AUTOMATICKÝ ANALYZÁTOR AMINOKYSELIN AAA 400

INGOS s.r.o

AUTOMATICKÝ ANALYZÁTOR AMINOKYSELIN AAA 400

Návod k obsluze chemická èást

PRAHA

11. dubna 2006

Výrobce

:

INGOS s.r.o divize laboratorních přístrojů

Vývoj a konstrukce Chemický systém

: :

PiKRON s.r.o V. Havlíček - ZMBD chemik

Dodavatel a servis

:

INGOS s.r.o K Nouzovu 2090 14316 PRAHA 4

(c) INGOS 2006

Tel: +420 296 781 683 +420 296 781 692 Fax: +420 244 403 051 e-mail:[email protected]

ÚVOD

CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ KAPITOLA

PØÍPRAVA VZORKÙ

BIOGENNÍ AMINY

VZOROVÉ ANALÝZY

OBSAH

1 2 3 4 5 6

1

1. ÚVOD

1.1 Úèel publikace

Tato příručka je určena pracovníkům, kteří se zabývají obsluhou automatického analyzátoru aminokyselin AAA 400. Byla vypracována jako pomůcka začínajícím obsluhám a začátečníkům v oboru ionexové chromatografie. Usnadňuje pochopit princip přístroje jako celku i jeho jednotlivých částí. Pochopení a osvojení všech činností, spojených s provozem přístroje,je základním předpokladem jeho správného využití a jeho bezporuchového chodu. Úvodní kapitoly poslouží jako pomůcka.

1.2 Základní chemická problematika aminokyselin. 1.2.1 Aminokyseliny Aminokyseliny jsou organické sloučeniny obsahující jak aminovou skupinu, tak i skupinu karboxylovou. Většina aminokyselin má obecnou strukturu, ve které primární aminy a skupina karboxylové kyseliny jsou připojeny k jednomu atomu uhlíku.


   

Další vazba tohoto uhlíku váže atom vodíku a čtvrtá vazba s připojenou skupinou určuje vlastnosti každé aminokyseliny. Tento postraní řetězec také přispívá ke specifickému rozdělení nábojů jednotlivých aminokyselin. Struktury vedlejších řetězců a běžné názvosloví nejdůležitějších aminokyselin a ninhydrin pozitivních látek jsou uvedeny v následující tabulce.

název ()2,6-amino pimelová kyselina

zkr.

MW

Dpm

190.20

strukturní vzorec O

O

OH

HO NH2

NH2

alanin 2-amino propionová kyselina

Ala

89,09

O OH

NH2 Tab.1 Přehled aminokyselin

INGOS s.r.o.

Strana 4

AAA400

Kapitola 1: ÚVOD

název

zkr.

MW

alfa amino adipová kyselina

Aad

161,16

O

HO

OH

O alfa amino-n-máselná kyselina

1

strukturní vzorec

Abu

NH2

103,12

O OH

NH2 gama amino-n-máselná kyselina

gAbu 103,12 O

H2N

beta amino isomáselná kyselina

OH

BAIBA 103,12

O

H2N

asparagová kyselina 2-amino jantarová kyselina

Asp

OH

133,10

O

HO

OH

O asparagin 2- amino 3-karbamylpropionová kyselina

Asn

132,12

O

H2N

OH

O arginin 2-amino 5-guanidinovalerová kyselina

NH2

Arg

174,20

NH H2N

N H

NH2 O OH

NH2

Tab.1 Přehled aminokyselin

INGOS s.r.o.

Strana 5

AAA400

název alfa amino-beta guanidino propionová kyselina

citrullin 2-amino -5-ureidovalerová kyselina

cystathionin 3 thio di 2 amino propionová kyselina

Kapitola 1: ÚVOD

zkr.

MW

AGPA 146,15

O

NH

175,19

O

H2N

Cysta 208,24

Cys

NH2

O N H

HO

OH

NH2 O

O

OH

S

H2N

cystein 2-amino -3-merkapto propionová kyselina

OH

N H

H2N

Cit

1

strukturní vzorec

121,16

NH2 O

HS

OH

NH2 cysteová kyselina 2-amino-3-sulfopropionová kyselina

Cya

169,16

O

O HO

cystin 2-amino-3-merkaptopropionová kyselina

240,30

OH

S O

NH2

HO

OH O O

H2N

NH2

S S ethanolamin 2-amino ethanol

EA

61,08

H2N

OH

Tab.1 Přehled aminokyselin

INGOS s.r.o.

Strana 6

AAA400

Kapitola 1: ÚVOD

název

zkr.

MW

fenylalanin 2-amino-3-fenylpropionová kyselina

Phe

165,19

1

strukturní vzorec O OH

NH2 glutamová kyselina 2-aminoglutarová kyselina

Glu

147,13

O

O

HO

OH

NH2 glutamin 2-amino-4-karbamoylmáselná kyselina

Gln

146,15

O

O

H2N

OH

NH2 glycin glykol,aminooctová kyselina

Gly

75.07 O

H2N

histidin 2-amino-3-(4-imidazolyl)propionová kyselina

His

homoserin 2-amino-4-hydroxy máselná kyselina

Hse

OH

155,16

O OH

HN N 119,12

NH2 O

HO

OH

NH2 homocystein 2amino-4 mercapto máselná kyselina

Hcy

135,19

O

HS

OH

NH2 Tab.1 Přehled aminokyselin

INGOS s.r.o.

Strana 7

AAA400

název hydroxy prolin 4-hydroxypyrolidin2-karboxylová kys.

Kapitola 1: ÚVOD

zkr.

MW

HO

4Hyp 131,13

N H isoleucin 2-amino 3-methylvalerová kyselina

Ile

1

strukturní vzorec

131,18

OH O O OH

NH2 leucin 2-amino-5-methylvalerová kyselina

Leu

131,18

O OH

NH2 lysin (2,6-diaminokapronová kyselina)

Lys

146,19

O

H2N

OH

NH2 methionin 2-amino-4-methylthio máselná kys.

Met

149,21

O

S

OH

NH2 1 methyl histidin 2-amino 3-(imidazol)1-methyl di azol octová kyselina

1mHis 169,18

3 methyl histidin 2-amino 3-(imidazol)3-methyl di azol octová kyselina

3mHis 169,18

O OH

N N

NH2 O OH

N N

NH2

Tab.1 Přehled aminokyselin

INGOS s.r.o.

Strana 8

AAA400

Kapitola 1: ÚVOD

název

zkr.

MW

norleucin 2-amino kapronová kyselina

Ahx

131,18

1

strukturní vzorec O OH

NH2 norvalin 2 amino valerová kyselina

Ape

117,15

O OH

NH2 ornithin 2,5 diaminovalerová kyselina

Orn

132,16

O

H2N

OH

NH2 prolin pyrolidin -alfa karbonová kyselina

serin 2-amino-3-hydroxypropionová kyselina

Pro

115,13 OH

N H Ser

O

105,09

O

HO

OH

NH2 taurin 2-aminoethansulfonová kyselina

threonin 2-amino-3-hydroxymáselná kyselina

Tau

125,14

O S

H2N Thr

119,12

OH O

OH

O OH

NH2 Tab.1 Přehled aminokyselin

INGOS s.r.o.

Strana 9

AAA400

Kapitola 1: ÚVOD

název

zkr.

MW

strukturní vzorec

tryptofan 2-amino-3-(3-indolyl) propionová kyselina

Trp

204,23

O OH

NH2

N H tyrosin 2-amino-3-(4hydroxyfenyl propionová kyselina

Tyr

valin (2-aminoisovalerová kyselina)

Val

181,19

O OH

NH2

HO 117,15

O OH

NH2 Tab.1 Přehled aminokyselin

1.2.2 Výskyt aminokyselin Aminokyseliny se vyskytují v přírodě bud ve volném stavu nebo jako polymerované řetězce nazývané peptidy nebo proteiny, které mohou být spojeny s nejrůznějšími substráty jako např. uhlohydráty, lipidy a.p. Všechny tyto aminokyseliny, po vhodné úpravě vzorku, je možno analyzovat chromatografickými metodami. Peptidy jsou polymerické řetězce aminokyselin.Peptidické vazby se vytvářejí kondenzací alfa aminoskupiny jedné aminokyseliny a alfa karboxylové skupiny druhé aminokyseliny.













    
     
   
  
 
 
 
  !" Vazba dvou aminokyselin tvoří dipeptidy, tří aminokyselin tripeptidy a více aminokyselin polypeptidy. Protein je dlouhý polypeptid, obsahující přibližně 20 zbytků aminokyselin, má obvykle specifickou biologickou funkci (na př. enzym). Analýza složení aminokyselin v peptidu nebo proteinu se provádí po hydrolýze peptidických vazeb. Spojením aminokyselin s jinými substráty je možno vytvořit mnoho derivátů. Tyto dvě skupiny, t.j. aminokyseliny a substráty, se často analyzují odděleně po hydrolýze konjugátu.

INGOS s.r.o.

Strana 10

1

AAA400

Kapitola 1: ÚVOD

1.2.3 Historie analýzy aminokyselin Stanford Moore a William Stein věnovali mnoho času separaci aminokyselin. Když v roce 1958 publikovali, společně se Spackmanem, popis prvého automatického analyzátoru pro kvantitativní i kvalitativní stanovení ninhydrin pozitivních látek, uzavřeli tím jednu dlouhou etapu v biochemické analýze.V roce 1972 obdrželi Nobelovu cenu. Od roku 1958 se mnoho autorů zabývalo zdokonalením analýzy aminokyselin, byla provedena řada zlepšení, avšak žádné z nich nebylo zásadní. Náš přístroj pracuje na tradičním principu Moora a Steina s ninhydrinovou detekcí. V poslední době je ve značné oblibě HPLC. U těch pracovníků, kteří nejsou dobře obeznámeni s posledními trendy vývoje stanovení aminokyselin mohou, proto některé nově používané metody vyvolat zmatek. Stanovení aminokyselin pomocí HPLC přináší řadu problémů a nedostatků proti dnes již klasickému stanovení podle Moora a Steina. Tím je možno vysvětlit pomalé pronikání HPLC do běžných provozních aplikací. Pro HPLC se vyžadují většinou naprosto čisté vzorky bez zákalů a p.,jinak se zničí drahá náplň analytické kolony, problémová bývá i derivatizace aminokyselin, odstraňování přebytečného činidla, nutnost používat velice čistých elučních roztoků atd. Nesnadné bývá i rozdělení složitých směsí. Tyto problémy u klasické ionexové chromatografie s ninhydrinovou detekcí odpadají. Vzhledem k tomu, že celý proces stanovení aminokyselin je zcela automatizován, předčí svými parametry HPLC co do spolehlivosti i přesnosti stanovení.

1.2.4 Reakce ninhydrinu s aminokyselinami Reakci ninhydrinu (indantrionového hydrátu) s aminokyselinami a iminokyselinami lze znázornit takto: Reakce NHD s primárními aminokyselinami







    

    
        








 

 

!#" $  %  & '% (

Reakce NHD se sekundárními aminokyselinami (iminokyselinami)



    







 



    ! 

Ninhydrin je silné oxidační činidlo, které reaguje s alfa aminoskupinami, uvolňuje amoniak, oxid uhličitý, aldehyd a redukovanou formu ninhydrinu hydrindantin. Uvolněný amoniak pak reaguje s hydrindantinem a další molekulou ninhydrinu a dává purpurovou INGOS s.r.o.

Strana 11

1

AAA400

Kapitola 1: ÚVOD

substanci (Ruhemanova červeň). Hydrindantin přítomný v detekčním činidle zabraňuje vedlejší reakci, která by redukovala vznikající Ruhemanovu červeň. Sekundární aminokyseliny vytvářejí různé chromofory.

1.2.5 Detekce Ruhemanova červeň má absorbční maximum při 570 nm.Tato absorbance je lineární funkcí množství přítomných alfa aminoskupin. Reakce je vhodným základem pro stanovení všech organických sloučenin obsahujících aminokyseliny. Reakce nihydrinu se sekundárními aminokyselinami má absorbční maximum při 440 nm. Měření při vlnových délkách pod 440 nm dává příliš velkou doplňkovou absorbanci z nezreagovaného ninhydrinu.

1.3 Iontomìnièová chromatogra e aminokyselin 1.3.1 Struèná teorie iontomìnièové chromatogra e. Aminokyseliny je možno oddělovat chromatografií založenou na výměně iontů. Chromatografická kolona je naplněna pryskyřicí s negativním nábojem a aminokyseliny jsou na kolonu zaváděny při nízkém pH. Tím jsou všechny kladně nabity. Za těchto podmínek nenastane chromatografické dělení. Aminokyseliny čekají na počátku kolony na změnu podmínek. Při zvýšeném pH, zvýšené teplotě nebo vyšší iontové síle elučního roztoku dojde k dosažení izoelektrického bodu aminokyseliny. Tehdy ztrácí přitažlivost svých iontů k pryskyřici a aminokyselina je eluována z kolony. Izoelektrický bod molekuly je definován jako pH, při kterém molekuly v roztoku nenesou žádný náboj. Izoelektrický bod aminokyselin je funkcí pK hodnot ionizovatelných skupin v molekule. Podmínky jsou upraveny tak, že izoelektrické body, pro všechny aminokyseliny, se dosahují v různých časech. To umožňuje provést chromatografické dělení. Jako příklad uvedeme kyselinu asparagovou.   





  





  





  



 













 

 








 




Podíváme-li se na výše uvedenou rovnici kyseliny asparagové, vidíme, že při pH 1 mají v zásadě všechny molekuly jeden kladný náboj. Při vzrůstajícím pH, bude mít stále větší počet molekul na alfa karboxylové skupině negativní náboj, až při pH 2,8 jej budou mít všechny. To je izoelektrický bod. Karboxylová skupina v postranním řetězci je méně kyselá než alfa karboxylová skupina a koncentrace iontů vodíku je stále dostatečná, aby se zabránilo její ionizaci. Když pH stoupne na 6,6, budou mít všechny molekuly ionizovány karboxylové skupiny postranního řetězce a budou mít dva záporné a jeden kladný náboj. Při pH 11 mají všechny molekuly pouze dva záporné náboje. Podíváme-li se nyní, na př. na molekulu lysinu, který má aminoskupinu i na postranním řetězci, zjistíme, že jeho izoelektrický bod je při pH 9,7, a je to právě aminokyselina INGOS s.r.o.

Strana 12

1

AAA400

Kapitola 1: ÚVOD

na postranním řetězci, která je při izoelektrickém bodu nabita. Má tedy větší váhu, než alfa aminoskupina. 












 








 







 






 


 



 !



 

#"%$

 

Proces výměny iontů je možno znázornit jednoduše takto:

 




  

 



  




    

 



 

Separace je ovlivňována změnou pH,teploty nebo koncentrace opačně nabitých iontů. Tím se posunuje rovnováha jedním nebo druhým směrem.

1.4 Iontomìnièe

Iontoměničové náplně dnešních klasických analyzátorů aminokyselin mají sférický kulový tvar. Jejich syntéza se provádí kopolymerací styrenu a divinylbenzenu. Divinylbenzenu bývá při syntéze použito přibližně 8%. Procenta divinylbenzenu jsou velice důležitá nejen proto, že tvoří v řetězcích styrenu příčné vazby, čímž vzniká kulovitý tvar, ale ionex podle množství příčných vazeb má řadu vlastností příznivých i méně příznivých, na př. rigiditu, botnavost, pórovitost a.p. Množství příčných vazeb se u ionexů označuje písmenem X (crosslinking). Strukturu pryskyřice je možné znázornit na následujícím obrázku.


