Artikel Ilmiah. Disusun oleh : Dra. Agnes Sri Harti, M.Si

BIOPREPARASI PROBIOTIK DAN PREBIOTIK DALAM YOGHURT SEBAGAI PENURUN KOLESTEROL BIOPREPARATION OF PROBIOTIC AND PREBIOTIC ON THE YOGHURT AS CHOLESTEROL REDUCTION

Artikel Ilmiah

Disusun oleh : Dra. Agnes Sri Harti, M.Si.

Disampaikan pada Seminar Nasional Farmasi ”Imunomodulator dan Perkembangannya (Manfaat dan Bahayanya)” Tanggal 15 Mei 2008 di STIFAR ”Yayasan Pharmasi” Semarang

1

BIOPREPARASI PROBIOTIK DAN PREBIOTIK DALAM YOGHURT SEBAGAI PENURUN KOLESTEROL Agnes Sri Harti, Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Setia Budi, Surakarta

INTISARI Konsep sinergistik antara probiotik dan prebiotik (disebut sinbiotik) sebagai penurun kadar kolesterol serum menjadi obyek penelitian dewasa ini. Yoghurt merupakan hasil susu fermentasi oleh satu atau lebih bakteri asam laktat yaitu Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus. Synbiotik dapat disuplementasikan dalam yoghurt sebagai sumber probiotik dan suplement prebiotik. Penelitian meliputi 4 tahap yaitu : 1) isolasi dan identifikasi Bakteri Asam Laktat, 2) efek sinbiotik secara in vitro, 3) efek sinbiotik secara in vivo, 4) Biopreparasi sinbiotik dalam yoghurt. Analisis data menggunakan metode Analisis varian General Linier Models Univariate. Hasil penelitian menunjukkan adanya efek sinergistik dari sinbiotik secara in vitro terhadap toleransi keasaman dan garam empedu, pH dan asimilasi kolesterol dalam media yang mengandung sinbiotik dan oxgall 0,3%. Efek sinergistik dari sinbiotik secara in vivo terhadap peningkatan berat badan, pakan, penurunan populasi mikrob patogen saluran cerna, penurunan kadar kolesterol, HDL, LDL hewan uji. Biopreparasi sinbiotik dalam yoghurt dapat digunakan sebagai kandidat imunostimulan dan diet untuk penurunan kadar kolesterol serum.

Kata kunci : probiotik, prebiotik, yoghurt, imunostimulant, reduksi kolesterol. BIOPREPARATION OF PROBIOTIC AND PREBIOTIC ON THE YOGHURT AS CHOLESTEROL REDUCTION Agnes Sri Harti Faculty of Health Science, Setia Budi University, Surakarta ABSTRACT The synergistic concept of probiotic and prebiotic (known as synbiotics) as natural means to counter increased serum cholesterol level has generated much interest recently. Yoghurt was fermented milk by lactic acid bacteria its one of two culture Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus. The synbiotic can be supplemented on the yoghurt as probiotic resources with prebiotic supplement. The studies were conducted in four steps : 1) Isolation and identification of Lactic Acid Bacteria, 2) The effect of the synbiotic in vitro 3) The effect of the synbiotic in vivo 4) Biopreparation of synbiotic on the yoghurt. Analysis of variance General Linier Models Univariate was used to analyze the data. Result of this study showed the effect of synbiotic in vitro may have contribute synergistic to acid and bile tolerance, pH, cholesterol assimilation on media containing prebiotic and oxgall (0,3%). The effect of synbiotic in vivo may have contribute synergistic to increased body weight, feed intake, and decreased in the population of gastrointestinal microbes, concentration of cholesterol, trigliseride, HDL, LDL on the rats. The biopreparation of synbiotic on yoghurt may be promising candidates for use as immunostimulant and a dietary adjunct to lower serum cholesterol . Keywords : probiotic, prebiotic, yoghurt, immunostimulant, cholesterol reduction

