SZERVES SAVAK Elsődleges anyagcseretermékek, az energiatermeléshez vagy a növekedéshez kötött bioszintézis. Minden nagy rendszertani egységben (baktériumok, élesztők, fonalas gombák) vannak termelők. Általában hiányos anyagcserét jelez a savtermelés – az oxidáció nem megy végig szén-dioxidig és vízig. Anaeroboknál nem az oxidáció hiányos, hanem speciális, kis energianyereségű reakciók fordulnak elő (homofermentatívak, homoacetogének). Általában létezik más, nem fermentációs gyártási technológia is, az eljárások versenyeznek a piacon.
CITROMSAV H2C- COOH │ HO-C-COOH │ H2C-COOH Tulajdonság: kellemes íz, nagy pufferkapacitás. Komplexképző, biológiailag bontható. Nem korrozív de elég erős sav. Termelés:
1929 1953 1976 1980 2007
5 000 t/év 50 000 t/év 200 000 t/év 350 000 t/év 1 600 000 t/év
Felhasználás: Élelmiszeripar: üdítők, borok, lekvár, édességek, stabilizátor, (íz, szín, vitamin)…. Gyógyszeripar: Ca bevitel (angolkór), Na-só (véralvadás gátló), kozmetikum (tartósítószer.) Műanyagipar: citromsav észterek: lágyítók (vinil és cellulózgyantákhoz) Fémipar: felület tisztítás, rozsdamentesítés, galvánadalék Detergens: polifoszfát helyett (amit az USA-ban be is tiltottak) TÖRTÉNET: 1784 1913 1917 1918 1928
60 % 10 % 25 %
SCHELE izomból izolálja 1923-ig citrusból termelik ZAHORSKY citromsav termelő törzset szabadalmaztat CURRIE: felületi eljárás, cukor, 2 pH, Hozam: 60 % Első CS üzem Belgium, aztán: Pfizer (USA), Sturge (Anglia) Felületi üzem Kaznejov, melasz. LEOPOLD: K-ferrocianid alkalmazása + 20 % 1950 Perquin, Kluyver Lab., Szűcs (P-limitáció feloldása) SZUBMERZ! + 80 % 1960 Gyártás n-paraffinon: Candida lipolytica (Szardínia)
TERMELŐ CÉGEK: USA: Pfizer, MILES LAB ANGLIA: STURGE Ltd. BELGIUM: Citrique BELGE (HOFFHANN La ROCHE) NSZK: BENCKISER, BOEHRINGER
AUSZTRIA: JUNGBUNZLAUER (Röhr prof.) KÍNA, Olaszország, Spanyolország, Törökország, Lengyelország, Jugoszlávia TÖRZSEK:
Asp.niger, Asp. wentii, Pen. citrinum, C. lipolytica (n-paraffinon), C. guillermondii, Trichoderma viride (cellulózon, Kyowa Hakko) Screenelés: pH indikátor; specifikus: EHRLICH reagens (p-dimetil-amino-benzaldehid.) 1,4 pH-jú oldatban is növekednek, ill. 20 %-os citromsavat is tolerálják. Wix: a jó CS termelő spórái: feketék, sötétek Törzseltartás: aktív szén + konídium-szárítás
BIOSZINTÉZIS: 1) Citrát szintetáz aktivitás legyen nagy (10x) 2) Akonitáz és 3) Izocitrát dehidrogenáz aktivitás legyen kicsi A citromsav felhalmozódása miatt nincs oxálacetát képződés, ez az anaplerotikus anyagcsereutakon át történik: 4) piruvát karboxiláz (akonitáz) Fe++ !kofaktor! 4)
Piruvát + CO2 + ATP
oxál-acetát + Pi + ADP
Mg,K
5) PEP karboxikináz 5)
PEP + CO2 + ADP
oxál-acetát + ATP
Mg,K Mn, NH4+
A citromsav gátolja (glikolízis reguláció) a 6) Foszfo-fruktokinázt, de a kevés Pi és az NH4+ többlet kompenzálja ezt. Oxigén hiány: irreverzibilis inaktiválódás (ecetsavnál is!), de csak a citromsavképzés károsodik, a micélium-képződés (növekedés) nem! SZUBSZTRÁTOK: szacharózon hozam 123 % (móltömegekkel: 2*192/342) de ez elmélet; a sejttömeg képződés miatt max. 92 % Szénhidrátok: glükóz, fruktóz, szacharóz (ill. keményítő, melasz, hulladék szénhidrát) n-alkánok: C9 –C30; Jó konverzió (145 %, g citromsav/g paraffin), de: izocitromsav is képződik + drága a szubsztrát. félelem: karcinogenitás (Szardínián bezárták az üzemet) Alkoholok: etilalkohol, metilalkohol: gyenge konverzió, drága
FERMENTÁCIÓ 1. TÁPOLDAT:
C-forrás: lásd fent N-forrás: NH4+ (vagy NO3-). NH4+ jobb: lásd bioszintézis.