 



 
 
 




 

 



 
 



 
 


 


 

 

 
 

 


 

 
 
 

 



  



 







 

 


Příčně svázaná pryskyřičná struktura se nazývá pryskyřičná matrice. Je-li tato matrice nasulfonována, potom získáme silně kyselý katex. Také písmena v označení českých ionexů ve znaku KS značí silně kyselý. Úseky uvnitř skeletu se nazývají póry a pro nabité ionty SO3- se užívá termínu vázané ionty. Opačně nabité ionty jsou vyměnitelné ionty, které jsou přiřazeny k matrici heteropolárními vazbami (kladně nabité skupiny v pufrech nebo aminokyselinách). Při iontové výměně pronikají opačně nabité ionty v pufru do pórů matrice a vyměňují si místa s opačně nabitými ionty, které jsou tam vázané. INGOS s.r.o.

Strana 13

1

AAA400

Kapitola 1: ÚVOD

U pryskyřic (ionexů) používaných pro analýzu aminokyselin, jsou proměnnými parametry rozměry částic, stupeň sulfonace a stupeň zesítění /crosslinking). Chromatografickou činnost analyzátorů aminokselin ovlivňují ještě jiné parametry, jako rozměry kolony, rychlost toku eluentu, teplota a přítomnost organických rozpouštědel a.p. O těchto parametrech bude pojednáno v dalších kapitolách - příprava elučních roztoků.

INGOS s.r.o.

Strana 14

1

2. CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ KAPITOLA

2.1 Ionexy

Pro analyzátory aminokyselin se používají tři druhy ionexů. Všechny jsou od firmy Spolek pro chemickou a hutní výrobu Ústí nad Labem. Jsou prodávány pod ochrannou značkou OSTION. Označení LG znamená určení ionexu pro analytické účely. Prvé dvojčíslí značí stupeň zesítění, druhé dvojčíslí velikost zrna. Toto je běžné u analytických ionexů u nás toto značení používáme pouze pro ionex předkolony. Ionexy určené pro analytické kolony našich analyzátorů aminokyselin mají poněkud odlišné značení. Pro náplň analytické kolony určené pro stanovení hydrolyzátů bílkovin se používá Ostion LG ANB, dodávaný v Na cyklu. Pro analýzu volných aminokyselin se dodává Ostion LG FA, dodávaný v Li cyklu. Ionexy mají odlišné značení od běžných analytických ionexů proto, že jsou testovány podle jiných kriterií, než běžné ionexy.

2.1.1 Ionex pro pøedkolonu. Ionex pro předkolonu je dodáván pod označením Ostion LG KS 0804, v Na cyklu. Pro použití v Li provoze je nutné jej přecyklovat podle kapitoly 2.1.5. Skladování se provádí v chladničce ve vlhkém stavu.

2.1.2 Ostion LG ANB pro stanovení hydrolyzátù. Ostion LG ANB je silně kyselý katex s průměrnou velikostí zrna asi 12 um. Je dodáván zásadně v Na formě v balení po 20 ml. Skladování se provádí v chladničce ve vlhkém stavu.

2.1.3 Ostion LG FA pro stanovení volných aminokyselin. Speciálně vyvinutý ionex pro náš přístroj. Dodává se zásadně v Li formě. Skladování se provádí v chladničce ve vlhkém stavu.Pro stanovení volných aminokyselin lze také použít Ostion LG ANB. Je však nutné jej převést do Li cyklu.

2.1.4 Práce s ionexy. Před plněním kolony, nebo po delší době stání ionexu (několik měsíců) jej doporučujeme přecyklovat, protože se během skladování uvolňují zbytky látek po syntéze, které zhoršují dělící schopnosti ionexu a kvalitu nulové linie. Během provozu jsou na ionex vázány nečistoty ze vzorků a většinou se neúnosně zvětší tlaky, nebo podstatně zhorší dělení obtížně dělitelných dvojic. Takto znečištěný ionex nic neztrácí na své kvalitě, je však nutné jej vyčistit. Toto provedeme opakovaným převedením do H cyklu a zpět do Na nebo Li cyklu. Při práci s analytickými ionexy musíme zachovávat určitá pravidla, na která upozorňujeme. 1.Ionex nesmíme nikdy nechat vyschnout. Když už se tak stane, je nutné jej přecyklovat, silně naředit - 20 ml ionexu smíchat v odměrném válci přibližně s 250 ml destilované vody. Počkat asi 20 až 30 min, až se ionex usadí a vrchní zakalenou část H2O odsát (dekantovat).Toto lze zopakovat podle potřeby 2 až 3 krát. Touto manipulací se zbavíme drtě, která vznikla uschnutím ionexu. Zmenší se nám sice množství , avšak vzroste kvalita a sníží se tlaky v systému. INGOS s.r.o.

Strana 15

2

AAA400

Kapitola 2: CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ KAPITOLA

2.Ionex uchováváme vždy vlhký, to znamená, že po přecyklováni nebo jiné manipulaci (plnění kolony a.p.) jej kvantitativně spláchneme do skladovací nádobky destilovanou vodou. Po usazení dekantujeme. Nad ionexem ponecháme stát malé množství vody (l až 2 mm). 3. Skladováni provádíme pokud možno v chladničce, abychom zabránili případné kontaminaci (bakterie,plísně). 4. Při manipulaci s ionexem musíme míchat skleněnou tyčinkou, nepřípustné je míchání protřepáváním. Při protřepávání se naváže na jednotlivá zrnka ionexu vzduch, což má za následek vysoké tlaky a zhoršené dělení čerstvé kolony. 5.Při cyklování nesmí dojít nikdy k prosátí vzduchu přes vrstvu ionexu na fritě. Staneli se, že se nám přes všechnu opatrnost navázal do ionexu vzduch je nutné opakovat minimálně jednou cyklování.

2.1.5 Cyklování ionexu - èi¹tìní. Když je ionex znečištěný balastními látkami a zhorší se jeho vlastnosti, je nutné jej přecyklovat.Nyní bude popsán praktický postup cyklování ionexů. Před započetím je nutné přečíst kapitolu 2.1.4. 1.Převedení do H formy. Jeden objemový díl ionexu smícháme s 5 až 6 objemovými díly 15 % HCl (1:1). Za občasného míchání zahříváme na teplotu 80C po dobu 6O min.Potom promyjeme na fritě S4 (nebo takové, která nemá větší velikost pórů než 4 um) destilovanou vodou do neutrální reakce. Takto zpracovaný ionex je v H formě. 2. Převedení do Na formy. Ionex v H formě smícháme s 16 % NaOH v poměru 1 objemový díl ionexu + 5 až 6 objemových dílů NaOH. Ponecháme asi 30 min stát při pokojové teplotě. Občas zamícháme celý obsah skleněnou tyčinkou. Potom opět sfiltrujeme přes fritu S 4, promyjeme destilovanou vodou do neutrální reakce. 3. Převedení do Li formy. Ionex v H formě smícháme s pětinásobným množstvím nasyceného roztoku LiOH. Za občasného míchání skleněnou tyčinkou ponecháme stát asi 1 hod. Potom sfiltrujeme přes fritu S 4 a promyjeme destilovanou vodou do neutrální reakce. Pro plnění analytické kolony nebo předkolony ředíme prvním analytickým pufrem 0,18 N Li pH 2,9. Pro uskladnění převedeme do PE lahvičky a skladujeme ve vlhkém stavu v chladničce. 4. Skladování ionexu. Po převedení ionexu do Na nebo Li formy tento promyjeme na fritě prvním pufrem a v tomto stavu jej uchováváme v PE lahvičce v lednici. Nikdy neskladujeme ionex po převedení do Na nebo Li formy po promytí louhem. Louh se z pórů ionexu uvolňuje a ionex je potom skladován prakticky v louhu, což způsobuje jeho naboptnání a ztrátu tvrdosti. Skladuje se proto v kyselém prostředí prvního pufru. K udržení vlkosti postačí doplňovat H2O.

2.1.6 Plnìní analytických kolon pro hydrolyzáty Na cyklus. Kolona se plní ionexem OSTION ANB. Kolonu nejprve chemicky vymyjeme,přišroubujeme k ní spodní uzávěr, jehož kapiláru odpojíme od směšovače a vložíme do malé kádinky. Kolonu zasadíme do držáku kolony v analyzátoru a necháme povytaženou z lůžka topení ven. Připravíme si asi 5ml injekční stříkačku opatřenou PE hadičkou s vnitřním INGOS s.r.o.

Strana 16

2

AAA400

Kapitola 2: CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ KAPITOLA

průměrem asi 1 mm a délce 500 mm. Do této stříkačky nasajeme destilovanou vodu a vpravíme ji na dno do výše 10-20 mm. Potom do této stříkačky nasajeme ionex, který jsme předtím zředili prvním pufrem v poměru 1 díl ionexu a 2-3 díly pufru. Při rozmíchávání ionexu používáme vždy skleněnou tyčinku, míchání provádíme pomalu. Nikdy nerozmícháváme ionex protřepáváním! Zasuneme PE hadičku na dno kolony, pomalu vytlačujeme ionex ze stříkačky do kolony a současně vytahujeme hadičku tak,aby byla stále 5-10 mm pod hladinou suspenze, až naplníme kolonu po okraj. Potom na kolonu našroubujeme plnící uzávěr (shodný s uzávěrem předkolony) a běžným průtokem plníme. Když je suspenze ionexu nad sedimentem ionexu asi 20mm, vypneme čerpadlo. Počkáme na pokles tlaku, odšroubujeme horní plnící uzávěr,odsajeme čirou kapalinu až k suspenzi a opět naplníme suspenzí ionexu. Takto pokračujeme až docílíme požadovanou výšku ionexu v koloně. Výška ionexu v koloně má být pro stanovení hydrolyzátů 350-370mm, což odpovídá počtu asi 23-25 000 teoretických pater. Počáteční plnění kolony necháváme na 370mm, protože během prvních analýz ionex asi o 20mm klesne. Přeplníme-li kolonu, postačí přebytečné množství odsát. Po naplnění kolony neodsáváme přebytečný pufr nad ionexem, ale vložíme do kolony analytický uzávěr, který dotáhneme těsně na ionex. Během prvních analýz kontrolujene dotažení horního uzávěru na ionex a v případě potřeby jej opět dotáhneme, nelze-li uzávěr již dotáhnout na ionex pomocí šroubu, vložíme na uzávěr další distanční trubičku. Upozornění: V případě, že při plnění dojde ke spojení suspenze se sedimentem, neodsajeme všechen přebytečný pufr, ale ponecháme nad sedimentem asi 10-20mm pufru a hadičkou krouživým pohybem rozhrábneme horní vrstvu ionexu a dále plníme běžným způsobem. Neprovedeme-li toto rozhrábnutí je vážné nebezpečí, že kolona nebude dobře dělit.

2.1.7 Plnìní analytických kolon pro volné aminokyseliny Li cyklus. Kolona se plní ionexem OSTION LG FA, ředění ionexu opět provedeme prvním pufrem ve stejném poměru jako při plnění hydrolyzátové kolony. Plnění provádíme postupem v kapitole 2.1.6. Kolona se plní do výše 200-220mm.

2.1.8 Plnìní pøedkolony. Předkolona se plní ionexem OSTION 0804 stejným způsobem jako analytická kolona. Pro plnění kolony do Li cyklu (stanovení volných aminokyselin) se má teoreticky ionex přecyklovat do Li cyklu. Z praxe však víme, že to není nutné, protože během plnění se ionex přecykluje sám. Je ale nutné alespoň 2x vystřídat po 10 min. průchod kolonou LiOH a první pufr, na hořejší části se objeví malá prohlubeň. Postačí otevřít horní uzávěr a kolonu doplnit čerstvým ionexem, nejlépe je slít z uskladněného ionexu pufr a hustým sedimentem pomocí špachtle (kopistě, navažovací lžičky) doplnit ionex (dokytovat).Projeví-li se nám časem zhoršené doběhnutí arg na základní linii a kolona je řádně naplněna, bývá většinou horní vrstva ionexu znečištěná. Poznáse to po sejmutí horního uzávěru. Na povrchu je ionex tmavé barvy. Tento ionex odstraníme až na čistý ionex a doplníme čerstvý ionex. Při zavírání předkolony musí být její okraj vždy řádně očištěn, jinak by mohla kolona špatně těsnit, což je hrubá závada. INGOS s.r.o.

Strana 17

2

AAA400

Kapitola 2: CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ KAPITOLA

2.1.9 Vyprazdòování kolon Z kolony odšroubujeme spodní uzávěr, podsuneme pod ní kádinku a spustíme pufrové čerpadlo. Počkáme, až mám všechen ionex vyteče z kolony. Tento ionex uskladňujeme samostatně a až je ho větší množství, tak jej přecyklujeme a vrátíme k původnímu ionexu.

2.2 Ninhydrinové èinidlo. 2.2.1 Chemikálie potøebné pro pøípravu ninhydrinového èinidla: 2.2.2 Ninhydrin Ninhydrin - 1,2,3 - triketohydrinden monohydrát C9H6O4, MW 178,14. Kvalitní ninhydrin (dále jen NHD) tvoří světle žluté krystalky. Červenofialové krystalky v NHD jsou známkou jeho znehodnocení. NHD uskladňujeme při normální teplotě v tmavých láhvích za nepřístupu světla.

2.2.3 2-methoxyethanol 2-methoxyethanol (ethylenglykolmonomethylether, methylcellosolv) MW 76,10 C3H8O2 CH3-O-(CH2)2-OH Methylcellosolv (dále jen MCV) musí být prostý peroxydů. V případě, že je obsahuje projeví se to na rychlém zhoršování ploch píků a jejich výšek.(pokud není jiný důvod k jejich snižování). V takovém případě je nutné MCV předestilovat a to pouze potřebné množství pro přípravu NHD činidla. Destilace se provádí s přídavkem 10 ml roztoku FeSO4 na 1000 ml MCV. Roztok síranu železnatého připravíme rozpuštěním 6 g FeSO4 ve 100 ml destilované vody okyselené 6 ml koncentrované H2SO4.

2.2.4 4 M acetátový tlumiè. se připraví takto: V 600 ml horké destilované vody rozpustíme 544 g octanu sodného (CH3COONa.3H2O). Po zchladnutí přidáme 100 ml ledové kyseliny octové a doplníme na 1000ml destilovanou vodou. Tento acetátový tlumič bývá výrobcem většinou dodáván hotový.

2.2.5 Hydrindantin dihydrát MW 358,31. Bílá jemně krystalická látka. Skladuje se v tmavé láhvi pokud možno za nepřístupnosti světla (ve skříni) při pokojové teplotě. Navažuje se s přesností 0,02 g.

2.2.6 Pøíprava ninhydrinového èinidla. Chemikálie rozpouštíme v uvedeném pořadí za stálého probublávání dusíkem přímo v reagenční láhvi.Množství, pořadí a nezbytná doba pro probublávání dusíkem jsou uvedeny v následující tabulce. poř.čís.

název

množství

l. 2. 3. 4.

ninhydrin (NHD) methoxyethanol (MCV) 4 M Na acetátový pufr hydrindantin dihydrát

40 g 1 500 ml 500 ml 2,00 g

INGOS s.r.o.

dusík min. promývání do rozp.NHD 5 min do rozpušt.

