Autoři: Dr. Dominika Wróbel, Mgr. Jan Malý, Ph.D

Šance pro mladé výzkumníky na Univerzitě J. E. Purkyně, CZ.1.07/2.3.00/30.0062

BIOANALYTICKÉ METODY

SOUBOR LABORATORNÍCH ÚLOH PRO PŘEDMĚT KBI/P320, KBI/N301 A KBI/N031

Autoři: Dr. Dominika Wróbel, Mgr. Jan Malý, Ph.D.

Katedra biologie PřF UJEP Září 2014

Tato publikace vnikla v rámci projektu „Šance pro mladé výzkumníky na Univerzity J. E. Purkyně“, reg. číslo CZ.1.07/2.3.00/30.0062 Text je určen pro praktickou výuku studentů PřF UJEP

1


Úloha 1. Homogenizace semen ječmene, precipitace jejich proteinů síranem amonným s následnou dialýzou, ultrafiltrací a odsolením na kolonce Sephadex. Nabobtnaná semena obilnin jsou vhodným zdrojem pro studium enzymů aktivních v raných fázích vývoje rostlin, zejména pro vysoké aktivity a snadnou finanční dostupnost. Nabobtnaný (nakllíčený) ječmen (slad) je výborným zdrojem amylas, enzymů významných v technologické praxi, především v lihovarnictví a pivovarnictví. Ve sladu jsou zastoupeny dva enzymy, které štěpí α(1-4) glykosidovou vazbu polysacharidů: α-amylasa (1,4-α-D-glukan-glukanonhydrolasa, EC 3.2.1.1) a β-amylasa (1,4-α-D-glukan-maltohydrolasa, EC 3.2.1.2). Jak napovídají systematické názvy, první enzym štěpí molekulu škrobu ve vnitřní části řetězce za vzniku dextrinu (glukanů), kdežto druhý odštěpuje disacharid maltosu z neredukujícího konce řetězce. Cílem úlohy je zvládnout základní techniky izolace, srážení, přečištění (odsolení) a kvantifikace proteinů ve vzorku. TEORIE Rozpustnost proteinu ve vodných roztocích závisí na jejich solvatačním obalu, tj. vrstvě molekul vody a iontů, které obalují jejich molekuly. Příčinou solvatačních obalů jsou elektrostatické síly mezi polárními strukturami proteinů a dipóly vody. Rozpustnost proteinů se s rostoucí koncentrací solí zpravidla nejprve zvyšuje (vsolovací efekt), prochází maximem a posléze klesá (vysolovací efekt). Vsolování je způsobeno vytvořením iontového oblaku kolem ionizovaných skupin biopolymerů – dochází ke snížení interakce nabitých skupin biopolymerů mezi sebou a zvýšení interakcí s rozpouštědlem. Dalším přídavkem neutrální soli se snižuje tloušťka solvatačního obalu a efektivní koncentrace vody, a tím se snižuje i rozpustnost proteinu. Charakter závislosti rozpustnosti na koncentraci soli je určen nejen typem biopolymeru, ale i typem soli a hodnotou pH. Nejnižší je rozpustnost v izoelektrickém bodě, tj. hodnota pH, při které má molekula biopolymeru neutrální náboj. Precipitovatelnost určitého proteinu z vodného roztoku je závislá na druhu použité soli, iontové síle, hodnotě pH, teplotě a koncentraci proteinů. Při vysolovacím efektu se uplatňuje daleko více povaha aniontu než kationtu. Dvojmocné a vícemocné anionty precipitují proteiny většinou mnohem účinněji než anionty jednomocné. Nejčastěji používanou solí pro vysolování biopolymerů je síran amonný. Jeho výhodou je značná rozpustnost (např. ve srovnání s Na2SO4), která je jen nepatrně závislá na teplotě, a malý denaturační vliv. Doporučuje se používat dostatečně čistý síran amonný bez obsahu kovových iontů, které by mohly interagovat s proteiny a katalyzovat některé oxidační reakce. Jiné soli se používají jen ve speciálních případech, např. síran hořečnatý k izolaci γ-globulinové frakce ze séra nebo chlorid sodný k precipitaci fibrinogenu. Díky své velké kapacitě a tlumivé schopnosti by byly fosforečnany ideálními srážedly, ale pro svou špatnou rozpustnost se v praxi používají jen velmi omezeně. Často používanou solí pro precipitaci některých enzymů je i chlorid manganatý. Vlastní precipitace se provádí tak, že se do roztoku biopolymerů sůl zpravidla přidává po malých dávkách v pevném stavu nebo jako nasycený vodný roztok za stálého míchání, aby nedošlo k lokálnímu přesycení. Vysolování probíhá při konstantní teplotě, chlazení není vždy nezbytné. Optimální koncentrační 2


rozsah pro frakcionaci daného proteinu je nutno najít empiricky. Po přidání takového množství síranu amonného, které odpovídá 30% množství potřebného ke vzniku nasyceného roztoku této soli (v praxi označováno jako 30% nasycení), se srážejí nukleové kyseliny a poměrně málo proteinů. Mezi 30 – 75% nasycení pak precipituje většina proteinů. V tomto rozmezí je třeba nasycení zvyšovat po poměrně malých dávkách. Po přidání příslušného množství soli se roztok biopolymeru míchá ještě asi 20 minut a precipitát se oddělí centrifugací. Pokud je daný biopolymer obsažen v precipitátu, lze po rozpuštění sraženiny získat jeho koncentrovaný roztok. Síran amonný se z roztoku oddělí většinou dialýzou, gelovou chromatografií nebo ultrafiltrací. MATERIÁL A CHEMIKÁLIE 50 g nabobtnalých ječmenných obilek, 0,1 M Tris/acetátový pufr, pH 7,6, pevný síran amonný, Nesslerovo činidlo na amonné ionty. Centrifuga, kyvety, třecí miska s tloučkem, elektromagnetická míchačka, míchadlo, dialyzační membrána, spona na dialyzační membránu, odměrné válce, ultrafiltrační zkumavky, předvážky, zkumavky, pipety, kádinky, lžička. POJMY Precipitát (sediment) - pevná, usazená část po centrifugaci Supernatant – čirá kapalina nad precipitátem Difuzát – kapalina procházející membránou při ultrafiltraci Retentát – roztok vysokomolekulárních látek neprocházející ultrafiltrační membránou a zůstávající v ultrafiltrační cele. POSTUP 1. a. b. c. d.