2

I. PENDAHULUAN Bakteri Asam Laktat (BAL) sebagai probiotik bermanfaat di bidang kesehatan Jumlah probiotik dapat dioptimalkan dengan penggunaan prebiotik. Konsep sinergistik antara probiotik dan prebiotik dikenal sebagai synbiotik dikaitkan dengan kadar kolesterol dalam serum [7,8,9]. Yoghurt merupakan salah satu produk fermentasi susu oleh Bakteri Asam Laktat (BAL) jenis Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus. Yoghurt dapat digunakan sebagai pangan synbiotik yaitu sebagai sumber probiotik dengan suplemen prebiotik [6]. Optimalisasi probiotik dapat dilakukan dengan pemilihan atau seleksi strain yang tepat, monitoring proses fermentasi dan aplikasinya dalam pangan synbiotik yang tepat. Penggunaan produk probiotik dapat memberi manfaat kesehatan antara lain : peningkatan kekebalan terhadap infeksi usus, perbaikan penggunaan laktosa, pencegahan diare, hiperkolesterolemia, kanker kolon, stabilitas barier mukosa usus, perbaikan absorbsi kalsium dan sintesis vitamin [12]. Tujuan penelitian ini yaitu mengkaji biopreparasi probiotik dan prebiotik dalam yoghurt sebagai penurun kadar kolesterol secara in vitro dan in vivo. II. METODOLOGI PENELITIAN 1. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei sampai Oktober 2009 di laboratorium Mikrobiologi, Biokimia, Farmakologi, Kimia Klinik, Hematologi, Kimia Air Makanan Minuman; Universitas Setia Budi di Surakarta. 2. Alat dan Bahan Bahan yang digunakan MRS Agar, BHI cair, BHI Agar, Thioglikolat Agar, BGLB cair, Nutrien Agar, prebiotik : Maltodextrin 2 %, FOS 2 %, NaCl fisiologis, buffer pepton 0,1 %, cat Gram, Oxgall, Kolesterol kit diagnostic, Isolat strain BAL (Bakteri Asam Laktat), tikus Wistar jantan, pakan tikus, diet cholesterol tinggi, copha, probiotik (strain Lactobacillus acidophilus FNCC 0051, Lactobacillus acidophilus LIPI MC 92 dan Streptococcus thermophilus LIPI MC 192), kultur A, B, C, (Vitacharm), sampel yoghurt. Alat yang digunakan : inkubator, autoclave, centrifuge, membran filter, oven, neraca analitis, pH meter, anaerobic jar, , spektrofotometer UV-Vis Shimadzu, mikro pipet, cawan petri, tabung reaksi, Gas Generating Kit, vortex, Micropipet, jarum syringe, alat bedah tikus, centrifuge, kandang hewan coba, autoclave, inkubator, tabung reaksi, cawan petri, neraca, oven.

3

3. Metode Penelitian Isolasi, Identifikasi dan Inventarisasi Probiotik : Isolasi probiotik metode goresan menggunakan media seletif MRS Agar dari 10 macam sumber probiotik.. Identifikasi Probiotik, dilakukan secara mikroskopis dengan pewarnaan Gram. Hasil isolasi dan identifikasi diinventarisasi sebagai inokulum BAL

Kajian Efek Sinergistik Synbiotik Secara In Vitro Efek sinergistik synbiotik secara in vitro dilakukan menginokulasi isolat BAL (10 % v/v) pada 4 macam media yaitu BHI, BHI + prebiotik (Maltodextrin 2 %, FOS 2 % = 1 : 1), BHI + oxgall 0,3%; BHI + kolesterol. Media diinkubasi suhu 370C selama 24 jam secara anaerobik,diukur absorbansinya pada λ = 620 nm. Parameter pengukuran berdasarkan toleransi keasaman dan garam empedu, pH media, kadar kolesterol

