szer apoptózist indukált idő- és koncentrációfüggően mind a BL41 (34. ábra), mind a BL41/95 lymphoma sejtekben (35. ábra). Hasonló koncentrációkat használtunk, mint a HT58 lymphoma sejtek esetében. A DNS-fragmentáció mellett viszont jelentős mértékű nekrózist tapasztaltunk a 4HPR adása után a magasabb koncentrációknál (8-10 µM). A BL41 esetében a DNS-fragmentáció legjobban 12 óra
62
A.
C.
80 Kontroll ATRA 30 µM ATRA 40 µM
D NS frag m en tác ió (% )
60 50 40 30 20 10 0
B.
0
10
15
20
D.
Kontroll ATRA 30µM ATRA 40µM
70
40 30 20 10 0
40 30 20 10
5
10
15
20
25
Idő (óra)
80
Kontroll 4HPR 5µM 4HPR 8µM 4HPR 10 µM
60
50
0
50
70
N ek róz is (% )
60
60
0
25
Idő (óra)
80
N ek róz is (% )
5
Kontroll 4HPR 5µM 4HPR 8µM 4HPR 10 µM
70
D NS frag m en tác ió (% )
70
80
50 40 30 20 10
0
5
10
15
20
0
25
0
5
10
Idő (óra)
15
20
25
Idő (óra)
35. ábra Az ATRA és a 4HPR által kiváltott DNS-fragmentáció (A, C) és nekrózis (B, D) BL41/95 sejtekben A DNS-fragmentációt és a nekrózist áramlási citometriával mértük.
80
Kontroll ATRA 30µM ATRA 40µM
70 60 50 40 30 20 10 0
0
5
10
15
20
25
M ito ko ndrium d epo larizác ió (% )
M ito ko ndrium d epo larizác ió (% )
80
Idő (óra)
Kontroll 4HPR 5µM 4HPR 8µM 4HPR 10 µM
70 60 50 40 30 20 10 0
0
5
10
15
20
25
Idő (óra)
36. ábra Az ATRA és a 4HPR által kiváltott mitokondrium depolarizáció BL41 sejtekben A mitokondrium depolarizációt áramlási citometriával mértük. DiOC6 festéket használtunk a kimutatására.
után emelkedett mindkét retinoid esetén. A BL41/95 esetében viszont az ATRA-
63
indukálta DNS-fragmentáció a HT58-hoz hasonlóan plató-fázist ért el 12 óra után. A BL41/95 esetében a kiváltott sejthalál alacsonyabb mértékű, mint a BL41 esetében. 5.2.7. Mitokondriumdepolarizáció vizsgálata retinoid kezelés után BL41 és BL41/95 sejteken
A mitokondrium depolarizációja az ATRA-kezelés hatására jelentősebb mindkét sejtvonal esetén, mint a 4HPR kezelés után (36., 37. ábra). Ez azt mutatja, hogy az ATRA által kiváltott sejthalálban a mitokondriumnak jelentős szerepe van a BL41 és a BL41/95 sejtekben.
80
Kontroll ATRA 30µM ATRA 40µM
70 60
M ito ko ndrium d epo larizác ió (% )
M ito ko ndrium d epo larizác ió (% )
80
50 40 30 20 10 0
0
5
10
15
20
25
Kontroll 4HPR 5µM 4HPR 8µM 4HPR 10 µM
70 60 50 40 30 20 10 0
0
5
10
15
20
25
Idő (óra)
Idő (óra)
37. ábra Az ATRA és a 4HPR által kiváltott mitokondriumdepolarizáció BL41/95 sejtekben A mitokondriumdepolarizációt áramlási citometriával mértük. DiOC6 festéket használtunk a kimutatására.
A további vizsgálatokban hasonló jelenségeket tapasztaltunk a BL41 és BL41/95 sejteknél, mint a HT58 sejteknél. A 4HPR fokozta a ROS termelődést a sejtekben. Mindkét retinoid csökkentette a Bcl-2 mennyiségét, míg az ATRA indukálta a Bax transzlokációját a mitokondriumba.
64
5.3. A Bcl-2 család fehérjéinek konformáció- és mennyiségi változása a cisplatin indukálta apoptózis során
A cisplatin (cis) ismert DNS károsító szer, mely kettős töréseket okoz a DNSben. A hatásának pontos molekuláris mechanizmusa még nem tisztázott. Kimutatták, hogy a cisplatin apoptózist indukál melanómasejtekben (109), és ehhez a mitokondriális apoptotikus utat használja a Bak molekula segítségével. Kísérleteinkben a Bak molekula konformációváltozásait és fehérjekapcsolatait vizsgáltuk a cisplatin indukálta apoptózisban. 5.3.1. A cisplatin hatására a Bak konformációja megváltozik, a keresztköthető forma eltűnik
Korábbi kísérletekben kiderült, hogy a 224 melanómasejtekben a cisplatin által kiváltott apoptózisban a Bak molekula központi szerepet játszik (109). A Bak molekula homo- és heterodimereket alkot a különböző sejtekben, ezenkívül van aktív és inaktív formája. A Bak fehérjének az inaktív formája a sejtek nehézmembrán frakciójából egy ciszteinspecifikus keresztkötőanyag segítségével (BMH) kimutatható Western blotton. Ez az inaktív forma 21 kDa-nál jelenik meg, míg az aktiváció során ez a forma eltűnik BMH
DMSO
Bak 26kDa Bak 21 kDa
Ko cis
Ko
cis
38. ábra A cisplatin hatására eltűnik a 21 kDa-os forma, a Bak aktiválódik 20 órás cisplatin kezelés után AA sejtekből kivontuk a nehézmembrán frakciót, amiből keresztkötő anyag jelenlétében (BMH), illetve hiányában (DMSO) a Bak fehérjét kimutattuk. A cisplatin kezelés hatására eltűnt a 21 kDa-os forma.
és csak 26 kDa-nál jelenik meg a Bak fehérje (112). A kísérleteinkben két melanóma
65
sejtvonalat vizsgáltunk és kimutattuk, hogy AA sejtekben a cisplatin kezelés hatására (20 óra) a Bak molekula aktiválódott: nem mutatható ki az említett 21 kDa-os forma (38. ábra). Ez az eredmény megegyezik a 224 sejtekben kapott korábbi eredményekkel, de hasonló jelenséget a DFW sejtekben nem tapasztaltunk. Ezekben a sejtekben egyáltalán nem található meg az említett konformáció. A keresztköthető forma eltűnése azt jelzi, hogy a Bak molekula konformációja megváltozott. 5.3.2. Az Ab1 és Ab3 ellenanyagkötő formák megjelenésének változása
A Bak aktiválódását a keresztkötésen kívül áramlási citometriával is ki lehet mutatni aktivációspecifikus ellenanyagok segítségével. A Bak-Ab1 ellenanyag a
Fluoreszcencia (kontroll%)
DFW sejtvonal 500 400 300 Ab1
200
Ab3 100 0 kontroll
cis16ó
cis18ó
Fluoreszcencia (kontroll%)
AA sejtvonal 500 400 300
Ab1 Ab3
200 100 0 kontroll
cis16ó
cis18ó
cis20ó
39. ábra Cisplatin hatására a Bak molekulához képes kapcsolódni az Ab1 és az Ab3 antitest A cisplatin hatására az idő függvényében mind az Ab1, mind az Ab3 antitest képes kapcsolódni a Bak molekulához mindkét sejtvonal sejtjeiben. Az antitestek fluoreszcenciáját áramlási citometriával mértük.
molekula N-terminálisának szabaddá válását mutatja. Ha a molekula N-terminálisa elérhetővé válik az ellenanyag számára, az kötődik, a fluoreszcenciaintenzitás
66
növekszik. A Bak-Ab3 ellenanyag pedig a BH3 domén felszabadulásakor képes kötődni. Mindkét sejtvonalon (DFW, AA) a cisplatin kezelés hatására mindkét ellenanyag képes kötődni a Bak-hoz időfüggően (39. ábra). A DFW sejtekben kisebb az Ab1 kötődésének mértéke, mint az AA sejtekben, valamint az Ab3 kötődése jóval kisebb mértékű az Ab1 kötődésénél AA sejtekben. Ez jelzi, hogy a BH3 domén és a DFW sejtekben a Bak N-terminálisa csak kevés Bak molekulában szabadult fel. Ennek oka az lehet, hogy valamilyen más molekulával lehet komplexben a fehérje, ami akadályozza az ellenanyag kötődését. Emellett abból az eredményből, hogy a DFW sejtekben nem jelenik meg a 21 kDa-os csík, de cisplatin hatására az Ab1 és az Ab3 kötődik a Bak-hoz, arra következtethetünk, hogy a két különböző kimutatási mód (áramlási citometria, western blot) nem ugyanazt az állapotot jelzi. 5.3.3. A Bak aktiválódása idején a cisplatin kismértékű DNS-fragmentációt képes indukálni a különböző melanóma sejtvonalakban
Megvizsgáltuk, hogy ez alatt az idő alatt (20 óra) az apoptózis végső lépése, a DNS-fragmentáció lezajlik-e vagy sem. A DFW sejtek esetén ugyanolyan mértékű sejtpusztulás előidézéséhez nagyobb cisplatin koncentrációt kellett alkalmaznunk (AA 30 µM, DFW 40 µM). A két különböző érzékenységű sejtvonalban ebben a korai időben a DNS-fragmentáció csak kismértékű. A nagyobb mértékű apoptózis később (26-30 óra) következik be. A Bak aktiválódása korai jele az elinduló apoptózisnak. 5.3.4. A proapoptotikus Bcl-2 fehérjék mennyisége melanómasejtekben
A DNS-fragmentációs kísérletekből és az Ab1 ellenanyaggal végzett kísérletekből kitűnik, hogy a DFW sejtek kevésbé érzékenyek a cisplatin kezelésre és a Bak molekula is kisebb mértékben aktiválódik. Griffiths kísérleteiben kimutatta, hogy T-lymphomákban a Bakhoz Bcl-xL kapcsolódik és apoptotikus jelre a Bak konformációs változásának hatására, leválik róla (113). A Bak nemcsak a Bcl-xL-lel, hanem a Bcl-2-vel is alkothat heterodimert (114). Ezért megvizsgáltuk, hogy a melanómasejtek tartalmaznak-e ilyen antiapoptotikus fehérjéket (40. ábra). Az
67
eredményekből kitűnik, hogy a DFW sejtek az AA sejtekhez képest jelentősen több BclxL-et tartalmaznak.