Strana 18

2

AAA400

Kapitola 2: CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ KAPITOLA

Tab.2 Příprava ninhydrinu Hydrindantin se ve směsi acetátový pufr methoxyethanol velmi špatně rozpouští, proto při přípravě činidla odlijeme asi 200ml MCV do kádinky, jinak postup zachováme stejný. Když máme přidat hydrindantin, rozpustíme ho v připravované MCV. Ihned po vložení hydrindantinu do MCV intenzivně mícháme, aby se rozpustil v co nejkratší době (do 1 min.). Rozpuštění poznáme tak, že se roztok zcela vyjasní. Potom ihned nalijeme do láhve s připraveným činidlem NHD, kádinku nevyplachujeme a krátce probubláme dusíkem (1-2 min.). Poznámka: 1. Všechny použité chemikálie musí být čistoty pro analýzy, nebo pro analyzátory aminokyselin. 2. Methoxyethanol je možné nahradit dimethylsulfoxidem, je však nutné použít 4 N Li acetátový pufr pH 5,2. 3. Místo hydrindantinu je možné použít jiné redukční činidlo na př SnCl2 (O,8 g pro 4O g NHD) nebo 7,5 ml 15% roztoku TiCl3. 4. Dusík který používáme jako inertní plyn musí být zcela prostý kyslíku (žárovkový). Lze použít i argon. Nedoporučujeme použití helia (má malou molekulu).

2.2.7 Bezpeènostní pøedpisy pøi práci s NHD èinidlem Při přípravě činidla vždy používáme gumové rukavice. Dojde-li k potřísnění pokožky omyjeme zasažené místo vodou a posypeme pyrosiřičitanem sodným (dvojsiřičitan sodný). Při zjištění modrých skvrn na pokožce tyto též posypeme pyrosiřičitanem sodným a omyjeme vlažnou vodou. Při požití vyvoláme zvracení a ihned lékařskou pomoc.

2.3 Pøíprava sodno citrátových eluèních roztokù.

Sodno citrátové pufry jsou používány převážně pro stanovení aminokyselin v hydrolyzátech bílkovin.

2.3.1 Seznam potøebných chemikálií: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Kyselina citrónová p.a. Citronan sodný p.a. Chlorid sodný p.a. Hydroxid sodný p.a. - pecičky a roztok obsahující v 1 ml 0,5 g NaOH Kyselina boritá p.a. Thiodiglycol pro analyzátory aminokyselin Azid sodný Poznámka: 1.Používáme chemikálie pro analýzy, nebo chemikálie pro analyzátory aminokyselin, případně chromatograficky čisté. 2. Roztok NaOH připravujeme v minimálním množství 500 ml a uchováváme v PE láhvi. Pipetujeme vždy ze středu láhve pod vrstvou uhličitanů. Výsledná koncentrace NaOH má být 0,5 g v 1 ml. Př. 500 g NaOH rozpustíme za stálého míchání a chlazení asi ve 300 ml destilované vody. Po zchladnutí doplníme na 1000 ml destilovanou vodou. 3. Azid sodný můžeme nahradit fenolem, pentachlorfenolem, nebo kyselinou kaprylovou v množství 0,1 g na 1000 ml elučního roztoku. INGOS s.r.o.

Strana 19

2

AAA400

Kapitola 2: CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ KAPITOLA

Tabulka výpočtu množství jednotlivých chemikálií pro zhotovení sodno citrátových elučních roztoků. Na pufry

1

2

3

4

M Na M citr.

0.2 0.066

0.2 0.066

0.4 0.066

1.12 0.066

pH H Z F

2.6 30 19.6 11.7

3.0 30 19.6 11.7

4.25 32 19.6 23.4

viz dole∗ viz dole∗

přísady TDG ml/l NaOH roz. H3BO3 N3Na

2.5 0.1

2.5 0.1

2.5 0.1

– 0.5-3ml 2.05 g 0.1

Tab.3 Na Pufry Výpočet: kyselina citrónová [g/l] = citronan sodný [g/l] = chlorid sodný [g/l] =

H : pH Z - (A x 1.4) F - (B x 0.596)

=A =B

MW 210.14 294.11 58.44

∗

Pufr 4 se připraví navážením 19.6 g citronanu sodného a 52.6g chloridu sodného + přísady podle tabulky.Navážky jsou konstantní není třeba je vypočítávat, proměnné je pouze množství NaOH.

2.3.2 Postup pøi pøípravì eluèních roztokù (dále jen pufrù) Postupně rozpouštíme za stálého míchání jednotlivé složky pufru v teplé destilované vodě (40 až 60O C). Po rozpuštění doplníme na žádaný objem. Takto připravené pufry ”nezrají”, je možno je okamžitě používat. Několik praktických poznatků při přípravě pufrů. Při zavádění nového systému, na př. při výměně ionexu nejprve připravíme 1000 ml pufru , nevyhovuje-li tento pufr, (je rychlý, nebo pomalý), nezdržujeme se jeho opravou, ale připravíme nový pufr se změněnými parametry podle nového výpočtu.Změnu u prvního pufru neprovádíme zpravidla větší než o 0,1 pH. Známe-li parametry vyhovujícího pufru, není nutné jej podruhé vypočítávat, postačí si zapsat jeho pH a navážky, které se potom v praxi opakují. Doporučujeme připravovat z vyhovujících pufrů koncentráty v množství asi 5000 ml, pětinásobný koncentrát. Potom celá příprava pufru spočívá v odměření 200 ml koncentrátu a doplnění na 1000 ml destilovanou vodou.

INGOS s.r.o.

Strana 20

2

AAA400

Kapitola 2: CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ KAPITOLA

Příklad přípravy koncentrátu: Koncentrát vyrobíme tak, že v přibližně 2500 ml destilované vody rozpustíme postupně 25ti násobek jednotlivých složek pufru. Po rozpuštění doplníme destilovanou vodou na 5000 ml.

2.3.3 Vlastnosti Na pufrù Systém pufrů ”INGOS” má celou řadu výhod, je velice jednoduchý, pufry nevyžadují použití pomocných zařízení (pH metry). Jsou vyrobeny z pevných chemikálií a pouhým navážením na technických váhách se dociluje maximální reprodukovatelnosti.Celý systém výpočtu jednotlivých složek pufrů byl zjednodušen avšak variabilita pH byla zachována. Všechny zde popsané pufry budou prokazovat uvedené parametry při konstantním průtoku pufru 0,3 ml/min, dále při rozměrech kolony 0.37 x 45 cm, při náplni OSTION LG ANB (výrobce Spolek pro chemickou a hutní výrobu Ústí n/Labem.) a výšce sloupce ionexu l = 35 až 37 cm. Pufr 1 0.2 M Na, pH 2.7 Při použití tohoto pufru je poředí aminokyselin toto: Kyselina cysteová, kyselina asparagová, methionin sulfon, threonin, serin. Při správném nastavení času stabilizace kolony je rozdělení všech píku na 100%. Problém může činit jedině metS, který je při dlouhé stabilizaci kolony blíže k asp a naopak. Postačí proto upravit délku stabilizace tímto pufrem na konci analýzy. Upozorňujeme také na nebezpečí přidavku thiodiglykolum, který musí být přesný a je potřeba ho odměřovet, ovlivňuje též ruclost eluce metS. Pufr 2 0.2 M Na, pH 3.0 Tento pufr slouži k dokončení eluce kyselých aminokyselin, protože použitím pufru pH 2.8 by bylo zbytečně dlouhé. Eluují se jím tyto aminokyseliny: Kyselina glutámová, prolin, glycin, alanin, cystin a valin. Při správném přepnutí ihned na začátku analýzy nejsou žádné problémy a všechny píky jsou dodělěny na 100%. Přepnutí z pufru pH 2.7 na tento pufr provádíme zpravidla již v 1 min. Pufr 3 - 0,4 M Na, pH 4,25 Tímto pufrem jsou eluovány tyto aminokyseliny: met, ile, leu. Tento pufr není problematický,všechny dvojice jsou velice dobře rozděleny. Čím je pufr kyselejší, tím je pomalejší eluce a naopak. Totéž platí o teplotě. Čím vyšší teplota kolony, tím rychlejší eluce a naopak. Pufr 4 - 1.12 M Na, pH 7,9 Moderní pufr, který na počátku stlačí během prvních tří analýz ionexový sloupec v koloně o max. 1 cm a zvýší tlak na koloně přibližně o 0,2 až 0,5 MPa. Toto se v průběhu dalších analýz však vůbec nemění. Jeho veliká přednost spočívá v tom, že své analytické vlastnosti po celou dobu své životnosti nemění. Retenční doby se prakticky vůbec nemění a reprodukovatelnost je také výborná.Toto vše nám plně vynahradí malé sesednutí kolony a nepatrné zvýšení tlaků. Jeho příprava je velice jednoduchá a naprosto nenáročná. Eluční vlastnosti se určují pouze množstvím přidaného NaOH.

2.3.4 Pøíprava øedícího roztoku pufru O.2 M Na, pH 2.2 Tímto pufrem ředíme na žádanou koncentraci vzorky i standardy. U pufru není nutné měřit pH. Postačí jej připravit podle následující receptury. kyselina citronová 14.0 g/l INGOS s.r.o.

Strana 21

2

AAA400

Kapitola 2: CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ KAPITOLA

chlorid sodný thiodiglycol azid sodný

11.5 g/l 5.0 ml/l 0.1 g/l

2.3.5 Pøíprava regeneraèního roztoku NaOH 0,2 M Na Tento roztok připravíme rozpuštěním 8.0g NaOH (MW 40,01) v 1000 ml destilované vody.

2.3.6 Bezpeènostní pøedpisy pro práci s Na pufry. Vzhledem k tomu že se jedná o sloučeniny kyseliny citrónové a chloridu sodného, což jsou suroviny běžně obsažené v potravě, není nutné dbát zvláštních bezpečnostních předpisů.

2.4 Pøíprava lithno citrátových eluèních roztokù.

Lithno citrátové eluční roztoky (dále jen pufry) jsou používány převážně pro stanovení volných aminokyselin ve fyziologických roztocích.

2.4.1 Seznam potøebných chemikálií 1. 2. 3. 4. 5. 6.

kyselina citronová citronan lithný chlorid lithný hydroxid lithný thiodiglykol pro analyzátory aminokyselin azid sodný Poznámka: 1.Používáme chemikálií pro analýzy, nebo chemikálie pro analyzátory aminokyselin, případně chromatograficky čisté. 2. Chlorid litný je značně hydroskopický. Starší může obsahovat značné množství vody. Lépe něž jej sušit je rozpustit ho v destilované vodě, stanovit jednoduchým způsobem chloridy (např. titračně-argentometricky) a potom vypočítat množství LiCl v 1ml rozroku a odměřit potřebný počet g. 3.Azid sodný můžeme nahradit kyselinou kaprylovou, fenolem nebo pentachlorfenolem v množství 0,1 g na 1000 ml pufru. Při větším přidaném množství azidu sodného do Li pufrů může dojít ke koincidenci (splynutí) píku kyseliny asparagové a hydroxyprolinu. V sodných pufrech jsou jejich polohy opačné. 4.Pro přípravu pufrů používáme zásadně kvalitní čerstvou destilovanou vodu, která není kontaminována amoniakem. Navážky jednotlivých komponent pro 1000 ml provádíme s přesností  0,05 g. 5. Při rozpouštění je přípustné zahřát roztok na teplotu přibližně 60O C a mícháním napomáhat rychlejšímu rozpouštění.

2.4.2 Pøíprava øedícího pufru 0,1 M Li, pH 2,2 Tímto pufrem ředíme na žádanou koncentraci vzorky i standardy. U pufru není nutné měřit pH. Postačí jej připravit podle následující receptury. INGOS s.r.o.

Strana 22

2

AAA400

9.5g 8.5 g 5,0 ml 0,1 g

Kapitola 2: CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ KAPITOLA

citronan lithný kyselina chlorovodíková p.a. (33 - 35 %) thiodiglykolu azid sodný destilovaná voda - doplníme na konečný objem 1000 ml.

2.4.3 Pøíprava regeneraèního roztoku LiOH 0,3 M Li Tento roztok připravíme rozpuštěním 12.59 g LiOH (MW 41,96) v 1000 ml destilované vody. Máme-li LiOH s jinou MW, musíme provést přepočet.

2.4.4 Pøíprava eluèních roztokù a jejich výpoèet podle tabulky. Li pufry

1

2

3

4

5

M Li M citr.

0,18 0,053

0,20 0,06

0,35 0,07

0,33 0,10

1,20 0,22

pH H Z F

2,90 27,26 14,92 7,62

3,10 3O,O7 16,92 8,47

3,35 35,17 19,74 14,83

4,O5 38,48 28,20 13,98

4,65 41,65 62,04 50,87

přísady TDG N3Na

2,5 0,1

2,5 0,1

2,5 0,1

0,1

0,1

Tab.4 Li pufry Výpočet: kyselina citrónová [g/l] = citronan lithný [g/l] = chlorid lithný [g/l] =

H : pH Z - (A x 1.342) F - (B x 0.4509)

=A =B

MW 210.14 281.93 42.43

2.4.5 Vlastnosti Li pufrù Při hledání vhodného pH a ostatních partametrů pufrů je vždy nejdůležitější si uvědomit, které aminokyseliny (skupinu aminokyselin) nám bude pufr eluovat. pH pufrů neměříme. Posoudíme dělící vlastností pufru, jsou-li nevyhovující, připravíme nový pufr. Navážky vyhovujících pufrů si zapíšeme. Bývají neměnné, pokud neměníme analytické podmínky. Toto je veliká přednost systému pufrů INGOS. V popise jsou uvedeny aminokyseliny a NHD pozitivní látky v pořadí ve kterém jsou eluovány z kolony. Pufr 1 - 0.18 M Li, pH 2,80 První Li pufr eluuje tyto aminokyseliny (NHD pozitivní látky): kyselinu cysteovou, taurin, fosfoethanolamin, močovinu, asparagovou kyselinu, hydroxyprolin, threonin, serin, asparagin, glutamovou kyselinu, glutamin. Eluce se provádí při základní teplotě 37 až 40C. Nejcitlivější na pH a teplotu je trojice asn, glu, gln. Z těchto tří je nejcitlivější a nejpohyblivější, při změnách pH a teploty, kyselina glutamová. INGOS s.r.o.