Připravte 1/2 litru 0,1M Tris/acetátového pufru o pH 7,6 Vypočtěte hmotnost Tris báze - tris(hydroxymetyl)aminomethan (Mr = 121,14), potřebné na přípravu 500 mL pufru o koncentraci 0,1 mol.L-1. Odvažte toto množství na předvážkách na jedno desetinné místo do 500 mL kádinky. Do kádinky přilijte asi 400 mL destilované vody, vložte elektromagnetické míchadlo a na elektromagnetické míchačce míchejte až do úplné homogenizace roztoku. Podle návodu nakalibrujte pH metr a poté upravte pH roztoku na hodnotu 7,6 pomocí koncentrované kyseliny octové. Přídavky kyseliny provádějte pomocí Pasteurovy pipety za stálého míchání roztoku.

1. Příprava extraktu a diferenciální centrifugace Odvažte 50 gramů nabobtnaných semen a třete na kaši v třecí misce s tloučkem za přídavku pufru (viz dále). Proteiny extrahujte 100 mL 0,1 M Tris/acetátového pufru, pH 7,6. Extrakt nechejte za občasného míchání stát 10 minut na ledu. Následně separujte extrakt použitím gázy do kádinky. Extrakt rozdělte do deseti kyvet (po 9 ml), které je třeba pečlivě vyvážit na předvážkách. Centrifugujte 20 minut při 5000g na velkém rotoru centrifugy Hettich. Supernatant opatrně přepipetujte do čisté kádinky a odměrným válcem změřte 3


objem (poznamenejte). 0.5 mililitru extraktu odeberte do mikrozkumavky a změřte v něm obsah proteinů metodou dle Bradfordové (viz dále – na závěr cvičení). Zjistěte potřebné množství síranu amonného pro 50% nasycení (na objem extraktu v kádince, 331 g/L), toto množství síranu amonného odvažte a důkladně rozetřete ve třecí misce. Do kádinky s extraktem vložte elektromagnetické míchadlo a kádinku umístěte do misky s ledem na elektromagnetickou míchačku. Po dobu 20 minut postupně k extraktu přidávejte odvážené množství síranu amonného, další přídavek vždy až po rozpuštění předešlého. Dokonale rozpuštěný extrakt se síranem amonným rozdělte do deseti kyvet a centrifugujte (5000g, 20 min). Supernatant odstraňte pipetou a precipitát rozpusťte v 10 mL 0,02 M Tris/acetátového pufru, pH 7,6, který připravíte naředěním 0,1 M pufru (do každé kyvety přidejte 1ml pufru). 2. a.

Dialýza, ultrafiltrace a odsolení na koloně Sephadex 2 mL rozpuštěného precipitátu napipetujte do předem namočené dialyzační membrány (Spectrapore, MW cut-off 15 kDa) a nechte dialyzovat přes noc proti 1 L dH2O v kádince. Po dialýze stanovte množství proteinů a amoniaku v roztoku (vzorek č.1 – na závěr cvičení)

b.

Ze zbylých 8 ml rozpuštěného precipitátu odeberte do mikrozkumavky 0,5 mL (vzorek č. 2), další 2ml pipetujte do centrifugační mikrofiltrační zkumavky (MW cut-off 20kDa) a proveďte filtraci dle návodu výrobce (20-30 min. centrifugace při 2000x g na centrifuze SIGMA). Po provedení 1. kola filtrace doplňte (vyřeďte) retentát na 2.5ml 0,02 M Tris/acetátovým pufrem, pH 7,6, a odeberte z roztoku 0,5 ml (vzorek č. 3). Proveďte druhé kolo filtrace. Po provedení druhého kola vyřeďte na výsledný objem 2 ml a stanovte obsah proteinů a amoniaku (vzorek č. 4).

c. 1. 2. 3. 4. 5.

Obr. 1 Princip fce kolonky (zdroj – manuál výrobce) Zbytek použijte pro odsolení na kolonce Sephadex. Postupujte podle návodu výrobce (Obr.2) Odstraňte spodní a horní víčko kolony a odlejte nadbytečnou kapalinu Kolonku umístěte na stojánek Zvolna nechte ekvilibrovat kolonu 25ml elučního pufru (0,02 M Tris/acetátovým pufr, pH 7,6) Napipetujte do kolonky 2,5ml vzorku a po projiti tohoto objemu kolonou filtrát odstraňte Proveďte vymytí proteinů z kolony 3,5ml elučního pufru a zachyťte odsolené proteiny, které prošly kolonou. Typický chromatogram je na Obr. 3. Změřte obsah proteinů a amoniaku ve vzorku (vzorek č. 5)

4


Obr.2 Způsob použití, typický chromatogram a charakteristiky odsolovacích kolon Sephadex (zdroj: manuál výrobce) 3.

Stanovení amonných iontů reakcí s Nesslerovým činidlem

Princip: Amonné ionty reaguji s Nesslerovým činidlem (tetrajodortuťnatan draselný) za vzniku červenohnědého produktu, který lze stanovit kolorimetricky s maximem absorpce při 436 nm. NH4+ + 2 HgI42- + 4 OH- → NH2I.Hg2O + 7 I- + 3 H2O Do mikrozkumavek napipetujte 1,5 mL destilované vody, přidejte 0,1 mL vzorku č. 1-5, dialyzační pufr z právě probíhající dialýzy (vz. č. 6), čerstvý dialyzační pufr jako blank (vz. č. 7) a nakonec 0,1 mL Nesslerova činidla do každé zkumavky, po 5 minutách porovnejte zabarvení v jednotlivých zkumavkách a změřte hodnotu absorbance při 436 nm na jednopaprskovém spektrofotometru Biomate. 4.