Bcl-xL Bcl-2
AA
DFW
AA
DFW
40. ábra Az AA és a DFW melanómasejtek Bcl-2 és Bcl-xL expressziója A fehérjék mennyiségét western blottal mutattuk ki.
5.3.5. A Bak és a Bcl-xL kapcsolata
Immunprecipitáció
segítségével
megpróbáltuk
igazolni,
hogy
a
nagy
mennyiségű Bcl-xL kapcsolódása a Bak-hoz lehet az oka annak, hogy a DFW sejtekben a 21 kDa-os csík nem jelenik meg, illetve csak kismértékű a Bak aktiválódása. Ha kapcsolódik a Bcl-xL a Bakhoz, akkor cisplatin kezelés hatására leválik-e róla, és így szabadon hagyja-e a Bak BH3 doménjét? Az eddigi vizsgálataink alapján nem tudtuk igazolni, hogy a Bcl-xL fokozott termelése állhat a DFW sejtekben a csökkent cisplatin érzékenység hátterében. A valódi okok felderítése még további vizsgálatokat igényel.
68
6. MEGBESZÉLÉS
A daganatelleni kezelések egyik célja az apoptózis kiváltása a daganatos sejtekben. Az apoptózist kiváltó szerek lehetnek mesterséges anyagok, de előfordulnak olyan természetes, fiziológiás faktorok is, melyeknek szintén citotoxikus hatásuk lehet. Kísérleteink során ilyen anyagok apoptózist kiváltó/szabályozó hatását vizsgáltuk. Arra kerestünk választ, hogy milyen hatásmechanizmussal milyen apoptotikus jelutakat használva okoznak apoptózist. Az egyik ilyen természetes anyag a TGFβ1, mely többek között a normális lymphociták apoptózisát is indukálja. A B-sejtek életében és az immunrendszer működésének fenntartásában alapvető a sejtek keletkezésének és pusztulásának egyensúlya és ebben a TGFβ szerepe. Sok daganat esetén viszont a daganatsejtek rezisztenssé válnak a TGFβ-ra. Kérdés: a.) a TGFβ által használt jelátviteli út ép, de az apoptózist pl. túlélési jelek, antiapoptotikus fehérjék gátolják, b.) maga jelátviteli út hibás (mutáció, deléció, más hibák miatt). Kísérleteinkben egy TGFβ1 termelés mellett proliferáló, de arra nem reagáló B-sejt eredetű lymphoma sejtvonalat használtunk (HT58), és vizsgáltuk, hogy a kívülről adott TGFβ1 képes-e apoptózist kiváltani. Az eredményekből kiderült, hogy az exogén TGFβ1 idő és koncentrációfüggően apoptózist indukál a HT58 sejtekben. Ez jelzi, hogy a TGFβ1 által használt jelátviteli út (amelynek expresszióját és aktivációját is kimutattuk) és az apoptotikus útvonalak bekapcsolhatóak és működőképesek. CLL esetén mutatták ki, hogy a dagantsejtek termelnek ugyan TGFβ-t, de elveszítik érzékenységüket vele szemben (91). Az ok lehet a TGFβ1 receptor csökkent expressziója, fokozott lebontása, vagy növekedhet a gátló Smad-ok aktivitása is. Tehát lehetséges, hogy egyszerre meghibásodik a jelátviteli rendszer, mellette pedig gátolt az apoptózis is. HT58 sejtekben (B-sejtes lymphoma sejtek) az apoptotikus útvonalak feltérképezése során kimutattuk, hogy TGFβ1 adása után a mitokondrium depolarizálódik, és az általános kaszpázgátló z-VAD-fmk csak csökkenteni tudta ezt a folyamatot, megszüntetni nem. A kaszpázgátló jelenlétében hasonló tendenciát mutatott a mitokondrium depolarizáció, mint a gátlószer nélkül. Ebből arra következtethetünk, hogy van kaszpázfüggő és kaszpáz-független része ennek a folyamatnak. A kaszpázok vizsgálata során kimutattuk, hogy az effektor kaszpázok egyik legjelentősebb tagja, a
69
kaszpáz-3 aktiválódott a TGFβ1 kezelés után az idő függvényében, valamint mind a kaszpáz-8, mind a kaszpáz-9 specifikus gátlója csökkentette a TGFβ1 által kiváltott apoptózist. Ezekből arra következtethetünk, hogy a kaszpáz-3-on kívül a két iniciátor kaszpáz is aktiválódott. Legalább az egyik iniciátor kaszpáz aktiválódása várható, itt ez mindkettővel (kaszpáz-8, -9) megtörténik. A kaszpáz-9 legfőbb aktiválódási módja az apoptoszóma
segítségével
valósul
meg,
amihez
a
mitokondriummembrán
depolarizációja és a a citokróm-c kibocsátása szükséges (23). A kaszpáz-8 a halálreceptorok aktiválódása után a FADD segítségével aktiválódhat (9). Ezeken az aktiválódási módokon kívül a kaszpáz-3 hasíthatja még mindkét iniciátor kaszpázt (részletesen lsd. a Bevezetés). A prokaszpáz-8 a „kaszpáz-mitokondrium önerősítő kör”-ben, míg a prokaszpáz-9 mind a citoplazmában, mind a mitokondriumban hasítódhat az effektor kaszpáz segítségével (67, 68). A halálreceptorokon keresztüli aktivációt neutralizációs kísérletekkel vizsgáltuk és kimutattuk, hogy sem a FasR, sem a TNF-60R, sem a DR5 gátlása nem csökkentette a TGFβ1 által kiváltott apoptózist. Tehát a kaszpáz-8 enzim aktiválódásáért nem a halálreceptorok a felelősek. Hasonló eredményeket közölt Inman és Allday a BL41 EBV-negatív B-lymphoma sejtek esetén. Kísérleteikben a TGFβ1 hatására a kaszpáz-8 enzim aktiválódott, de a halálreceptoroktól független módon (115). Ha viszont nem a halálreceptorok felelősek az enzim aktiválódásáért, akkor feltételezhető, hogy mind a kaszpáz-9, mind a kaszpáz-8 aktiválódása a citokróm-c kibocsátása után megy végbe. A citokróm-c kibocsátásának és a mitokondriumdepolarizációnak fontos szabályozói a Bcl-2 család pro- és antiapoptotikus tagjai. Hepatocitákban a TGFβ1 hatására a Bcl-xL fehérje mennyisége csökken, ami a mitokondrium depolarizációját váltja ki (90). Herrera és mtsai kimutatták, hogy a TGFβ1 csökkentette a Bcl-xL expresszióját RNS és fehérje szinten egyaránt. Colorectális adenoma sejtekben a TGFβ1 csökkentette a Bcl-2 szintjét (116), míg egér emlőhámsejtekben a Bax fehérje expressziójának növelésével és transzlokációjának indukálásával okozott apoptózist (117). Megvizsgáltuk a különböző Bcl-2 családtagok expressziójának változását. Egyik általunk vizsgált antiapoptotikus fehérjének (Bcl-2, Bcl-xL) sem változott a mennyisége, míg a proapoptotikus tagok közül a Bid fehérje hasítását igazoltuk a TGFβ kezelés után. A Bid hasítása bekövetkezhet különböző proteázok, leggyakrabban a kaszpáz-8 segítségével. Ennek az enzimnek a szerepét jelezte a korábbi gátlószeres kísérlet
70
eredménye is. A hasított Bid a Bax oligomerizációját és mitokondriális transzlokációját okozhatja (51). A HT58 lymphoma sejtekben a TGFβ1 kezelés után a Bax fehérje mennyisége ugyan nem, de a lokalizációja változott, a mitokondriumba vándorolt. Tehát a mitokondriumdepolarizációt a 24. óra után valószínűleg a Bid és a Bax fehérjék poszttranszlációs változásai idézték elő. Mivel ehhez a folyamathoz szükséges volt a kaszpáz-8 enzim aktivitására is, amely jelenesetben a halálreceptoroktól függetlenül, valószínűleg az önerősítő körön keresztül aktiválódik. Ezt az önerősítő kört pedig feltehetőleg egy kezdeti kismértékű citokróm-c kibocsátás indítja el, amely még nem jár a belső membrán depolarizációjával (41. ábra). A
TGFβ1
nemcsak
a
Bcl-2
fehérje
család
szabályozásán
keresztül
befolyásolhatja a mitokondrium működését, hanem az oxidatív gyökök termelésének növelésével is. Hepatocitákban a TGFβ1 hatására ROS emelkedést tapasztaltak (90), valamint a TIEG, a TGFβ indukálta transzkripciós faktor is a ROS expresszió változásán keresztül fejti ki apoptotikus hatását (88). HT58 sejtekben TGFβ1 kezelés után
expresszálódik
a
TIEG.
Sikerült
oxidatív
gyököket
is
kimutatni
a
mitokondriumban, bár egyértelműen egyik antioxidáns enzim (SOD, kataláz) expressziója sem változott. Mivel az antioxidánsok csökkentették némileg a TGFβ1 által kiváltott apoptózist, a ROS szerepe ebben a folyamatban valószínűsíthető. A ROS
TGFβRI-II
Halálreceptorok
Bid
Casp-8
?
?
foszfatáz aktiváció
Bax
?
Smad
Apaf-1
Erk1/2 ProCasp-9
CitoC-C
ROS
Casp-3
NFκB (túlélési szignálok) TIEG
oxidatív enzimek + ?