Strana 23

2

AAA400

Kapitola 2: CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ KAPITOLA

Tím je určena taktika přípravy purfu. pH a teplotu musíme upravit tak, aby kyselina glutamová byla přesně uprostřed mezi asn a gln. Zvýšením teploty a zvětšením pH se eluční čas kyseliny glutamové zkrátí a tato se přiblíží k asn a naopak.U tohoto pufru můžeme také provést posun kyseliny glutamové zkrácením doby stabilizace.Čím kratší je doba stabilizace, tím je alkaličtější (rychlejší) první pufr a opačně. Jedná se o zkrácení o několik minut, max 15. Pufr 2 - 0,20 M Li, pH 3,05 Druhý Li pufr eluuje tyto aminokyseliny: kyselinu alfa amino adipovou, prolin, glycin, alanin, citrullin, kyselinu alfa amino máselnou a valin. Problém při dělení je pouze s citrullinem, který je velice citlivý na teplotu a pH. Jeho polohu je možné nastavit pomocí pH pufru (nový pufr). Většinou postačí upravit dobu přepnutí druhého pufru. Je-li citrullin eluován blízko alaninu, je druhý pufr méně kyselý (rychlejší), postačí posunout dobu jeho přepnutí o 2 až 3 min. Příklad: druhý pufr přepínáme v 16 min. provedeme tedy změnu přepnutí na 19 min. Totéž platí opačně, dělí-li se citrullin špatně od kyseliny alfa amino máselné. Někdy bývají drobné problémy s dělením prolinu. Zde musíme provést úpravu prvního pufru, aby ještě uspokojivě dělil trojici asn, glu, gln a současně se dělil dobře i pro ve druhém pufru. Pufr 3 - 0,36 M Li, pH 3,35 Třetí Li pufr eluuje tyto aminokyseliny: cystin, methionin, cystathionin, isoleucin, leucin. Tento pufr není náročný na pH. Z eluovaných aminokyselin je problematický jen cystathionin, který je citlivý na pH i na teplotu. Volíme proto přepnutí na vyšší teplotu 60O C tak, aby byl cystathionin uprostřed mezi methioninem a isoleucinem. V případě pozdějšího přepnutí teploty je cystathionin eluován později a je nedostatečně oddělen od isoleucinu, v opačném případě je eluován v methioninu. Zpravidla nebývá rozdíl od základního času větší než o 5 min. Také je důležité, aby změna pufru proběhla za valinem a aby cystin byl eluován již v tomto pufru. Toto poznáme na grafu standardu tak, že cystin je štíhlejší a vyšší pík než valin. Pufr 4 - 0,33 M Li, pH 4,05 Čtvrtý Li pufr eluuje tyto aminokyseliny: tyrosin, fenylalanin, beta alanin a beta aminomáselnou kyselinu. U tohoto pufru nejsou žádné problémy, je-li pufrová změna provedena na správném místě. Změnu pufru poznáme snadno, za leucinem se objeví při analýze standardu typické zvlnění pufrové změny. V případě, že je provedena brzy je eluován leucin již ve 4 pufru je užší vyšší než ile. (leu je ve standardu ze čtveřice met,cystathionin,ile,leu nejnižší). Když je eluován pouze částečně 4 pufrem, projeví se to jeho nesymetričností. V tomto případě také neuvidíme typické zvlnění nulové linie zaviněné změnou pufru. Pozdní změna pufru se projeví velkou mezerou mezi leucinem a tyrosinem. Toho se využívá při použití vnitřního standardu norleucinu (nle), který je právě eluován za leucinem v tomto místě. Pufr 5 - 1.20 M Li, pH 4.65 Pátým pufrem jsou eluovány tyto aminokyseliny: gama amino máselná kyselina, ethanolamin, amoniak, ornithin, lysin, histidin, 1-methyl histidin, 3-methyl histidin a arginin.Tento pufr je bezproblémový. Pufrovou změnu musíme provést za kyselinou beta aminomáselnou, aby tato byla eluována ve 4 pufru. (má pík řádově stejně vysoký jako beta alanin.) V případě, že byl pufr přepnut brzy, je beta aminomáselná kyselina podstatně vyšší než beta alanin. Také zde je dobře patrná pufrová změna. INGOS s.r.o.

Strana 24

2

AAA400

Kapitola 2: CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ KAPITOLA

Další pozornost musíme věnovat zařazení regenerace. Předčasné zařazení regenerace vede k deformaci píku argininu, nebo k jeho splynutí s regenerací. Pozdější zařazení regenerace se projeví podstatně pomalejším nárůstem nulové linie a v okamžiku, kdy přichází regenerace tento nárůst prudce stoupá.

2.4.6 Poznámky k Li provozu z praxe 1. Li pufry jsou mnohem agresivnější než Na, proto je vhodné přibližně jedenkrát měsíčně propláchnout, při maximálním průtoku, čerpadla teplou destilovanou vodou. Tuto nepouštíme do hydraulického systému. 2. Pro korekce časových změn přepínání pufrů použijeme kurzor, kterým odečteme časové hodnoty vzdáleností jednotlivých píků z grafu (ve výpočtové obrazovce). 3. Je nutné mít na paměti, že posuny časů přepnutí nižších pufrů se musí provést i u pufrů s vyššími čísly. Na př. pufr č 3 posuneme o 5 min, musíme tím samým směrem posunout přepnutí 4 a 5 pufru a regenerace též o 5 min. 4. V případě nouze lze provést analýzu volných aminokyselin též na ionexu OSTION LG ANB, který převedeme do Li cyklu. 5. V případě značné kontaminace pufrů amoniakem nebo v případě práce se značně znečištěnými vzorky, se může stát, že nulová linie se obtížně ustaluje. Projeví se to pomalým sestupem na základní čáru. Start analýzy proběhne a nulová linie není ještě ustálena. V tomto případě nepostačí pouhá jednoduchá regenerace. Je nutné provést dvě regenerace. Dosáhneme tím dokonalou reprodukovatelnost. Doporučujeme tento postup: a. regenerace 0,3 M LiOH po dobu 10 min, při teplotě 60o C. b. stabilizace pufrem č. 1 po dobu 20 min, teplota 60o C. c. regenerace 0,3 M LiOH po dobu 15 mi při teplotě 60o C. d. Stabilizace pufrem č.1 po dobu 50 min při teplotě 38o C. e. Pro zlepšení reprodukovatelnosti doporučujeme nepřetržitý provoz. 6. Všechny úpravy a ladění pufrů se provádí pouze na počátku při zavádění programu, nebo při změně analytických podmínek. Podrobně jsou zde popsány proto, aby obsluhu nezdržovaly. V praxi se již úpravy pufrů neprovádí, pouze se navažují, nebo se vyrábí koncentráty, tak jak to bylo popsáno v kapitole přípravy Na pufrů.

2.4.7 Bezpeènostní pøedpisy pro práci s Li pufry Tyto předpisy jsou shodné s Na pufry, pouze jsou agresivnější vůči všem kovům, není vhodné je nechávat delší dobu ve styku s povrchy laků a kovů.

2.5 Pøíprava eluèních roztokù pufrù

Celá tato problematika je součástí programu počítače, který obsluhuje analyzátor. Tento program nám po zadání pH vypočítá optimální složení pufru. V instrukci jsou potom vlastnosti jednotlivých pufrů i jejich úprava. Celá problematika elučních roztoků je též popsána ve stati 2.3. a 2.4. .

INGOS s.r.o.

Strana 25

2

3. PØÍPRAVA VZORKÙ

3.1 Úvod

Správně zvolený způsob přípravy vzorku je prvotním předpokladem správných a reprodukovatelných výsledků v automatické analýze aminokyselin. Chybný způsob přípravy vzorku může nejen vést k omylům v kvalitativní analýze a chybám při kvantitativním stanovení, ale může ohrozit i chod analyzátoru. Pro úspěšnou přípravu vzorku je žádoucí se nejprve seznámit s dostupnými literárními údaji o jeho spektru aminokyselin a jiných látek, jež mohou hrát roli při zpracování vzorků a interpretaci chromatogramu. Předběžná znalost přibližného obsahu aminokyselin je výhodná pro zvolení optimální navážky. K dávkování do automatického analyzátoru používáme zásadně pouze čiré roztoky, zbavené pevné fáze a koloidních příměsí. Přípravu vzorků lze rozdělit na uvolňování aminokyselin vázaných v bílkovinách, peptidech apod. hydrolýzou a na přípravu vzorků obsahujících volné aminokyseliny (biologické tekutiny, tkáňové extrakty), z nichž odstraňujeme bílkoviny a jiné rušivé látky. V komplexních biologických materiálech často stanovujeme vázané i volné aminokyseliny. Vzhledem k neobyčejné rozmanitosti přírodního materiálu a k rozsáhlému použití automatické analýzy aminokyselin v řadě oborů, lze v této stati podat pouze orientační údaje o přípravě vzorků, jež doporučujeme konfrontovat se speciální literaturou v daném oboru. Při výběru metod přípravy vzorků byla v této stati dána přednost jednoduchým, v praxi prověřeným postupům, jež nejsou náročné na přístrojové vybavení. Máme-li však možnost, provádíme zejména přípravu vzorků obsahujících volné aminokyseliny za nízkých teplot (používáme chlazených odstředivek, vakuové odpařování nahrazujeme lyofilizací apod.).

3.2 Bílkoviny a peptidy 3.2.1 Charakteristika materiálu Odolnost peptidických vazeb vůči hydrolýze se liší v závislosti na druhu aminokyseliny a struktuře bílkoviny. Aminokyseliny uvolněné z peptidické vazby mohou podléhat různým rozkladným změnám účinkem hydrolyzačního činidla nebo jiných složek reakční směsi. Není proto možné získat absolutní údaje o obsazích aminokyselin při jediných podmínkách hydrolýzy.

3.2.2 Hydrolýza kyselinou chlorovodíkovou [1] Pro tuto nejběžnější metodu hydrolýzy 6N HCl, kterou získáme buď zředěním koncentrované kyseliny v poměru 1:1 destilovanou vodou, nebo destilací azeotropní směsi HCl s vodou (1:1) ve skleněné aparatuře s přídavkem malého množství SnCl2. Hydrolýzu provádíme ve zkumavce ze Sialu nebo Pyrexu, postupně vypláchnuté chromsírovou směsí (40g CrO3 do 600ml H2O,po rozpuštění + 400ml H2SO4),destilovanou vodou a 1N HCl. Zbytky HCl se odstraní v sušárně při 100o C. Zkumavky pak uchováme v polyetylenových sáčcích, aby na nich nevznikly nálety NH4Cl. INGOS s.r.o.

Strana 26

3

AAA400

Kapitola 3: PŘÍPRAVA VZORKŮ

Vzorek diferenčně navážíme na dno zkumavky tak, aby materiál neulpěl na stěnách. Potom připipetujeme 6N HCl ve dvěstěnásobném přebytku. Ke kapalným vzorkům přidáme 12N HCl v objemu vzorku. Při stanovení navážek vycházíme z orientačního údaje, že 1mg bílkoviny obsahuje 0,3 - 1 mol jednotlivých aminokyselin. Na kyslíkovém plameni zúžíme vrch zkumavky na vnitřní průměr asi 2mm tak, aby nedošlo k zeslabení stěn. Roztok pak zmrazíme v mrazící lázni (aceton a suchý led) nebo v podchlazeném alkoholu. Pak vzorek evakuujeme přes kohout, uzavřeme a zkumavku v krčku zatavíme. Zkumavku vložíme do hydrolyzačního bloku nebo do vzdušného termostatu a ponecháme po dobu 20 hodin při teplotě 110  1o C. Další stejně připravený podíl vzorku hydrolyzujeme 70 hodin. Po hydrolýze zkumavky ochladíme, nařízneme a odpukneme přiložením na konci rozžhavené tyčinky. Kyselinu odpaříme ve vakuovém rotačním odpařováku. Vzorky, jež nemohou být ihned po hydrolýze analyzovány neotvíráme a uskladníme je v lednici nebo mraznici. Pokud je ve vzorku přítomen cystein, je nutno odparek rozpustit v destilované vodě a po úpravě fosforečnanovým pufrem na pH 6,5 jej ponecháme 4 hodiny při laboratorní teplotě. Po této oxidaci cysteinu na cystin se vzorek okyselí 1N HCl a doplní na potřebný objem pufrem o pH 2,2. Neprovádíme-li oxidaci cysteinu, rozpouštíme odparek přímo v tomto pufru.

3.2.3 Zdroje chyb Přítomnost těžkých kovů v hydrolyzačním médiu, kam mohou být vneseny např. s HCl, zvyšuje ztráty threoninu, serinu, sirných aminokyselin a tyrosinu. Ke ztrátám sirných aminokyselin a chloraci tyrosinu přispívá rovněž nedokonalá evakuace vzorku a zejména přítomnost oxidačních činidel (např. methionin - sulfoxidu, dimetylsulfoxidu, iontu NO3 - apod.). V přítomnosti nitroargininu se chloruje i fenylalanin. Ke ztrátám threoninu a serinu esterifikací přispívá přítomnost síranového iontu a starší způsob odstraňování HCl odpařením v exikátoru nad louhem, jež se projeví výskytem malých vrcholů v různých částech chromatogramu. Kyselina glutamová se za těchto podmínek částečně cyklizuje. Neúplné výtěžky některých aminokyselin jsou dány použitou metodou hydrolýzy HCl a nejsou prakticky odstranitelné. Cystin při hydrolýze recemizuje a poskytuje na chromatogramu plochý, asimetrický, obtížně integrovatelný pík. Přesnějších výsledků při stanovení sirných aminokyselin i s ohledem na možnou oxidaci při hydrolýze HCl lze dosáhnout oxidací vzorku před hydrolýzou (viz odst. 3.2.4 str. 28). Pro stanovení přesných obsahů isoleucinu a valinu, jež jsou obtížně uvolňovány z peptidických vazeb, používáme 70 hod. hydrolýzy. U threoninu a serinu dochází podle různých autorů při 20 - 24 hodinách hydrolýzy ke ztrátám ve výši 3 - 15%, přičemž je serin podle většiny údajů labilnější než threonin. Ztráty tyrosinu uváděné v literatuře pro tytéž časy hydrolýzy se pohybují v rozmezí 1 14%. Tryptofan je během kyselé hydrolýzy HCl ničen téměř úplně, píky jeho oxidačních produktů se však mohou objevit na chromatogramu před pozicí tryptofanu. Ostatní aminokyseliny jsou podle většiny literárních údajů při 20 - 24 hodinové hydrolýze považovány za stabilní, resp. jejich ztráty lze s ohledem na přesnost stanovení zanedbat.

INGOS s.r.o.

Strana 27

3

AAA400

Kapitola 3: PŘÍPRAVA VZORKŮ

Pro získání údajů o skutečném obsahu labilních aminokyselin v intaktním vzorku z výsledků rozborů hydrolyzátů byla navržena řada metod, jejichž přehled podává Robel [3]. Nejjednodušší postup předpokládá reakční kinetiku I.řádu, provedení dvou hydrolýz při čase t1 =20 hod. a t2 =70 hod. a výpočet původního obsahu A0 podle vzorce: t2

logA1

t1

logA2 t2 t1 t2 t1 kde A1 ,A2 jsou zjištěné obsahy aminokyseliny A v časech t1 , t2 . Korekce na základě grafické interpolace [2], nebo obecně použitelná řešení metodou nelineárních nejmenších čtverců [3] vyžadují 4 - 5 dob hydrolýzy. logA0 =

3.2.4 Pøíprava vzorku pro stanovení sirných aminokyselin [4] Nespecifickým redox reakcím sirných aminokyselin během hydrolýzy HCl zabráníme převedením cystinu a methioninu pomocí kyseliny permravenčí na stabilní oxidované deriváty - kyselinu cysteovou a methioninsulfon. Příprava oxidační směsi: 1 díl 30% H2O2 smísíme s 9 díly 88% kyseliny mravenčí, ponecháme stát 30 minut při laboratorní teplotě a vychladíme na 0o C. Směs pak přidáme ke vzorku v poměru 1ml na 0,04 až 0,08mg cystinu (tj. asi 2mg bílkoviny) a ponecháme stát při 0o C 4 hodiny. Vzorky, jež se v té době nerozpustí, ponecháme při této teplotě přes noc. Oxidační směs odpaříme na rotačním vakuovém odpařováku při 40o C do sirupovité konsistence - úplné odpaření vzorku způsobuje ztráty cystinu. Po přidání 200násobného přebytku HCl pak vzorek podrobíme normální kyselé hydrolýze (část 3.2.2 str. 26). Oxidovaný hydrolyzát zpravidla nepoužíváme ke stanovení ostatních aminokyselin, i když jsou kromě tyrosinu a tryptofanu vůči oxidaci stabilní. Výtěžek kyseliny cysteové lze poněkud zvýšit redukcí zbytků oxidační směsi před vakuovým odpařením pomocí HBr podrobnosti viz [5].