Změření koncentrace proteinů metodou dle Bradfordové

5


Barvivo Coomassie Brilliant blue G250 se váže na proteinové molekuly v kyselém pH dvěma způsoby. Trifenylmethanová skupina se váže na nepolární části proteinu a anion sulfoskupiny na bazické skupiny ve vedlejších řetězcích aminokyselin (arginin a lysin). Po vazbě barviva na proteiny dochází k barevné změně, která je úměrná množství proteinu. Reakce je velmi citlivá u albuminu a řady globulárních proteinů. Stanovení je však rušeno řadou interferujících látek, které jsou známy. Metoda je díky své jednoduchosti a citlivosti široce používána. Jako kalibrační protein se používá hovězí sérový albumin (BSA). Barevný produkt barviva s proteinem vykazuje absorpční maximum při 595 nm. Do pěti zkumavek napipetujte po 2 mL činidla Bradfordové. Do první přidejte 10 μL extraktu z ječmenných obilek, do druhé přidejte 10 μL vzorku po dialýze, do třetí 10 μL ze vzorku po filtraci a 10 μL ze vzorku po odsolení na koloně. Pátou zkumavku ponechte jako blank. Zkumavky promíchejte na vortexu (přístroj pro rychlé a účinné promíchání zkumavek) a nechejte 5 minut stát při laboratorní teplotě. Na spektrofotometru nastavte vlnovou délku 595 nm. Do kyvetového prostoru umístěte v kyvetě vzorek číslo 5 se samotným činidlem Bradfordové a přístroj vynulujte, poté postupně proměřte všechny čtyři připravené vzorky. Po každém vzorku kyvetu vypláchněte ethanolem, jelikož se barvivo Coomassie Brilliant blue váže na stěny skleněných i plastových kyvet. Hodnoty absorbance si zaznamenejte a z kalibrační křivky na BSA (dodá vedoucí cvičení) odečtěte obsah proteinů v daném vzorku. Množství proteinu pak přepočtěte na 1 mL vzorku. VYHODNOCENÍ 1) Popište a zhodnoťte purifikační proces. Srovnejte způsoby odsolení proteinů, které jste použili. Využijte výsledků reakce s Nesslerovým činidlem. Navrhněte alternativní kroky, které byste mohli použít pro homogenizaci, precipitaci a odsolení izolovaných proteinů. 2) Pomocí metody Bradfordové stanovte množství proteinů v 10 μL homogenátu (extrakt z obilek po centrifugaci), po dialýze, zahuštěného vzorku po odsolení v ultrafiltrační centrifugační zkumavce a po odsolení na koloně Sephadex. Ze získaných údajů vypočtěte množství proteinů (extrahovatelných) v jednom gramu obilek a procentuálně stanovte obsah proteinů, které vyizolujete z tohoto extraktu po 50% vysolení síranem amonným. Určete, která z metod je nejefektivnější (nejnižší obsah amoniaku, nejvyšší zadržení proteinu) Reference: Laboratorní protokol vznikl adaptací protokolu z publikace: Galuszka, P., Luhová, L.: LABORATORNÍ TECHNIKA PRO BIOCHEMIKY, Vydavatelství UP Olomouc, 2005.

6


Úloha 2. Sledování vzájemné interakce rekombinantního vazebného proteinu SI-SA-ABD a lidského sérového albuminu (HSA) pomocí elektroforézy Úvod Elektroforetické metody mohou být využity v řadě variant a aplikací, například k odhadu molekulové hmotnosti a zdokumentování přítomnosti určitých proteinů ve vzorku (denaturační SDS-PAGE elektroforéza). Velmi užitečnou a často využívanou variantou i je tzv. nativní elektroforéza, kde je elektroforéze podroben vzorek proteinů v nativní (tj. v přirozené, funkční) formě. V této variantě dochází k migraci nejen na základě velikosti proteinu (tj. molární hmotnosti), ale především na velikosti celkového náboje (určeného aminokyselinovým složením a izoelektrickým bodem proteinu) a případně i tvaru (fibrilární vs. globulární protein). Velmi často je tato varianta využívána pro vzájemné sledování interakcí biomolekul (protein-protein, protein-nukleová kyselina, nukleové kyseliny navzájem, interakce s nanočásticemi atp.). Vazbou těchto párů mezi sebou dochází k celkové změně vlastností migrujících částic a jejich rozdílné rychlosti migrace (pokud vůbec migrují) v gelu. Metodu je tedy možné využít i k průkazu těchto vazeb a zároveň sledovat např. stechiometrii či závislost na fyzikálně-chemických parametrech. Úkolem tohoto cvičení je prokázat vazbu mezi dvěma modelovými biologickými ligandy, lidským sérovým albuminem (HSA – human serum albumine) a „umělým“ tzv. rekombinantním vazebným proteinem produkovaným biotechnologickými postupy v bakteriích (SI-SA-ABD), který má schopnost specifické vazby k proteinu HSA. Chemikálie a roztoky a.

Roztoky pro přípravu vzorků do jamek

Roztok 1. Roztok 2. Roztok 3. Roztok 4. b.

HSA / MES pufr – 2 mg / ml, 50 mM, pH 6 (NaOH) (dodá vedoucí cvičení) SI-SA-ABD / PO43- pufr (3 mg / ml, 0,1 M, pH 7) (dodá vedoucí cvičení) glycerol / voda (50% v/v) (dodá vedoucí cvičení) MES pufr – 50 mM, pH 6 (NaOH) (připraví studenti, 150 ml pro celou skupinu, 220/1)

Roztoky pro přípravu PAGE gelu

POZOR- pracujte v rukavicích, akrylamid je toxická a karcinogenní látka! Roztok 5. Roztok 6. Roztok 7. Roztok 8. Roztok 9. c.

Akrylamid (2,5 g + 22,5 ml MES pufru (0,05 M, pH 6, 220/B3) N,N´-methylenbisakrylamid (66 mg + 2,5 ml H2O, 220/1) Amonium persulfate (APS) (NH4)2S2O8 (0,35 g + 1 ml H2O, 220/B3) Na2S2O3 – 0,1 g + 1 ml H2O (220/3) Tetramethylethylenediamine (TEMED) / H2O (1:9, lednice 222)

Roztoky pro elektroforézu a barvení gelu

Roztok 10.

Elektrodový pufr: MES pufr (0,1 M, pH 6) + 0,2% β-alanin (220/1, 1L pro celou skupinu)

7


Roztok 11. Roztok 12.

Coomassie Briliant Blue - 0,02% v EtOH / AcOH / H2O (50 %, 10 %, 40 % v/v) (500ml pro celou skupinu) Odbarvovací roztok - 10% EtOH, 10 % AcOH, 80 % voda (v/v/v) (500ml pro celou skupinu)

Postup 1.