Apoptózis 41. ábra TGFβ1 feltételezett hatásmechanizmusa HT58 sejtekben
71
növekedése emellett "túl későn" következik be a TIEG aktiváláshoz képest, ami miatt nem tekinthetjük őket egyedüli felelősnek az apoptózis kiváltásáért. A kérdés még nyitott, hogy mi indítja el a mitokondrium membránjának permeabilizációját, illetve mi az első lépés a TIEG aktiválódása után. Lehetséges, hogy az exogén TGFβ1 hatására a túlélési faktorok csökkennek, esetleg eközben az endogén TGFβ1 is aktiválódik. A TGFβ1 jelátvteli útjának feltérképezésére laboratóriumunkban folynak vizsgálatok. Ezekből kiderült, hogy mind a Smad, mind a Smad-független útvonal működik a HT58 sejtekben, de bizonyos foszfatázok aktiválódása elengedhetetlen az apoptózis bekövetkezéséhez. Ezeknek a folyamatoknak a megismerése segíthet a TGFβ1 által indukált apoptózis jobb megértésében. Kísérleteink második részében összehasonlítottuk két retinoid: egy természetes retinsav, az ATRA és annak mesterséges származéka, a 4HPR apoptotikus hatását Bsejt eredetű non-Hodgkin lymphoma sejteken. Az ATRA-t magasabb koncentrációban használtuk, mint a 4HPR-t, és mint a klinikailag releváns dózis, mert az apoptózis indukáló hatása a 4HPR-hez képest gyengébb volt (kb. 5-ször) és hasonló körülmények között szerettük volna vizsgálni a két szer apoptotikus hatását. Chen és mtsai által korábban vizsgált myeloma multiplex sejtekhez hasonlóan, kísérleteinkben mindkét retinoid a mitokondriális apoptotikus utat használja a HT58 sejtekben (118). Az ATRA által indukált mitokondriumdepolarizáció már korán, 2 órával a kezelés után kimutatható HT58 sejtekben. Ez a mitokondriumdepolarizáció csökkenthető volt z-VAD-fmk-val, ami a kaszpázok szerepét jelzi ebben a folyamatban. A mitokondrium és a kaszpázok pozitívan erősíthetik egymást. Egy korai kismértékű citokróm-c kiáramlás aktiválhatja a kaszpázokat és azok pedig tovább növelik a citokróm-c kibocsátást. Megvizsgálva a Bcl-2 családba tartozó pro- és antiapoptotikus fehérjéket, azt találtuk, hogy mindkét retinoid csökkentette a Bcl-2 szintjét, míg a Baxét nem változtatta meg, de indukálta a citoplazmából a mitokondriumba való transzlokációját a mitokondriumdepolarizációval egyidőben. Ebben az ATRA esetében szerepet játszhatott a kaszpáz-8 is, aminek gátlása csökkentette az ATRA által kiváltott apoptózist. 4HPR esetében nem tisztázott, hogy mi indukálja a Bax transzlokációját, mivel a kaszpáz-8 gátlónak nem volt jelentős hatása a 4HPR kiváltotta apoptózisra.
72
Lehetséges, hogy egyéb proapoptotikus jelek (Bcl-2 csökkenése, ROS fejlődés, Bid hasítása más proteázok által) aktiválták ezt a változást. A z-VAD-fmk 24 órás kezelés során csökkentette az ATRA apoptotikus hatását, de
növelte
azon
sejtek
számát,
melyek
permeábilis
citoplazmamembránnal
rendelkeztek, ez pedig a nekrózis korai jele. Ez a jelenség azt sugallja, hogy nemcsak kaszpázfüggő apoptózist indukálhat az ATRA, hanem a sejthalál egy másik mechanizmusát is elindíthatja. Ez a nekrotikus útvonal kiindulhat a mitokondriumból, ahol a sérült légzési transzportlánc miatt ATP hiány és energetikai stressz keletkezhet (119). Emellett a kaszpázokon kívül más proteázok is aktiválódhatnak, például a kalpain is, amely szintén felelős lehet a nekrotikus sejthalál beindításáért (83). A 4HPR hatására korai gyors ROS-növekedést tapasztaltunk, amit más sejttípusok esetében is megfigyeltek már (120). Ez a ROS-felszaporodás valószínűleg a mitokondriális légzési lánc gátlása miatt következik be, ahogy azt más sejtek esetében igazolták (121, 122). Mindez elősegítheti a mitokondriummembrán depolarizációját, illetve a mitokondriális pórusok nyitását. A DNS–fragmentációt a z-VAD-fmk nem tudta gátolni 4HPR kezelés után HT58 sejtekben, ami ellentmond néhány irodalmi adatnak, amelyekben a 4HPR által indukált apoptózist a kaszpázgátló csökkenteni tudta (123). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az apoptózis gépezete különféleképpen működhet különböző, de hasonló eredetű sejtvonalak esetén. Mivel HT58 sejtekben a 4HPR hatása kaszpázfüggetlenséget mutatott (érzéketlen z-VAD-fmk-ra), ezért elkezdtük keresni, hogy milyen faktorok idézhetik elő ezt az apoptózist. Az Endonukleáz G-t és az AIF-et megvizsgálva sikerült kimutatni, hogy míg az AIF nem, az Endo G kiszabadul a mitokondriumokból 4HPR hatására. Valószínűleg ez az a faktor, mely a kaszpázfüggetlen DNS-fragmentációt okozza. Érdekes, hogy az AIF nem szabadul ki a mitokondriumból, ami jelezheti azt, hogy egy olyan pórus nyílt a mitokondriumon, mely csak bizonyos anyagok számára áteresztő. Ez azért is lehetséges, mivel kis méretű pórusnyílás esetén az AIF molekula (57 kDa) a mitokondriumban maradhat, míg a majdnem feleakkora Endo G (30 kDa) kikerülhet. Érdekes még, hogy az Endo G "kieresztése" megelőzi a nagymértékű mitokondrium depolarizációt, ami szintén a specifikus pórusnyitás elméletet és nem a nagyméretű permeabilitási pórus nyitás elméletét támogatja. Az ATRA esetében késői időpontban találtunk kismértékű Endo G kiáramlást, amely viszont már nem nagyon befolyásolhatja
73
az apoptózis menetét, mert ebben az időpontban az apoptózis mértéke elérte a plató fázist. Láthattuk, hogy a HT58 sejtekben 4HPR által a kiváltott apoptózis kaszpázfüggetlenül zajlott az Endo G közvetítésével. A folyamatot a ROS termelés növekedése indította, amely okozhatta a Bcl-2 fehérje mennyiségének csökkenését, az Endo G kieresztését, valamint a mitokondriummembrán-depolarizációt. Ezt a ATRA
4HPR
Bax
zVADfmk
? Bcl-2 Mitokondrium
?
Bax
ROS
zVADfmk
Mitokondriumm
Endo G ? DNA- fragmentáció Nekrózis Apoptózis
42. ábra Az ATRA és a 4HPR által kiváltott sejthalál feltételezett mechanizmusa HT58 sejtekben
mitokondriummembrán-depolarizációt valószínűleg a Bax transzlokációja is segítette (42. ábra). Ezekből az eredményekből látszik, hogy a két retinsav különböző apoptotikus útvonalat használ hatása során. Érdekes, hogy kaszpázgátolt állapotban a két szer különféleképpen okoz sejthalált: míg az ATRA esetében nekrotikus sejthalál figyelhető meg, addig a 4HPR kaszpázfüggetlenül okoz apoptózist. Ez segítséget adhat olyan terápiák kidolgozásában, amelyeket olyan non-Hodgkin lymphomák esetén lehet alkalmazni, melyekben alacsony a kaszpázaktivitás, illetve az IAP fehérjék fokozott expressziója figyelhető meg (124). A BL41 és BL41/95 sejtvonallal folytatott vizsgálatokból kitűnik, hogy a retinoidok hasonló hatást váltanak ki a különböző lymphoma sejtekben, bár a BL41 sejtekben a 4HPR inkább nekrotikus sejthalált vált ki, mint apoptotikusat. A különbség okának a megtalálása még további kutatásokat igényel. Lehetséges, hogy a
74
mitokondrium nagyobb károsodást szenved a BL41 sejtekben vagy esetleg az oxidatív foszforiláció hibája (fokozott ROS termelés) miatt ATP hiány lép fel, ami a nekrotikus sejthalált indukál. A kalpain fokozott termelődése vagy aktivitása is lehet ennek az oka. A HT58 és a BL41/95 esetén az ATRA által kiváltott DNS -fragmentáció platófázist ért el. Ez a hatás nagyon hasonlít az enzimtelítési görbékre. Ez a hatás valószínűleg a receptorok telítése miatt következett be. Ez azt sugallja, hogy a HT58 és a BL41/95 sejtekben a receptorok mennyisége kevesebb, mint a BL41 sejtekben. A BL41/95 sejtek csökkent érzékenysége a retinoidokra, valószínűleg az EBV vírusfragmentnek köszönhető, mivel az általa termelt fehérjék érzéketlenítik a sejteket az apoptózist indukáló szerekre. A cisplatin régóta használt daganatellenes szer, és gyakran használják az apoptózis
modellezésére,
vizsgálatára.
Korábbi
kísérletekből
ismert,
hogy
melanómasejtekben a cisplatin apoptózist indukál a Bak segítségével (109). Kísérleteinkben megvizsgáltuk, hogy a Bak milyen aktivációs lépéseken megy keresztül a különböző melanóma sejtvonalakban és mi akadályozhatja ezt az aktivációt. A Bak a Bcl-2 fehérje család proapoptotikus tagjai közé tartozik, a mitokondriummembrán depolarizációját és a citokróm-c kibocsátást indukálja. A Baxhoz hasonlóan a Bak-nak is oligomerizálódnia kell, hogy pórusformálást és/vagy pórusnyitást okozzon (125). A Bax (126) és a Bak (113) nemcsak oligomereket vagy komplexeket alkothatnak, hanem egy aktiválódási folyamatra is szükségük van az apoptotikus hatás kifejtéséhez. Wei és munkatársai leírták, hogy a tBid aktiválja a Bak molekulát és ennek hatására alkot oligomereket (114). Egy keresztkötőanyaggal (BMH) a Bak molekula keresztköthető, így kimutathatóak a komplexek, amelyeket más molekulákkal alkot, valamint a komplexeken kívül kimutatható a Baknak egy nem aktivált formája, amely 21 kDa-nál jelenik meg a kezeletlen sejtekben. Ekkor a keresztkötőanyag a Bak molekulában levő egymáshoz közeleső 2 ciszteint (az egyik közel van az N-terminális véghez, míg a másik a C-terminális BH2 doménhez) köti keresztbe, amelynek hatására "gyorsabban fut" a fehérje a gélben (127). Griffiths szerint az aktivációs folyamat két lépésből áll. Ez a két lépés két apoptotikus jelre, egymás után következik be: 1.) a molekula N-terminálisa szabaddá válik, 2.) a Bak BH1 doménjéhez kapcsolódó Bcl-xL leválik róla (113).