2
Savanyodik a közeg: jó a citromsav képződésnek (kezdetben!) pigment és nyálkaképződés nincs: feldolgozás könnyebb P felesleg: kedvez a citromsav és oxálsav képződésnek (Szűcs) Nyomelemek: Fe és Zn limit kell a citromsav képződéshez. Ha kevés: lassú növekedés és cukorfelhasználás. Optimális: 50 – 100 µg Fe/l. A vas az akonitáz kofaktora! Befolyásolja a pelletképződést is MeOH a fémhatásokat kompenzálja Cu adagolás: a Fe hatását kompenzálja K-ferrocianid v. ioncsere: Fe-eltávolítás Mn > 20 µg/l felett a citromsavképződés drasztikusan csökken Ha nincs pufferolva a közeg, a pH gyorsan 3 alá megy - melaszban viszont pufferol (nagyobb glükonsav képződés) - pH=3 alatt az extracelluláris glükóz-oxidáz inaktiválódik, ezért csak citromsav! Savanyítás H2SO4-gyel. 2. FERMENTÁCIÓS PARAMÉTEREK oldott oxigén: ha alacsony, csökken a citromsav termelés; O2 dúsítás! + sejtkárosodás! Pellet!! pH: a melléktermékek képződését – fertőzési kockázatot befolyásolja. Optimális pH=1.5 – 2.8 ! pH < 3 csak citromsav-képződés. pH = 6 felett oxálsav képződés pH > 3 oxál- és glükonsav képződés is Hőmérséklet: Optimális = 28 – 33 oC t > 33 oC oxálsav képződés t < 28 oC a citromsav képződési sebesség csökken 3. FELÜLETI TENYÉSZTÉS, FERMENTÁCIÓ (MÁLEK-FENCL.) „Kaznejov” Zárt kamrák: mosható, dezinficiálható (HCHO, gőz …) Állványokon tálcák: (4 x 2,5 x 0,15 m) kb: 400-1200 l tápoldat. alumínium, rozsdamentes! Tápoldat: higított melasz (cukor: 15-20 %) + tápanyagok + pH=6 – 6,5 (H3PO4) - melasz minőség szerint: próbafermentáció. - a melaszt ioncserélik, ezzel eltávolítják a Fe, Mn, Zn ionokat (ezek feleslege: a növekedést fokozza és a citromsav képződést csökkenti. - optimális Fe koncentráció.: 10-100 mg/l K-ferrocianid (komplexben megköti a vasat, állandó koncentrációt biztosít Inokulum: Konidium szuszpenzióval (100-150 mg/m2) Fermentáció: steril levegőbefúvás: nedvesség, hőmérséklet-tartás, O2 bevitel, CO2 eltávolítás Jelentős a bepárlódás: 30-40 % Fermentációs idő: 10-15 nap Hozam: 65-75 % Produktivitás: 7-8 kg citromsav/m3*nap. De olcsó. 4. SZUBMERZ TENYÉSZTÉS Fermentor: 120-220 m3 keverős reaktor 3
200-1000 m3 air-lift, merülősugaras (pelletképzés)! Tápoldat: melasz tisztítás (ioncsere – K-ferrocianid) Kukorica-cukor (elfolyósítás - elcukrosítás) Inokulálás: konidium vagy vegetatív (pellet) inokulum: 12 órával rövidebb!
Fermentáció: levegőztetés: 0,2-1 vvm (O2 dúsítás)! hőmérséklet: 28-33 oC pH szabályozás: 2-2,6 2-3 nap pelletképződés, 5-8 nap citromsav képződés (függ a cukor koncentrációtól, adagolástól, a használt törzstől) Általában fed batch: 5% cukorral indul. Majd cukor és K-ferrocianid rátáplálás Állandó mikroszkópos megfigyelés (pellet) citromsav konc.: 130 g/l (melaszon); 200-250 g/l cukor (adagolni kell!) Konverzió: 87-92 %; Produktivitás: 0,67-0,75 kg citromsav/m3*h; ~ 16-18 kg citromsav/m3*nap Fruktóz: a szaharózból képződik invertálódással, kezdetben polimerizálódik (transz-fruktoziláz), majd visszabomlik.
20
40
(h)
60
4
FELDOLGOZÁS MICÉLIUM ELVÁLASZTÁS
MICÉLIUM szűrő segédanyag
OXALÁT FERROCIANID ELTÁVOLÍTÁS
ha micéliumot nem használják
mésztej + FeCl3 hulladék
trikalciumcitrát oldhatósága KALCIUM-CITRÁT KICSAPÁS ÉS ELVÁLASZTÁS
mésztej
CITROMSAV FELSZABADÍTÁS ÉS GIPSZ ELVÁLASZTÁS
H2SO4
SZÍNTELENÍTÉS ÉS IONMENTESÍTÉS
FERMENTLÉ
18 oC 25 oC 40 oC 90 oC
0,085 g/100 ml 0,096 0,085 0,058 !
GIPSZ aktív szén, gyanta regeneráló sav jelentős sótartalmú oldat
KONCENTRÁLÁS
KRISTÁLYOSÍTÁS KRISTÁLY SZEPARÁLÁS
SZÁRÍTÁS
APRÍTÁS OSZTÁLYOZÁS
CSOMAGOLÁS
1., Micélium elválasztás → vákuum dobszűrő
0,2 – 1,0 mm átmérőjű göbök → Newtoni szuszpenzió nyálkaképzés nehezíti a szűrést szűrősegédanyag → szalmatörek (takarmány)
2., Oxalát mentesítés → termékminőség miatt
Ca(OH)2 adagolás → CaCitrát kicsapódás veszélye! Klarifikálás → pl. nyomó szűrő, Funda szűrő ha micélium nem etetésre szánt, akkor a kettő együtt!