Příprava gelu

Připravte očištěná a suchá skla (dle instrukcí vedoucího cvičení) pro nalití elektroforetického gelu. Pomocí odměrného válce odměřte 10ml roztoku 5 (akrylamid), nalejte do kádinky a postupně přidejte: AA … 10 ml (v kádince) MBAA … 200 ul (NH4)2S2O8 … 200 ul Na2S2O3 … 200 ul TEMED / H2O (1:9) … 50 ul Ihned po smísení jednotlivých roztoků naneste gel pipetou do formy, bez bublinek, naplňte po okraj. Po nalití gelu vložte do formy hřebínek a převrstvěte okraj skleněné formy roztokem gelu tak, aby došlo k zabránění průniku vzduchu do jamek (inhibice tuhnutí gelu – rozpad jamek). Nechte gel ztuhnout po dobu 1 hodiny. Po ztuhnutí gelu vyjměte z desek silikonové těsnění, nalejte do spodní vaničky 200ml pufru (roztok 10) a umístěte gel do vaničky tak, aby spodní strana gelu byla zcela v kontaktu s pufrem (bez bublinek!). Následně nalejte do horní části vaničky 150ml pufru (roztok 10), vyjměte opatrně hřebínek a zkontrolujte, zda jsou dobře vytvarované jamky. Do očíslovaných jamek následně naneste 5 µl vzorku (pomocí mikrodávkovače Hamilton). Po nanesení vzorku ihned připojte k elektroforetickému zdroji a podrobte elektroforéze po dobu 2 hodin při konstantním proudu I = 20 mA. 2.

Příprava vzorků k elektroforéze

Ze zásobních roztoků proteinů (roztoky 1 – HSA a 2 - SI-SA-ABD), glycerolu (roztok 3) a MES pufru (roztok 4) připravte do EP následující varianty roztoků pro elektroforézu: Jamka číslo

složky

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

Bromophenol blue HSA HSA HSA SI-SA-ABD SI-SA-ABD SI-SA-ABD HSA + SI-SA-ABD HSA + SI-SA-ABD HSA + SI-SA-ABD

R1 HSA (µl)

R2 SI-SA-ABD (µl)

10 (ul) 18 10 2 18 10 2 2 10 18

18 10 2 8

R3 50% glycerin (µl) 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40

R4 MES (µl)

32 40 48 32 40 48 30 30 30


Vzorky naneste do jamek dle bodu 1 a podrobte elektroforéze. 3.

Barvení a dokumentace gelu

Po proběhlé elektroforéze rozeberte gelovou formu (pracujte opět v rukavicích!) a gel umístěte do vaničky s barvícím roztokem (roztok 11). Nechte inkubovat přes noc. Druhý den vyjměte gel, vložte do odbarvovacího roztoku na 2h (roztok 12) a zdokumentujte gel pomocí transiluminátoru. Vyhodnocení výsledků Vyhodnoťte výsledky elektroforézy. Zaměřte se na identifikaci jednotlivých zón (bandů) na gelu. Je z výsledku možné určit, zda vazebný protein SI-SA-ABD má vazebnou afinitu k proteinu HSA? Na základě jaké další metody by bylo možné specifickou vazbu potvrdit?

Obr. 1. Modelový výsledek elektroforézy (pouze první tři jamky)

9


Úloha 3 Stanovení parametrů enzymové kinetiky alkalické fosfatázy (AP) Úvod Fosfatázy jsou enzymy, které katalyzují hydrolýzu esterů kyseliny fosforečné. Vyskytují se v buňkách a extracelulárních tekutinách široké skupiny organismů. Jedná se o rozsáhlou skupinu enzymů, které jsou členěny do čtyř typů dle typu substrátu a hydrolytické reakce, které katalyzují. Jednou ze skupin jsou tzv. fosfomonoesterázy, které hydrolyzují tzv. monoestery kyseliny fosforečné (např. glukóza-6-fosfát). Jedním z těchto enzymů je tzv. alkalická fosfatáza (AP), která má pH optimum cca 9.0 a je inhibována v přítomnosti chelatačních činidel, jako je EDTA (AP vyžaduje pro aktivitu přítomnost hořčíku). Cílem této úlohy je demonstrovat základní parametry enzymové kinetiky (počáteční rychlost enzymové reakce (ν0), Michaelisovu konstantu (Km), maximální rychlost enzymové reakce (Vmax)) a určit jejich závislost na reakčních podmínkách. Princip stanovení je založen na enzymatickém štěpení čirého substrátu, pnitrofenylfosfátu (p-NPP) za vzniku žlutého produktu, p-nitrofenolu, jehož produkce bude měřena spektrofotometricky jako změna absorbance při 400 nm. Rychlost změn (vznik produktu) je využit pro stanovení parametrů enzymové reakce a jejich závislosti na reakčních podmínkách.

Schéma 1.

Reakční schéma enzymové reakce katalyzované alkalickou fosfatázou

Chemikálie: Alkalická fosfatáza (AP), zásobní roztok 1 mg/ml (TRIS pH 8) vyřeďte 10krát – 100ul roztok AP + 890ul pufru (TRIS-HCl, pH 7.0 – pH 9.0) + 10ul 0, 5M MgCl2.6H2O Substrát pro fosfatázu, p-nitrophenyl-fosfát (p-NPP), roztok o koncentraci 1,35mM v reakčním pufru (220/1, 20ml pro 1 úlohu) Reakční pufr Tris-HCl pH 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0 ( 0.1M, 150ml pro celou skupinu),(220/1) Roztok MgCl2.6H2O 0.5 M v H2O (50 ml pro celou skupinu, 220/4) Roztok NaH2PO4.H2O 0.1 M (10 ml pro celou skupinu 220/1) v H2O Roztok p-nitrofenolu 1mM v reakčním pufru Tris-HCl (220/1)

