Autostainer Plus)

EnVision™ FLEX+, Mouse, High pH, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) Kód K8012 5. vydání

Souprava obsahuje činidla postačující na 400–600 testů. Pro přístroje Dako Autostainer/Autostainer Plus.

Volitelná činidla: Kód

Název výrobku

Testy

K8004

EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x)

200-430

K8005

EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x)

200-430

K8006

EnVision™ FLEX Antibody Diluent

400-600

K8007

EnVision™ FLEX Wash Buffer (20x)

K8018

EnVision™ FLEX Hematoxylin, (Dako Autostainer/Autostainer Plus)

400-600

K8019

EnVision™ FLEX+ Rabbit (LINKER), (Dako Autostainer/Autostainer Plus)

120-190

K8022

EnVision™ FLEX+ Mouse (LINKER), (Dako Autostainer/Autostainer Plus)

120-190

Další volitelné položky K8020

(125104-001)

FLEX IHC Microscope Slides

500

P03910CZ_01_K8012/2011.03.25 p.1/11

Obsah Strana Použití k určenému účelu.............................................................................................................. 3 Souhrn a vysvětlení ...................................................................................................................... 3 Činidla .......................................................................................................................................... 4 A. Dodávané materiály ............................................................................................................. 4 B. Potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky ............................................................. 5 C. Volitelná činidla.................................................................................................................... 5 Bezpečnostní opatření.................................................................................................................. 6 Skladování.................................................................................................................................... 6 Příprava činidel............................................................................................................................. 7 Sběr vzorků a příprava ................................................................................................................. 7 Postup .......................................................................................................................................... 8 A. Postup předběžného zpracování ......................................................................................... 8 B. Postup barvení..................................................................................................................... 9 Kontrola kvality ........................................................................................................................... 10 Interpretace výsledků.................................................................................................................. 10 Omezení..................................................................................................................................... 10 Vysvětlivky k symbolům .............................................................................................................. 11

(125104-001)

P03910CZ_01_K8012/2011.03.25 p.2/11

ČESKY Použití k určenému účelu K diagnostice in vitro. Detekční systém Dako EnVision™ FLEX+ je určen k použití v imunohistochemii společně s barvícími automaty Dako Autostainer/Autostainer Plus. Systém detekuje primární myší a králičí protilátky a reakce se vizualizuje pomocí EnVision™ FLEX DAB+ Chromogen. Jestliže se použije s EnVision™ FLEX+ Mouse (LINKER) nebo EnVision™ FLEX+ Rabbit (LINKER) (kód 8019) lze dosáhnout amplifikace signálu primárních králičích protilátek nebo primárních myších protilátek. Činidla EnVision™ FLEX+ jsou určena k použití na tkáňových řezech fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu.