3., Ca-citrát kicsapás → fontos paraméterei: citromsav koncentráció., hőmérséklet, pH, Ca(OH)2 adagolás üteme mono-, di-, tricalcium citrát egyensúly → oldhatóság nagy kristályok képződése előnyös → kevesebb szennyezés - 90 oC, pH 7, 18-25%-os CaO - nagymennyiségű hő szabadul fel → hasznosítás szűrés → vákuum dobszűrőn
4., citromsav felszabadítása 60-70 %-os H2SO4 felesleggel (12 g/l) képződő gipszet vákuum dobszűrőn szűrik
5., Színanyagok eltávolítása → aktív szenes oszlopon Ionok eltávolítása →
kationcserélő DOWEX 50 anioncserélő DUOLITE 100
regenerálás erős savval ill. bázissal
6., Tiszta citromsav oldat koncentrációja: 200-250 g/l → további koncentrálás. Többfokozatú vákuum bepárló , kb. 40 oC
7., Kristályosítás vákuumkristályosítóban 20-25 oC-on → a képződő termék citromsav-monohidrát → kristálycentrifuga 5 anyalúg visszavezetése a folyamatba
8., Szárítás 36,5 oC alatti hőmérsékleten (kristályvízvesztés miatt)
FELÜLETI FERMENTÁCIÓ Répamelasz
Spóra
Levegő
Micélium (állattakarmány) sterilizálás fermentlé
Melasz tart.
fermentáció
SZUBMERZ FERMENTÁCIÓ Nádmelasz
micélium elválasztás
Levegő
Spóra
Micélium (hulladék) oltóanyag előállítás Melasz tart.
sterilizálás fermentlé
FELDOLGOZÁS IZOLÁLÁS
fermentáció
micélium elválasztás
Citragil (takarmány)
cefre bepárlás
kicsapás
citrát elválasztás
citromsav nyersoldat
citromsav felszabadítás
gipsz elválasztás
gipsz (hulladék)
TISZTÍTÁS
centrifugálás ioncserés bepárlás kristályosítás sótalanítás
szárítás aprítás osztályozás
CSOMAGOLÁS
6
6. MELLÉKTERMÉKEK, SZENNYVÍZ 1 t citromsavra számítva Micélium: 135 kg (25 – 30 % fehérje, 15 – 20 % szénhidrát) Takarmány – trágya – papíripar Gipsz: 1,4 t (kristályvizes) – építőipar (ennyit nem vesz fel) Szennyvíz: 8 m3 5 – 6 % szárazanyag; KOI ≈ 50 000 mg/l Feldolgozása: - Bepárlás (szárazanyag: 65 – 70 %) takarmány kiegészítő (Citragil) (az ár nem fedezi a költségeket, de csökkenti a veszteséget) - Élesztősítés: Torula szaporítés: 14 kg/ m3; 112 kg/8 m3 - Biogáz: ANAMAT eljárás. Output: CH4, CO2, víz Aerob és anaerob eljárás kombinációja
ÉRDEKES – BONYOLULT, KOMPLEX FERMENTÁCIÓ. (Talán a legbonyolultabb) 1. Metabolic eng. Természetes mutánsok!
Szelekció: savképződés!
2. Technológia:
felületi tenyésztés (még ma is)! Fed-batch: cukor, ferro-cianid, NH3, P Levegő: O2-dúsítás sejt inaktiválódás (O2-limit), pellet Feldolgozás: ioncserék, sóképzések stb. Tápoldat: fémmentesítés 3. Fermentációs paraméterek: hőmérséklet: más sav képz. ← 28-33 → gyenge növekedés pH:
kis pH: citromsav:+, más savak:- (gyors savanyodás kell) (NH4)SO4 Tápoldat komponensek:
Zn Mn Fe 4 kofaktora nagy koncentráció citromsav:Pelletképződés
NH3 5 aktivátor közeg savanyodik pigment (-) nyálka (-) citromsav feed-back inhib. (+) kikapcsol.
P P-limit: citromsav: + (feed-back I. kikapcsol)
Ferro-cianid
Citromsav: + Yx:csökken Yp:nő
Ferrocianid MeOH Cu
7
ECETSAV GYÁRTÁS Ecetsavat ipari léptékben kémiai és biológiai eljárásokkal egyaránt elő lehet állítani. Kémiai úton: Metanol karbonilezése Acetaldehid oxidációja Etilén oxidációja Fa száraz lepárlása Biotechnológiai úton: Mivel az alapanyag etilalkohol, tulajdonképpen két fermentációs lépés kapcsolódik össze. Cukrok Saccharomyces cerevisiae (anaerob)
etanol
ecetsav Acetobacter aceti (aerob)
Ez a két folyamat a legősibb, spontán is végbemenő biotechnológiai eljárás: A must cukortartalma → borrá erjed → a bor „megecetesedik” → borecet keletkezik Az ecetsav képződésének bruttó leírása: C2H5OH + O2
CH3COOH + H2O
Az ecetsav baktériumok az alkoholt molekuláris oxigén felhasználásával ecetsavvá oxidálják. AZ ESETSAV-BAKTÉRIUMOK Az alkoholt ecetsavvá oxidáló mikroorganizmusokat általában ecetsav-baktériumoknak nevezzük. Polimorf, Gram negatív baktériumok, sejtjeik elipszoid vagy pálca alakúak; melyek egyenesek vagy enyhén hajlítottak; 0,60,8 µm hosszúak (=aprók); egyesével, párokban vagy láncokban fordulnak elő. Mozgásra képtelen és mozgásra képes formái is előfordulnak, poláris vagy peritrich flagellummal rendelkeznek. Obligát aerobok, bizonyos fajai pigmentet, míg más fajai cellulózt termelnek.
