Arifin Wibowo, Aulanni am, Masdiana C. Padaga Program Studi Pendidikan Dokter Hewan Universitas Brawijaya

Pengaruh Pemberian Ekstrak Air Buah Kesemek Junggo (Diospyros kaki L.f.) terhadap Ekspresi Interleukin-1 Beta (IL-1β) dan Gambaran Histopatologi Jaringan Sendi Tikus (Rattus norvegicus) Artritis

Effect of Water Extract Junggo Persimmon Fruit (Diospyros kaki L.f.) Of Interleukin-1 Beta (IL-1β) Expression and Arthritis Rat (Rattus novergicus) Joint Histopathology Arifin Wibowo⃰, Aulanni’am, Masdiana C. Padaga Program Studi Pendidikan Dokter Hewan Universitas Brawijaya ⃰Email : [email protected]

ABSTRAK Artritis Reumatoid (AR) merupakan penyakit inflamasi kronik yang mengakibatkan degradasi jaringan ikat membran sinovial pada sendi. Buah kesemek memiliki kandungan bahan fitonutrien sebagai antioksidan dan antiinflamasi. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui potensi pemberian ekstrak air buah kesemek terhadap penurunan kadar ekspresi interleukin-1 beta (IL-1β) dan perbaikan gambaran histopatologi jaringan membran sinovial sendi tikus artritis hasil induksi Complete Freund’s Adjuvan (CFA). Penelitian ini mengunakan hewan coba tikus yang dikelompokan menjadi 4 kelompok yaitu kelompok kontrol, kelompok artritis, kelompok artritis yang mendapat terapi 750 mg/kg BB dan kelompok artritis yang mendapat terapi 1000 mg/kg BB. Hasil penelitian menunjukan bahwa terapi ekstrak air buah kesemek dapat menurunkan kadar ekspresi IL-1β. Dosis terapi 1000 mg/kg BB menunjukkan dosis efektif menurunkan kadar ekspresi IL-1β. Hasil pengamatan pada gambaran histopatologi menunjukan terdapat perbaikan jaringan membran sinovial yang mendapat terapi ekstrak air buah kesemek. Kata kunci : artritis reumatoid, buah kesemek, interleukin-1 beta (IL-1β)

ABSTRACT Rheumatoid Arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease cause synovial membrane degradation of the joints. Persimmon contains phytonutrients as antioxidant and antiinflammatory. The aim of this study was to determine the potential of water extract of persimmon to decrease the levels of interleukin-1 beta (IL-1β) expression and repaired synovial membrane histopathology of arthritis rats induced by Complete Freund's Adjuvant (CFA). This study used rats were divided into 4 groups, the control group, arthritis group, group that received therapy for arthritis 750 mg/kg of body weight and group that received therapy for arthritis 1000 mg/kg of body weight. The results showed that the water extract of persimmon therapy can reduced levels of IL-1β expression. Therapeutic dose of 1000 mg/kg of body weight is effective dose to reduced levels of IL-1β expression. This observation showed that synovial membrane histopathology of arthritis rat were repaired treat with water extract of persimmon. Keywords : rheumatoid arthritis, persimmon, interleukin-1 beta (IL-1β)