Souhrn a vysvětlení Detekční systém Dako EnVision™ FLEX+ je flexibilní systém, který poskytuje optimální zabarvení na barvících automatech Dako Autostainer/Autostainer Plus, jestliže se použije doporučený protokol uvedený v této příbalové informaci. Pro orientaci, použitím EnVision™ FLEX+ Mouse (kód K8012) se zvýší amplifikace signálu 4–5tinásobně a použitím EnVision™ FLEX+ Rabbit (kód K8019, volitelné činidlo) se zvýší amplifikace signálu 2–3násobně. Před barvením je třeba tkáňové řezy fixované běžným způsobem a zalité v parafínu nejdříve deparafinovat a hydratovat a potom předběžně zpracovat tepelně indukovaným vyhledáváním epitopu (HIER) použitím roztoku na vyhledávání cíle, specifikovaném v tomto příbalovém letáku pro primární protilátku. Přečtěte si rovněž část Postup, kde naleznete pokyny k přípravě vzorků 3-v-1. Kód K8012 zahrnuje roztok EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x). Lze rovněž doporučit použití EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (kód K8004) nebo EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x) (kód K8005). Některé primární protilátky vyžadují k optimálnímu zabarvení namísto HIER enzymatické předběžné zpracování tkání. Endogenní peroxidázu je třeba blokovat činidlem EnVision™ FLEX Peroxidase-Blocking Reagent (DM821) obsaženým v této soupravě. Vzhledem k účinnému postupu promývání a přítomnosti stabilizačních proteinů v činidlech výrobce Dako, není potřeba další blokovací krok ke snížení nespecifického dobarvení pozadí. Doporučuje se použít pufr EnVision™ FLEX Wash Buffer (20x) (DM831) obsažený v této soupravě nebo jako volitelné činidlo (kód K8007). Primární protilátky nejsou součástí této soupravy. Doporučujeme použít primární protilátky k okamžitému použití Dako FLEX Ready-to-Use Primary Antibodies nebo koncentrované primární protilátky Dako oncentrated Primary Antibodies. EnVision™ FLEX Antibody Diluent (kód K8006) se doporučuje pro ředění koncentrovaných primárních protilátek Dako concentrated Primary Antibodies. Pokud používáte králičí primární protilátky, roztok EnVision™ FLEX+ Mouse (LINKER) (DM824), který je součástí této soupravy nebo je k dispozici jako volitelné činidlo (kód K8022), může být nahrazen roztokem EnVision™ FLEX+ Rabbit (LINKER) (kód K8019). EnVision™ FLEX+ Mouse (LINKER) a EnVision™ FLEX+, Rabbit (LINKER) lze aplikovat pro volitelnou amplifikaci signálu králičích, respektive myších primárních protilátek. Pro orientaci: EnVision™ FLEX+ Mouse (LINKER) poskytuje 4–5tinásobnou amplifikaci signálu a EnVision™ FLEX+ Rabbit (LINKER) poskytuje 2–3násobnou amplifikaci signálu. Detekční činidla v této soupravě Dako EnVision™ FLEX /HRP detection reagent (SM802) obsahují dextranový řetězec, na který se váže velký počet molekul peroxidázy (HRP) a molekul sekundární protilátky. Pro vazebnou reakci se používá unikátní chemikálie, která umožňuje vazbu až 100 molekul HRP a až 20 molekul protilátky na řetězec. Substrátový systém v této soupravě se skládá ze dvou komponent: EnVision™ FLEX DAB+ Chromogen (DM827), koncentrovaný roztok diaminobenzidinu (DAB) a EnVision™ FLEX Substrate Buffer (DM823), s obsahem peroxidu vodíku. Před použitím se musí chromogen EnVision™ FLEX DAB+ Chromogen naředit pufrem EnVision™ FLEX Substrate Buffer. Substrátový systém vytváří hnědě zbarvený koncový produkt v místě cílového antigenu. (125104-001)

P03910CZ_01_K8012/2011.03.25 p.3/11

Pro kontrastní barvení se doporučuje EnVision™ FLEX Hematoxylin (kód K8018). Činidlo poskytuje jasně modré nukleární barvení. Obarvené tkáně nebo řezy lze montovat buď vodným médiem nebo montovacím médiem na bázi organického rozpouštědla.