menggunakan kolesterol kit

diagnostic

Kajian Efek Sinergistik Synbiotik Secara In Vivo Efek sinergistik synbiotik secara in vivo dilakukan dengan menginokulasikan probiotik secara oral pada hewan uji (tikus jantan Wistar) yang diberi diet pakan kolesterol tinggi. Model percobaan dibagi 4 grup dengan tiap grup diberikan perlakuan diet pakan berbeda. Setiap grup diberi diet yang mengandung 75 % (b/b) diet kolesterol tinggi dan 5 % (b/b) copha (hardened coconut oil 99% , soybean lecithin 1 %). Ratio penggunaan inokulum, konsentrasi FOS dan Maltodexrin yang digunakan adalah 1.7 : 4.8 : 6.8 [7,8,9,10]. Semua grup tikus diberi diet pakan per oral (water ad libitum) selama 4 minggu. Paramater pengukuran adalah penimbangan berat badan dan feed intake per minggu dicatat. Teknik sampling dan analisis kolesterol : setelah akhir perlakuan (4 minggu) dilakukan pengambilan darah tikus melalui retroorbital menggunakan micro-hematocrit. Sampel serum selanjutnya dianalisis total HDL (High-Density Lipoprotein), kolesterol, LDL (Low Density Lipoprotein) dan trigliseride menggunakan reagent kit komersial (diagnostic reagent for quantitative in vitro determination of cholesterol in serum or plasma on photometric systems, manifactured for DSI in Germany) Analisis mikrobial dilakukan dengan cara sampel feces dikumpulkan pada minggu I dan IV, lalu dilakukan perhitungan jumlah mikrob metode plate count menggunakan media sesuai yaitu perhitungan jumlah bakteri aerob total (medium Nutrien Agar), jumlah bakteri anaerob (medium tioglikolat agar), jumlah bakteri coliform (media BGLB cair), dan jumlah bakteri

4

Lactobacillus (media MRS Agar). Semua media plate agar diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam, untuk bakteri anaerob diinkubasi secara anaerobik. Biopreparasi Synbiotik Sebagai Suplemen Dalam Yoghurt Pembuatan yoghurt dengan penambahan synbiotik : susu sebanyak 100 ml ditambah gula pasir 25 gram dan susu skim dengan konsentrasi 15 % dari bahan baku. Susu dipanaskan mencapai suhu diatas 85–90oC selama 15 menit sambil diaduk. Susu didinginkan hingga suhu 43–45oC, dinokulasikan isolat BAL 10 %. Lalu dikemas dalam cup. Analisis hasil fermentasi meliputi : uji organoleptis (metode Hedonic test) terhadap tingkat kesukaan (warna, bau, konsistensi, rasa) oleh panelis, analisa kimiawi dan cemaran mikrob [4, 13]

4. Analisis Data Data hasil percobaan dianalisis statistik menggunakan Anova General Linier Models Univariate. III. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 1. Isolasi, Identifikasi BAL Hasil isolasi , identifikasi dan inventarisasi probiotik terhadap 10 sampel menunjukkan sebagian besar merupakan bakteri berbentuk batang (Tabel 1), susunan menyebar, reaksi Gram positif pada genus Lactobacillus, Bifidobacterium dan bakteri bentuk coccobasil, coccus susunan berderet pada genus Streptococcus (Gambar 1 dan 2).

Gambar 1. Foto hasil pewarnaan Gram Lactobacillus acidophilus FNCC 0051 secara mikroskopis

Gambar 2. Hasil Isolasi Probiotik Dari Produk Yoghurt

5

2. Kajian Efek Sinergistik Synbiotik Secara In Vitro

Efek Sinergistik Synbiotik Terhadap Toleransi Keasaman dan Garam Empedu Hasil analisis statistik menunjukkan adanya oxgall 0,3 % tidak memberikan efek secara signifikan terhadap pertumbuhan probiotik. Pada masa inkubasi 2 dan 7 jam belum mencapai fase pertumbuhan secara eksponensial, namun adanya oxgall 0,3 % dalam media menunjukkan BAL mampu bertoleransi terhadap keasaman dan garam empedu. Efek Sinergistik Synbiotik Terhadap Penurunan pH Media Hasil analisis statistik menunjukkan pengaruh waktu inkubasi menyebabkan penurunan pH media menjadi lebih asam karena BAL melakukan fermentasi asam laktat.