75
Kísérleteinkben
BMH-t
alkalmazva
vizsgáltuk
a
Bak
doménjeinek
felszabadulását. Egyes melanómasejtekben (AA) kezelés hatására a 21 kDa-os, keresztkötött forma eltűnik, és csak a normál méretű 26 kDa-os forma mutatható ki. Ennek az inaktív formának az eltűnése jelzi, hogy a molekulának megváltozott a szerkezete és a ciszteinek már nincsenek a BMH számára elérhető közelségben. Érdekes, hogy a másik melanóma sejtvonalban (DFW) egyáltalán nem jelenik meg a 21 kDa-os csík. Ezt az okozhatja, hogy valamilyen molekula olyan szerkezetben tartja a Bak-ot, hogy a benne levő ciszteinek nem kerülnek megfelelő közelségbe, miközben őt magát nem lehet keresztkötni a Bak-kal. A futtatás során a komplex felbomlik, viszont a Bak konformációja nem változik, nem tudja kialakítani a 21 kDa-os formát. A másik feltételezés, hogy olyan aktivációs jel éri a Bak-ot, hogy csak az aktivált formában található meg a DFW sejtekben. Ebben az esetben esetleg már eleve szabad az Nterminálisa és csak a változás minimális a cisplastin kezelés során? Megvizsgáltuk, hogy melanómasejteken kimutatható-e a Griffiths és mtsai által leírt aktivációs folyamat (113). Mindkét sejtvonal sejtjein tapasztalhattuk az Nterminális felszabadulását, bár eltérő mértékben, valamint a BH3 domén kismértékű kiszabadulását. Munkacsoportunk nem a BH1-es domént vizsgálta, mint Griffiths csoportja, hanem a BH3-ast, amely leginkább felelős a fehérje-fehérje kapcsolódásért. Az AA sejtekben a Bak N-terminálisának felszabadulása sokkal nagyobb mértékű, mint a DFW sejtekben. Ez azt jelzi, hogy kevesebb Bak molekula képes aktiválódni a DFW sejtekben. Ezen sejtek esetében magasabb cisplatin koncentrációt kellett alkalmazni, mint az AA sejteknél, ugyanolyan mértékű apoptózis kiváltásához. Lehetséges, hogy a cisplatinnal szembeni érzéketlenség hátterében a Bak kismértékű aktivációkészsége áll. Megvizsgáltuk az antiapoptotikus Bcl-2 és Bcl-xL mennyiségét a két sejtvonalban, melyek gátolhatják az apoptózis kialakulását. A DFW sejtekben nagy mértékű Bcl-xL expressziót találtunk. Griffiths kísérleteiből láthattuk, hogy a Bcl-xL kapcsolódhat a Bak-hoz, de apoptotikus szignál hatására leválik róla. A DFW sejtekben megjelenő nagy mennyiségű Bcl-xL azt suggalta, hogy ez a molekula felelős a sejtek érzéketlenségéért, esetleg a Bak aktiváció elmaradásáért. Az immunprecipitációs kísérletekben viszont nem sikerült kimutatni, hogy a Bcl-xL kapcsolódna a Bak-hoz, illetve cisplatin hatására leválna onnan. Lehetséges, hogy az érézketlenség hátterében a
76
Bcl-xL áll, de nem a Bak-kal van kapcsolatban, hanem más fehérjével. A Bak aktiváció elmaradásának és a 21 kDa-os forma hiányának hátterében lehetséges, hogy egy másik fehérjének a Bakhoz való kapcsolódása áll. Ennek a kimutatása további kutatásokat igényel. (43. ábra). Az eredményekből látható, hogy a különböző anyagok, legyenek azok természetes vagy mesterséges eredetűek, eltérő apoptotikus utakat használnak. Ezeknek a megismerése és a terápia kapcsán való figyelembe vétele, elengedhetetlen feltétele a sikeres kezeléseknek.
aktív Ab-1
cis
21 kDa DFW
cis
cis
AA
Ab1 Ab3
sejt-halál
komplex képzés?
26 kDa ?
X
?
X
43. ábra A Bak molekulának lehetséges aktiválódási lépései AA és DFW sejtekben
77
7. LEGFONTOSABB ÚJ MEGFIGYELÉSEK ÉS MEGÁLLAPÍTÁSOK
7.1. HT58 B-lymphoma sejteken TGFβ1 kezelés után végzett vizsgálatok alapján megállapítjuk:
1. A TGFβ1-et termelő B-lymphoma sejtekben (HT58), melyek a saját TGFβ-jukra érzéketlenek, exogén TGFβ1 segítségével képesek voltunk apoptózist indukálni időés koncentrációfüggően. 2. Ezekben a lymphoma sejtekben TGFβ1 hatására az apoptózis mitokondriális útja kapcsol be. 3. A mitokondriális út során az ismert halálreceptoroktól függetlenül aktiválódnak a kaszpázok, melyek egy erősítőkörben további mitokondriumdepolarizációt idéznek elő a Bax mitokondriumba történő transzlokációjának elősegítésével. 4. A vizsgálatok során igazoltuk, hogy a TIEG transzkripciós faktor expressziója növekszik, és a reaktív oxigéngyököknek szerepe van a TGFβ1 által indukált apoptózisban B-lymphoma sejtekben. 5. HT58 sejtekben az exogén TGFβ1 proliferációt gátló hatása nem figyelhető meg. A TGFβ1 kezelést követően elmarad a p16, p21 és a CDK4 expresszió fokozódása.
7.2. Az ATRA és a 4HPR kezelések alapján megállapítjuk:
6. Mind a természetes retinsav (ATRA), mind mesterséges analógja (4HPR) képes Blymphoma sejtekben apoptózist kiváltani. 7. Az apoptotikus mechanizmus vizsgálata alapján megállapítottuk, hogy mindkét retinsav által indukált apoptózisban szerepe van a mitokondriumnak, de míg az ATRA kaszpázfüggő, a 4HPR az Endonukleáz G segítségével kaszpázfüggetlen apoptózist indukál HT58 sejtekben. 8. Mindkét retinsav csökkentette a Bcl-2 mennyiségét és az ATRA indukálta a Bax mitokondriumba történő transzlokációját HT58 sejtekben. 9. A reaktív oxigéngyökök mennyiségét az ATRA nem változtatta meg, a 4HPR viszont már 15 perc után növelte azt koncentrációfüggően.
78
10. Az általános kaszpázgátló (z-VAD-fmk) hatására az ATRA-kezelt sejtek apoptózis helyett nekrózissal pusztulnak el HT58 sejtekben. 11. Az EBV-pozitív BL41/95 sejtek kevésbé érzékenyek a retinoid kezelésre, mint a BL41 EBV-negatív sejtek. 12. A BL41 sejtekben nekrózis következik be 4HPR hatására. 13. A lymphomák terápiájában a retinoidok alkalmazása során a kaszpázok aktivitása fontos befolyásoló tényező a kiváltott sejthalál formáját illetően.
7.3. A Bak konformációjának vizsgálata alapján megállapítjuk:
14. Az AA melanoma sejtekben cisplatin kezelés hatására a Bak aktiválódik és tovább nem keresztköthető BMH-val. DFW sejtvonal esetén a kezeletlen sejtekben sem jelenik meg ez a forma. 15. Mindkét sejtvonal sejtjeiben cisplatin kezelés hatására a Bak N-terminálisa szabaddá válik, de a BH3 domén csak kevés Bak esetén. 16. A DFW sejtekben nagyobb a Bcl-xL mennyisége, mint az AA sejtekben, ennek a Bak aktivitását befolyásoló szerepét (Bak-Bcl-xL komplex) nem tudtuk igazolni. 7.4. A vizsgálatok összegzéséből megállapítjuk: 17. Az általunk felhasznált mesterséges anyagok (cisplatin, 4HPR) főleg direkt sejtkárosító hatás révén váltanak ki apoptózist, míg a vizsgált természetes anyagok (TGFβ1, ATRA) inkább génszabályozás útján, sokkal finomabb szabályozással képesek sejthalált, többnyire apoptózist indukálni. 18. Mindegyik anyag hatásában megfigyelhettük a Bcl-2 fehérje család anti- és proapoptotikus tagjainak szerepét (transzlokációjának változását, aktiválódását, expressziójának csökkenését).
79
8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Értekezésem végén szeretném megköszönni mindazoknak a segítségét, akik az eddigi többéves munkámban a segítségemre voltak:
programvezetőm és témavezetőmnek Dr. Kopper László egyetemi tanárnak, a Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet igazgatójának, aki mind a kísérletes munkám során, mind a dolgozat elkészítésénél, sokat segített és támogatott;
Dr. Sebestyén Anna tudományos munkatársnak, akivel nagyon sokat dolgoztunk együtt, és akinek segítsége és tanítása nélkül nem jutottam volna idáig;
Dr. Mihalik Rudolf tudományos munkatársnak, akitől megtanulhattam az áramlási citometria rejtelmeit és építő kritikáival előbbre vitt a tudományos kutatásban;
Dr. Peták István tudományos főmunkatársnak, aki ötleteivel segített a cikkek írása során;
Csorba Gézáné asszisztensnek, aki előkészítő munkájával és kedvességével segítette a munkámat a laboratóriumban;
Maria Shoshan PhD associated professor-nak, aki lehetővé tette, hogy Stockholmban, a laboratóriumában és a csoportjában bekapcsolódjam a munkába;
Dr. Paku Sándor tudományos munkatársnak, aki segített a konfokális mikroszkópos képek elkészítésében;
köszönet illeti a közleményekben szereplő minden szerzőtársat a Kopper-labor és a FACS-labor valamennyi munkatársát, hogy támogatták munkámat;
végezetül, de nem utolsó sorban köszönöm Pató Adriennek, kedvesemnek a bíztató szavait, a mellettem való kitartását és édesanyámnak a sok türelmet, a sok éves bíztatást és az ábrák készítésében való segítséget.