Činidla A. Dodávané materiály DM821 EnVision™ FLEX Peroxidase-Blocking Reagent 10 x 13 mL, k okamžitému použití Fosfátový pufr obsahující peroxid vodíku, 15 mmol/L NaN3 a detergent. DM822 EnVision™ FLEX /HRP 10 x 13 mL, k okamžitému použití Dextran navázaný s molekulami peroxidázy a molekulami kozí sekundární protilátky proti králičím a myším imunoglobulinům. V pufrovém roztoku obsahujícím stabilizující protein a konzervační látku. DM827 EnVision™ FLEX DAB+ Chromogen 3 x 3 mL 3,3'-diaminobenzidin tetrahydrochlorid v organickém rozpouštědle. Barva činidla může kolísat od silně fialové až po bezbarvou; rozdíly v barvě nemají žádný vliv na účinnost soupravy. DM823 EnVision™ FLEX Substrate Buffer 20 x 13 mL Pufrový roztok s obsahem peroxidu vodíku a konzervačním činidlem. DM828 EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) 9 x 30 mL, 50x koncentrováno Tris/EDTA pufr, pH 9 DM831 EnVision™ FLEX Wash Buffer (20x) 4 x 1 L, 20x koncentrovaný fyziologický roztok pufrovaný Tris, který obsahuje Tween 20, pH 7,6 (±0,1). DM824 EnVision™ FLEX+, Mouse (LINKER) 10 x 13 mL, k okamžitému použití V pufrovém roztoku obsahujícím stabilizující protein a antimikrobiální činidlo.

(125104-001)

P03910CZ_01_K8012/2011.03.25 p.4/11

B. Potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky Přístroj Dako Autostainer/Autostainer Plus Dako PT Link Dako Proteinase K, Ready-to-Use (je-li potřeba) Dako FLEX Ready-to-Use Primary Antibodies nebo vhodně naředěné koncentrované primární myší nebo králičí protilátky od výrobce Dako Dako FLEX Ready-to-Use Rabbit nebo Mouse Universal Negative Control nebo jiné vhodné činidlo pro negativní kontrolu pro primární protilátku Nádoby k přístroji Dako Mikroskopická sklíčka, např. FLEX IHC Microscope Slides Běžná laboratorní činidla k odstranění parafínu z parafínových tkáňových řezů Montovací médium (vodné nebo na bázi organického rozpouštědla) a krycí sklíčka C. Volitelná činidla K8004 DM828

K8005 DM829

K8006 DM830 K8007 DM831

K8018 DM826

K8019 DM825

K8022 DM824

(125104-001)

EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) 3 x 30 mL, 50x koncentrováno Tris/EDTA pufr, pH 9

EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x) 3 x 30 mL, 50x koncentrováno citrátový pufr, pH 6,1

EnVision™ FLEX Antibody Diluent 120 mL, k okamžitému použití Tris pufr, pH 7,2 s obsahem 15 mmol/L NaN3 a protein.

EnVision™ FLEX Wash Buffer (20x) 1 L, 20x koncentrovaný fyziologický roztok pufrovaný Tris, který obsahuje Tween 20, pH 7,6 (±0,1).

EnVision™ FLEX Hematoxylin 10 x 13 mL, k okamžitému použití Vodný roztok hematoxylinu.

EnVision™ FLEX+ Rabbit (LINKER) 3 x 13 mL, k okamžitému použití V pufrovém roztoku obsahujícím stabilizující protein a antimikrobiální činidlo.

EnVision™ FLEX+, Mouse (LINKER) 3 x 13 mL, k okamžitému použití V pufrovém roztoku obsahujícím stabilizující protein a antimikrobiální činidlo.

P03910CZ_01_K8012/2011.03.25 p.5/11

Bezpečnostní opatření 1. 2.