Efek Sinergistik Synbiotik Terhadap Asimilasi Kolesterol Hasil analisis statistik menunjukkan pengukuran kadar kolesterol pada saat 0 jam, 20 jam dan setelah sterilisasi menunjukkan kadar kolesterol yang bervariasi. Hal ini menunjukkan bahwa masih adanya berbagai faktor yang belum jelas mengenai asimilasi kolesterol [5,6] dalam metabolisme sel mikrob. Asimilasi kolesterol berkaitan dengan metabolisme kolesterol untuk pertumbuhan sel. Mekanisme kolesterol yang lain dijelaskan oleh Noh et al [9] bahwa diduga L. acidophilus dihubungkan dengan perpindahan kolesterol dari medium ke dalam membrane seluler selama pertumbuhan. 3. Kajian Efek Sinergistik Synbiotik Secara In Vivo Efek Sinergistik Synbiotik Terhadap Berat Badan Mencit Hasil analisis statistik menunjukkan berbeda secara bermakna terhadap mean berat badan mencit.

Efek sinergistik berpengaruh terhadap penambahan berat badan mencit

dibandingkan dengan kontrol

Efek Sinergistik Synbiotik Terhadap Jumlah Pakan (Feed Intake) Mencit Hasil analisis statistik menunjukkan kebutuhan pakan tiap mencit tiap hari rata-rata 5 gram. Peningkatan kebutuhan pakan dikaitkan dengan metabolisme hewan uji, adanya synbiotik dapat berfungsi sebagai imunostimulan sehingga mempengaruhi metabolisme hewan uji yang dapat diamati dengan adanya peningkatan berat badan mencit tiap minggu dibandingkan kontrol.

6

Efek Sinergistik Synbiotik Terhadap Jumlah Mikroba Pencernaan Hasil analisis statistik menunjukkan jenis pakan dan waktu inkubasi, berbeda secara bermakna terhadap jumlah bakteri total, bakteri probiotik (BAL), bakteri anaerob dan bakteri coliform pada masing-masing media selektif. Ada 2 kelompok bakteri dalam usus yaitu golongan bakteri yang “baik” (contoh Lactobacillus, Bifidobacteria) dan golongan bakteri “jahat” (contoh Escherichia coli, Clostridium perfringens, Salmonella, Shigella dan Staphylococcus) [12, 13, 14,16]. Kedua kelompok bakteri tersebut sering terjadi interaksi (kompetisi) yang berakibat pada kondisi inang tubuh menjadi sehat atau sakit. Ada lima species sebagai penghuni pasti saluran usus manusia yaitu B. infantis, B. breve dalam usus bayi dan B. bifidum, B. longum, B. adolescentis sebagai penghuni usus anak-anak dan orang dewasa. Bifidobacteria tersebut berperan sebagai faktor kunci dalam menentukan kesehatan individu segala usia. Adanya BAL sebagai probiotik mampu menekan pertumbuhan bakteri anaerob dan koliform. Jumlah bakteri koliform menunjukkan adanya penurunan jumlah yang signifikan pada minggu ke 1 dibandingkan pada minggu IV.

Efek Sinergistik Synbiotik Terhadap Kadar Kolesterol Total , Trigliserida, HDL (High Density Lipoprotein), LDL (Low Density Lipoprotein) Hasil analisis statistik menunjukkan jenis pakan dan waktu inkubasi berbeda secara bermakna terhadap kadar kolesterol, trigliserida, HDL dan LDL. Kolesterol total sebenarnya merupakan susunan dari banyak zat, termasuk trigliserida, kolesterol LDL dan HDL. Trigliserida adalah salah satu bentuk lemak yang diserap oleh usus. Trigliserida di dalam jaringan pembuluh darah, otot, jaringan lemak akan dipecah oleh ensim lipase. Hasil pemecahan ini oleh hepar dimetabolisme kembali menjadi LDL. Kolesterol LDL mampu melekat pada dinding pembuluh darah dan menyebabkan terjadinya penyumbatan. Kelebihan kolesterol pada jaringan pembuluh darah ini akan diangkut oleh HDL ke liver yang kemudian dikeluarkan melalui saluran empedu. Kadar LDL yang ideal adalah < 130 mg/dL dan kolesterol HDL > 40 mg/dL, kadar normal kolesterol total < 200 mg/dL dan trigliserida < 200 mg/dL. Hiperkolesterolemia terjadi jika jumlah kolesterol LDL dalam darah melebihi ambang batas. Beberapa strain BAL mampu melakukan metabolism kolesterol dari makanan dalam usus halus sehingga tidak diserap tubuh Beberapa Lactobacillus mampu menurunkan kolesterol total dan kolesterol LDL (low-density lipoprotein). Beberapa strain L. acidophilus mampu mensekresikan “bile salt hydrolase” (cholylglycine hydrolase) yang