80
9. RÖVIDÍTÉS JEGYZÉK
4HPR - N-(4-hydroxyphenyl)-retinamid
DTT - di-tio-treitol
AIF - apoptosis inducing factor
EBV - Epstein-Barr vírus
AMID - AIF-homologous mitochondrion-
ENDO G - Endonukleáz G
associated inducer of death
ERK - extracellular-signal regulated
ANT - adenin nukleotid transzlokátor
kinase
APAF-1 - apoptosis protease-activating
FADD - Fas-associated death domain
factor 1
FAK - fokális adhéziós kináz
ARC - apoptosis repressor with caspase
FITC - fluoreszcein izo-tio cianát
recruitment domain
FLICE - FADD-homologous
ATRA - all-trans retinoic acid
ICE/CED-3-like protease
BCL-2 - B cell lymphoma 2 gén
FLIP - FLICE inhibitory protein
BPR - benzodiazepin periferial receptor
GSH - gluthation
CAD - caspase activated DNase
H2DCF-DA - 2’-7’-dikloro-dihidro-
CARD - caspase recruiting domain
fluoreszcein-diacetát
CCCP - carbonyl cyanide 3-
HK - hexokinase II
chlorophenylhydrazone
ICAD - inhibitor of CAD
CDDP - cis-diamminedichloro platinum
ICE - interleukin 1beta converting
CED-3 - Caenorhabditis elegans death
enzyme
gene 3
JC1 - 5,5’,6,6’tetrakloro-1,1’,3,3’-
CK - creatine kinase
tetraetil-benzimidazolil-carbocianin
CMTMRos - klorometil-
jodid
tetrametilrosamin
JNK - Jun N terminal kinase
DcR1 - decoy receptor 1
MAP-kináz - Mitogen aktivated protein
DD - death domain
kinase
DED - death effector domain
MEKK1 - MAPK/ERK kináz kináz 1
DiOC6 - 3,3’dihexiloxacarbocyanin jodid
MMP - mátrix metalloproteáz
DISC - death inducing signaling complex
NAC - N-acetil-cistein
DMSO - di-metil szulfoxid
NIK - NF-κB-inducing kinase
DNS-PK - DNS protein kináz
NO - nitrogen monoxid
81
PI - propidium jodid
Z-LETD-FMK - benzyloxicarbonyl
PMSF - phenyl-methyl-sulfonyl fluoride
Leu-Glu-Trp-Asp-fluoromethyl-ketone
PRG3 - p53-responsive gene 3
Z-VAD-FMK - benzyloxicarbonyl-ValAla-Asp-fluoromethyl-ketone
PTPC - permeability transmission pore
complex RAIDD - RIP-associated Ich1/CED3
homolougus protein with death domain RIP - receptor-interacting protein ROS - reactive oxigen species SAPK - stress activated protein kinase SMAC/DIABLO - second mitochondria-
derived activator of caspases/direct IAP binding protein with Low p1 SOD - superoxid dismutase TGFß - transzformation growth factor
beta TIEG - TGFß induced early gene TIMP - tissue inhibitor of
metalloproteinases TNF - tumornekrózis faktor TNFR - tumornekrózis faktor receptor TRADD - TNFR-associated death domain TRAF1/2 - TNF receptor-associated
factor 1/2 TRAIL - TNF related apoptosis inducing
ligand VDAC - voltage dependent anion channel XIAP - X-linked inhibitor of apoptosis Z-IETD-FMK - benzyloxicarbonyl -Ile-
Glu-Trp-Asp-fluoromethyl-ketone Z-LEHD-FMK - benzyloxicarbonyl Leu-
Glu-His-fluoromethyl-ketone
82
10. IRODALOM JEGYZÉK:
1.
Petak I, Houghton JA. Shared pathways: death receptors and cytotoxic drugs in cancer therapy.Pathol Oncol Res. 2001;7(2):95-106.
2.
Loetscher H, Pan YC, Lahm HW, Gentz R, Brockhaus M, Tabuchi H, Lesslauer W. Molecular cloning and expression of the human 55 kd tumor necrosis factor receptor. Cell. 1990 Apr 20;61(2):351-9.
3.
Oehm A, Behrmann I, Falk W, Pawlita M, Maier G, Klas C, Li-Weber M, Richards S, Dhein J, Trauth BC, et al. Purification and molecular cloning of the APO-1 cell surface antigen, a member of the tumor necrosis factor/nerve growth factor receptor superfamily. Sequence identity with the Fas antigen. J Biol Chem. 1992 May 25;267(15):10709-15.
4.
Tartaglia LA, Ayres TM, Wong GH, Goeddel DV. A novel domain within the 55 kd TNF receptor signals cell death. Cell. 1993 Sep 10;74(5):845-53.
5.
Gruss HJ, Dower SK. Tumor necrosis factor ligand superfamily: involvement in the pathology of malignant lymphomas. Blood. 1995 Jun 15;85(12):3378-404.
6.
Pan G, Ni J, Wei YF, Yu G, Gentz R, Dixit VM.An antagonist decoy receptor and a death domain-containing receptor for TRAIL. Science. 1997 Aug 8;277(5327):815-8.
7.
Ashkenazi A, Dixit VM. Death receptors: Signaling and modulation Science 1998 Aug 28;281(5381):1305-8
8.
Hofmann K, Bucher P, Tschopp J. The CARD domain: a new apoptotic signalling motif. Trends Biochem Sci. 1997 May;22(5):155-6.
9.
Muzio M, Stockwell BR, Stennicke HR, Salvesen GS, Dixit VM. An induced proximity model for caspase-8 activation. J Biol Chem. 1998 Jan 30;273(5):292630.
10.
Irmler M, Thome M, Hahne M, Schneider P, Hofmann K, Steiner V, Bodmer JL, Schroter M, Burns K, Mattmann C, Rimoldi D, French LE, Tschopp J. Inhibition of death receptor signals by cellular FLIP. Nature. 1997 Jul 10;388(6638):190-5.
83
11.
Kelliher MA, Grimm S, Ishida Y, Kuo F, Stanger BZ, Leder P. The death domain kinase RIP mediates the TNF-induced NF-kappaB signal. Immunity. 1998 Mar;8(3):297-303.
12.
Devin A, Lin Y, Liu ZG. The role of the death-domain kinase RIP in tumournecrosis-factor-induced activation of mitogen-activated protein kinases. EMBO Rep. 2003 Jun;4(6):623-7.
13.
Ahmad M, Srinivasula SM, Wang L, Talanian RV, Litwack G, FernandesAlnemri T, Alnemri ES. CRADD, a novel human apoptotic adaptor molecule for caspase-2, and FasL/tumor necrosis factor receptor-interacting protein RIP. Cancer Res. 1997 Feb 15;57(4):615-9.
14.
Kuwana T, Smith JJ, Muzio M, Dixit V, Newmeyer DD, Kornbluth S. Apoptosis induction by caspase-8 is amplified through the mitochondrial release of cytochrome c. J Biol Chem. 1998 Jun 26;273(26):16589-94.
15.
Krammer PH. CD95's deadly mission in the immune system. Nature. 2000 Oct 12;407(6805):789-95.
16.
Thornberry NA and Lazebnik Y. Caspases: Enemies within Science 1998 Aug28;281:1312-1316.
17.
Wang S, Miura M, Jung YK, Zhu H, Li E, Yuan J. Murine caspase-11, an ICEinteracting protease, is essential for the activation of ICE. Cell. 1998 Feb 20;92(4):501-9.
18.
Humke EW, Ni J, Dixit VM. ERICE, a novel FLICE-activatable caspase. J Biol Chem. 1998 Jun 19;273(25):15702-7.
19.
Koenig U, Eckhart L, Tschachler E. Evidence that caspase-13 is not a human but a bovine gene. Biochem Biophys Res Commun. 2001 Aug 3;285(5):1150-4.
20.
Pistritto G, Jost M, Srinivasula SM, Baffa R, Poyet JL, Kari C, Lazebnik Y, Rodeck U, Alnemri ES. Expression and transcriptional regulation of caspase-14 in simple and complex epithelia. Cell Death Differ. 2002 Sep;9(9):995-1006.
21.
Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J. 1997 Aug 15;326 ( Pt 1):1-16.
22.
Nicholson DW, Thornberry NA. Caspases: killer proteases. Trends Biochem Sci. 1997 Aug;22(8):299-306.
84
23.
Li P, Nijhawan D, Budihardjo I, Srinivasula SM, Ahmad M, Alnemri ES, Wang X. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 1997 Nov 14;91(4):479-89.
24.
Enari M, Sakahira H, Yokoyama H, Okawa K, Iwamatsu A, Nagata S. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 1998 Jan 1;391(6662):43-50.
25.
Cheng EH, Kirsch DG, Clem RJ, Ravi R, Kastan MB, Bedi A, Ueno K, Hardwick JM. Conversion of Bcl-2 to a Bax-like death effector by caspases. Science. 1997 Dec 12;278(5345):1966-8.
26.
Kothakota S, Azuma T, Reinhard C, Klippel A, Tang J, Chu K, McGarry TJ, Kirschner MW, Koths K, Kwiatkowski DJ, Williams LT. Caspase-3-generated fragment of gelsolin: effector of morphological change in apoptosis. Science. 1997 Oct 10;278(5336):294-8.
27.
Ray CA, Black RA, Kronheim SR, Greenstreet TA, Sleath PR, Salvesen GS, Pickup DJ. Viral inhibition of inflammation: cowpox virus encodes an inhibitor of the interleukin-1 beta converting enzyme. Cell. 1992 May 15;69(4):597-604.
28.
Bump NJ, Hackett M, Hugunin M, Seshagiri S, Brady K, Chen P, Ferenz C, Franklin S, Ghayur T, Li P, et al. Inhibition of ICE family proteases by baculovirus antiapoptotic protein p35. Science. 1995 Sep 29;269(5232):1885-8.