1

PENDAHULUAN Artritis Reumatoid (AR) merupakan penyakit autoimun yang bersifat inflamasi kronik-sistemik. Inflamasi kronik menyebabkan hipertropi membran sinovium, sehingga terjadi hambatan aliran darah dan nekrosis sel. Interleukin-1 beta (IL-1β) dan Tumor Nekrosis Faktor-α (TNF-α) adalah sitokin utama yang sering terlibat dalam inflamasi dan merupakan stimulator yang kuat pada sel-sel sinovium (Isbaqio, 2006). Interleukin-1 beta (IL-1β) menginduksi proliferasi sel sinovium dan meningkatkan produksi matriks metalloproteinase (MMP) oleh kondrosit dan sel sinovium sehingga mengakibatkan degradasi tulang rawan sendi. Sitokin ini juga menghambat proses pemulihan tulang rawan sendi melalui penghambatan sintesis protein matriks (Suryana, 2008). Buah kesemek junggo dikenal dengan buah kaki yang merupakan tanaman asli dari China dan Jepang yang kini banyak terdapat di Indonesia, salah satunya di kota Batu Jawa Timur. Buah kesemek junggo (Diospyros kaki L.f.) dipilih dalam penelitian ini karena mengandung senyawa bioaktif paling tinggi khususnya pada polypenol dan tanin (Chen et al., 2008). Buah kesemek juga mengandung fitonutrien sebagai radical scavenging, antioksidan dan antiinflamasi. Antioksidan akan menghambat proses aktifasi sel inflamasi sehingga aktifasi makrofag dalam memproduksi sitokin juga berkurang dan terhambatnya juga produksi radikal bebas. Oleh karena itu, penelitian ini sangat penting untuk dilakukan untuk mengetahui potensi kandungan Buah Kesemek Junggo sebagai terapi herbal pada penyakit AR berdasarkan kadar IL-1β dan gambaran histopatologi jaringan sendi. Penelitian ini melakukan pengujian pengaruh ekstrak air buah kesemek pada hewan model tikus artritis. Adjuvant Induced Arthritis (AIA) telah dilaporkan sebagai model eksperimen dalam mengembangkan studi AR. Pada hewan coba, induksi Complete Freund’s Adjuvant (CFA) menyebabkan respons inflamasi (Prabowo, 2005). Tujuan penelitin ini untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak air buah kesemek junggo (Diospyros kaki L.f.) terhadap ekspresi interleukin-1 beta (IL-1β) dan gambaran histopatologi jaringan sendi tikus (Rattus novergicus) artritis.

METODE DAN MATERI Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bak pemeliharaan hewan coba, seperangkat alat gelas, seperangkat alat bedah, pengaduk kaca, tabung mikro, tabung polipropilen, vortex, autoklave, mortar, neraca analitik, mikropipet, blue dan yellow tips, disponsable syringe, oven, mikroskop cahaya, botol semprot, tabung reaksi, timer, pipet tetes, rak tabung reaksi, lemari pendingin, pengaduk kaca, corong dan inkubator. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu ekstrak buah kesemek junggo (Diospyros kaki L.f.) dan tikus (Rattus norvegicus) jantan strain Wistar, CFA, antibodi primer, antibodi sekunder berlabel biotin, Strep Avidin-Horseradish Peroxidase (SA-HRP), kromogen 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB), Hematoksilin Eosin (HE), aquades, alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 90%, alkohol 100%, xylol, hidrogen peroksida (H2O2), PFA 4%, BSA 1%, ether, NaCl, Methanol absolute, etanol absolute, xylol, parafin, dan aquades. Hewan coba yang digunakan yaitu tikus (Rattus norvegicus) jantan strain Wistar berumur 8-12 minggu denga berat badan antara 150-250 gram sebanyak 20 ekor, yang diperoleh dari Unit Pengembangan Hewan Percobaan (UPHP) UGM Yogyakarta. Pengunaan hewan coba telah mendapatkan persetujuan laik etik oleh Komisi Etik Penelitian Universitas Brawijaya. Tikus dikandangkan dalam kandang yang berukuran 17,5 x 23,75 x 17,5 cm, diadaptasi terhadap lingkungan selama tujuh hari dengan pemberian makanan berupa ransum basal. Tikus dibagi menjadi empat yaitu kelompok kontrol (A), kelompok artritis (B), kelompok artritis dengan terapi 750 mg/Kg BB (C), kelompok artritis dengan terapi 1000 mg/Kg BB (D). Pembuatan ekstrak air buah kesemek Buah kesemek junggo yang digunakan memiliki usia masak pohon 60 hari dengan ciri warna buah oranye. Buah kesemek yang telah dipilih kemudian dicuci, dikupas kulitnya dan dipotong tipis-tipis. Potongan buah kesemek dioven suhu 37°C selama 24 jam. Ekstrak untuk kelompok tikus C yaitu buah kesemek yang telah kering ditimbang sebanyak 0,75 g (750 mg), dimasukkan ke dalam labu ukur, ditambahkan aquades hingga 50 mL, direbus pada temperatur 70°C hingga air rebusan 2