Az ecetsav baktériumok osztályozása Az Acetobacteraceae–n belül 3 genus különíthető el: Acetobacter, Gluconobacter, Frauteria. Ebner és Follman többször is megkísérelték az ecetsav-baktériumok osztályozását. A legfontosabb segítség a pontos taxonómia kialakításában a Gillis és De Ley DNS-rRNS hibridizációs tanulmánya. A legfontosabb következtetés, hogy ay korábbi osztályozás alapján elkülönített két csoport, az Acetobacter és a Gluconobacter igazából közeli rokonságot mutat. Az Acetobacter-félék erősen savas közegben az ecetsavat túloxidálják CO2-dá és vízzé, amíg a Frateuria és a Gluconobacter család nem.
Gluconobacter
Acetobacter
Fraeturia
A törzsek izolálása és azonosítása sok problémával jár. Az ecetgyártásban mindig olyan ecetsav baktériumokkal dolgoznak, amelyek nem tiszta tenyészkultúrákból származnak. A fermentáció során használt baktériumokat nehéz taxonómiai osztályokba besorolni. A természetben (és az ipari félfolytonos/folytonos eljárásoknál is) vegyes kultúrákat alkotnak, sok, jelentősen eltérő altípussal és spontán hibridekkel. A fenotípusos megkülönböztetés is nehéz, mert egy faj különböző baktérium törzsei nem feltétlenül hasznosítják ugyanazt a szénforrást. Az Acetobacter törzs egy új faját izolálták Németországban és Svájcban is, erősen savas fermentációkból. Ezt a fajt Acetobacter europaeus-nak nevezték el. Az összes vizsgált törzs, amit szubmerz fermentációból izoláltak csak kis mértékben mutatott DNS-DNS hasonlóságot a hagyományos Acetobacter törzsekkel. Viszont szignifikánsan meg lehet különböztetni az Acetobacter europaeust az Acetobacter nemzettség többi tagjától azért, mert ez a faj erősen toleráns 4-8%-os ecetsavra AE-agarban. A törzseket szilárd és félszilárd táptalajon nehéz tenyészteni, folyadékban meg nehéz „széleszteni”. Jelentős előrelépést értek el Japánban, ahol speciális dupla rétegű agaron tenyésztették ki a baktériumokat (Acetobacter polyoxigenes). Az iparban használt ecetsav baktérium törzsek A fermentáció oltóecet beoltásával kezdődik meg, ez egy mikrobiológiailag meghatározatlan maradéka az előző fermentációnak. Ha megfelelő ecetsav toleranciájú és tápanyagigényű baktériumtörzzsel dolgozunk, évekig fenntartható a fermentáció anélkül, hogy félbeszakadna a folyamat vagy csökkenne a hozama, illetve a hatékonysága. Iparban használt törzsektől elvárt tulajdonságok: tolerálja a nagy ecetsav és alkohol koncentrációt kis tápanyag szükséglet ne lépjen fel túloxidáció magas hozamot produkáljon fágrezisztens legyen.
Az Acetobacter törzsek genetikai módosítása Az Acetobacter és Gluconobacter törzsek tulajdonságainak javítására rekombináns DNS technikát, host-vektor technikát és transzformációs módszert is kifejlesztettek. A sejtfúziós kísérletek során a sejt sejtfalának majdnem teljes eltávolításával szferoplasztokat képeznek, majd ezeket fúzionáltatják. Egy 37°C-on és 4% ecetsav tartal9
mú oldatban szaporodó törzset és egy 35°C-on és 5%-os ecetsav tartalmú környezetben szaporodó törzset fúzionáltattak. Az eredmény egy olyan törzs, amely 37°C-on és 5%-os ecetsav oldatot tartalmazó táptalajon megél, pedig ilyen körülmények között egyik kiindulási törzs sem képes megélni. Szferoplaszt(protoplaszt) fúziós technika: Szferoplaszt képzés (a sejtfal leemésztése) Két különböző tulajdonságú baktériumtörzs szferoplasztjának fúzionáltatása Eredmény: a tulajdonságok új kombinációja. (csak néhány stabilizálódik az új törzsben)
AZ ECETSAV KÉPZŐDÉS BIOKÉMIÁJA A folyamat két lépésben megy végbe, az etanol előbb acetaldehiddé oxidálódik (alkoholdehidrogenáz), majd az aldehid oxidálódik ecetsavvá (aldehid dehidrogenáz).