10


Provedení: 1. Měření enzymové kinetiky – základní provedení Do EP zkumavky připravte reakční směs dle tabulky 1. Pipetujte vždy patřičný objem zásobního roztoku substrátu pro AP, dále reakční pufr (s pH a složením dle jednotlivých variant provedení) na celkový objem vzorku 2ml. Připravte kontrolní vzorek (č.7) s reakčním pufrem bez přídavku substrátu pro AP. Po přidání 20ul MgCl2.6H2O nebo 20µl roztoku NaH2PO4.H2O (viz úloha 2 a 3) pipetujte 100ul roztoku z každé zkumavky do jamky v mikrotitrační destičce v pořadí zkumavek 1-7 (poslední kontrola). Následně pipetujte pomocí mikropipety s rozsahem 0,5-10ul do každé jamky 10ul roztoku enzymu AP připravené v patřičném pufru. Roztok pipetujte v co nejkratším čase od jamky s nejnižší koncentrací substrátu pro AP až po nejvyšší koncentraci. Ihned po napipetování roztoku vložte do ELISA čtečky a měřte 5 minut v intervalu 30s při vlnové délce 400nm tvorbu produktu. Všechny hodnoty absorbance (resp. ∆A400/min) pro jednotlivé varianty zaznamenejte. Základní provedení experimentu je obdobné pro všechny varianty experimentu. Varianty se liší složením reakčního pufru. Varianta zkumavky

Zásobní roztok pro AP (ml) 1 0,8 2 0,4 3 0,24 4 0,16 5 0,12 6 0,08 Tabulka 1. Základní provedení experimentu

Reakční pufr (ml) 1,2 1,6 1,76 1,84 1,88 1,92

Výsledná koncentrace substrátu (mM) 0,54 0,27 0,162 0,108 0,081 0,054

2. Stanovení závislosti rychlosti enzymové reakce na pH Proveďte sadu měření dle tabulky 1. s využitím reakčních pufrů s rozdílným pH (7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0). Připravte do kyvety roztok dle tabulky a před přidáním enzymu AP do kyvety pipetujte 20µl roztoku MgCl2.6H2O, pak postupujte dle bodu 1. Získáte tak sadu měření, kde pro každý reakční pufr (pH) obdržíte celkem 6 křivek. Tyto data pak vyhodnotíte dle instrukcí v bodu 5. Z Lieneweaver-Burkova grafu pro jednotlivé varianty pH určete Michaelisovou konstantu Km a maximální rychlost enzymatické reakce Vmax. Určete optimální hodnotu pH pro aktivitu enzymu. 3. Stanovení inhibice AP kompetetivní inhibicí fosfátem Proveďte měření dle tabulky 1. v přítomnosti reakčního pufru Tris-HCl pH 9.0 s přídavkem 20µl roztoku MgCl2.6H2O a 20µl roztoku NaH2PO4.H2O. Inhibiční křivku budete po vyhodnocení dat srovnávat s křivkou bez přítomnosti fosfátu (ve stejném reakčním pufru) získanou v bodě 2. Z Lieneweaver-Burkova grafu pro jednotlivé varianty pH určete Michaelisovou konstantu Km a maximální rychlost enzymatické reakce Vmax a srovnejte s kontrolním vzorkem (bez fosfátu). Vyhodnoťte změny v přítomnosti/nepřítomnosti fosfátu. Jak je možné určit, že se jedná o kompetetivní inhibici? 4. Kalibrační křivka produktu Připravte roztok produktu enzymatické reakce, p-nitrofenolu ze zásobního roztoku ředěním dle tabulky (místo substrátu pro AP pipetujte p-nitrofenol). 100 ul z každé zkumavky pipetujte do jamek v mikrotitrační 11


destičce (pořadí 1-6) a změřte absorbanci při 400nm. Z hodnot absorbance a přepočtené koncentrace produktu v jamce vytvořte kalibrační křivku a spočítejte absorpční koeficient produktu (směrnice přímky), viz bod 5. 5. Vyhodnocení dat a. Pro každou variantu měření vytvořte graf změny absorbance v čase a z lineární části závislosti určete změnu absorbance za jednotku času (∆A400/min). (Obr.1) b. Hodnota ∆A400/min odpovídá nárůstu koncentrace produktu, p-nitrofenolu za minutu (∆c/min). c. Hodnotu ∆c/min (produktu) získáme z rovnice: ∆A400/min ∆c/min = -------------------- (mol/litr/min) ɛ A kde ɛ = ---------- (litr/mol/centimetr) c c … koncentrace produktu (z kalibrační křivky pro produkt) A .. absorbance (z kalibrační křivky pro produkt) ɛ … absorpční koeficient (z kalibrační křivky pro produkt) d. Určete tzv. počáteční rychlost enzymové reakce ν0 v jednotkách µmol/min: ν0 = ∆c/min × 0,12ml/1000 mol/min (převeďte na µmol/min) e. Stanovte kinetické parametry Vmax (maximální rychlost enzymatické reakce) a Km (Michaelisova konstanta) z tzv. dvojitého recipročního grafu (Lieneweaver-Burk), který získáte tak, že na osu x vynesete reciproční hodnotu koncentrace 1/[S] (S – koncentrace substrátu) a na osu y reciproční hodnotu ν0, tj. 1/ ν0 (viz Obr.2) pro každou experimentální variantu (křivky získané z tabulky 1.). Hodnotu Vmax zjistíte jako reciproční hodnotu průsečíku lineární aproximace bodů křivky s osou y (hodnota y = 1/Vmax). Michaelisova konstanta enzymové reakce je definována jako koncentrace substrátu, při které je počáteční rychlost enzymové reakce rovna polovině Vmax. Zjistíte ji jako reciprokou hodnotu průsečíku lineární aproximace křivky s osou x, tj. x = - 1/Km. Hodnoty Vmax a Km v jednotlivých variantách provedení pokusu navzájem porovnejte.

12


Obr.1. Lineární závislost tvorby produktu alkalickou fosfatázou ∆A 400/min

Obr.2. Lieneweaver-Burkův graf pro jednotlivé experimentální varianty (různé pH reakčního pufru)

Reference: Laboratorní protokol vznikl adaptací protokolu z publikace: Galuszka, P., Luhová, L.: LABORATORNÍ TECHNIKA PRO BIOCHEMIKY, Vydava telství UP Olomouc, 2005.