29.
Uren AG, Coulson EJ, Vaux DL. Conservation of baculovirus inhibitor of apoptosis repeat proteins (BIRPs) in viruses, nematodes, vertebrates and yeasts. Trends Biochem Sci. 1998 May;23(5):159-62.
30.
Zhou Q, Krebs JF, Snipas SJ, Price A, Alnemri ES, Tomaselli KJ, Salvesen GS. Interaction of the baculovirus anti-apoptotic protein p35 with caspases. Specificity, kinetics, and characterization of the caspase/p35 complex. Biochemistry. 1998 Jul 28;37(30):10757-65.
31.
Richter BW, Duckett CS. The IAP proteins: caspase inhibitors and beyond. Sci STKE. 2000 Aug 8;2000(44):PE1.
32.
Koseki T, Inohara N, Chen S, Nunez G. ARC, an inhibitor of apoptosis expressed in skeletal muscle and heart that interacts selectively with caspases. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Apr 28;95(9):5156-60.
85
33.
Németh K. Interleukin-1β konvertáz peptid inhibitorainak hatása a gyulladást közvetítő citokinek képződésére és apoptózisra in vitro. Doktori értekezés (1997)
34.
Brenner C, Kroemer G. Apoptosis. Mitochondria--the death signal integrators. Science. 2000 Aug 18;289(5482):1150-1.
35.
Kopper L, Fésüs L: Apoptózis. Medicina Könyvkiadó, 2002
36.
Gottlieb TM, Oren M. p53 and apoptosis. Semin Cancer Biol. 1998;8(5):359-68.
37.
Marchenko ND, Zaika A, Moll UM. Death signal-induced localization of p53 protein to mitochondria. A potential role in apoptotic signaling. J Biol Chem. 2000 May 26;275(21):16202-12.
38.
Giraudo CG, Maccioni HJ.Ganglioside glycosyltransferases organize in distinct multienzyme
complexes
in
CHO-K1
cells.
J
Biol
Chem.
2003
Oct
10;278(41):40262-71. 39.
Rippo MR, Malisan F, Ravagnan L, Tomassini B, Condo I, Costantini P, Susin SA, Rufini A, Todaro M, Kroemer G, Testi R. GD3 ganglioside directly targets mitochondria in a bcl-2-controlled fashion. FASEB J. 2000 Oct;14(13):2047-54.
40.
Stoica BA, Movsesyan VA, Lea PM 4th, Faden AI.Ceramide-induced neuronal apoptosis is associated with dephosphorylation of Akt, BAD, FKHR, GSK-3beta, and induction of the mitochondrial-dependent intrinsic caspase pathway. Mol Cell Neurosci. 2003 Mar;22(3):365-82.
41.
Bernardi P, Scorrano L, Colonna R, Petronilli V, Di Lisa F. Mitochondria and cell death. Mechanistic aspects and methodological issues. Eur J Biochem. 1999 Sep;264(3):687-701.
42.
Tsujimoto Y, Croce CM. Analysis of the structure, transcripts, and protein products of bcl-2, the gene involved in human follicular lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986 Jul;83(14):5214-8.
43.
Korsmeyer SJ. Bcl-2: an antidote to programmed cell death. Cancer Surv. 1992;15:105-18.
44.
Gross A, McDonnell JM, Korsmeyer SJ. BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 1999 Aug 1;13(15):1899-911.
45.
Yin XM, Oltvai ZN, Korsmeyer SJ. BH1 and BH2 domains of Bcl-2 are required for inhibition of apoptosis and heterodimerization with Bax. Nature. 1994 May 26;369(6478):321-3.
86
46.
Sattler M, Liang H, Nettesheim D, Meadows RP, Harlan JE, Eberstadt M, Yoon HS, Shuker SB, Chang BS, Minn AJ, Thompson CB, Fesik SW. Structure of BclxL-Bak peptide complex: recognition between regulators of apoptosis. Science. 1997 Feb 14;275(5302):983-6.
47.
Zhu W, Cowie A, Wasfy GW, Penn LZ, Leber B, Andrews DW. Bcl-2 mutants with restricted subcellular location reveal spatially distinct pathways for apoptosis in different cell types. EMBO J. 1996 Aug 15;15(16):4130-41.
48.
de Jong D, Prins FA, Mason DY, Reed JC, van Ommen GB, Kluin PM. Subcellular localization of the bcl-2 protein in malignant and normal lymphoid cells. Cancer Res. 1994 Jan 1;54(1):256-60.
49.
Gross A, Jockel J, Wei MC, Korsmeyer SJ. Enforced dimerization of BAX results in its translocation, mitochondrial dysfunction and apoptosis. EMBO J. 1998 Jul 15;17(14):3878-85.
50.
Puthalakath H, Huang DC, O'Reilly LA, King SM, Strasser A. The proapoptotic activity of the Bcl-2 family member Bim is regulated by interaction with the dynein motor complex. Mol Cell. 1999 Mar;3(3):287-96
51.
Desagher S, Osen-Sand A, Nichols A, Eskes R, Montessuit S, Lauper S, Maundrell K, Antonsson B, Martinou JC. Bid-induced conformational change of Bax is responsible for mitochondrial cytochrome c release during apoptosis. J Cell Biol. 1999 Mar 8;144(5):891-901.
52.
Eskes R, Desagher S, Antonsson B, Martinou JC. Bid induces the oligomerization and insertion of Bax into the outer mitochondrial membrane. Mol Cell Biol. 2000 Feb;20(3):929-35.
53.
Schlesinger PH, Gross A, Yin XM, Yamamoto K, Saito M, Waksman G, Korsmeyer SJ. Comparison of the ion channel characteristics of proapoptotic BAX and antiapoptotic BCL-2. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Oct 14;94(21):11357-62.
54.
Shimizu S, Ide T, Yanagida T, Tsujimoto Y. Electrophysiological study of a novel large pore formed by Bax and the voltage-dependent anion channel that is permeable to cytochrome c. J Biol Chem. 2000 Apr 21;275(16):12321-5.
55.
Rostovtseva TK, Antonsson B, Suzuki M, Youle RJ, Colombini M, Bezrukov SM. Bid, but not Bax, regulates VDAC channels. J Biol Chem. 2004 Apr 2;279(14):13575-83.
87
56.
Basanez G, Sharpe JC, Galanis J, Brandt TB, Hardwick JM, Zimmerberg J. Baxtype apoptotic proteins porate pure lipid bilayers through a mechanism sensitive to intrinsic monolayer curvature. J Biol Chem. 2002 Dec 20;277(51):49360-5.
57.
Vander Heiden MG, Li XX, Gottleib E, Hill RB, Thompson CB, Colombini M. Bcl-xL promotes the open configuration of the voltage-dependent anion channel and metabolite passage through the outer mitochondrial membrane. J Biol Chem. 2001 Jun 1;276(22):19414-9.
58.
Marzo I, Brenner C, Zamzami N, Susin SA, Beutner G, Brdiczka D, Remy R, Xie ZH, Reed JC, Kroemer G. The permeability transition pore complex: a target for apoptosis regulation by caspases and bcl-2-related proteins. J Exp Med. 1998 Apr 20;187(8):1261-71.
59.
Crompton M. The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death. Biochem J. 1999 Jul 15;341 ( Pt 2):233-49.
60.
Petrosillo G, Ruggiero FM, Pistolese M, Paradies G. Reactive oxygen species generated from the mitochondrial electron transport chain induce cytochrome c dissociation
from
beef-heart
submitochondrial
particles
via
cardiolipin
peroxidation. Possible role in the apoptosis. FEBS Lett. 2001 Dec 14;509(3):435-8. 61.
Pandey P, Saleh A, Nakazawa A, Kumar S, Srinivasula SM, Kumar V, Weichselbaum R, Nalin C, Alnemri ES, Kufe D, Kharbanda S. Negative regulation of cytochrome c-mediated oligomerization of Apaf-1 and activation of procaspase9 by heat shock protein 90. EMBO J. 2000 Aug 15;19(16):4310-22.
62.
Bruey JM, Ducasse C, Bonniaud P, Ravagnan L, Susin SA, Diaz-Latoud C, Gurbuxani S, Arrigo AP, Kroemer G, Solary E, Garrido C.Hsp27 negatively regulates cell death by interacting with cytochrome c. Nat Cell Biol. 2000 Sep;2(9):645-52.
63.
Saleh A, Srinivasula SM, Balkir L, Robbins PD, Alnemri ES.Negative regulation of the Apaf-1 apoptosome by Hsp70. Nat Cell Biol. 2000 Aug;2(8):47683.
64.
Beere HM, Wolf BB, Cain K, Mosser DD, Mahboubi A, Kuwana T, Tailor P, Morimoto RI, Cohen GM, Green DR.Heat-shock protein 70 inhibits apoptosis by preventing recruitment of procaspase-9 to the Apaf-1 apoptosome. Nat Cell Biol. 2000 Aug;2(8):469-75.
88
65.
Du C, Fang M, Li Y, Li L, Wang X.Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition. Cell. 2000 Jul 7;102(1):33-42.
66.
Marzo I, Susin SA, Petit PX, Ravagnan L, Brenner C, Larochette N, Zamzami N, Kroemer G. Caspases disrupt mitochondrial membrane barrier function. FEBS Lett. 1998 May 8;427(2):198-202.
67.
Chen Q, Gong B, Almasan A.Distinct stages of cytochrome c release from mitochondria: evidence for a feedback amplification loop linking caspase activation to mitochondrial dysfunction in genotoxic stress induced apoptosis. Cell Death Differ. 2000 Feb;7(2):227-33.
68.
Susin SA, Lorenzo HK, Zamzami N, Marzo I, Brenner C, Larochette N, Prevost MC, Alzari PM, Kroemer G. Mitochondrial release of caspase-2 and -9 during the apoptotic process. J Exp Med. 1999 Jan 18;189(2):381-94.
69.
Chandra D, Tang DG. Mitochondrially localized active caspase-9 and caspase-3 result mostly from translocation from the cytosol and partly from caspase-mediated activation in the organelle. Lack of evidence for Apaf-1-mediated procaspase-9 activation in the mitochondria. J Biol Chem. 2003 May 9;278(19):17408-20.