3.2.5 Urychlené odpaøování vzorkù po hydrolýze oxidaèní i bì¾né Po hydrolýze vzorek sfiltrujeme přes černou pásku do odměrné baňky 200 nebo 250 ml. Filtr promyjeme teplou vodou a doplníme po vychladnutí. K odpařování požíváme alikvot (20 nebo 25 ml), který spláchneme do 10 ml odměrné baňky a doplníme ředícím, pufrem pH 2.2. Tímto postupem si značně zrychlíme odpařování vzorku, jelikož odpařování objemu cca 150ml vzorku je značně zdlouhavé. Odpaření 20ml trvá několik minut.

3.2.6 Pøíprava vzorkù pro stanovení aminocukrù Aminocukry vázané v glykoproteinech lze jako látky reagující s ninhydrinem dobře stanovit analyzátorem aminokyselin. Při běžných způsobech hydrolýzy jsou však větší části ničeny a tvoří součást tzv. huminů, jež se z hydrolyzátů odstraňují odstřeďováním či filtrací. Pro stanovení aminocukrů se používá hydrolýzy 4N HCl po dobu 1 - 4 hod. nebo 2N HCl po dobu 12 hod. při 100o C. Postupuje se podle metody v části 3.2.2 str. 26, vyloučení kyslíku a těžkých kovů je zcela nezbytné.

3.2.7 Pøíprava hydrolyzátù pro stanovení tryptofanu Příprava vzorku pro stanovení tryptofanu vázaného v bílkovině je obtížná vzhledem k nízké stabilitě této aminokyseliny v obvyklých hydrolyzačních médiích, zvláště v přítomINGOS s.r.o.

Strana 28

3

AAA400

Kapitola 3: PŘÍPRAVA VZORKŮ

nosti nebílkovinných složek. U čistých bílkovin neobsahujících cukry lze částečně zabránit rozkladu tryptofanu (dále jen trp) při kyselé hydrolýze přídavkem merkaptosloučenin k HCl nebo použitím aryl- a alkylsulfonových kyselin k hydrolýze. Pro vzorky obsahující cukry se užívá bazické hydrolýzy, při níž se výsledek tryptofanu snižuje oxidací vzdušným kyslíkem, uvolňováním křemičitanů ze stěn skleněných hydrolyzačních nádob (zvláště při použití NaOH) a absorbcí tryptofanu na případných sraženinách a nerozpustných podílech reakční směsi. Podle většiny prací poskytuje nejvyšší výtěžky trp hydrolýza hydroxidem barnatým, odstraňování Ba(OH)2 před ionexovou chromatografií je však pracné a může být zdrojem dalších ztrát. Dále jsou uvedeny dva příklady seriózně ověřených metod hydrolýzy pro stanovení tryptofanu.

3.2.8 Kyselá hydrolýza [6] K HCl přidáme 4% kyseliny thioglykolové p.a. a postupujeme jako při standardní kyselé hydrolýze (část 3.2.2 str. 26). Výtěžěk tryptofanu činí 90%, vzorek však nesmí obsahovat cukry. Cystein vznikající při tomto způsobu hydrolýzy interferuje se stanovením prolinu. Kyselina thioglykolová poskytuje dva píky na chromatogramu, jeden v oblasti mezi píky kyseliny cysteové a asparagové, druhý na místě karboxymetylcysteinu.

3.2.9 Bazická hydrolýza [7] Tryptofan je uvolňován působením 4,2N NaOH na vzorek umístěný v evakuované propylenové kyvetě za přídavku částečně hydrolyzovaného škrobu. Příprava částečně hydrolyzovaného škrobu: 50g bramborového škrobu se přidá ke směsi 99ml acetonu a 1ml koncentrované HCl. Směs se zahřívá 2 hodiny na 50o C. Po přidání 25ml 1M octanu sodného se směs převede na fritu a promyje postupně 2l destilované vody a 2l acetonu. Produkt se vysuší v exikátoru. Lze použít i obchodního preparátu škrobu pro gelovou elektroforézu. Pro hydrolýzy nejprve připravíme roztok bílkoviny v 0,005N HCl nebo NaOH, obsahující 0,1 - 0,5 mol trp na 1ml, 0,1ml tohoto roztoku se pipetuje do polypropylenové odstředivkové kyvety (11 x 50mm), přidá se 25mg částečně hydrolyzovaného škrobu a 0,5ml 5n NaOH, čerstvě připraveného z 50% NaOH . Kyveta se pak umístí do tenkostěnné zkumavky (16 x 150mm) a přidá se 5µl 1% roztoku oktanolu v toluenu pro zamezení pěnění. Zkumavka se přibližně v polovině vytáhne nad kyslíkovým plamenem do průměru asi 2mm. U tenkostěnné zkumavky to lze provést bez poškození plastické vložky. Pak se spodek zkumavky vychladí ve směsi acetonu a suchého ledu po 90s tak, aby nezmrzl obsah. Poté se evakuuje olejovou vývěvou, přičemž se spojením se zdrojem vakua několikrát přeruší a v případě, že vzorek příliš pění, se zkumavka opět ponoří do chladící lázně. Po dosažení evakuace po 50 m Hg se zkumavka zataví. Zatavená zkumavka se hydrolyzuje při 110  1o C. Po dokonalém ochlazení se pak zkumavka otevře naříznutím a přiložením horké skleněné tyčinky. Ke vzorku se přidá 0,5ml sodnocitrátového pufru o pH 4,25 (nemá obsahovat BRIJ - 35) a směs se promíchá. Pak se roztok kvantitativně převede tímto pufrem do 5ml

INGOS s.r.o.

Strana 29

3

AAA400

Kapitola 3: PŘÍPRAVA VZORKŮ

odměrky, obsahující 420µl 6N HCl a umístěné v suchém ledu. Pak se obsah baňky doplní po značku. Případný zákal odstraníme odstředěním po dobu 30 minut při 40,000 g.

3.2.10 Zdroje chyb

Výtěžky tryptofanu touto metodou dosahují 100  2% za předpokladu, dostatečné doby hydrolýzy. Pro většinu bílkovin postačuje 16 hodin, avšak vazba Val - Trp nebo Ile Trp vyžaduje až 98 hodin nebo 48 hodin při 135o C. Pro stanovení jiných aminokyselin se bazické hydrolýzy nepoužívá (s vyjímkou metioninsulfoxidu), neboť u řady z nich dochází ke značným změnám. Arginin přechází částečně na ornitin, cystin na lanthionin, reakcí rozkladných produktů cystinu a serinu s lysinem vzniká lysinoalanin atd. Pro oddělení tryptofanu od lysinoalaninu při automatické analýze doporučujeme metodu Hugliho a Moora [7].

3.3 Krevní plazma 3.3.1 Charakteristika materiálu Krevní plasma či serum obsahující volné aminokyseliny, bílkoviny odstraňované deproteinací a vázané aminokyseliny v ninhydrinnegativních formách, neodstranitelné deproteinací. K odbílkovinování byla navržena ultrafiltrace, gelová filtrace, ultracentrifugace po okyselení apod., nejběžnější jsou však metody chemické deproteinace, zejména pomocí kyseliny sulfosalicylové a pikrové.

3.3.2 Odbìr a pøíprava plasmy pro deproteinaci Odebraná krev se převede do centrifugační zkumavky, obsahující 5mg heparinu/25ml krve, odstředí se 10 minut při 21 000 g a supernatan se odebere pro analýzu tak, aby se zamezilo jaho kontaminaci sedlinou. Všechny operace včetně deproteinace mají být provedeny ihned po odběru.

3.3.3 Deproteinace kyselinou sulfosalicylovou K plasmě přidáme pevnou kyselinu sulfosalicylovou v poměru 3Omg na 1ml plasmy, protřepeme a odstředíme 1O minut při 21 000 g. Pro eliminaci chyb, vzniklých změnami objemu kapalné fáze lze při deproteinaci přidat vnitřní standard norleucinu (10µmol) ml v 0,02N HCl/ v poměru 0,2ml na 4 ml plasmy. Tento postup poskytuje roztok, jehož koncentrace aminokyselin (0,05-0,6µmol/ml) je postačující pro přímé dávkování do analyzátoru. Použití kyseliny sulfosalicylové však může v některých případech poněkud zhoršit dělení kyselých a neutrálních aminokyselin v oblasti od startu po pík serinu.

3.3.4 Deproteinace kyselinou pikrovou [10] Ke 4ml plazmy 20 ml 1% roztoku kyseliny pikrové. Po pečlivém protřepání se odstředí a 20ml supernatantu se nanese na kolonku průměru 2 cm, plněnou 6ml středně bazického anexu (Ionex Bio Rad AG 2 - X 10 použitý v původní práci lze nahradit Dowexwm 2, Amberlitem IRA - 410 nebo Ostionem AD. Vhodné zrnění je 200 - 4OO event. 100 - 200 mesh.).Ionex slouží k odstranění kyseliny pikrové.

INGOS s.r.o.

Strana 30

3

AAA400

Kapitola 3: PŘÍPRAVA VZORKŮ

Příprava ionexového sloupce: ionex několikrát rozmícháme v cca 10násobném množství destilované vody a opakovanou dekantací odstraníme prachové částice. Poté ionex promyjeme na fritě 10násobným objemem 1N HCl, destilovanou vodou do neutrální reakce efluentu a ve vodní suspenzi /2 díly vody na 1 díl ionexu) jej plníme do kolony. Uvedené množství ionexu vytvoří asi 2cm vysoký sloupec, jehož povrch chráníme přiložením kolečka filtračního papíru. Kolonu promyjeme 15ml 1N HCl a po opětném promytí vodou do neutrální reakce je kolona připravena. Nad povrchem ionexu ponecháme 2 5mm kapaliny - povrch nesmí vyschnout!! Při průchodu vzorku kolonou jímáme veškerý eluent. Po úplném vsáknutí vzorku (musíme však zabránit vniknutí vzduchu do ionexového sloupce) opláchneme stěny 3ml 0,02N HCl. Po vsáknutí kyseliny postup ještě dvakrát opakujeme se stejnou dávkou HCl a nakonec s 1ml dávkou 0,02N HCl. Nemámeli k dispozici lyofilizaci, postupujeme podle Steina a Moora [12] tak, že vzorek odpaříme ve vakuu a po rozpuštění vzorku ve vodě a přibližné neutralizaci na pH 7 - 8 oxidujeme cystein na cystin stáním při laboratorní teplotě po dobu 4 hod. Pak vzorek okyselíme (pH 2,2).

3.3.5 Pøíprava vzorku plazmy pro stanovení tryptofanu Chceme-li určit veškerý volný tryptofan v plazmě včetně podílu reversibilně vázaného na bílkoviny, použijeme deproteinace kyselinou trichloroctovou [10].

3.3.6 Stanovení ve¹kerých nebílkoviných aminokyselin v plasmì Pro stanovení veškerých aminokyselin včetně konjugovaných použijeme 1ml alikvot. roztoku, získaného po deproteinaci kyselinou pikrovou a přečištěním na anexu. Postupujeme podle části 3.2.2 str. 26, odparek po hydrolýze rozpustíme ve 2ml pufru pH 2,2.

3.3.7 Zdroje chyb Při opakované venipunktuře klesá v odebrané plasmě obsah taurinu a kyseliny glutamové. Opožděná deproteinace způsobuje zrtáty cystinu, homocystinu a směsných disulfidů sirných aminokyselin. Při kontaminaci odebrané plasmy krevními destičkami a leukocyty vzrůstá obsah taurinu, kyseliny asparagové a glutámové. Hemolýza se projevuje nálezem glutathionu a vzrůstem obsahu ornitinu, zatím co obsah kyseliny asparagové a cystinu klesá. Skladování plazmy při teplotách nad -68o C vede ke zvýšení obsahu kyseliny asparágové a glutámové na úkor příslušných amidů. Snižuje se rovněž obsah tryptofanu. Obsah amidů se snižuje rovněž zpracováním vzorku nad 40o C a stáním okyseleného vzorku při nízkém pH (glutamin je podstatně labilnější než asparagin). Použitím kyseliny etylendiamintetraoctové jako antikoagulantu mohou být do vzorku zaneseny ninhydrinpositivní nečistoty. Pokud jde o volbu optimálního deproteinačního činidla z hlediska výtěžků volných aminokyselin a jejich reprodukovatelnosti, literární výsledky nejsou jednoznačné.

3.4 Tkáòové extrakty INGOS s.r.o.

Strana 31

3

AAA400

Kapitola 3: PŘÍPRAVA VZORKŮ

3.4.1 Charakteristika materiálu V živočišných tkáních nacházíme kromě volných aminokyselin rovněž některé typické peptidy. Výskyt některých z nich (karnosin, anserin, homokarnosin apod.) je vázán pouze na některé tkáně, zatím co peptid glutation nacházíme v oxidované i redukované formě ve všech tkáňových vzorcích. Ve vysoké koncentraci je glutathion přítomen v játrech. Redukovaný glutathion se eluuje v oblasti píku kyseliny asparágové, oxidovaný se vymývá jako velmi široký pík za glutaminem. Příprava vzorku tkáně zahrnuje extrakci spojenou s deproteinací a odstranění glutathionu.