Určeno pro profesionální uživatele. EnVision™ FLEX /HRP, EnVision™ FLEX+ Mouse (LINKER) a EnVision™ FLEX+ Rabbit (LINKER) obsahuje materiál živočišného původu a vzhledem k výrobním postupům nelze vyloučit stopy lidského materiálu. Jako u každého výrobku biologického původu je nutno dodržovat řádná bezpečnostní opatření. 3. Nevystavujte EnVision™ FLEX DAB+ Chromogen nebo EnVision™ FLEX Substrate Working Solution během procedury silnému světlu. 4. Pro EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) a EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x) jsou bezpečnostní listy pro profesionální uživatele k dispozici na vyžádání. 5. Pro EnVision™ FLEX Wash Buffer (20x) je bezpečnostní list pro profesionální uživatele k dispozici na vyžádání. 6. Pro EnVision™ FLEX Peroxidase-Blocking Reagent je bezpečnostní list pro profesionální uživatele k dispozici na vyžádání. 7. EnVision™ FLEX DAB+ Chromogen obsahuje 1–5 % 3,3’-diaminobenzidin tetrahydrochloridu a je označena: Zdraví škodlivý R40 Podezření na karcinogenní účinky. R43 Může vyvolat senzibilizaci při kontaktu s kůží. R68 Možné nebezpečí nevratných účinků. S35 Tento materiál a jeho nádobu je nutno zlikvidovat bezpečným způsobem. S36/37 Používejte vhodný ochranný oděv a rukavice. Základní pravidlo – osoby mladší 18 let nesmí s tímto produktem pracovat. Uživatelé musí být řádně proškoleni co se týče správného pracovního postupu, nebezpečných vlastností produktu a nutných bezpečnostních opatření (podle Směrnice EU 94/33/EC). Další informace naleznete v Bezpečnostním listu (MSDS). USA: 3,3’-diaminobenzidin (DAB) může být zdraví škodlivý při vdechování, styku s kůží a při požití. Materiál dráždí oči a pokožku. Pokud dojde ke kontaktu s pokožkou, opláchněte postižené místo vodou a mýdlem. POZNÁMKA: Ačkoliv diaminobenzidin je strukturou příbuzný benzidinu, nebylo hlášeno, že diaminobenzidin má rakovinotvorné vlastnosti. Doporučené metody likvidace jsou uvedeny ve státních a místních předpisech. 8. EnVision™ FLEX Antibody Diluent (kód K8016) obsahuje azid sodný (NaN3), který je v čisté formě vysoce toxický. Přestože se koncentrace azidu sodného ve výrobku neklasifikuje jako nebezpečná, může reagovat s olovem a mědí v odpadním potrubí a vytvářet vysoce explozivní azidy těchto kovů. Při likvidaci splachujte dostatečným množstvím vody, aby nedocházelo k usazování azidů kovů v potrubí. 9. Používejte odpovídající osobní ochranné prostředky, aby nedošlo k zasažení očí nebo pokožky. 10. Nespotřebované roztoky je nutno likvidovat v souladu s místními a celostátními předpisy.

Skladování Uchovávejte činidla EnVision™ FLEX a EnVision™ FLEX+ při 2–8 °C. Uchovávejte EnVision™ FLEX Hematoxylin (kód K8018) při pokojové teplotě v temnu. Nepoužívejte po datu exspirace vytištěném na lahvičce Pokud se činidla skladují za jakýchkoli jiných než uvedených podmínek, musí uživatel tyto podmínky ověřit. Připravený pracovní substrátový roztok Substrate Working Solution se musí skladovat v temnu při 2–8 °C a je nutno ho spotřebovat během 5 dnů. Pokud zpozorujete neočekávané zabarvení, které nelze vysvětlit změnami laboratorních postupů a máte podezření, že se jedná o problém s tímto produktem, obraťte se technické služby společnosti Dako

(125104-001)