Több ecetsav-baktériumból is sikeresen tisztítottak alkohol-dehidrogenáz enzimet, ilyen irányú kutatásokat főleg Acetobacter aceti, A. rancens, G. suboxydans baktériumokkal végezték. Az ADH prosztetikus csoportja PQQ (pirrolo-kinolin-kinon), ez veszi át a hidrogéneket. Az enzimek a citoplazmamembránba épülnek be. A hidrogéneket ubikinonnak adják át. Az ubikinol visszaoxidálása során a terminális oxidációhoz hasonlóan molekuláris oxigénnel víz képződik és proton exportálódik a periplazmikus térbe. A protonok visszaáramlásával a sejt ATPt termel, így nyer energiát a folyamatból.
Tápanyagok, szubsztrátok A tápoldat fő komponense a tisztított és higított etilalkohol. A legtöbb országban az ilyen célra szánt alkoholt denaturálják, az USA-ban etil-acetáttal, Európában pedig ecetsavval. Az alkoholtartalmú tápoldatot cefrének nevezik. Az alkoholtartalmat térfogatszázalékban adják meg. Az oldat általában kis mennyiségben ecetsavat is tartalmaz, ezt vegyes százalékban (gramm ecetsav/ 100ml oldat) mértékegységben fejezik ki. A két különböző mértékegységű koncentráció számértékének összegét összkoncentrációnak nevezik, ez közelítőleg megadja a teljes fermentáció alatt kinyerhető maximális ecetsav koncentrációt. A kinyert ecetsav koncentráció és az összkoncentráció hányadosa a hozam. Az ecetsav fermentáció során az etanol teljes mennyisége ecetsavvá oxidálódik. Általában a kitermelés 95-98% körül szokott lenni, a maradék elveszik a kiáramló gázzal. Közben megfelelő szénforrás (általában glükóz) oxidálódik, ennek termékei H2O és CO2 .
10
Az étkezési ecetek gyártásánál a tiszta alkohol helyett különböző természetes, erjesztett, alkoholtartalmú leveket használnak nyersanyagként. A borecetnél bor, az almaecetnél az almabor az alapanyag. A maláta ecet az árpa vagy egyéb gabona forrázatának az alkoholosan erjesztett (sörszerű) levéből készül. Rizsecetnél pedig elcukrosított rizsből készül alkoholos és ecetsavas fermentációval.
A balzsamecetek az ecet mellett sok cukrot (gyümölcslé, szirup) is tartalmaznak.
TÁPANYAGOK, SZUBSZTRÁTOK Szénforrások A cukor (glükóz, szacharóz) könnyebben beépül a sejt anyagába, mint az acetát. Az ecetsav baktériumok a pentóz-foszfát úton hasznosítják. Acetát Az Acetobacter törzsek képesek a citromsav-cikluson keresztül hasznosítani az acetátot és a laktátot, de a túloxidáció csökkentésére törekszünk. Szén-dioxid A sejtek igénylik szén-dioxidot a növekedéshez. A szén-dioxid asszimilálódik a sejt anyagába, a sejt széntartalmának ~0,1%-a ebből származik. Nagyon kis mennyiségű ecetsav is ebből a CO2-ből származik. Nitrogén-forrás: Szerves szénforrás jelenlétében sok ecetsav-baktérium törzs képes ammónium ionokat is nitrogénforrásként felhasználni. Egyes törzseknek viszont aminosavra is szüksége van. Növekedési faktorok: Egyes törzsek növekedési faktorokat/vitaminokat igényelnek, illetve ezek jelenlétében jobban termelnek (p-aminobenzoesav, niacin, tiamin, pantoténsav). Az A. aceti törzsnél halmozottan pozitív hatást érhetünk el glutation és Na-glutamát együttes adagolásával. A növekedési faktor szükséglet a szénforrás ellátástól függ. Szervetlen sók Természetes nyersanyagoknál általában nincs szükség további tápanyag hozzáadására. Bár az almaborban kevesebb nitrogéntartalmú vegyület van, de ez feljavítható ammónium-foszfát hozzáadásával. Néhány szőlőborhoz is szükséges ammónium-foszfátot adni az optimális fermentációhoz. Tiszta alkohol alapú ecetsav gyártásnál mindenképp szükség van glükóz, kálium, nátrium, magnézium, kalcium, ammónium (ammónium-foszfát formájában), szulfát és klorid hozzáadására. Ezen kívül nyomelemekre: vas, mangán, kobalt, réz, molibdén, vanádium és cink is szükség van. Kereskedelmi forgalomban található tápanyag keverékek további adalékokat is 11
tartalmaznak, mint például szárított élesztőt azért, hogy egy esetleges leállás esetén újrainduljon a fermentáció. Etanol: Az ecetsav-baktériumok károsodhatnak, ha a fermentáció során az összes etanol oxidálódik és az etanol tartalmú friss tápoldat hozzáadása nem történik meg időben. Az etanol hiánya a légzési lánc kiesése miatt az oxigénhiányhoz hasonlóan megzavarja a fermentációt. A kár mértéke a teljes koncentrációtól és az etanol hiány idejétől függ. A túloxidáció az a nem kívánatos reakció, mely során az ecetsav tovább oxidálódik és CO2 és H2O keletkezik. Ezt megelőzhetjük, ha az összkoncentrációt magas értéken tartjuk és az etanolt állandóan pótoljuk. Ennek érdekében célszerű az etanol koncentrációt folyamatosan mérni. A Frings cég által kifejlesztett Alkosens időkésés nélkül méri az etanolt a fermentlében. A szenzor működése membrándiffúzión alapszik, ezért csak állandó hőmérsékleten ad megbízható eredményeket.