mampu mengkatalisa

hidrolisis glycine atau taurine garam empedu terkonjugasi menjadi residu asam amino dan garam empedu bebas (asam empedu) [2]. Garam empedu bebas bersifat kurang larut daripada

7

garam empedu terkonjugasi sehingga atau berakibat absorpsinya lebih rendah di dalam lumen usus. Asam empedu dekonjugasi dapat mereduksi kadar kolesterol serum dengan peningkatan pembentukan asam empedu baru yang diperlukan sebelum masuk dalam sirkulasi enterohepatic [3]. Mekanisme kolesterol yang lain dijelaskan oleh Noh et al [11] bahwa diduga L. acidophilus dihubungkan dengan perpindahan kolesterol dari medium ke dalam membrane seluler selama pertumbuhan. Kolesterol terikat dalam atau melekat pada sel bakteri yang tidak tersedia untuk absorpsi dari usus ke dalam darah. BAL mampu melakukan dekonjugasi garam empedu dalam usus halus untuk mncegah absorpsi kembali oleh tubuh sehingga merangsang hati / hepar untuk mensintesis lebih banyak garam empedu dari kolesterol serum sehingga kadar kolesterol serum berkurang. TABEL 1. Hasil Pengukuran Efek Sinergistik Synbiotik Terhadap Kadar Kolesterol Total (mg/dl) No.

Kontrol

Pakan

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

288 288 288 288 288 288 288 288 288 288

120 133 119 110 113 100 121 130 129 120

Pakan + campuran Prebiotik 104 101 104 120 135 114 137 151 153 125

TABEL 2. Hasil Pengukuran Efek Sinergistik Synbiotik Terhadap Kadar Trigliserida (mg/dl) No.

Kontrol

Pakan

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

259 259 259 259 259 259 259 259 259 259

98 99 91 110 80 100 84 89 95 86

8

Pakan + campuran Prebiotik 83 116 80 94 120 114 96 105 135 108

TABEL 3. Hasil Pengukuran Efek Sinergistik Synbiotik Terhadap Kadar HDL (mg/dl) No.

Kontrol

Pakan

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

11 11 11 11 11 11 11 11 11 11

59 66 74 59 45 58 61 74 70 75

Pakan + campuran Prebiotik 50 52 63 79 72 54 75 90 96 65

TABEL 4. Hasil Pengukuran Efek Sinergistik Synbiotik Terhadap Kadar LDL (mg/dl) No.

Kontrol

Pakan

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

225,2 225,2 225,2 225,2 225,2 225,2 225,2 225,2 225,2 225,2

41,4 47,2 26,8 29,0 52,0 22,0 43,2 38,2 40,0 27,8

Pakan + campuran Prebiotik 38,2 25,8 25,0 22,2 39,0 37,2 42,8 40,0 30,0 38,4

Biopreparasi Synbiotik Sebagai Suplemen Dalam Yoghurt Uji Organoleptis Hasil analisis statistik menunjukkan jenis yoghurt

tidak berbeda secara bermakna

terhadap organoleptis (warna, rasa, bau dan konsistensi) dan analisis kimiawi kimiawi (pH, keasaman, kadar protein dan kadar lemak). Analisis kimiawi yoghurt sangat dipengaruhi oleh factor bahan baku, sifat fisiologis BAL dan factor lingkungan. Yoghurt yang ideal adalah keasaman rendah, kadar protein tinggi dan kadar lemak rendah. Karbohidrat, protein susu akan terfermentasi oleh BAL menghasilkan aroma, sehingga memberi citra yang yoghurt spesifik karena adanya senyawa volatile (asetaldehid, diasetil, etanol dan aseton). Adanya diasetil yang tinggi menyebabkan timbulnya rasa agak pahit. Yoghurt merupakan susu fermentasi yang mampu menaikkan nilai toleransi terhadap laktosa sehingga bermanfaaat bagi orang-orang yang intolerance terhadap laktosa. 30 – 40 % laktosa dalam susu akan terurai menjadi glukosa dan galaktosa yang mudah diserap tubuh. Oleh karena itu yoghurt menyebabkan nilai cerna lebih tinggi dibandingkan mengkonsumsi susu non fermentasi.