3.4.2 Pøíprava vzorku s pou¾itím kyseliny pikrové [13] Tkáně určené k analýze mají být pokud možno co nejrychleji vyjmuty z vykrváceného živočicha a zpracovány. Mají-li být převáženy nebo uchovány, musí být zmrazeny suchým ledem a přechovávány při -45o C. Tkáň zbavenou tuku a spojovacího vaziva odvážíme a rozřežeme na dávky, které přelijeme v mixéru desetinásobkem váhového množství 1% vodného roztoku kyseliny pikrové. Pro mozkové tkáně použijeme pětinásobného přebytku. Po homogenizaci v mixéru rychle odstředíme vyloučené bílkoviny a kapalný podíl naneseme na kolonu, plněnou středně bazickým anexem (viz část 3.3.4 str. 30). Pro méně než 80ml extraktu použijeme kolonu, která má vnitřní průměr 2cm, plněnou 6ml ionexem. Stěny kolony se vymyjí 3 x 5ml 0,02N HCl, veškerá kapalina vycházející z kolony při nanášení vzorku a vyplachování kolony se jímá. Pro větší množství extraktu použijeme dvojnásobného množství měniče iontů a pro mozkové extrakty používáme kolonu průměru 7,5cm, plněnou ionexem do výše 2cm. Pro změněné množství ionexu přiměřeně upravíme i množství HCl pro výplach kolony. Eluát z kolony lyofilizujeme nebo vakuově odpaříme na objem asi 1ml. Objeví-li se sraženina, přidáme asi 4ml vody a několik mg Cellitu a suspenzi přefiltrujeme na filtru, promytém 1N HCl a vodou. Filtrát opět odpaříme. Koncentrát vymyjeme do 5ml odměrky tak aby objem nepřekročil 3ml. V této fázi lze vzorek uskladnit ve zmrazeném stavu přes noc. Následující den upravíme pH roztoku na 7 - 8 pomocí 1N NaOH (kontrola indikátorovým papírkem) a objemem destilovanou vodou na 5ml. Ze vzorku odebereme alikvot pro stanovení celkového obsahu volných a vázaných aminokyselin po hydrolýze (viz část 3.2.2 str. 26) a další 2ml alikvot smísíme s 0,5N siřičitanem sodným, který přidáme v poměru 0,2ml na každých 2,5g tkáně v alikvotu extraktu. Oba podíly vzorku nepodrobeného hydrolýze (s přidáním a bez přidání Na2SO3) ponecháme 4 hodiny při laboratorní teplotě. V podílu neobsahujícím siřičitan dojde k oxidaci cysteinu na cystin, zatím co v alikvotu s přídavkem siřičitanu přejdou obě formy glutathioninu na glutathion - S - sulfonát, eluovaný při automatické analýze před kyselinou asparágovou. Rovněž cystein na cystin v tomto podílu vzorku přejdou na příslušný - S - sulfonát, vycházející na počátku analýzy s mrtvým objemem kolony. Pro stanovení cystinu proto použijeme podíl bez přídavku Na2SO3. Konečnou fází přípravy vzorku je úprava pH 1M HCl na 2,2 tak, aby konečná koncentrace vzorku odpovídala (přibližně) 0,5g původní tkáně na 1ml.

INGOS s.r.o.

Strana 32

3

AAA400

Kapitola 3: PŘÍPRAVA VZORKŮ

3.4.3 Zdroje chyb Popsaný postup poskytuje snížené výtěžky citrulinu, homocitrulinu a tryptofanu a podle Saifera [15] rovněž bazických a sirných aminokyselin. K deproteinaci lze použít i jiných činidel, z nichž se pro mozkové extrakty nejlépe osvědčila kyselina chloristá, kterou lze jednoduše odstranit přidáním KOH a ochlazením roztoku [15]. Tkáňové extrakty někdy čistíme rovněž na katexu (viz část 3.6.2 str. 33), chceme-li získat čisté aminokyseliny.

3.5 Moè 3.5.1 Charakteristika materiálu Moč je z hlediska automatické analýzy aminokyselin velmi složitým materiálem. Převažujícími ninhydrinpozitivními složkami jsou močovina a čpavek, více než 50% aminokyselin v moči je přítomno v různých konjugovaných formách. Bílkoviny nejsou v normální moči přítomny.

3.5.2 Odbìr a zpracování vzorku moèi Vzorek předkládaný k analýze zpravidla představuje 24 hodinový sběr, který má být konzervován přídavkem několika ml toluenu a uchovávám v chladnici. Vícedenní skladování vzorku vyžaduje uložení v polyetylénové lahvi v mraznici. Před analýzou ohřejeme vzorek na laboratorní teplotu a zjistíme jeho celkový objem a specifickou hmotnost. Pokud z moči neodstraňujeme čpavek, je jedinou úpravou pro analýzu okyselení vzorku na pH 2 6M HCl. Jestliže rozlehlý pík čpavku znemožňuje stanovení sousedních látek, přidáme k 10ml moči v kádince po kapkách 2 - 4M NaOH až do dosažení pH 11,5 - 12. Reakci kontrolujeme indikátorovým papírkem. Kádinku s močí pak vložíme do exikátoru a evekuujeme vodní vývěvou 6 hodin. Poté moč z exikátoru vyjmeme, upravíme pH na 2,2 pomocí 6M HCl a objem adjustujeme pufrem o pH 2,2 [8]. Pro stanovení veškerých aminokyselin v moči včetně konjugovaných hydrolyzujeme 1ml alikvot moči se stejným objemem 12N HCl podle části 3.2.2 str. 26. Residuum po vakuovém odpaření rozpustíme ve 3ml pufru o pH 2,2, převedeme do 5ml odměrky a doplníme pufrem po značku.

3.6 Rostlinné extrakty 3.6.1 Charakteristika materiálu Rostlinné extrakty jsou z hlediska analýzy aminokyselin rovněž velmi složitým materiálem, neboť jsou výhradním zdrojem většiny z dosud známých několika set volných aminokyselin [16],[17]. Většina z těchto aminokyselin je však svým výskytem omezena na několik příbuzných rostlin a většina hospodářsky významných rostlin tyto vzácné aminokyseliny neobsahuje. Kromě aminokyselin však rostlinné extrakty mohou obsahovat i další ninhydrinpozitivní látky jako aminy, kyselé - glutamylové peptidy, rostlinná barviva a dusíkaté látky, reagující s ninhydrinem (např. redukující cukry). Příprava rostliných vzorků pro stanovení volných aminokyselin vyžaduje desintegraci rostlinných buněk, extrakci aminokyselin a případně odstranění rušivých složek extraktů.

3.6.2 Extrakce rostlinných vzorkù a úpravy extraktù INGOS s.r.o.

Strana 33

3

AAA400

Kapitola 3: PŘÍPRAVA VZORKŮ

Nejběžnějším extrakčním činidlem je etanol, který na aminokyseliny nepůsobí chemicky agresivně, lze jej snadno odpařit a za varu zároveň deproteinuje extrakt. 50g jemně pokrájeného vzorku či rozemletého suchého vzorku (rostlinných materiálů s nízkým obsahem vody a pevnými buněčnými stěnami rozetřeme vzorek v třecí misce s abrasivním materiálem, např. skleněnou drtí), doplníme 200ml vroucího alkoholu, jehož koncentrací upravíme horkou vodou podle obsahu vody ve vzorku tak, aby konečná koncentrace po smíšení se vzorkem byla 80% objemových. Směs vaříme 5 minut pod zpětným chladičem a necháváme vychladnout na laboratorní teplotu. Pak směs převedeme 80% alkoholu a směs homogenizujeme po dobu 20 minut. Poté necháme usadit pevnou fázi a kapalný podíl přidáme k supernatantu po odstředění. Extrakci v mixéru opakujeme ještě 3x s novými 100ml dávkami 80% alkoholu. Kombinované kapalné podíly necháme přes noc stát v lednici, druhý den je zfiltrujeme, filtr propláchneme 80% alkoholem a další zpracování volíme podle povahy vzorku. Materiály s vysokým obsahem volných aminokyselin, nebo s nízkým obsahem barviv (např. podzemní části) a vzorky, u nichž je nutno přesně stanovit obsah glutaminu a kyseliny glutamové, zpracováváme takto: Filtrovaný extrakt odpaříme při 50o C na rotačním vakuovém odpařováku na koncentraci asi 2,5 - 25g vzorku na ml roztoku (podle očekávaného obsahu aminokyselin). Koncentrát lze skladovat v lednici. Před analýzou odebereme z koncentrátu temperovaného na laboratorní teplotu 1 - 2ml, k nimž po převedení do odměrné baňky přidáme 0,5ml vnitřního standardu (norleucin v 10% isopropanolu, 10mol/ml) a 1ml 1,5M litno Citrátového pufru. Tento pufr připravíme podle návodu pro přípravu 0,3M litnocitrátového pufru o pH 2,2 použijeme však pětinásobné navážky . Roztok doplníme po značku destilovanou vodou a ponecháme stát 1 hodinu v chladnici. Pak roztok, je-li třeba, odstředíme a ihned použijeme k analýze. Vzorek po přidání pufru je nestálý - dochází k hydrolýze glutaminu vlivem nízkého pH. V takto připraveném vzorku se mohou při chromatografii kromě aminokyselin objevit i píky jiných látek, zmíněných v části 3.6.1 str. 33. Píky cukrů a rostlinných barviv jsou lokalizovány na chromatogramu v oblasti píku kyseliny cysteové. Vzorky obsahující zvýšené množství pigmentů nelze úspěšně koncentrovat ve vakuu bez vypadnutí pevné fáze. Kromě toho mohou tyto látky koagulovat v kapilárním reaktoru a způsobit nekvalitní zápis, případně ucpat reaktor. Téměř čisté směsi aminokyselin lze získat čištěním extraktu na měniči kationtů v H+ formě. Lze použít jakéhokoliv silně kyselého sulfonovaného polystyrenového katexu (Dowex 50W, Amberlite IT - 120, Kationit KV - 2, Bio Rad AG - 50W atp.). 100ml extraktu prolijeme kolonkou, obsahující 16ml ionexu ve formě H+ (na tuto formu ionex převedeme 2N HCl a propláchneme vodou do neutrální reakce). Po vsáknutí vzorku kolonku promyjeme 300ml destilované vody, kterou vymyjeme část rostlinných barviv, cukry a anorganické i organické kationty. Pak vymyjeme aminokyseliny (18) postupnou elucí 100ml 2M NH4OH a 100ml 4M NH4OH při průtokové rychlosti asi 5ml/min. Čpavek odstraníme odpařením na vakuovém rotačním odpařováku při 40o C. Suchý odparek rozpustíme ve 2,5ml 10% isopropanolu (je výhodné, obsahuje-li roztok vnitřní standard norleucin v koncentraci 1µmol/ml). Rozpuštěný odparek skladujeme v chladINGOS s.r.o.

Strana 34

3

AAA400

Kapitola 3: PŘÍPRAVA VZORKŮ

ničce. Hodinu před analýzou odebereme z roztoku vytemperovaného na laboratorní teplotu 2ml, přidáme 1ml 1,5M litnocitrátového pufru a doplníme destilovanou vodou po značku. Ponecháme vzorek 1 hodinu v chladničce. Před dávkováním do analyzátoru odstředíme případnou sraženinu.

3.6.3 Pøíprava vzorkù pro stanovení aminokyselin rostliny Při použití jiných extrakčních činidel než vroucího alkoholu přecházejí spolu s volnými aminokyselinami do roztoku ve větší či menší míře i rostlinné bílkoviny [18][19]. Pro správnou interpretaci výsledků je proto nutno dbát na oddělení nízko- a vysokomolekulárního podílu. Z extraktu se bílkoviny sráží sedminásobným přebytkem acetonu při stání při -200 C, nebo smíšením s 10% roztokem kyseliny trichloroctové v poměru 1:1. Sraženiny se po důkladném promytí suší a navažují k hydrolýze, při níž ke ztrátám přispívá přítomnost síranu, těžkých kovů a zbytku organických činidel.

3.6.4 Zdroje chyb Extrakce: Žádné extrakční činidlo neposkytuje zcela kvantitativní výtěžky. Pro zvýšení výtěžku je účinnější zvětšit počet opakování než zvětšit objem extraktantu. Použití kyselých extrakčních činidel obsahujících alkohol může vést za vyšších teplot k esterifikaci některých aminokyselin, nízké pH způsobuje hydrolýzu glutaminu. Dlouhodobé zahřívání vzorku při neutrální reakci (zejména přítomnosti fosfátu) působí cyklaci glutaminu na ninhydrinem nedetekovatelnou kyselinu pyrolidonkarbonovou. V přítomnosti bílkovin může dojít k vazbě sirných aminokyselin na bílkovinu nebo k proteolýze. Dělení na katexu: Působí 16 - 50% ztráty kyseliny glutámové cyklací. Může dojít i ke ztrátám jiných aminokyselin hydrolýzou, neúplným zadržením na koloně (kyselina asparágová), neúplnou elucí či vlivem bazické reakce. Ztráty si můžeme ověřit modelovým pokusem se standardní směsí aminokyselin a standardizujeme je pečlivým dodržováním konstantních časů jednotlivých operací. Místo čpavku, jehož přítomnost v odparku může rušit sousední píky, lze použít trimetylaminu [20]. Z katexu se mohou rovněž vymývat v něm obsažené ninhydrinpozitivní látky, vymývané při automatické analýze přibližně na místě čpavku.

3.7 Potraviny a krmiva 3.7.1 Charakteristika materiálu Jedná se o velmi různorodou skupinu vzorků rostlinného, živočišného event. mikrobielního původu. Pro stanovení nutriční hodnoty zpravidla stanovujeme celkový obsah volných i vázaných aminokyselin po hydrolýze vzorku. Pro posouzení vlivu technologie výroby a skladování je často účelné sledovat i obsah volných aminokyselin. Při technologickém zpracování se mohou ve vzorcích vytvářet ninhydrinpozitivní látky, jež se ve výchozím přírodním materiálu nevyskytují.

INGOS s.r.o.

Strana 35

3

AAA400

Kapitola 3: PŘÍPRAVA VZORKŮ

3.7.2 Pøíprava vzorkù pro stanovení volných aminokyselin Příprava vzorků je určována jeho původem. U vzorků živočišného původu postupujeme jako při přípravě vzorků pro stanovení volných aminokyselin v tkáňových extraktech (část 3.4 str. 31), u vzorků rostlinného původu postupujeme jako při přípravě rostliných extraktů (3.6 str. 33). Jsou-li vzorky v tekuté formě či ve formě zcela rozpustné ve vodě, deproteinujeme roztok kyselinou trichloroctovou (3.6.3 str. 35), vysrážené bílkoviny dokonale promyjeme vodou, vysušíme a použijeme pro přípravu hydrolyzátu (část 3.2 str. 26 a další 3.7.3 str. 36). Bylo-li do vzorku při technologickém zpracování vneseno větší množství cizorodých látek, můžeme vzorek přečistit na katexu (3.6.2 str. 33).

3.7.3 Hydrolýzy potravin a krmiv Metodika přípravy hydrolyzátů potravin a krmiv se liší od práce s čistými bílkovinami, neboť vzhledem k heterogenitě materiálu zpravidla pracujeme s velkými navážkami a upouštíme od evakuace vzorku, kterou nahražujeme dusíkovou atmosférou. Vzorky s vysokým obsahem tuků (olejniny) před hydrolýzou navažujeme zásadně suché, jemně mleté vzorky se známým obsahem dusíku. Postup při hydrolýze 6M HCl: 0,5 - 2,5g jemně mletého suchého vzorku odpovídající 0,04g N/0,25g dusíkatých látek (navážíme do 500ml trojhrdlé varné baňky, zalijeme 250ml 6M HCl, jedním z postraních ramen zavedeme kapilárou proud dusíku a hydrolyzujeme 24 hodin pod zpětným chladičem. Ochlazený hydrolyzát přefiltrujeme přes fritu S2. Hydrolyzační baňku a fritu promyjeme 0,1M HCl. Spojené filtráty a promývací vody kvantitativně převedeme do odměrky o objemu 500ml a doplníme destilovanou vodou po značku. Z roztoku odebereme 50ml alikvot, odpovídající 0,004g N, který odpaříme při 50o C ve vakuovém rotačním odpařováku do sirupovité konsistence. Odparek převedeme 0,2M sodnocitrátovým pufrem pH 2,2 do 50ml odměrky a doplníme. Alternativní provedení hydrolýzy: Pohodlnější než hydrolýza pod zpětným chladičem je použití speciálních ampulí . Navažujeme stejné množství vzorku, přidáme 150ml 6M HCl a obsah ampule probubláme pomocí kapiláry analyticky čistým N2 po dobu 10 minut (pěnění potlačuje 0,2ml kyseliny kaprylové) a zatavíme. Zatavené ampule stavíme ve vertikální poloze do termostatu vytemperovaného na 100  1o C na 22 hodin. Po dokonalém ochlazení nařízneme zúženou část ampule těsně pod zatavením, špičku odlomíme a obsah převedeme na fritu S2. Ampuli a fritu proplachujeme 0,1M HCl a dále postupujeme jako v předchozí metodě. Ampuli lze několikanásobně použít, pokud je její stopka alespoň 2cm dlouhá. Hydrolýzu lze značně urychlit vyšší teplotou a tlakem (použitím autoklávu). Podle literatury [2] jsou 4 hodiny při 145o C ekvivalentní 26 hodinám při 110o C.