P03910CZ_01_K8012/2011.03.25 p.6/11

Příprava činidel A.1 EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (DM828, kód K8004) Před započetím plánovaného barvícího postupu nařeďte dostatečné množství roztoku EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) v poměru 1:50 destilovanou nebo deionizovanou vodou. Jestliže se pro předběžné zpracování používá nádrž Dako PT Link, ředění je možné provést vyprázdněním obsahu ampulky s roztokem Target Retrieval Solution (50x) do nádrže Dako PT Link a přidáním destilované nebo deionizované vody až po vyznačenou rysku (ryska plnění). Nepoužitý naředěný roztok lze skladovat jeden měsíc při 2–8 °C. Roztoky zlikvidujte, pokud jsou zakalené. Když se používá společně s PT Link pro předběžné zpracování 3-v-1 je možné naředěný roztok použít 3krát během 5 dní, jestliže je skladován při pokojové teplotě. A.2 EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x) (DM829, kód K8005) Před započetím plánovaného barvícího postupu nařeďte dostatečné množství roztoku EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x) v poměru 1:50 destilovanou nebo deionizovanou vodou. Nepoužitý naředěný roztok lze skladovat jeden měsíc při 2–8 °C. Jestliže se pro p ředběžné zpracování používá nádrž Dako PT Link, ředění je možné provést vyprázdněním obsahu ampulky s roztokem Target Retrieval Solution (50x) do nádrže Dako PT Link a přidáním destilované nebo deionizované vody až po vyznačenou rysku (ryska plnění). Roztoky zlikvidujte, pokud jsou zakalené. Když se používá společně s PT Link pro předběžné zpracování 3-v-1 je možné naředěný roztok použít 3krát během 5 dní, jestliže je skladován při pokojové teplotě. A.3 EnVision™ FLEX Wash Buffer (20x) (DM831, kód K8007) Před započetím plánovaného barvícího postupu nařeďte dostatečné množství roztoku EnVision™ FLEX Wash Buffer (20x) v poměru 1:20 destilovanou nebo deionizovanou vodou. Aby se minimalizovala tvorba pěny, provádějte ředění přidáváním koncentrovaného pufru Wash Buffer do předem odměřeného množství destilované nebo deionizované vody. Roztok opatrně promíchávejte, až bude homogenní. Nepoužitý naředěný roztok lze skladovat jeden měsíc při 2–8 °C. Roztoky zlikvidujte, pokud jsou zakalené. Když se používá společně s PT Link pro předběžné zpracování 3-v-1 je možné naředěný roztok použít 3krát během 5 dní, jestliže je skladován při pokojové teplotě. A.4 EnVision™ FLEX Substrate Working Solution Roztok EnVision™ FLEX Substrate Working Solution s obsahem DAB se připraví pečlivým smícháním 1 kapky EnVision™ FLEX DAB+ Chromogen (DM827) na 1 mL EnVision™ FLEX Substrate Buffer (DM823). Použít EnVision™ FLEX Substrate Working Solution během 5 dnů (skladovat v temnu při 2–8 °C).

Sběr vzorků a příprava Vzorky mohou být tkáňové řezy fixované ve formalínu a zalité v parafínu. Doba fixace závisí na fixačním prostředku a na typu/tloušťce tkáně. Například tkáňové bločky o tloušťce 3–4 mm je potřeba fixovat v neutrálním pufrovaném formalínu po dobu 18–24 hodin. Optimální tloušťka parafínových řezů je zhruba 4 µm. Vzorky se musí namontovat na mikroskopická sklíčka, např. FLEX IHC Microscope Slides (kód K8020). Řezy je třeba na sklíčka montovat pokud možno bez jakýchkoli záhybů. Příliš mnoho nerovností by mělo dopad na výsledný barevný produkt. POZNÁMKA: Mikroskopická sklíčka musí mít šířku vhodnou pro přístroje Dako Autostainer/Autostainer Plus. Popis vhodných mikroskopických sklíček je uveden v Návodu k obsluze k příslušnému přístroji Dako. Parafinové řezy musí být montovány po vyjmutí z předehřáté vodní lázně s obsahem destilované nebo deionizované vody. Vodní lázeň nesmí obsahovat žádné přísady (například želatinu, poly-L-lysin, atd.). Řezy se suší zahříváním, obvykle při teplotě ne vyšší než 60 °C na dobu minimáln ě 60 minut. Pro zajištění dobré přilnavosti řezů ke sklíčkům je důležité nechat z nich před započetím procesu sušení okapat vodu.