13


Úloha 4. Analýza hydrodynamického průměru a Zeta potenciálu suspense částic Teorie Zařízení Zetasizer Nano (výrobce Malvern) umožňuje stanovit některé vlastnosti částic v tekutém médiu jako je hydrodynamický průměr (Dh) a Zeta potenciál. Cílem této úlohy je analyzovat tyto parametry u dvou typů částic – hovězího sérového albuminu (BSA) a polystyrenových mikročástic. Hydrodynamický průměr částic je průměr sférické částice, která difunduje se stejnou rychlostí jako částice, která je měřena v roztoku. Zařízení Zetasizer Nano analyzuje velikost částic tak, že měří rychlost Brownova pohybu částic pomocí metody tzv. Dynamického rozptylu světla (DLS). Brownův pohyb je definován jako náhodný pohyb částic v kapalině způsobený srážkami částice s molekulami, které je obklopují. Větší částice projevují pomalejší Brownův pohyb, menší částice se naopak pohybují rychleji. Kinetickou analýzou rozptylu (DLS) monochromatického polarizovaného světla (laser) na těchto částicích v kapalině je pak možné získat informaci o rychlosti Brownova pohybu a na základě toho pak spočítat Dh částic. Zeta potenciál částice je definován jako elektrický potenciál (napětí) mezi povrchem částice a hraniční vrstvou molekul, které jsou unášeny společně s částicí v průběhu její difúze. Hodnota Zeta potenciálu, uváděná v mV má velmi zásadní dopad na chování částic v roztoku. Malé hodnoty Zeta potenciálu mohou způsobit agregaci částic. Pro stabilitu koloidních roztoků jsou tedy nezbytné vysoké (záporné či pozitivní) hodnoty Zeta potenciálu. Zeta potenciál je v přímém vztahu k elektroforetické migraci částic v externím elektrickém poli a rozhoduje o směru a rychlosti migrace částic (např. při elektroforéze). Stanovení Zeta potenciálu částic je tedy důležitou analytickou metodou umožňující charakterizovat stabilitu koloidního roztoku a chování částic v elektrickém poli. Zeta potenciál částice je měřen kombinací dvou technik – elektroforézy a tzv. Laserové dopplerovy velocitometrie. Tato metoda měří rychlost pohybu částic v elektrickém poli (elektroforéza) analýzou rozptylu monochromatického polarizovaného záření na těchto částicích (metodou tzv. Dopplerova posunu – změny frekvence rozptýleného záření na pohybujících se částicích). Ze získané rychlosti pohybu je možné získat informaci o Zeta potenciálu částice. Obr.1. Zeta potenciál částice (ζ) (zdroj: manuál výrobce Malvern)

14


Postup 1.

Analýza hydrodynamického průměru (Dh) koloidních částic

1.1 a.

Analýza hovězího albuminu (BSA) a polystyrenových mikročástic Naplňte plastovou kyvetku 1ml suspense polystyrenových mikročástic. Postupně proměřte rozdílné koncentrace suspense (0,1, 0,5 a 1% - dodá vedoucí cvičení). Po proměření každého vzorku kyvetku vypláchněte destilovanou vodou. Suspenzi mikročástic pipetujte zpět do eppendorfovy zkumavky (pozor na záměnu zkumavek!) Připravte koncentrační řadu BSA (0.1, 1, 10, 20 µM, 1ml od každé koncentrace) ředěním roztoku BSA o koncentraci 20µM (dodá vedoucí cvičení). Naplňte měřící celu 1 ml roztoku a proměřte hydrodynamický průměr částic. Po proměření každého vzorku kyvetku vypláchněte destilovanou vodou. Suspenzi mikročástic pipetujte zpět do eppendorfovy (EP) zkumavky (pozor na záměnu zkumavek!) Zaznamenejte všechny výpočty (ředění vzorků atp.) do protokolu. Zaznamenejte změřené hodnoty Dh prezentované v závislosti na intenzitě, objemu a počtu částic. Popište pozorované hodnoty Dh ve vztahu k typu částice. Popište případné změny velikosti částic na jejich koncentraci v roztoku, pokud byla pozorována.

b.

c.

1.2 a.

b.

2. a. b.

Analýza směsi částic Od vedoucího cvičení obdržíte dvě směsné suspense (1 – 0,1% polystyrenové mikročástice + 10 µM BSA, 2 – 1% polystyrenové mikročástice + 0,1 µM BSA). Pipetujte 1 ml směsi do měřící kyvetky a proměřte hodnoty velikosti částic (v závislosti na intenzitě, objemu a počtu částic). Po proměření každého vzorku kyvetku vypláchněte destilovanou vodou. Suspenzi mikročástic pipetujte zpět do EP zkumavky (pozor na záměnu zkumavek!) Vypočítejte objem 5% roztoku polystyrenových mikročástic, objem 20 µM BSA a objem pufru nutného pro vytvoření 1ml směsné suspense č. 1 (0,1% polystyrenové mikročástice + 10 µM BSA). Výpočet vložte do protokolu. Porovnejte velikosti částic získané z prezentace závislosti na intenzitě, objemu a počtu částic. Popište případné změny velikosti částic na jejich koncentraci v roztoku, pokud byla pozorována. Popište, zda je možné změřit Dh pro jednotlivé odlišné populace částic (BSA, polystyrenové mikročástice) v jednom měřícím kroku. Zeta potenciál polystyrenových mikročástic a BSA Analyzujte Zeta potenciál všech vzorků z úlohy 1.1 a 1.2. Kyvetku naplňte roztokem z EP dle postupu demonstrovaném vedoucím cvičení. Po změření vždy kyvetku vypláchněte destilovanou vodou. Do protokolu zaznamenejte hodnoty Zeta potenciálu pro všechny vzorky. Pozorované hodnoty se pokuste interpretovat. Jaké hodnoty jste obdrželi pro identické vzorky o různé koncentraci částic? Byl pozorován nějaký rozdíl? Jaké hodnoty byly pozorovány pro BSA a polystyrenové mikročástice? Pokud jsou rozdílné, z jakého důvodu? Pozorovali jste nějaké změny Zeta potenciálu ve směsi BSA a polystyrenových mikročástic? Pozorované změny se pokuste interpretovat.