9

Cemaran Mikroba meliputi : MPN Coliform, identifikasi Escherichia coli dan identifikasi Salmonella. Hasil analisis cemaran mikroba terhadap yoghurt menunjukkan hasil negatif atau tidak mengandung Escherichia coli, MPN coliform dan Salmonella, yang artinya yoghurt hasil fermentasi memenuhi syarat secara mikrobiologis. KESIMPULAN 1. Efek sinergistik synbiotik (probiotik dan prebiotik) secara in vitro berpengaruh nyata terhadap toleransi keasaman, garam empedu, pH dan asimilasi kolesterol. 2. Efek sinergistik synbiotik (probiotik dan prebiotik) secara in vivo berpengaruh nyata terhadap berat badan, asupan pakan (feed in take), jumlah mikroba pencernaan, kadar kolesterol total, trigliserida, HDL, LDL pada hewan uji. 3. Jenis isolate tidak berpengaruh nyata terhadap uji organoleptis, analisis kimiawi dan cemaran mikrob dalam biopreparasi yoghurt. UCAPAN TERIMA KASIH Penelitian ini dibiayai oleh Direktorat Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat, Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional dalam Hibah Kompetitif Penelitian Sesuai Prioritas Nasional Tahun I (2009) dengan Nomor Kontrak : 208/SP2H/PP/DP2M/V/2008 Tanggal 30 Mei 2009. Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu pelaksanaan penelitian. DAFTAR PUSTAKA 1. Anderson, J. W., and S. E. Gilliland. 1999. J. Am. Coll. Nutr. 18 : 43–50 2. Corzo, G., and S. E. Gilliland. 1999.. J. Dairy Sci. 82 : 466–471. 3. Djide, M.N., 2006. Jurnal Sains & Teknologi, April 2006, Volume 6 No. 1 : 13 – 18. ISSN 1411 – 4674 4. Hadiwiyono, S., 1994, Teori dan Prosedur Pengujian Mutu Susu dan Hasil Olahannya. Liberty : Yogyakarta. 5. Harti, A.S. 2007. Kajian Efek Sinergistik Probiotik dengan Prebiotik terhadap Diaregenik Escherichia coli. Laporan Hasil Penelitian Dosen Muda. Dibiayai oleh Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, Tahun 2007. 6. Ishibashi, N., and S. Yamazaki. 2001. Am. J. Clin. Nutr. 73 : 462S–470S. 7. Liong, M. T., and N. P. Shah. 2005a. J. Dairy Sci. 88 : 55–66. 8. Liong, M. T., and N. P. Shah. 2005b. Int. Dairy J. 15 : 391–398. 9. Liong, M. T., and N. P. Shah. 2005c. Appl. Environ. Microbiol. 71 : 1745–1753. 10. Liong, M. T., and N. P. Shah. 2005d. J. Food Sci. 70 : M113–M120. 11. Noh, D. O., S. H. Kim, and S. E. Gilliland. 1997. J. Dairy Sci. 80 : 3107–3113. 12. Pereira, D. I. A., and G. R. Gibson. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68 : 4689–4693. 13. Sudarmadji, S, Haryono, B, dan Suhardi, 1994. Prosedur Analisa untuk Bahan Makanan Pertanian. Angkasa : Bandung. 14. Tahri, K., J. P. Grill, and F. Schneider. 1996. Curr. Microbiol. 33 : 187–193. 15. Topping, D. L., and P. M. Clifton. 2001. Short- Physiol. Rev. 81 : 1031–1063. 16. Waspodo I., 2004. Agar Probiotik Menyehatkan Saluran Cerna dalam Harian Kompas (6 November 2004).

10