(125104-001)

P03910CZ_01_K8012/2011.03.25 p.7/11

Postup K dosažení optimálních výsledků používají přístroje Dako Autostainer/Autostainer Plus techniky založené na různých principech. Před spuštěním protokolu na přístrojích Dako Autostainer/Autostainer Plus se nejdříve podrobně seznamte s Návodem k obsluze konkrétního přístroje Dako. Za účelem získání rekrodukovatelného vyhledávání epitopu se doporučuje vkládat nosiče sklíček vždy zcela zaplněné. Tím je zajištěna stejná intenzita zahřívání řezů v každém cyklu. A. Postup předběžného zpracování Doporučený postup přípravy vzorků 3-v-1 použito na PT Link: Deparafinaci, rehydrataci a tepelné vyhledávání epitopu (HIER) je možné provádět na tkáňových řezech fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu použitím postupu přípravy 3-v-1: 1. 2. 3. 4.

5. 6.

7. 8. 9.

Připravte pracovní roztok naředěním koncentrovaného EnVision FLEX Target Retrieval Solution (50x) v poměru 1:50 destilovanou nebo deionizovanou vodou. Naplňte nádrže PT Link dostatečným množstvím (1,5 L) pracovního roztoku, aby byly tkáňové řezy úplně zakryty. Nastavte přístroj PT Link na předehřívání roztoku na 65 °C. Ponořte namontované tkáňové řezy fixované ve formalínu a zakryté v parafínu do předem ohřátého roztoku Target Retrieval Solution (pracovního roztoku) v nádržích PT Link a inkubujte po dobu 20-40 minut při 97 °C. Optimální dobu inkubace musí stanovit uživ atel. Ponechejte řezy ochladit v přístroji PT Link na 65 °C. Vyjměte každý stojan se sklíčky barvícího automatu z nádrže přístroje PT Link a ihned ho ponořte do nádoby/nádrže (např. stanice PT Link Rinse Station, kód PT109) s naředěným pufrem EnVision FLEX Wash Buffer (20x) pokojové teploty. Ponechat sklíčka v naředěném pufru EnVision FLEX Wash Buffer (20x) pokojové teploty po dobu 5 minut. Umístěte sklíčka do přístroje Dako Autostainer/Autostainer Plus a pokračujte barvením. Tkáňové řezy nesmí během zpracování nebo během následného imunohistochemického barvení vyschnout. Po obarvení se doporučuje sklíčka provést dehydrataci, čištění a namontování permanentním médiem. POZNÁMKA: Když se používá společně s PT Link pro předběžné zpracování 3-v-1 je možné naředěný roztok použít 3krát během 5 dní, jestliže je skladován při pokojové teplotě.

Postup HIER pomocí PT Link: Po odstranění parafínu a hydrataci pufrem (vodou) je potřeba většinu řezů tkání předběžně zpracovat tepelně indukovaným vyhledáváním epitopu (HIER): 1. Připravte pracovní roztok naředěním koncentrovaného EnVision FLEX Target Retrieval Solution (50x) v poměru 1:50 destilovanou nebo deionizovanou vodou. 2. Naplňte nádrže PT Link dostatečným množstvím (1,5 L) pracovního roztoku, aby byly tkáňové řezy úplně zakryty. 3. Nastavte přístroj PT Link na předehřívání roztoku na 65 °C. 4. Manuálně odstraňte parafín a rehydratujte tkáňové řezy namontované na podkladních sklech. Pro zvýšení přilnavosti řezů tkání ke sklíčku se doporučuje používat potažená podložní skla nebo silanizovaná skla. 5. Ponořit tkáňové řezy při pokojové teplotě do předehřátého roztoku EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution (pracovní roztok) a inkubovat po dobu 20–40 minut při 97 °C. Optimální doba inkubace musí být stanovena uživatelem. 6. Ponechejte řezy ochladit v přístroji PT Link na 65 °C. 7. Vyjměte každý stojan se sklíčky z nádrže přístroje PT Link a ihned ho ponořte do nádoby/nádrže (např. stanice PT Link Rinse Station, kód PT109) s naředěným pufrem EnVision FLEX Wash Buffer (20x) pokojové teploty. (125104-001)

P03910CZ_01_K8012/2011.03.25 p.8/11

8. 9.