15


Úloha 5. Úvod do spektrofluorimetrie molekul Teorie Cílem této úlohy je seznámit se se základními pojmy a postupy při studiu optických vlastností některých molekul (vč. biomolekul), tj. schopnosti absorpce a emise záření ve formě fluorescenčního záření. Luminiscence je emise záření z molekul, která vychází z existence tzv. excitovaných stavů, tj. stavů s vyšší hodnotou energie. Luminiscence je formálně členěna na tzv. fluorescenci a fosforescenci, v závislosti na povaze excitovaného stavu, ze kterých vychází. Procesy, ke kterým dochází při absorpci a emisi záření jsou často Obr 1. Jablonského diagram (převzato z Egelman a kol., znázorňovány tzv. Jablonského diagramem (Obr.1). Tento Comprehensive Biophysics, Academic press, 2014) diagram znázorňuje existenci energetických stavů molekul a možných přechodů mezi jednotlivými stavy, které jsou spojené se zářivými (emise) a nezářivými (vibrace) jevy. Tzv. základní stav, první a druhý excitovaný stav, ve kterých se molekuly mohou vyskytovat je označen jako S0, S1 a S2. Každý z těchto energetických stavů může být dále rozčleněn na vibrační energetické stavy (hladiny) označené jako 0,1,2, atd. Takto prezentovaný diagram nezahrnuje řadu molekulárních interakcí jako je tzv. zhášení fluorescence, transfer energie (např. fotooxidace) či interakce se solventem. Přechod mezi jednotlivými energetickými hladinami, který je spojen s absorpcí či emisí fotonu je vyznačen vertikálními barevnými šipkami. Absorpce a emise záření zpravidla vychází z molekul, které se nachází na nejnižší vibrační energetické hladině v jednotlivých stavech S0 a S1. Během excitace dochází vybuzení molekuly ze stavu S0 na hladinu S1 nebo S2 zpravidla do vyšších vibračních hladin v jednotlivých energetických stavech. Většina molekul velmi rychle přechází neradiačním přechodem do stavu S1 s nejnižší vibrační energetickou hladinou. Z této hladiny přechází molekula do základní hladiny S0 zpravidla s vyšší vibrační energetickou hladinou vyzářením fluorescence. Fluorescenční záření je vyzářeno v případě, kdy se při excitaci nemění spin elektronu, který je tzv. spárován s elektronem Obr. 2. Absorpční a emisní spektrum (převzato s opačným spinem v základní energetické hladině z Egelman a kol., Comprehensive Biophysics, (singletový stav). Emise fluorescence probíhá Academic press, 2014) 16


v čase cca 10ns po excitaci. Fluoreskující látky jsou velmi často molekuly obsahující tzv. aromatické jádro. Tzv. fluorescenční (resp. emisní) spektrum je zpravidla zrcadlově symetrické k absorpčnímu spektru (Obr. 2). Emisní maximum fluorescence je vždy posunuto k delším vlnovým délkám vzhledem k absorpčnímu maximu. Tento jev je označován jako tzv. Stokesův posun. Základní vlastností fluorescence je, že tvar emisního spektra je nezávislý na excitační vlnové délce. Molekuly excitované do S1 stavu mohou podléhat tzv. spinové konverzi, při které se změní spin excitovaného elektronu. Vzniká tzv. tripletový stav T1. Emise záření z T1 stavu je označována jako fosforescence a je zpravidla posunuta k delším vlnovým délkám (menší energie) než fluorescence. Fosforescence probíhá také v podstatně delších časech než fluorescence. Intenzita fluorescence může být ovlivněna řadou podmínek. Velmi často dochází ke snížení intenzity emise procesem tzv. zhášení fluorescence (např. vysoká koncentrace fluoroforů, přítomnosti jiných molekul v roztoku atd.). Interakcí záření a molekul může docházet k rozptylu záření. Tzv. Rayleightův (elastický) rozptyl je zdrojem fotonů, které mají stejnou frekvenci jako dopadající záření a šíří se do všech směrů se stejnou pravděpodobností. Naproti tomu tzv. Ramanův rozptyl je tzv. neelastický rozptyl, při kterém se část energie odraženého fotonu ztrácí (Stokesův posun), či naopak energii od molekul získává (anti -Stokesův posun). Tento energetický rozdíl je dán přechodem molekuly mezi vibračními stavy v hladině S0. Molekuly vody jsou schopné kromě tzv. elastického rozptylu podléhat i Ramanovu rozptylu, při kterém je monitorován posun frekvence (vlnové délky) dopadajícího záření, pozorovatelný jako zdánlivé emisní maximum. Ve skutečnosti se nejedná o fluorescenci v pravém slova smyslu. Intenzita Ramanova rozptylu je obecně velmi nízká oproti rozptylu elastickému. Ramanův rozptyl vody slouží velmi často ke kontrole správného nastavení (kalibraci) spektrofluorimetru a zjištění jeho citlivosti. Chemikálie a roztoky - destilovaná voda z místnosti 220 - destilovaná voda přečištěná systémem MiliQ (vysoká čistota) - voda z vodovodního řadu - 10 mM Hepes pufr s150 mM NaCl - 130 mM 5(6)-karboxyfluorescein Postup 1.

Analýza ramanova spektra vody

Nastavení parametrů pro změření ramanova spektra vody: Ex = 350 nm; štěrbina (slit) = 5 nm Em = 370-450; štěrbina (slit) = 5 nm Ramanovo spektrum vody bude změřeno pro 4 vzorky: - destilovanou vodu z místnosti 220 - destilovanou vodu přečištěnou systémem MiliQ (vysoká čistota) - vodu z vodovodního řadu - 10 mM Hepes pufru s 150 mM NaCl Pipetujte 1,5 ml vzorku do křemenné kyvety (obyčejné sklo a plastové kyvety fluoreskují v UV oblasti). Očistěte povrch kyvety od případných kapek roztoku a nečistot jemnou buničinou a vložte do držáku kyvety ve spektrofluorimetru. Uzavřete vzorkový prostor víkem a v program FluorEssence klikněte na 17


ikonu Experiment Menu, následně Spectra and Emission. Použijte přednastavené parametry měření a klikněte na ikonu Run button čímž zahájíte měření. Otevře se tím okno s aktuálním záznamem měření. Maximum ramanova rozptylu vody by mělo být lokalizováno v oblasti 397 nm. Na konci tohoto měření byste měli získat 4 nezávislé emisní křivky ramanova rozptylu pro každý z připravených vzorků . Vložte všechny grafy do jednoho grafu v protokolu a označte, o který se vzorek se jedná. 2.