tinggal 10 mL kemudian disaring sehingga didapatkan ekstrak buah kesemek. Ekstrak untuk kelompok tikus D yaitu buah kesemek ditimbang sebanyak 1 g (1000 mg), dimasukan ke dalam labu ukur, ditambahkan aquades hingga 50 mL, direbus pada temperatur 70°C hingga air rebusan tinggal 10 mL kemudian disaring sehingga didapatkan ekstrak air buah kesemek. Sediaan ekstrak air buah kesemek dipersiapkan setiap hari. Volume pemberian terapi diberikan per oral sebanyak 2 mL per tikus selama 14 hari.

menit sebanyak 3 kali. Direndam dalam 5% BSA, dalam PBS selama 30 menit dan dicuci dalam PBS selama 5 menit sebanyak 3 kali. Preparat direaksikan dengan antibodi primer (Anti rat IL-1β) selama 24 jam dengan suhu 4°C, dilakukan pencucian dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit sebanyak 3 kali. Direaksikan dengan antibodi sekunder berlabel biotin (Anti Rabbit IgG biotin labeled) selama 1 jam suhu ruang. Dicuci dengan PBS selama 5 menit sebanyak 3 kali. Ditambahkan SA-HRP selama 40 menit, dicuci dengan PBS 5 menit sebanyak 3 kali. Cromogen DAB ditambahkan, diinkubasi selama 10 menit lalu dicuci dengan PBS 5menit sebanyak 3 kali. Counterstaining dilakukan dengan Hematoxylen selama 5 menit suhu ruang, dicuci dengan air, dikering anginkan dan terakhir mounting dengan entellan dan pengamatan dilakukan dengan mikroskop.

Injeksi CFA pada tikus Tikus kelompok B, C, dan D diinjeksi 0,1 ml CFA secara intradermal pada ekor tikus. Setelah 7 hari dilakukan injeksi CFA secara intradermal dosis 0,05 ml pada kaki belakang kanan dan 0,05 ml pada kaki belakang kiri, tujuanya untuk meningkatkan respons inflamasi, menyebabkan sel T asesori dan sel B teraktivasi, memacu makrofag melepaskan mediator inflamasi pada sendi kaki tikus. Setelah 7 hari akan muncul gejala artritis yang ditandai dengan pembengkakan kaki belakang dan aktifitas tikus menjadi berkurang.

Pembuatan preparat histopatologi metode Hemaktosilin-Eosin Jaringan sendi tikus dibuat preparat histologi dengan metode pewarnaan Hemaktosilin-Eosin. Perubahan yang diamati adalah membran sinovial.

Pengambilan jaringan sendi kaki Pengambilan jaringan sendi kaki hewan coba tikus dilakukan pada hari ke 15 setelah diterapi mengunakan ekstrak air buah kesemek. Tikus dieuthanasi dengan cara dislokasi pada bagian leher kemudian dilakukan pembedahan. Pembedahan dilakukan pada bagian kaki belakang, tikus diletakkan dengan posisi rebahdorsal, kemudian diambil bagian kaki belakang, diisolasi dan dipotong. Organ kaki belakang yang telah dipotong dibilas dengan NaClfisiologis 0,9%. Kemudian kaki dimasukkan ke larutan PFA 4%.