Ponechat sklíčka v naředěném pufru EnVision FLEX Wash Buffer (20x) pokojové teploty po dobu 5 minut. Umístěte sklíčka do přístroje Dako Autostainer/Autostainer Plus a pokračujte barvením. Během předběžného zpracování a během imunohistochemického barvení nesmí řezy vyschnout.

10. Po obarvení je potřeba sklíčka namontovat pomocí vodného nebo permanentního

montovacího média. POZNÁMKA: Když se používá společně s PT Link pro předběžné zpracování 3-v-1 je možné naředěný roztok použít 3krát během 5 dní, jestliže je skladován při pokojové teplotě. Postup HIER použitím nádob Coplin: Po odstranění parafínu a hydrataci pufrem (vodou) je potřeba většinu řezů tkání předběžně zpracovat tepelně indukovaným vyhledáváním epitopu (HIER): 1. Vložte nádoby na barvení obsahující naředěný roztok EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution (50x) do vodní lázně.

2. Zahřejte vodní lázeň a nádoby naplněné roztokem EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution (pracovní roztok) na 95–99 °C. Zakryjte nádoby víke m, aby se stabilizovala teplota a zamezilo se odpařování.

3. Ponořte řezy vyvážené při pokojové teplotě do předehřátého roztoku EnVision FLEX Epitope 4. 5.

Retrieval Solution (pracovní roztok) do nádob na barvení. Přiveďte teplotu vodní lázně a roztoku EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution zpět na 95–99 °C. Inkubujte 20 ( ±1) minut při 95–99 °C. Vyjměte celou nádobu se sklíčky z vodní lázně. Nechejte podložní skla zchladnout v roztoku EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution po dobu 20 (±1) minut při pokojové teplotě.

6. Slijte roztok EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution a opláchněte řezy naředěnýcm pufrem EnVision™ FLEX Wash Buffer (20x) pokojové teploty na dobu 1–5 minut. 7. Umístěte stojan s propláchnutými sklíčky do přístroje Dako Autostainer/Autostainer Plus. Ihned započněte předem naprogramovaný cyklus barvení. POZNÁMKA: Když se pro postup HIER používají nádoby Coplin, je možné použít naředěný roztok Target Retrieval Solution a naředěný pufr Wash Buffer pouze jedenkrát (pouze na jedno použití). Několik epitopů nesnáší HIER a některé vyžadují enzymatické předběžné zpracování. Další pokyny naleznete v příbalovém letáku k jednotlivým primárním protilátkám výrobce Dako. Tkáňové řezy nesmí během zpracování nebo během následného imunohistochemického barvení vyschnout. Z důvodu vyšší přilnavosti řezů tkání k podložním sklům se doporučuje používat podložní skla FLEX IHC Microscope Slides (kód K8020). B. Postup barvení Dako FLEX Ready-to-Use Primary Antibodies lze použít s detekčním systémem Dako EnVision™ FLEX+ a aplikovat na tkáňové řezy fixované ve formalínu, zalité v parafínu. Návod na ředění koncentrovaných primárních protilátek Dako je uveden v příbalovém letáku k jednotlivým koncentrovaných primárním protilátkám. Koncentrované primární protilátky lze ředit pomocí EnVision™ FLEX Antibody Diluent (DM830, kód K8006). V softwaru přístrojů Autostainer/Autostainer Plus jsou předem naprogramovány kroky barvení a inkubační doby, za použití následujících protokolů: Šablona protokolu: Šablona protokolu: FLEX_200 (200 µL dávkovací objem) nebo FLEX_300 (300 µL dávkovací objem) Automatické programy pro barvící cykly: FLEX (FLEX protokol) FLEX_Mo (FLEX+ Mouse (LINKER) protokol) FLEX_Rb (FLEX+ Rabbit (LINKER) protokol) (125104-001)