70.
Susin SA, Lorenzo HK, Zamzami N, Marzo I, Snow BE, Brothers GM, Mangion J, Jacotot E, Costantini P, Loeffler M, Larochette N, Goodlett DR, Aebersold
R,
Siderovski
DP,
Penninger
JM,
Kroemer
G.
Molecular
characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor. Nature. 1999 Feb 4;397(6718):441-6. 71.
Ravagnan L, Gurbuxani S, Susin SA, Maisse C, Daugas E, Zamzami N, Mak T, Jaattela M, Penninger JM, Garrido C, Kroemer G.Heat-shock protein 70 antagonizes apoptosis-inducing factor. Nat Cell Biol. 2001 Sep;3(9):839-43.
72.
Yakovlev AG, Di X, Movsesyan V, Mullins PG, Wang G, Boulares H, Zhang J, Xu M, Faden AI. Presence of DNA fragmentation and lack of neuroprotective effect in DFF45 knockout mice subjected to traumatic brain injury. Mol Med. 2001 Mar;7(3):205-16.
73.
van Loo G, Schotte P, van Gurp M, Demol H, Hoorelbeke B, Gevaert K, Rodriguez I, Ruiz-Carrillo A, Vandekerckhove J, Declercq W, Beyaert R, Vandenabeele P. Endonuclease G: a mitochondrial protein released in apoptosis
89
and involved in caspase-independent DNA degradation. Cell Death Differ. 2001 Dec;8(12):1136-42. 74.
Faccio L, Fusco C, Chen A, Martinotti S, Bonventre JV, Zervos AS.Characterization of a novel human serine protease that has extensive homology to bacterial heat shock endoprotease HtrA and is regulated by kidney ischemia. J Biol Chem. 2000 Jan 28;275(4):2581-8.
75.
Verhagen AM, Silke J, Ekert PG, Pakusch M, Kaufmann H, Connolly LM, Day CL, Tikoo A, Burke R, Wrobel C, Moritz RL, Simpson RJ, Vaux DL.HtrA2 promotes cell death through its serine protease activity and its ability to antagonize inhibitor of apoptosis proteins. J Biol Chem. 2002 Jan 4;277(1):445-54.
76.
Chang NS, Pratt N, Heath J, Schultz L, Sleve D, Carey GB, Zevotek N.Hyaluronidase induction of a WW domain-containing oxidoreductase that enhances tumor necrosis factor cytotoxicity. J Biol Chem. 2001 Feb 2;276(5):336170.
77.
Wu M, Xu LG, Li X, Zhai Z, Shu HB. AMID, an apoptosis-inducing factorhomologous mitochondrion-associated protein, induces caspase-independent apoptosis. J Biol Chem. 2002 Jul 12;277(28):25617-23.
78.
Ohiro Y, Garkavtsev I, Kobayashi S, Sreekumar KR, Nantz R, Higashikubo BT, Duffy SL, Higashikubo R, Usheva A, Gius D, Kley N, Horikoshi N. A novel p53inducible apoptogenic gene, PRG3, encodes a homologue of the apoptosis-inducing factor (AIF). FEBS Lett. 2002 Jul 31;524(1-3):163-71.
79.
Didenko VV, Ngo H, Minchew CL, Boudreaux DJ, Widmayer MA, Baskin DS. Caspase-3-dependent and -independent apoptosis in focal brain ischemia. Mol Med. 2002 Jul;8(7):347-52.
80.
Anselmi C, Ettorre A, Andreassi M, Centini M, Neri P, Di Stefano A. In vitro induction of apoptosis vs. necrosis by widely used preservatives: 2-phenoxyethanol, a mixture of isothiazolinones, imidazolidinyl urea and 1,2-pentanediol. Biochem Pharmacol. 2002 Feb 1;63(3):437-53.
81.
Lin Y, Choksi S, Shen HM, Yang QF, Hur GM, Kim YS, Tran JH, Nedospasov SA, Liu ZG.Tumor necrosis factor-induced nonapoptotic cell death requires receptor-interacting
protein-mediated
cellular
reactive
accumulation. J Biol Chem. 2004 Mar 12;279(11):10822-8.
90
oxygen
species
82.
Kemp TJ, Kim JS, Crist SA, Griffith TS. Induction of necrotic tumor cell death by TRAIL/Apo-2L. Apoptosis. 2003 Dec;8(6):587-99.
83.
Wang KK. Calpain and caspase: can you tell the difference? Trends Neurosci. 2000 Feb;23(2):59.
84.
Broker LE, Huisman C, Span SW, Rodriguez JA, Kruyt FA, Giaccone G.Cathepsin B mediates caspase-independent cell death induced by microtubule stabilizing agents in non-small cell lung cancer cells. Cancer Res. 2004 Jan 1;64(1):27-30.
85.
Letterio JJ, Roberts AB. Regulation of immune responses by TGF-beta. Annu Rev Immunol. 1998;16:137-61.
86.
Dzik WH. Apoptosis, TGF beta and transfusion-related immunosuppression: Biologic versus clinical effects. Transfus Apheresis Sci. 2003 Oct;29(2):127-9.
87.
Massague J, Chen YG. Controlling TGF-beta signaling. Genes Dev. 2000 Mar 15;14(6):627-44.
88.
Subramaniam M, Harris SA, Oursler MJ, Rasmussen K, Riggs BL, Spelsberg TC. Identification of a novel TGF-beta-regulated gene encoding a putative zinc finger protein in human osteoblasts. Nucleic Acids Res. 1995 Dec 11;23(23):490712.
89.
Tachibana I, Imoto M, Adjei PN, Gores GJ, Subramaniam M, Spelsberg TC, Urrutia R. Overexpression of the TGFbeta-regulated zinc finger encoding gene, TIEG, induces apoptosis in pancreatic epithelial cells. J Clin Invest. 1997 May 15;99(10):2365-74.
90.
Albright CD, Salganik RI, Craciunescu CN, Mar MH, Zeisel SH. Mitochondrial and microsomal derived reactive oxygen species mediate apoptosis induced by transforming growth factor-beta1 in immortalized rat hepatocytes. J Cell Biochem. 2003 May 15;89(2):254-61.
91.
DeCoteau JF, Knaus PI, Yankelev H, Reis MD, Lowsky R, Lodish HF, Kadin ME. Loss of functional cell surface transforming growth factor beta (TGF-beta) type 1 receptor correlates with insensitivity to TGF-beta in chronic lymphocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 May 27;94(11):5877-81.
92.
Lo Coco F, Nervi C, Avvisati G, Mandelli F. Acute promyelocytic leukemia: a curable disease. Leukemia. 1998;12:1866-80.
91
Reynolds CP, Matthay KK, Villablanca JG, Maurer BJ. Retinoid therapy of
93.
high-risk neuroblastoma. Cancer Lett. 2003;197:185-92. 94.
Moon RC, Metha RG, and Rao KVN Retinoids and cancer in experimental animals. In Sporn MB, Roberts AB and Goodman DS, editors. The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine. New York: Raven Pres Ltd, 2nd Edition, 1994, p.573-595.
95.
Simeone AM, Ekmekcioglu S, Broemeling LD, Grimm EA, Tari AM. A novel mechanism by which N-(4-hydroxyphenyl)retinamide inhibits breast cancer cell growth: the production of nitric oxide. Mol Cancer Ther. 2002;1:1009-17. Erratum in: Mol Cancer Ther. 2002;1:1366.
96.
Pergolizzi R, Appierto V, Crosti M, Cavadini E, Cleris L, Guffanti A, Formelli F. Role of retinoic acid receptor overexpression in sensitivity to fenretinide and tumorigenicity of human ovarian carcinoma cells. Int J Cancer. 1999;81:829-34.
97.
Faderl S, Lotan R, Kantarjian HM, Harris D, Van Q, Estrov Z. N-(4Hydroxylphenyl) retinamide (fenretinide, 4-HPR), a retinoid compound with antileukemic and proapoptotic activity in acute lymphoblastic leukemia (ALL). Leuk Res. 2003;27:259-66.
98.
Delia D, Aiello A, Lombardi L, Pelicci PG, Grignani F, Grignani F, Formelli F, Menard S, Costa A, Veronesi U, et al. N-(4-hydroxyphenyl) retinamide induces apoptosis of malignant hemopoietic cell lines including those unresponsive to retinoic acid. Cancer Res. 1993;53:6036-41.
99.
Zheng A, Mantymaa P, Saily M, Siitonen T, Savolainen ER, Koistinen P An association between mitochondrial function and all-trans retinoic acid-induced apoptosis in acute myeloblastic leukaemia cells. Br J Haematol. 1999;105:215-24.
100.
Notario B, Zamora M, Vinas O, Mampel T. All-trans-retinoic acid binds to and inhibits adenine nucleotide translocase and induces mitochondrial permeability transition. Mol Pharmacol. 2003 Jan;63(1):224-31.
101.
Asumendi A, Morales MC, Alvarez A, Arechaga J, Perez-Yarza G. Implication of
mitochondria-derived
ROS
and
cardiolipin
peroxidation
in
N-(4-
hydroxyphenyl)retinamide-induced apoptosis. Br J Cancer. 2002;86:1951-6. 102.
Boya P, Morales MC, Gonzalez-Polo RA, Andreau K, Gourdier I, Perfettini JL, Larochette N, Deniaud A, Baran-Marszak F, Fagard R, Feuillard J, Asumendi A,
92
Raphael M, Pau B, Brenner C, Kroemer G. The chemopreventive agent N-(4hydroxyphenyl)retinamide induces apoptosis through a mitochondrial pathway regulated by proteins from the Bcl-2 family. Oncogene. 2003;22:6220-30. 103.
Reed E. Platinum-DNA adduct, nucleotide excision repair and platinum based anti-cancer chemotherapy.Cancer Treat Rev. 1998 Oct;24(5):331-44.
104.
Shibuya H, Kato Y, Saito M, Isobe T, Tsuboi R, Koga M, Toyota H, Mizuguchi J. Induction of apoptosis and/or necrosis following exposure to antitumour agents in a melanoma cell line, probably through modulation of Bcl-2 family proteins. Melanoma Res. 2003 Oct;13(5):457-64.