3.7.4 Zdroje chyb Z literatury lze soudit, že u vzorků s vysokým obsahem nebílkovinných látek způsob hydrolýzy (reflux, hydrolýza v zatavené nádobě pod vakuem či pod dusíkem) významně neovlivňuje výsledky. Ztráty aminokyselin však mohou být významně ovlivňovány složením vzorku.

INGOS s.r.o.

Strana 36

3

AAA400

Kapitola 3: PŘÍPRAVA VZORKŮ

Analyzujeme-li sériově vzorky o podobném složení (např. obilniny), je vhodné u reprezentativního vzorku na základě několika časů hydrolýzy (viz. část 3.2.3 str. 27) zjistit ztráty labilních aminokyselin, stanovitelných po hydrolýze HCl (threoninu, serinu, tyrosinu). Pro ostatní sériové rozbory pak používáme jen jediného času hydrolýzy (obvykle 20 až 24 hodin) a ztráty korigujeme pomocí vypočtených korekčních faktorů [23]. Při interpretaci chromatogramu hydrolyzátu může činit obtíže přítomnost volných aminokyselin ve vzorku před hydrolýzou. Některé z těchto látek jsou při hydrolýze stabilní (kyselina -aminoadipová, kyselina -aminomáselná, ornithin a řada méně běžných rostlinných aminokyselin, labilní látky se mohou rozpadat na ninhydrinpozitivní rozkladné produkty. U vzorků s významným zastoupením volných aminokyselin lze proto doporučit nejprve provést analýzu hydrogenizovaného vzorku metodou pro volné aminokyseliny a teprve po zjištění spektra ninhydrinpozitivních látek použít pro seriové rozbory hydrolyzátové metodiky. Působení alkálií na vzorek před hydrolýzou se může projevit částečným přechodem argininu na ornithin a tvorbu lanthioninu z cystinu. Přítomnost cukrů podle většiny autorů nezvyšuje ztráty aminokyselin při hydrolýze. Některé rozkladné produkty cukrů se při automatické analýze eluují v oblasti za kyselinou cysteovou, další podíl sacharidů přechází do tzv. huminů, jež částečně odstraňujeme filtrací na fritě. Použití odbarvovacích prostředků pro odstranění tmavě zbarvených huminových látek nelze doporučit vzhledem k možnosti absorbce některých aminokyselin.

3.7.5 Pøíprava vzorkù pro stanovení sirných aminokyselin Pro stanovení sirných aminokyselin v krmivech a potravinách používáme zásadně oxidační metodiky (viz. část 3.2.4 str. 28), neboť zejména u vzorků rostlinného původu při hydrolýze HCl nelze zabránit ztrátám. Poznámky k metodice: Na navážku vzorku odpovídající 0,04g N použijeme 100ml oxidační směsi. Pěnění vzorku při odpařování potlačujeme přídavkem 0,2ml kyseliny kaprylové. Po odpaření kyseliny permravenčí hydrolyzujeme vzorky přímo v baňce, v níž byl vzorek oxidován, pod zpětným chladičem. Přívod dusíku není nutný. Hydrolýza v uzavřených ampulích se nedoporučuje, při nedokonalém odpaření oxidační směsi by mohlo dojít k explozi. Chybu při stanovení kyseliny cysteové může způsobit přítomnost železitého iontu, jež se eluuje na stejném místě chromatogramu. Lze jej však odstranit na katexu v H+ formě (3.6.2 str. 33). S kyselinou cysteovou se mohou rovněž smývat oxidační produkty jiných sirných aminokyselin, vyskytující se např. ve volné formě v některých rostlinách.

3.7.6 Pøíprava vzorkù potravin pro stanovení tryptofanu Vzhledem k přítomnosti cukrů používáme při stanovení vázaného tryptofanu v krmivech a potravinách zásadně bazické hydrolýzy (část 3.2.9 str. 29). Část vzorku jež se při hydrolýze nerozpustila, se odstraní odstředěním. Na sraženině se může absorbovat

INGOS s.r.o.

Strana 37

3

AAA400

Kapitola 3: PŘÍPRAVA VZORKŮ

část tryptofanu - údaj o 4% ztrátách [7] se doporučuje přezkoušet přídavkem známého množství tryptofanu event. analýzou neodstředěného vzorku.

3.8 Literatura

Uvádíme výběr prací souvisejících s přípravou vzorků s krátkými charakteristikami: 1. S.MOORE, W.H.STEIN: Methods Enzymol. 6, 1963, 819 Diskuze klasického způsobu kyselé hydrolýzy. 2. D.ROACH, C.W.GEHRKE: J. Chromatog. 52, 1970, 393 Přehled literatury o kyselé hydrolýze, zrychlení zvýšením teploty. 3. E.J.ROBEL, A.B.CRANE: Anal. Biochem. 49, 1972, 233 Korekce ztrát při hydrolýze - přehled literatury, popis nové metody. 4. F.SCHRAMM, S.MOORE, E.J.BIGWOOD: Biochem. J. 59, 1954, 33 Oxidace sirných aminokyselin kyselinou permravenčí. 5. S.MOORE: J. Biol. Chem. 238, 1963, 235 Zdokonalení oxidace. 6. H.MATSUBARA, R.M.SASAKI: Biochim. Biophys. Res. Commun. 35, 1969, 175 Ochrana tryptofanu při kyselé hydrolýze. 7. T.E.HUGLI, S.MOORE: J. Biol. Chem. 247, 1972, 3828 Bazické hydrolýzy bílkovin a automatické stanovení tryptofanu. 8. J.V.BENSON, J.A.PATTERSON: Anal. Biochem. 13, 1965, 365 Příprava vzorku moči. 9. T.L.PERRY, S.HANSEN: Clin. Chim. Acta 25, 1969, 53 Deproteinace plasmy kyselinou sulfosalicylovou, zdroje chyb. 10.B.J.BERRIDGE, W.R.CHAO, J.H.PETERS: Amer. J. Clin. Nutr. 24, 1971, 934 Příprava vzorků krve a moče. 11.J.M.PETERS, B.J.BERRIDGE: Chromatog. Rev. 12, 1970, 157 Přehledný referát o stanovení aminokyselin v krvi, moči. 12.W.H.STEIN, S.MOORE: J. Biol. Chem. 211, 1954, 915 Deproteinace krevní plasmy kyselinou pikrovou. 13.H.H.TALLAN, S.MOORE, W.H.STEIN: J. Biol. Chem. 211, 1954, 927 Příprava tkáňových extraktů kyselinou pikrovou. 14.J.E.KNIPPEL, D,A.CHRISTIANSEN, B.D.OWEN: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 92, 1969, 981 Srovnání kyseliny pikrové a sulfosalicylové při deproteinaci krve a tkáňových extraktů. 15.A.SEIFER: Anal. Biochem. 40, 1971, 412 Porovnání sedmi metod extrakce a deproteinace mozkových tkání. 16.L.FOWDEN: Progres. Phytochem. 2, 1970, 203 Přehledný referát o volných aminokyselinách v rostlinách. 17.R.M.ZACHARIAS, E.E.TALEY: Anal.Chem. 34, 1962, 1951 Ninhydrinpozitivní složky rostlinných extraktů. 18.S.T.NGUYEN, R.PAQUIN: J. Chromatog. 61, 1971, 349 Extrakce volných aminokyselin a bílkovin z rostlin, deproteinace, čištění na katexu. 19.V.P.KRIŠČENKO: Izvestia AN SSSR, ser. biol. No 3, 1978, 406 Komplexní metodika stanovení aminokyselin v různých frakcích dusíkatého komplexu rostlin. 20.E.WELTE, PRZEMECK, R.,M.C.NUH: Z. Pflanzenernahr. Bodenkunde 128, 1971, 243 Příprava vzorků pro analýzu volných aminokyselin v rostlinách. 20.VRÁTNÝ, P.J.OUHRABKOVÁ: J. Chromatog. 152, 1978, 214 příprava vzorků a automatická analýza rostlinných extraktů. 22.J.V.CAVINS, W.F.KWOLEK, E.E.INGLET, INGOS s.r.o.

Strana 38

3

AAA400

Kapitola 3: PŘÍPRAVA VZORKŮ

J.C.COWAN: J. Assoc. Off Anal.Chem. 55, 1972, 686 Vliv přípravy vzorku na reprodukovatelnost stanovení aminokyselin v soji. 23.R.TKACHUK, G.N.IRVINE: Cereal Chem. 46, 1969, 206 Stanovení aminokyselin v obilovinách a olejninách. 21.KREIENGRING, F.M.MEINL, J.EUNSCHE: Nahrung 16, 1972, 671 Optimalizace hydrolýzy krmiv. 22.SINNER, J.PULS: J. Chrom 156 (1978) 197-204 23.JOSIČ R.HOFERMAAS, Ch BAUER, W.REUTTER: J. Chrom. 317 (1984) 35-39 24.KENNTH MOPPER, E.NELVIN GINDLER: Analyt. biochem. 56, 1973, 440-442 25.TAKEHARU MASAKI: J. Chrom. 332 (1985) 275-282 26.JOHN O.BAKER, MICHAEL E.HIMMEL: J. Chrom. 357 (1986) 161-181 27.G.ALIQURESHI, A.GUTIERREZ, J.BERGSTR”OM: J. Chrom. 374 (1986) 363369 28.SVEND ERIK MOLLER, J.of Chrom.613,1993,223-230 29.BARRY N.JONES and JAMES P.GLLIGAN,J.of Chromatography 226,(1983) 471-482

INGOS s.r.o.

Strana 39

3

4. BIOGENNÍ AMINY Biogenní aminy vznikají většinou dekarboxylací aminokyselin (viz několik příkladů v kapitole 4.2). Mohou se dělit na monoaminy a polyaminy. Některé jsou zdraví prospěšné, jiné zdraví škodí a jsou důkazem počátku kažení potravin. Mezi nejznámější patří tyramin (vzniklý dekarboxylací tyrosinu) dopamin (3,4-dihydroxifenylalanin, odvozený od histidinu), serotomin (odvozený od 5-hydroxitryptofanu), putrescin (od ornithinu) cadaverin (od lysinu) a řada dalších. Vzhledem k tomu, že firma INGOS chce svým zákazníkm nabídnout další využití analyzátoru aminokyselin, bez náročných úprav, vypracovala metodiku stanovení nejdůležitějších biogenních aminů. Pro toto stanovení dodáváme veškeré potřebné chemikálie, včetně standardů pro kalibraci přístroje.

4.1 Základní biogenní aminy

Histamin Je biogenní amin, stimuluje sekreci žaludečních šťáv , rozšiuje krevní kapiláry a snižuje tlak. Zvyšuje permeabilitu buněčných membrán a způsobuje kontrakci hladkého svalstva trávícího traktu, dělohy a průdušek. Histamin je považován za tkáňový hormon. Serotomin Je živočišný hormon, biologicky aktivní látka, tzv. tkáňový hormon, vzniká hydrolyzací a následnou dekarboxylací tryptofanu. Tvoří se v mnoha živočišných i rostlinných tkáních a působí jako neurotransmiser v místech svého vzniku. Má např. vazkonstrikční účinky (uvolňuje se z krevních destiček při poranění, viz. vazkonstrikce), ve střevní sliznici povzbuzuje peristaltiku střevní, v CNS je jeho výlev spojen se stavy útlumu (spánek). Serotomin je prerkursorem hormonu melatoninu. Tyrosamin Je dekarboxylační produkt tyrosinu. Dopamin Transmiser na synapsích v centrálním nervovém systému. Nedostatek dopaminu vede ke vzniku parkinsonu. (viz katecholaminy). Putrescin Jedovatý organický amin, který vzniká mikrobiálním rozkladem bílkovin. Cadaverin Je zásaditá organická látka, která vzniká při enzymové dekarboxylaci lysinu.

4.2 Pøíklady vzniku biogenních aminù Vznik putrescinu:




 
 
  


 
 !"# 
 


  
 

 
  INGOS s.r.o.


  
  

 
    
  
  
  

 Strana 40

4

AAA400

Kapitola 4: BIOGENNÍ AMINY

Vznik tyraminu:





 




 

 





 
 


 

Vznik histaminu:





 







 




  

   

Vznik cadaverinu:


  
  






 





 







 
 


  

4


  
  
 
  !

4.3 Úprava AAA400 pro stanovení biogenních aminù Pro stanovení biogenních aminů je zbytečná předkolona, protože aminy jsou eluovány prakticky za aminokyselinami. Tzn. že musíme nejprve vytěsnit z kolony aminokyseliny a potom teprve rozdělit aminy. Předkolona slouží pouze pro pozdržení eluce amoniaku obsaženém v elučních roztocích, proto je zbytečná. 1. Odpojíme předkolonu od přístroje a uzaveřme ji uzávěrem, aby nám nevyschla. 2. Připojíme analytickou kolonu přímo na odvzdušňovací ventil místo předkolony. 3. Vyprázdníme analytickou kolonu, nebo použijeme prázdnou (novou) 4. Kolonu naplníme (běžným způsobem) ionexem Ostion LG ANB do výše 6 cm a dotáhneme horní uzávěr na kolonu. Výše ionexového sloupce se má pohybovat v rozmezí 5,5 až 7 cm Vyšší výška sloupce zlepší dělení některých aminů. Podle našich zkušeností je pro běžný provoz optimální výška sloupe 6cm. 5. Připravíme si pufry (eluční roztoky pro stanovení biogenních aminů) viz dále příprava el.roztoků. 6. Příprava detekčního činidla ninhydrinu je totožná s přípravou pro aminokyseliny. 7. Průtoky, teplota reaktoru a ostatní parametry zůstávají stejné.

4.4 Program pro stanovení biogenních aminù Čas 0.00 2.00 43.00 70.00 74.00

Teplota 60 60 60 60 60

INGOS s.r.o.

Pufr 1 1 2 2 6

Příkaz Poznámka I pufr 1 Z pufr 1 pufr 2 S pufr 2 0,2 M NaOH Strana 41

AAA400

79.00 83.00 89.00 94.00

Kapitola 4: BIOGENNÍ AMINY

60 60 60 60

1 1 1 1

D N

pufr pufr pufr pufr

1 1 1 1

4.5 Slo¾ení pufrù pro stanovení biogenních aminù

Ředící pufr je běžný Na pufr pH 2.2, který se používá na ředění standardů a vzorků pro analýzu hydrolyzátů. Jeho složení je totožné lze jej najít v technologické obrazovce AAA 400 pod F1. Pufr

1

2

Kyselina citronová Citronan sodný Chlorid sodný Chlorid draselný Bromid draselný Hydroxid draselný Isopropanol

1,05g 21,0g 5,0 g 41,65g 250,0ml

14,0g 171,5 g 10,0ml -

Konečný objem

1000 ml

1000 ml

4

Tab.5 Pufry pro biogenní aminy KOH (hydroxid draselný si připravíme rozpuštěním v H2 O, aby koncentrace na 1 ml byla 0,5g, Standardy pro toto stanovení se připravují buď v molární koncentraci běžné u aminokyselin, tzn. 2,5 mikromol na 1ml, nebo ve váhových množstvích v přesné koncentraci 50mg/ml. Firma INGOS připravuje standard v molové koncentraci, na přání zákazníka vyrobíme i jinou koncentraci. Vzhledem k vysokým pořizovacím nákladům na pevné (sypké) aminy nedoporučujeme zákazníkům, aby si připravovali tyto standardy. Standardy se přechovávají v chladničce za teploty +5o C. Jsou velice stálé, přibližně tak jako standardy aminokyselin. Standardy od naší firmy jsou stabilizovány.