Frings Alkosens
Oxigén: az Acetobacter-ek obligát aerobok, a fermentáció során nagy mennyiségű oxigénre van szükség, ezért nagyon fontos a megfelelő levegőztetés. Kiterjedt kutatások bizonyítják, hogy a levegőztetés megszakítása a fermentációban zavart okozhat, például az ecetsav koncentráció vagy a fermentációs sebesség csökkenését. Az oxigén ellátás zavara is éles esést okoz az oxidációs sebességben, illetve az enzimek aktivitásában. Minél hosszabb időre szakad meg a levegőztetés és minél nagyobb cefre összkoncentrációja, annál erősebb a hatás. Egy 5%-os összkoncentrációjú elegynél a 2-8 perces levegőztetés kimaradás ugyanakkora kárt okoz, mint egy 11-12%-os összkoncentrációjú elegynél a 15-60 mp-ig tartó. Ugyanakkor a levegő nagy térfogatárama sok illékony komponenst (ecetsav és etanol) visz magával, ezzel veszteséget okoz.
12
LEVEGŐZTETÉSI MEGOLDÁSOK Felületi fermentáció Orleans-i eljárás Régebben használták borecet készítésére, ilyen módszer az Orleans-i eljárás, ahol álló fahordóba vezették a bort, a hordó felső részében légzőnyílásokat alakítottak ki és szobahőmérsékleten állni hagyták. Az ecetsav-baktériumok a levegővel jutottak a bor felszínére és elkezdték a borban lévő etilalkohol átalakítását ecetsavvá. A keletkező ecetsav sűrűsége kisebb a bor sűrűségénél, ezért lesüllyed és elvezethető a hordó alsó részéből. Kiváló minőségű ecetet lehetett így előállítani.
Orleans típusú ecet fermentáció
Újabb típusú felületi fermentációknál egy sekély folyadékréteg felületén baktérium filmet alakítanak ki. A folyadékot (cefre) áramoltatják. A folyadék mélysége ~10 mm, az kifolyó ecetsav koncentrációja 5-6%. Mozgócefrés fermentáció A mozgócefrés fermentorok töltött oszlopnak tekinthetők, bennük bükkfa forgácsot, nyírfa gallyakat vagy kukoricacsöveket használtak hordozó anyagként. Az ecetsav baktériumok a töltet felületén telepedtek meg, biofilm alakult ki. Az alkoholtartalmú cefrét felülről locsolták a töltetre, ezzel egyidőben alulról a hézagokban felfelé áramoltatták a levegőt. A lecsorgó folyadékot újra rávezették a töltetre, recirkuláltatták (innen a mozgócefrés elnevezés), mindaddig, amíg az átalakulás teljesen végbe nem ment. Nagy, fából készült tartályokat (akár 100 m3) építettek erre a célra. A belső tér nem steril, de a befertőződéstől védi az alkoholtartalom és a savas pH. Viszont a biofilmben gyakran megtelepszik egy nagyon specializálódott baktériumfaló fonálféreg, az „ecetangolna” (Anguillula aceti). Mozgócefrés fermentáció
A szubmerz fermentációknál intenzív levegőztetésre van szükség, keverős és air-lift megoldást egyaránt alkalmaznak.Különleges megoldás a Frings-acetátor (önbeszívó turbinakeverő).
13
Frings acetátor A Frings levegőztető önszívó rendszerű, nincs szüksége kompresszorra, a környezetből szívja be a levegőt egy szívócsövön keresztül. A motor alulról forgatja, és a levegőt felülről, a tengelycsövön át szívja be, és eloszlatja. Egy belső forgó- és egy külső állórészből áll. A levegő átpréselődik a sztátor csatornáin, így lép be a fermentorba ahol a diszpergálódik a fermentlében. A levegőztetés sebességét úgy kell megválasztani, hogy az a levegő egyenletes eloszlását biztosítsa a fermentor teljes keresztmetszetén. Mivel nem lehet teljesen kiküszöbölni a habképződést, az acetátor egy mechanikai habtörővel van felszerelve. A gyorsan forgó habtörő leválasztja a habból a folyadékot és visszaengedi a fermentorba. Az elpusztult baktériumok lízise során fehérjék szabadulnak ki, amelyek fokozzák a habzást. Mivel az intenzív levegőztetés okozza a habzást, ezért a habtörőnek a ciklus nagy részében működnie kell. A Frings acetátor a legelterjedtebb eszköz ecet gyártására. 1996 végére 642 Acetátor működött a világ minden részén, teljesen automatizált, teljes termelése 1,5 *106 m3/év ecet 10%-os ecetsavra átszámítva. Energia fogyasztása 400 W/L etanol, kitermelése 98% feletti.