Analýza pozice excitačního maxima ramanova spektra vody

Opakujte měření z předchozí úlohy pro každý vzorek stejným postupem s odlišným nastavením excitační vlnové délky (Ex = 340 nm, Ex = 350 nm, Ex = 360 nm, slit = 5nm). Rozsah emisních vlnových délek nastavených v parametrech měření je pro všechna měření stejný (Em = 370-450 nm; slit = 5 nm). Výsledkem budou 3 ramanova spektra pro každý vzorek získaná excitací při různé vlnové délce (jiné excitační maximum). Tyto tři spektra pro každý vzorek vložte do jednoho grafu a označte, o které podmínky excitace se jedná. 3.

Změření absorpčního a emisního spektra fluoreskující molekuly 5(6)-karboxyfluoresceinu

Ze zásobního roztoku 5(6)-karboxyfluoresceinu o koncentraci 130 mM připravte 1ml 1,3 mM roztoku a dále nařeďte do 5 ml na výslednou koncentraci 1µM. Jako solvent použijte destilovanou vodu. Pipetujte 1,5 ml 1 µM roztoku 5(6)-karboxyfluoresceinu do křemenné kyvety. Očistěte povrch kyvety od případných kapek roztoku a nečistot jemnou buničinou a vložte do držáku kyvety ve spektrofluorimetru. Uzavřete vzorkový prostor víkem a v program FluorEssence klikněte na ikonu Experiment Menu, následně Spectra and Emission. Použijte přednastavené parametry měření (Ex = 300 nm; slit = 1 nm; Em = 320-600; slit = 1 nm) a klikněte na ikonu Run button čímž zahájíte měření. Otevře se okno s aktuálním záznamem měření. Obdržíte emisní spektrum 5(6)-karboxyfluoresceinu (spektrum 1). Určete maximum emise záření (nm). V software FluorEssence zvolte ikonu Experiment Menu, pak Spectra a Exitation. Použijte nastavení parametrů (Ex = 200-500 nm; slit = 1 nm; Em = vložte maximum emise, které jste obdrželi ve spektru 1; slit = 1 nm) a klikněte na Run button. Změřením získáte absorpční spektrum (spektrum 2) 5(6)-karboxyfluoresceinu a odečtěte excitační maximum (vlnové délka excitace poskytující nejvyšší intenzitu emise). Nyní změřte opět emisní spektrum molekuly 5(6)-karboxyfluoresceinu. V programu FluorEssence klikněte na ikonu Experiment Menu, následně Spectra a Emission. Použijte přednastavené parametry měření (Ex = vložte hodnotu změřeného excitačního maxima z předchozího kroku (spectrum 2); slit = 1 nm; Em = vložte hodnotu změřeného excitačního maxima z předchozího kroku (spektrum 2) + 10 nm až 600 nm; slit = 1 nm) a klikněte na ikonu Run button čímž zahájíte měření. Získáte emisní spektrum 5(6)-karboxyfluoresceinu v roztoku s maximální možnou intenzitou emise. Vložte všechna spektra do jednoho grafu. 4.

Vliv koncentrace fluoreskujících molekul na zhášení fluorescence

Připravte koncentrační řadu 5(6)-karboxyfluoresceinu ředěním zásobních roztoků (1 µM, 1.3 mM) dle následujícího postupu (solvent destilovaná voda):  

Z 5 ml roztoku 1 µM (zásobní roztok) 2 ml roztoku 100 nM a 2 ml roztoku 500 nM Z 1.3 mM roztoku  2 ml roztoku 1.5 µM

Výsledkem jsou následující roztoky, které budete proměřovat:  2 ml o koncentraci 100 nM  2 ml o koncentraci 500 nM 18


 

2 ml o koncentraci 1 µM 2 ml o koncentraci 1.5 µM

Pipetujte 1,5 ml 5(6)-karboxyfluoresceinu do křemenné kyvety. Jako první pipetujte vzorek o nejnižší koncentraci 5(6)-karboxyfluoresceinu a následně vzorky s koncentrací vyšší. Očistěte povrch kyvety od případných kapek roztoku a nečistot jemnou buničinou a vložte do držáku kyvety ve spektrofluorimetru. Uzavřete vzorkový prostor víkem a v program FluorEssence klikněte na ikonu Experiment Menu, následně Spectra and Emission. Použijte přednastavené parametry měření (Ex = 492 nm; slit = 1 nm; Em = 496-600; slit = 1 nm) a klikněte na ikonu Run button, čímž zahájíte měření. Otevře se tím okno s aktuálním záznamem měření. Opakujte postupně pro všechny koncentrace vzorku. Na konci každého měření po odpipetování vzorku z kyvety se pokuste maximálně kyvetu vysušit, napipetujt e 1,5 ml 130 mM 5(6)-karboxyfluoresceinu (zásobní roztok s nejvyšší koncentrací) a rovněž proměřte emisní spektrum. Výsledkem bude 5 emisních křivek pro různé koncentrace vzorku. Vložte všechny křivky do jedné a označte, o který vzorek se jedná. 5.

Závislost intensity emise na vlnové délce excitace

Pipetujte 1,5 ml 5(6)-karboxyfluoresceinu o koncentraci 1 µM do křemenné kyvety. Očistěte povrch kyvety od případných kapek roztoku a nečistot jemnou buničinou a vložte do držáku kyvety ve spektrofluorimetru. Uzavřete vzorkový prostor víkem a v program FluorEssence klikněte na ikonu Experiment Menu, následně Spectra and Emission. Použijte přednastavené parametry měření (Ex = 400 nm; slit = 1 nm; Em = 496-600; slit = 1 nm) a klikněte na ikonu Run button, čímž zahájíte měření. Otevře se tím okno s aktuálním záznamem měření. Opakujte měření s identickým vzorkem postupně pro excitační vlnové délky 420 nm, 440 nm, 460 nm, 480 nm and 492 nm, při zachování rozpětí měřeného emisního spektra. Výsledkem měření bude 6 emisních spekter. Vložte všechna spektra do jednoho grafu a označte, o jakou excitační vlnovou délku se jedná.

19

Autoři: Dr. Dominika Wróbel, Mgr. Jan Malý, Ph.D

Recommend Documents