105.
Mayer F, Honecker F, Looijenga LH, Bokemeyer C.Towards an understanding of the biological basis of response to cisplatin-based chemotherapy in germ-cell tumors.Ann Oncol. 2003 Jun;14(6):825-32.
106.
Floros KV, Thomadaki H, Lallas G, Katsaros N, Talieri M, Scorilas A. Cisplatin-induced apoptosis in HL-60 human promyelocytic leukemia cells: differential expression of BCL2 and novel apoptosis-related gene BCL2L12. Ann N Y Acad Sci. 2003 Dec;1010:153-8.
107.
Murata T, Haisa M, Uetsuka H, Nobuhisa T, Ookawa T, Tabuchi Y, Shirakawa Y, Yamatsuji T, Matsuoka J, Nishiyama M, Tanaka N, Naomoto Y. Molecular mechanism of chemoresistance to cisplatin in ovarian cancer cell lines. Int J Mol Med. 2004 Jun;13(6):865-8.
108.
Sanchez-Perez I, Murguia JR, Perona R. Cisplatin induces a persistent activation of JNK that is related to cell death. Oncogene. 1998 Jan 29;16(4):533-40.
109.
Mandic A, Viktorsson K, Molin M, Akusjarvi G, Eguchi H, Hayashi SI, Toi M, Hansson J, Linder S, Shoshan MC. Cisplatin induces the proapoptotic conformation of Bak in a deltaMEKK1-dependent manner. Mol Cell Biol. 2001 Jun;21(11):368491.
110.
Kopper L, Bankfalvi A, Mihalik R, Nagy P, Fulop C, Sarmay G. New in vitro line from a human (B) non-Hodgkin lymphoma. Anticancer Res. 1991 JulAug;11(4):1645-9.
111.
Alexandrow MG, Moses HL.Transforming growth factor beta and cell cycle regulation. Cancer Res. 1995 Apr 1;55(7):1452-7.
93
Cheng EH, Wei MC, Weiler S, Flavell RA, Mak TW, Lindsten T, Korsmeyer
112.
SJ.BCL-2, BCL-X(L) sequester BH3 domain-only molecules preventing BAX- and BAK-mediated mitochondrial apoptosis. Mol Cell. 2001 Sep;8(3):705-11. 113.
Griffiths GJ, Corfe BM, Savory P, Leech S, Esposti MD, Hickman JA, Dive C. Cellular damage signals promote sequential changes at the N-terminus and BH-1 domain of the pro-apoptotic protein Bak. Oncogene. 2001 Nov 15;20(52):7668-76.
114.
Diaz JL, Oltersdorf T, Horne W, McConnell M, Wilson G, Weeks S, Garcia T, Fritz
LC.
A
common
binding
site
mediates
heterodimerization
and
homodimerization of Bcl-2 family members. J Biol Chem. 1997 Apr 25;272(17):11350-5. 115.
Inman GJ, Allday MJ. Apoptosis induced by TGF-beta 1 in Burkitt's lymphoma cells is caspase 8 dependent but is death receptor independent. J Immunol. 2000 Sep 1;165(5):2500-10.
116.
Hague A, Bracey TS, Hicks DJ, Reed JC, Paraskeva C. Decreased levels of p26Bcl-2, but not p30 phosphorylated Bcl-2, precede TGFbeta1-induced apoptosis in colorectal adenoma cells. Carcinogenesis. 1998 Sep;19(9):1691-5.
117.
Motyl T, Gajkowska B, Ploszaj T, Wareski P, Skierski J, Zimowska W. Expression and subcellular redistribution of Bax during TGF-beta1-induced programmed cell death of HC11 mouse mammary epithelial cells. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 2000 Feb;46(1):175-85.
118.
Chen Q, Chai YC, Mazumder S, Jiang C, Macklis RM, Chisolm GM, Almasan A. The late increase in intracellular free radical oxygen species during apoptosis is associated with cytochrome c release, caspase activation, and mitochondrial dysfunction. Cell Death Differ. 2003 Mar;10(3):323-34.
119.
Leist M, Single B, Castoldi AF, Kuhnle S, Nicotera P. Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis. J Exp Med. 1997 Apr 21;185(8):1481-6.
120.
Delia D, Aiello A, Meroni L, Nicolini M, Reed JC, Pierotti MA. Role of antioxidants and intracellular free radicals in retinamide-induced cell death. Carcinogenesis. 1997 May;18(5):943-8.
121.
Asumendi A, Morales MC, Alvarez A, Arechaga J, Perez-Yarza G. Implication of
mitochondria-derived
ROS
and
94
cardiolipin
peroxidation
in
N-(4-
hydroxyphenyl)retinamide-induced
apoptosis.
Br
J
Cancer.
2002
Jun
17;86(12):1951-6. 122.
Suzuki S, Higuchi M, Proske RJ, Oridate N, Hong WK, Lotan R. Implication of mitochondria-derived reactive oxygen species, cytochrome C and caspase-3 in N(4-hydroxyphenyl)retinamide-induced apoptosis in cervical carcinoma cells. Oncogene. 1999 Nov 4;18(46):6380-7.
123.
Shan D, Gopal AK, Press OW. Synergistic effects of the fenretinide (4-HPR) and anti-CD20 monoclonal antibodies on apoptosis induction of malignant human B cells. Clin Cancer Res. 2001 Aug;7(8):2490-5.
124.
Shinozawa I, Inokuchi K, Wakabayashi I, Dan K. Disturbed expression of the anti-apoptosis gene, survivin, and EPR-1 in hematological malignancies. Leuk Res. 2000 Nov;24(11):965-70.
125.
Wei MC, Lindsten T, Mootha VK, Weiler S, Gross A, Ashiya M, Thompson CB, Korsmeyer SJ. tBID, a membrane-targeted death ligand, oligomerizes BAK to release cytochrome c. Genes Dev. 2000 Aug 15;14(16):2060-71.
126.
Makin GW, Corfe BM, Griffiths GJ, Thistlethwaite A, Hickman JA, Dive C. Damage-induced Bax N-terminal change, translocation to mitochondria and formation of Bax dimers/complexes occur regardless of cell fate. EMBO J. 2001 Nov 15;20(22):6306-15.
127.
Wei MC, Lindsten T, Mootha VK, Weiler S, Gross A, Ashiya M, Thompson CB, Korsmeyer SJ. tBID, a membrane-targeted death ligand, oligomerizes BAK to release cytochrome c. Genes Dev. 2000 Aug 15;14(16):2060-71.
A témához kapcsolódó megjelent cikkek: 1. Etoposide indukálta kaszpáz függő és független sejthalál: egy három fázisos modell Mihalik R., Barna G., Uher F., Peták I., J. A. Houghton, Kopper L. Magyar Onkológia 1999. 2, 94-99. 2. TGFß1 induced caspase-dependent but death-receptor independent apoptosis in lymphoid cells Tótth Á., Sebestyen A., Barna G., Nagy K., Göndör A., Bocsi J., Mihalik R., Petak I., Kopper L. Anticancer Res. 2001, 21/2A p1207-1212.
95
3. TGFB1 kill lymphoma cells using mitochondrial apoptosis pathway with help of caspase8. Barna G., Sebestyén A., Chinopoulos CC., Nagy K., Mihalik R., Paku S., Kopper
L. Anticancer Res. 2002, Anticancer Res. 2002 Nov-Dec;22(6C):3867-72. 4. Mevastatin induced apoptosis and growth suppression in U266 myeloma cells. Janosi J., Sebestyen A., Bocsi J., Barna G., Nagy K., Vályi-Nagy I., Kopper L. Anticancer Res. 2004 May-Jun;24(3a):1817-22. 5. Mevastatin induced apoptosis in U266 human myeloma cells. Janosi J, Sebestyen A, Bocsi J, Barna G, Nagy K, Valyi-Nagy I, Kopper L. Magy Onkol. 2004;48(4):3337. 6. In vitro and in vivo antitumor effect of 2-methoxyestradiol on human melanoma. Dobos J, Timar J, Bocsi J, Burian Z, Nagy K, Barna G, Petak I, Ladanyi A. Int J Cancer. 2004 Dec 10;112(5):771-6. 7. Different ways to induce apoptosis by fenretinide and all-trans retinoic acid in human B-lymphoma cells. Barna G., Sebestyén A., Weischede S., Petak I., Paku S., Mihalik R., Formelli F
and Kopper L. Anticancer Res. 2005 (elfogadva) 8. Smad signal and TGFß induced apoptosis in human lymphoma cells. Sebestyen A, Barna G, Nagy K, Jánosi J, Paku S, Kohut E, Berczi L, Mihalik R, Kopper L Cytokine 2005 (elfogadva) Könyv: fejezet Kopper L, Fésüs L – Apoptózis, Medicina 2002 4. fejezet: Az apoptózis mitokondriális útja - Barna G., Kopper L. Absztraktok: 1. Characterization of TGFß1 induced apoptosis in HT58 NHL cell line Barna G., Sebestyén A., Chinopoulos C., Nagy K., Tótth Á., Mihalik R., Kopper L.
IIAR Apoptosis Conference Athen 2001 may Anticancer Res. 2001, 21/3A, p1519. 2. The relationship between proteasome and caspase activation in apoptosis induced by etoposide and nocodazole in HL60 cells
96
Nagy K., Nagy E., Barna G., Sebestyen A., Kopper L., Mihalik R. IIAR Apoptosis Conference Athen 2001 may Anticancer Res. 2001, 21/3A, p1529. 3.
The apoptotic effect of TGFß in human lymphoma cells Sebestyen A., Barna G., Göndör A., Nagy K., Weischede S., Bauer P., Kopper L. ECCO 11 2001, EJC Vol 37., Suppl 6. oct. 2001, S123.
4. Retinoids (ATRA and 4HPR) induce caspase–independent DNA fragmentation and cell death in human B-lymphoma cells Barna G., Sebestyén A., Mihalik R., Kopper L. XXII. ISAC Congress, Mount-
Pellier 2004 may 22-27., Cytometry 2004
97