Turbina és turbinaház (forgó- és állórész)
Frings turbinák
14
TECHNOLÓGIÁK A szubmerz gyártásoknál félfolytonos és folytonos fermentációs technológiákat alkalmaznak. A 12-15%-os ecet gyártását félfolyamatos módszerrel végzik. Itt minden fermentációs ciklusnak azonos hosszúságúnak kell lennie. Amikor az alkohol koncentráció 0,05-0,3% közé csökken, a fermentlé egy részét eltávolítják a fermentorból, majd újratöltik 0-2% ecetsav tartalmú és 12-15% alkohol tartalmú cefrével. Az újratöltést lassan, erőteljes kevertetés és állandó hőmérséklet mellett kell végezni. A fermentor töltése során ugyanolyan összkoncentrációjú cefrét kell betölteni, mint az előző ciklusban és közben kevertetni kell, mert a helyileg kialakuló nagy koncentráció károsíthatja a baktériumokat. A következő ciklus lag fázis nélkül indul el. Közben a a hőmérsékletet állandó értéken kell tartani, mert az ismételt hőmérséklet-változás is károsíthatja a baktériumokat. Egylépcsős félfolytonos 1994 óta lehetséges 19%-os ecetsav gyártása módosított fermentációval. A cefrét és a többletalkoholt külön program szerint adagolják. Az előzőhöz hasonló kiindulási cefrével indítják a folyamatot, majd lassan adagolják a többlet alkoholt. Az alkohol adagolást addig folytatják, amíg el nem érik az előírt (19%) összkoncentrációt. Az oxidáció lejátszódik és amikor az alkohol koncentráció lemegy nullára, a fermentlé egy részét lefejtik és a helyébe a hígabb cefrét táplálják be. Később újból alkohol adagolásával növelik a összkoncentrációt. Kétlépcsős félfolytonos A konzerviparban magas ecetsav tartalmú ecetre van szükség. A kétlépcsős folyamat során 15%-os és ennél nagyobb ecetsav tartalmú ecetet lehet gyártani. Az első fermentorban az összkoncentráció 15% alatt van, majd az alkoholt lassan adagolják hozzá, amíg el nem érik a 18,5%-os összkoncentrációt. Amikor eléri az ecetsav koncentráció a 15%-ot, a fermentlé 30%-át áttöltik a második fermentorba és az első fermentort újratöltik alacsonyabb összkoncentrációjú eleggyel. A második fermentorban folytatódik a fermentáció, amíg a konverzió majdnem teljes nem lesz, ekkor a levet lefejtik. Folyamatos fermentációnál a lehetséges maximum ecetsav koncentráció 9-10%, mivel meg kell találni a kompromisszumot az állandósult etanol koncentráció beállításánál. A termékben a sok ecetsav és kevés maradék alkohol a célszerű. Az alacsony állandósult etilalkohol koncentráció viszont lecsökkenti a baktériumok fajlagos növekedési sebességét. Kísérletek immobilizált ecetsav baktériumokkal A mozgócefrés eljárás biofilmje is tulajdonképpen immobilizálásnak tekinthető, de pl. Japánban sok kísérlet folyik rizsecet vagy gyümölcsecet gyártására immobilizált ecetsav baktériumokkal. A rögzített sejteket félfolytonos fermentációban, airlift bioreaktorokban alkalmazták. Karragénan gél gyöngyökön immobilizált ecetsav baktériumokkal nagy fajlagos növekedési sebességet és respirációs aktivitást értek el. Más hordozó anyagoknál, mint a polipropilén rostoknál a 3%-os, míg kerámia méhsejt szerkezetű monolitnál maximum 4%-os ecetsav koncentráció érhető el. Kalcium-alginát gél gyöngyökkel fluidizált reaktorban pedig 3,5%-os ecetsav koncentráció nyerhető ki.
15
Feldolgozás A fermentléből a sejtek eltávolításánál problémát okoz, hogy az Acetobacter sejtek nagyon aprók, centrifugálással, szűréssel alig választhatók el. Célszerűen membránszűréssel (mikroszűréssel) távolítják el, ehhez nem szükséges szűrési segédanyag.
Keresztáramú (cross flow) szűrés üregesszál (hollow fiber) modulban Az ecetsav bepárlással töményíthető (fp = 118 °C), a víz az illékonyabb komponens. HOMOACETOGÉNEK Új lehetőség az ecetsav gyártásban Termofil homoacetogének: Clostridium thermoaceticum, Cl. thermoautotroficum Speciális biokémiai utak: 1 C6H12O6 + 2 H2O 2 CO2 + 8 H+ + 8e C6H12O6
2 CH3-COOH + 2 CO2 + 8 H+ + 8e CH3-COOH + 2 H2O 3 CH3-COOH !
A 2 CO2 –ből autotróf CO2 -fixálással egy új acetil-CoA képződik Sok homoacetogén Clostridium autotróf módon H2/CO2 vagy CO gázkeveréken is tud nőni. Előny: +50% hozam (100 g cukorból az elméleti hozam: 100 g ecetsav, gyakorlati: 90 – 95 g) Hátrány: lassú a folyamat (Törzsfejlesztéssel esetleg javítható) Fermentáció típusa Szakaszos Folyamatos sejtvisszatáplálás Folyamatos sejtvisszatáplálás nélkül Forgódobos fermentor
Produktivitás (g*l-1*h-1) 0,9 4 2,5 10
Ecetsav konc. (g*l-1) 120 22 7 37
Szakaszos: glükózrátáplálás, dolomitos semlegesítés, Félfolytonos: (50 % lefejtés) Forgódobos fermentáció: immobilizálás, a baktérium a forgó tányérokhoz tapad
16
Az ecetsav felhasználása: Vegyipar: erős sav, reakciók, alapanyag, Vízkőoldás Élelmiszeripar: tartósítás Új: jégmentesítés: só helyett Ca- vagy Mg-acetát
17
GLÜKONSAV (GS) GYÁRTÁS COOH │ HC-OH │ HOC-H │ HC-OH │ HC-OH │ CH2OH
1928
Felületi tenyésztés Pen. luteum, 80-87%-os konverzió.