P03910CZ_01_K8012/2011.03.25 p.9/11

„Doplňkový“ krok je třeba nastavit na „proplachovat pufrem“ v barvicím cyklu s ≤ 10 sklíčky. Barvíte-li v cyklu ≥ 10 sklíček, nastavte „doplňkový” krok na „žádný“. Tím se zajistí srovnatelné doby promývání. Všechny kroky inkubace by měly probíhat při pokojové teplotě. Další informace v návodu k obsluze příslušného přístroje. Pokud nejsou na používaných přístrojích Dako Autostainer/Autostainer Plus připraveny protokoly, kontaktujte technické služby výrobce Dako. Optimální časy inkubace primární protilátky a EnVision™ FLEX /HRP závisí na aplikované primární protilátce. Další pokyny naleznete v příbalovém letáku k jednotlivým primárním protilátkám výrobce Dako. Uživatel musí aplikovaný protokol ověřit. Po ukončení barvící procedury je třeba vzorky namontovat. Pro montáž vodným roztokem se doporučují například montovací média Dako Glycergel™ Mounting Medium, kód C0563 nebo Faramount Aqueous Mounting Medium kód S3025.

Kontrola kvality Každý barvicí cyklus musí zahrnovat kontrolní vzorek o kterém je známo, že je pozitivní za účelem zajištění správné účinnosti všech aplikovaných činidel. Pokud se při pozitivních kontrolách neprojeví pozitivní zabarvení, je nutno považovat výsledky testovacích vzorků za neplatné. Aby bylo možno identifikovat nespecifické zabarvení, musí se použít činidla pro negativní kontrolu. Jestliže není možné jednoznačně rozlišit nespecifické zabarvení od specifického zabarvení, je třeba považovat test vzorku za neplatný.

Interpretace výsledků Pracovní substrátový roztok s Substrate Working Solution obsahem diaminobenzidinu barví hnědě místa s cílovým antigenem rozpoznané primární protilátkou. Hnědé zabarvení musí být přítomno na vzorku pro pozitivní kontrolu v očekávaném místě cílového antigenu. Je-li přítomno nespecifické zabarvení, objeví se spíše jako difúzní, hnědé zabarvení na sklíčcích zpracovávaných s činidly pro negativní kontrolu. Jádro se kontrastním barvivem hematoxylin zabarví do modra.

Omezení 1. Platí pouze pro automatizované přístroje Dako Autostainer. Pokud se provádí manuální barvení, musí uživatel stanovit a ověřit optimální postup, pokud není v příbalové informaci ke konkrétní primární protilátce uvedeno jinak. 2. Používejte pouze tkáňové řezy fixované ve formalínu a zalité v parafínu. Pokud se používají zmrazené řezy, musí uživatel stanovit a ověřit optimální postup, pokud není v příbalové informaci ke konkrétní primární protilátce uvedeno jinak. Změny postupu mohou mít vliv na počet testů provedených pomocí této soupravy.

(125104-001)

P03910CZ_01_K8012/2011.03.25 p.10/11

Vysvětlivky k symbolům

Katalogové čí slo

Teplotní rozm ezí

Použitelné do

In vit ro diagnos tick ý zdravotnic ký prost ředek

Obs ah post ačujíc í pro testů

Výrobc e

Seznam te se s návodem k použití

Obs ah post ačujíc í pro testů

Zdraví šk odlivé

Systémy DAKO EnVision™ jsou kryty patentem USA 5,543,332 a patentem pro Evropu 594,772.

Vyrobeno: Dako North America, Inc. Vyrobeno pro: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Tel. +45 44 85 95 00 Fax +45 44 85 95 95

(125104-001)

P03910CZ_01_K8012/2011.03.25 p.11/11