4.6 Poznámky ke stanovení biogenních aminù

Příprava pufrů není náročná jak na pH, tak na koncentraci iontů. Postačí navážit na běžných pedvážkách a doplnit ve válci na předepsaný objem. Doporučujeme vzhledem k velké spotřebě pufru 1 nahradit v přístroji 1000ml lahev za 2000 ml a připravovat rovnou 2000 ml pufru 1. Pufr 2 vykazuje občas odskok nulové linie od základu, jelikož bývá vzhledem ke své koncentraci iontů lehce zbarven do žluta, což není na závadu, pouze se zvýší poněkud nulová linie. Nedoporučujeme touto metodou stanovovat tryptamin, vzhledem k jeho nízké odezvě. Lze jej stanovovat spolehlivě pouze při vyšší koncentrci ve vzorcích. Pokud budete mít potřebu tryptamin stanovovat, jeho pík vychází těsně za cadaverinem, naše firma vám připraví jeho standardní roztok ve vyšší koncentraci. INGOS s.r.o.

Strana 42

AAA400

Kapitola 4: BIOGENNÍ AMINY

Také agmatin má malou odezvu při běžných koncentracích, proto o něm platí totéž co o tryptaminu. Vychází v blízkosti sperminu. Nemáte-li potebu stanovovat spermin a spermidin, lze celé stanovení zkrátit přibližně o 40 min. Doporučujeme v tomto případě se obrátit na naše techniky, kteří s vámi tuto problematiku vyřeší. Firma vám též pomůže při zavádění tohoto programu, telefonicky, faxem a emailem bezplatně, nebo placenou službou přímo u vás na pracovišti.

4

INGOS s.r.o.

Strana 43

5.1 Stanovení volných aminokyselin Standard 25 nmol Náplň kolony: OSTION Lg FA Výška sloupce: 20-22 x 0.37 cm Teplota kolony: Viz program Pufry: 1: pH 2: pH 3: pH 4: pH 5: pH 6: 0.3

2.8 0.18 M Li+ 3.1 0.20 M Li+ 3.35 0.35 M Li+ 4.05 0.33 M Li+ 4.65 1.20 M Li+ M LiOH

Program: Čas Teplota 0.00 38.00 33.00 38.00 45.00 70.00 50.00 70.00 63.00 70.00 95.00 74.00 120.00 74.00 136.00 53.00 139.00 74.00 144.00 38.00 160.00 38.00

Pufr 2 3 3 4 5 5 6 5 1 1 1

VS - chlor phenyl alanin

INGOS s.r.o.

Strana 44

5.2 Analýza hydrolyzátu Standard 25 nmol Náplň kolony: OSTION Lg ANB Výška sloupce: 35 x 0.37 cm Teplota kolony: Viz program Pufry: 1: pH 2: pH 3: pH 4: 5: 6: 0.2

2.7 0.2 M Na+ 4.25 0.5 M Na+ 6.9 1.12 M Na+

M NaOH

Program: Čas Teplota 0.00 50.00 1.00 50.00 29.00 50.00 44.00 60.00 63.00 74.00 66.00 74.00 71.00 74.00 77.00 60.00 82.00 53.00 87.00 50.00 101.00 50.00

INGOS s.r.o.

Pufr 1 4 2 3 3 6 1 1 1 1 1

Strana 45

5.3 Analýza hydrolyzátu Hydrolyzát želatiny Náplň kolony: OSTION Lg ANB Výška sloupce: 35 x 0.37 cm Teplota kolony: Viz program Pufry: 1: pH 2: pH 3: pH 4: 5: 6: 0.2

2.7 0.2 M Na+ 4.25 0.5 M Na+ 6.9 1.12 M Na+

M NaOH

Program: Čas Teplota 0.00 50.00 1.00 50.00 29.00 50.00 44.00 60.00 63.00 74.00 66.00 74.00 71.00 74.00 77.00 60.00 82.00 53.00 87.00 50.00 101.00 50.00

INGOS s.r.o.

Pufr 1 4 2 3 3 6 1 1 1 1 1

Strana 46

5.4 Zkrácená analýza sirných aminokyselin Standard 25 nmol Náplň kolony: OSTION Lg ANB Výška sloupce: 35 x 0.37 cm Teplota kolony: Viz program Pufry: 1: pH 2.7 0.2 M Na+ 2: 3: 4: 5: 6: 0.2 M NaOH Program: Čas Teplota 0.00 60.00 3.00 60.00 8.00 60.00 25.00 60.00

INGOS s.r.o.

Pufr 1 6 1 1

Strana 47

5.5 Zkrácená analýza sirných aminokyselin Oxidativní hydrolyzát krmné směsi Náplň kolony: OSTION Lg ANB Výška sloupce: 35 x 0.37 cm Teplota kolony: Viz program Pufry: 1: pH 2.7 0.2 M Na+ 2: 3: 4: 5: 6: 0.2 M NaOH Program: Čas Teplota 0.00 60.00 3.00 60.00 8.00 60.00 25.00 60.00

INGOS s.r.o.

Pufr 1 6 1 1

Strana 48

5.6 Zrychlené stanovení TRP na zkrácené koloně Standard 25 nmol Náplň kolony: OSTION Lg ANB Výška sloupce: 10 x 0.37 cm Teplota kolony: Viz program Pufry: 1: pH 2: 3: pH 4: 5: 0.4 6: 0.2

2.7 0.2 M Na+ 6.9 1.12 M Na+ M Na+ M NaOH

Program: Čas Teplota 0.00 50.00 2.30 52.00 13.00 52.00 18.00 52.00 24.00 52.00 28.00 52.00

INGOS s.r.o.

Pufr 3 3 6 1 5 5

Strana 49

5.7 Zkrácené stanovení tyr, phe s použítím vnitřního standardu Standard 25 nmol Náplň kolony: OSTION Lg FA Výška sloupce: 20-22 x 0.37 cm Teplota kolony: Viz program Pufry: 1: pH 2: 3: pH 4: pH 5: 6: 0.3

2.8 0.18 M Li+ 3.35 0.35 M Li+ 4.05 0.33 M Li+ M LiOH

Program: Čas Teplota 0.00 60.00 12.00 70.00 13.00 70.00 18.00 70.00 21.00 60.00 30.00 60.00

Pufr 4 4 6 1 3 3

VS - chlor phenyl alanin

INGOS s.r.o.

Strana 50

5.8 Zkrácené stanovení thr, lys Standard 25 nmol Náplň kolony: OSTION Lg ANB Výška sloupce: 35 x 0.37 cm Teplota kolony: Viz program Pufry: 1: pH 2: pH 3: pH 4: pH 5: 6: 0.2

2.7 0.2 M Na+ 4.25 0.5 M Na+ 6.9 1.12 M Na+ 3.0 M NaOH

Program: Čas Teplota 0.00 53.00 4.00 60.00 8.00 60.00 20.00 68.00 22.00 68.00 24.00 68.00 36.00 60.00 41.00 53.00

INGOS s.r.o.

Pufr 4 2 3 3 6 4 4 4

Strana 51

5.9 Stanovení biogenních aminů Standard 25 nmol AMINOKYSELINY NEVYHODNOCUJÍ SE

Náplň kolony: OSTION Lg ANB Výška sloupce: 5.5-7 x 0.37 cm Teplota kolony: Viz program Pufry: 1: Viz tabulka 2: Viz tabulka 3: 4: 5: 6: 0.2 M NaOH Program: Čas Teplota 0.00 60.00 48.00 60.00 74.00 60.00 79.00 60.00 94.00 60.00

Pufr 1 2 6 1 1

Tabulka: Pufr Kyselina citronová Citronan sodný Chlorid sodný Chlorid draselný Bromid draselný Hydroxid draselný Isopropanol Konečný objem

INGOS s.r.o.

1 1,05g 21,0g 5,0 g 41,65g 250,0ml 1000 ml

2 14,0g 171,5 g 10,0ml 1000 ml

Strana 52

6. OBSAH 1. ÚVOD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1.1 Účel publikace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1.2 Základní chemická problematika aminokyselin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1.2.1 Aminokyseliny . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1.2.2 Výskyt aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 1.2.3 Historie analýzy aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1.2.4 Reakce ninhydrinu s aminokyselinami . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1.2.5 Detekce . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.3 Iontoměničová chromatografie aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.3.1 Stručná teorie iontoměničové chromatografie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.4 Iontoměniče . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 2. CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ KAPITOLA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 2.1 Ionexy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 2.1.1 Ionex pro předkolonu. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 2.1.2 Ostion LG ANB pro stanovení hydrolyzátů. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 2.1.3 Ostion LG FA pro stanovení volných aminokyselin. . . . . . . . . . . . . . . . . 15 2.1.4 Práce s ionexy. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 2.1.5 Cyklování ionexu - čištění. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.1.6 Plnění analytických kolon pro hydrolyzáty Na cyklus. . . . . . . . . . . . . . . 16 2.1.7 Plnění analytických kolon pro volné aminokyseliny Li cyklus. . . . . . . 17 2.1.8 Plnění předkolony. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 2.1.9 Vyprazdňování kolon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.2 Ninhydrinové činidlo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.2.1 Chemikálie potřebné pro přípravu ninhydrinového činidla: . . . . . . . . . 18 2.2.2 Ninhydrin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.2.3 2-methoxyethanol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.2.4 4 M acetátový tlumič. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.2.5 Hydrindantin dihydrát MW 358,31. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.2.6 Příprava ninhydrinového činidla. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.2.7 Bezpečnostní předpisy při práci s NHD činidlem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.3 Příprava sodno citrátových elučních roztoků. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.3.1 Seznam potřebných chemikálií: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.3.2 Postup při přípravě elučních roztoků (dále jen pufrů) . . . . . . . . . . . . . . 20 2.3.3 Vlastnosti Na pufrů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.3.4 Příprava ředícího roztoku pufru O.2 M Na, pH 2.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.3.5 Příprava regeneračního roztoku NaOH 0,2 M Na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 2.3.6 Bezpečnostní předpisy pro práci s Na pufry. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 2.4 Příprava lithno citrátových elučních roztoků. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 2.4.1 Seznam potřebných chemikálií . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 2.4.2 Příprava ředícího pufru 0,1 M Li, pH 2,2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 2.4.3 Příprava regeneračního roztoku LiOH 0,3 M Li . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 INGOS s.r.o.

Strana 53

6

AAA400

Kapitola 6: OBSAH

2.4.4 Příprava elučních roztoků a jejich výpočet podle tabulky. . . . . . . . . . . 2.4.5 Vlastnosti Li pufrů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.6 Poznámky k Li provozu z praxe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.7 Bezpečnostní předpisy pro práci s Li pufry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5 Příprava elučních roztoků pufrů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3. PŘÍPRAVA VZORKŮ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1 Úvod . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2 Bílkoviny a peptidy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.1 Charakteristika materiálu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.2 Hydrolýza kyselinou chlorovodíkovou [1] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.3 Zdroje chyb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.4 Příprava vzorku pro stanovení sirných aminokyselin [4] . . . . . . . . . . . . 3.2.5 Urychlené odpařování vzorků po hydrolýze oxidační i běžné . . . . . . . . 3.2.6 Příprava vzorků pro stanovení aminocukrů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.7 Příprava hydrolyzátů pro stanovení tryptofanu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.8 Kyselá hydrolýza [6] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.9 Bazická hydrolýza [7] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.10 Zdroje chyb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3 Krevní plazma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.1 Charakteristika materiálu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.2 Odběr a příprava plasmy pro deproteinaci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.3 Deproteinace kyselinou sulfosalicylovou . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.4 Deproteinace kyselinou pikrovou [10] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.5 Příprava vzorku plazmy pro stanovení tryptofanu . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.6 Stanovení veškerých nebílkoviných aminokyselin v plasmě . . . . . . . . . . 3.3.7 Zdroje chyb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4 Tkáňové extrakty . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.1 Charakteristika materiálu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.2 Příprava vzorku s použitím kyseliny pikrové [13] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.3 Zdroje chyb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5 Moč . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5.1 Charakteristika materiálu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5.2 Odběr a zpracování vzorku moči . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.6 Rostlinné extrakty . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.6.1 Charakteristika materiálu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.6.2 Extrakce rostlinných vzorků a úpravy extraktů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.6.3 Příprava vzorků pro stanovení aminokyselin rostliny . . . . . . . . . . . . . . . 3.6.4 Zdroje chyb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.7 Potraviny a krmiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.7.1 Charakteristika materiálu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.7.2 Příprava vzorků pro stanovení volných aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . 3.7.3 Hydrolýzy potravin a krmiv . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.7.4 Zdroje chyb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . INGOS s.r.o.

23 23 25 25 25 26 26 26 26 26 27 28 28 28 28 29 29 30 30 30 30 30 30 31 31 31 31 32 32 33 33 33 33 33 33 33 35 35 35 35 36 36 36

Strana 54

6

AAA400

Kapitola 6: OBSAH

3.7.5 Příprava vzorků pro stanovení sirných aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . 3.7.6 Příprava vzorků potravin pro stanovení tryptofanu . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.8 Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4. BIOGENNÍ AMINY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.1 Základní biogenní aminy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2 Příklady vzniku biogenních aminů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3 Úprava AAA400 pro stanovení biogenních aminů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4 Program pro stanovení biogenních aminů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5 Složení pufrů pro stanovení biogenních aminů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.6 Poznámky ke stanovení biogenních aminů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5. VZOROVÉ ANALÝZY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1 Stanovení volných aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2 Analýza hydrolyzátu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3 Analýza hydrolyzátu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.4 Zkrácená analýza sirných aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.5 Zkrácená analýza sirných aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.6 Zrychlené stanovení TRP na zkrácené koloně . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.7 Zkrácené stanovení tyr, phe s použítím vnitřního standardu . . . . . . . . . . . . . . 5.8 Zkrácené stanovení thr, lys . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.9 Stanovení biogenních aminů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6. OBSAH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1 Seznam obrázků a tabulek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

37 37 38 40 40 40 41 41 42 42 44 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 55

6.1 Seznam obrázkù a tabulek

Tab. Tab. Tab. Tab. Tab. Tab. Tab. Tab. Tab. Tab. Tab.

1. 1. 1. 1. 1. 1. 1. 2. 3. 4. 5.

Přehled aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Přehled aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Přehled aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Přehled aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Přehled aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 Přehled aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Přehled aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 Příprava ninhydrinu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 Na Pufry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 Li pufry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 Pufry pro biogenní aminy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

INGOS s.r.o.

Strana 55

6