Ma: Asp. niger, Metanol hasznosító baktériumok (RINGPFEIL) Pseudomonas oralis, Acetobacter suboxidans. Szubmerz, glükóz (CaCO3) rátáplálásos. (max 15 % glükóz) Yp=0,9-0,95, micélium – újrafelhasználás !
Kataláz előállítás, glükóz-oxidáz.
– FAD
FADH2
glükóz H2O2
H 2O
δ glükono-lakton
glükonsav
O2
glükóz-oxidáz (notatin, penicillin B): H2O2 ! Nagy blama Üzemek:
AKZO (Hollandia); CARLO ERBA (Olaszo.); MERCK (Németo.); MALLINCKRODT (USA), RICHTER (Magyarország)
Felhasználás: Fémipar (tisztítás, rozsdátlanítás) Üveg (tisztítás) Detergensekben (komplexképző) Gyógyszeripar: Ca, Fe … glükonát Cementadalék Folyamatábra: sók, DEXTRÓZ
gabonaáztató lé oltóanyag víz
víz
kalcium-karbonát
steril levegő kalcium-karbonát - sterilizáló dextrózsterilizáló
FERMENTOROK
hűtőközeg
micélium VÁKUUMSZŰRŐ bepárló CaCO3 aktív szenes oszlop tárolótartály
KALCIUMGLÜKONÁT kristályosító centrifuga
18
GLÜKONSAV Kapacitás:
5 000 t/a
Üzemeltetési költség
Beruházás/a járulékos beruházások nélkül/:$7 250 000 Egység
Egység/t
Egység/a
Ár,$/egység
Költség $/t
$/a
Közvetlen költségek
Nyersanyagok Dextróz Kalcium-karbonát Gabonaáztató lé (szilárd tartalom) Kénsav Magnézium-szulfát (heptahidrát) Diammónium-foszfát Monokálium-foszfát
t t
1,140 0,230
607,00 21,00
691,98 4,83
t
0,012
260,00
3,12
t t
0,002 0,012
75,50 277,83
0,15 3,33
t t
0,020 0,001
264,00 340,00
5,28 0,34 709,03
≈60 %
3 545 150
Munkabérek
Üzemeltetők Művezető Üzemvezető
Karbantartás /a beruházás 4%-a/ Szolgáltatás Villamos energia Technológiai víz Hűtővíz Gőz
fő/év fő/év fő/év
kWh 1 000 5,00 m3 3 m 60,00 t 3,50
Eddig összesen Közvetett költségek Rezsi költség /a munkabérek 75%-a/ Adók és biztosítás /a beruházás 2%-a/ Értékcsökkenési leírás /a beruházás 1O%-a/ Eddig összesen
8 4 1
25 600,00 29 100,00 35 100,00
71,26 ≈6 %
204 800 116 400 35 100 356 300
58,00
290 000
0,041 41,00 0,170 0,85 0,017 vízforgatás 1,02 11,00 38,50 81,37 ≈7 % 919,66
145,00 227,45
406 850 4 598 300 267 145 725 1 137
225 000 000 225
Összesen
1147,11
5 735 525
20
1.Rátáplálás hatása p
p Kis p-képződési sebesség
t
nagy lag szakasz
t1
t2<< t1 !
Produktivitás (kg/m3.h)
2. Micélium: újrafelhasználás ill. enzim előállítás
t2
t
ALMASAV (Corinebacterium glutamicum)
CHIBATA (1974)
HOOC─CH ║ HC·COOH fumársav
Brevibact. ammoniagenes Fumaráz
Nyugvósejtes konverzió Egyensúlyi reakció: 15 % 85 %
COOH │ HC·OH │ CH2 │ COOH
kalcium-malát (oldott)
egyensúlyi arány: ≈15:85
oldhatóság ≈1%
oldhatóság ≈1%
kalcium-fumarát (kristályos)
centrifugálás
Nagy hőstabilitás
Almasav
kalcium-fumarát (oldott)
Oldhatóság a két sónál: 1 % Pseudo kristály fermentáció (konverzió)
Polietilén- imidbe immobilizálják
kalcium-malát (kristályos)
kicsapás
centrifugálás
kristályosítás
elpárologtatás
Nem steril rendszer: p-hidroxi-benzoesav mikróbák ellen. Bovin albumin és szója fehérje: adagolás. Megakadályozza az enzim adszorpcióját a falra, keverőre, illetve a denaturációt Down stream: H2SO4 (gipsz szűrés). Tisztrítás: ioncserés kromatográfia. (Elválasztás) Katalizátor: Sejtszuszpenzió. AMINO GmbH. Szakaszos keverős reaktor. 2000 t/év 1988. Immobilizált enzim TANABE (Japán) pH: 8, hőmérséklet: 25 ˚C Igény: 40 000 t/év Felhasználás: élelmiszer, kozmetikum, gyógyszer (infúziónál)
22