Analisis data Data yang diperoleh dari hasil pengukuran kadar IL-1β dianalisis dengan uji ANOVA dan apabila didapatkan hasil yang berbeda antar perlakuan dilakuan analisis lebih lanjut dengan uji beda nyata jujur (BNJ)/Uji Tukey (α=0,05) mengunakan SPSS 16.0 For Wiindows (Steel & Torrie, 1995). Analisis gambaran histopatologi jaringan sendi dilakukan secara deskriptif. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil penelitian tentang pengaruh pemberian ekstrak air buah kesemek terhadap IL-1β disajikan pada gambar 1 dan analisis statistika mengunakan uji ANOVA disajikan pada Tabel 1. Gambar 1 (C) kelompok AR yang mendapatkan terapi ekstrak buah kesemek junggo dosis 750 mg/kg BB terlihat penurunan jumlah warna coklat yang terekspresi dibandingkan dengan gambar 1 (B). Gambar 1 (D) kelompok AR yang mendapat terapi ekstrak buah kesemek junggo 1000 mg/kg BB,

Pengamatan ekspresi IL-1β Pengamatan ekspresi IL-1β dengan menggunakan metode imunohistokimia indirect. Preparat jaringan sendi dimasukan secara berurutan pada Xylol I, Xylol II, alkohol bertingkat (100%, 90%, 80%, 70%), kemudian dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit sebanyak 3 kali. Ditetesi H2O2 3% selama 20 menit, dicuci dengan PBS selama 5

3

Gambar 1. Ekspresi interleukin 1 beta (IL-1) pada jaringan sendi kaki tikus AR. Keterangan: A = sendi kaki tikus kontrol; B = sendi kaki tikus AR; C = sendi kaki tikus AR+terapi dosis 750 mg/kg BB dan D = sendi kaki AR+terapi dosis 1000 mg/kgBB. Perbesaran 100x. Anak panah menunjukkan terjadinya ekspresi IL-1β dengan dosis yang lebih besar mampu menurunkan jumlah IL-1β lebih banyak daripada tikus C yang ditunjukkan dengan ekspresi warna coklat gelap yang lebih sedikit. Sesuai dengan penelitian Green dan Flavell (2000) bahwa ekspresi sitokin terjadi pada bagian sitoplasma. Hal ini dikarenakan antigen yang masuk dalam tubuh ditangkap oleh Antigen Precenting Cell (APC), terutama sel dendritik. Setelah menangkap antigen sel dendritik segera melakukan migrasi melalui pembulu limfe aferen menuju kelenjar limfe regional. Sepanjang perjalanannya sel dendritik mengalami proses maturasi sambil mengolah antigen tersebut. Di dalam tubuh sel dendritik antigen ditempatkan dalam fagosom. Fagosom tersebut kemudian berdifusi dengan

lisosom yang mengandung enzim protease, membentuk fagolisosom. Dengan enzim tersebut antigen didegradasi menjadi potoganpotongan pendek peptida. Semetara itu di dalam retikuloendoplasma dibentuk molekulmolekul MHC. Peptida antigen terikat pada molekul MHC membentuk kompleks MHCpeptida. Kompleks tersebut diekspresikan ke permukaan sel. Peptida antigen yang diekspresikan oleh MHC akan dikenali oleh sel imfosit T-CD4+. Peptida antigen akan berikatan dengan T-cell receptor (TcR), semetara MHC akan berikatan dengan molekul CD4+ yang terdapat pada permukaan sel TCD4+. Ikatan ini menimbulkan sinyal yang akan mengaktifkan sel T-CD4+. Sel T-CD4+ yang telah aktif akan memproduksi dan melepaskan sitokin

Tabel 1. Ekspresi Interleukin 1 Beta (IL-1β) pada Tikus Perlakuan Kelompok Perlakuan Rata-rata Ekspresi Penurunan Ekspresi IL- 1β (%) IL- 1β (%) Kontrol (A) 1,657±0,528a 0 Artritis Reumatoid (B) 8,895±0,558c 357 b Artritis Reumatoid+Terapi 750 mg (C) 2,618±0,281 70 Artritis Reumatoid+Terapi 1000 mg (D) 2,335±0,206ab 74 Keterangan: Notasi a, b, dan c menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan antar perlakuan terhadap nilai kadar IL-1 β (p<0.05).

4

Sesuai dengan data Tabel 1 bahwa kelompok AR (B) terdapat perbedaan rata-rata ekspresi dengan kelompok kontrol (A) dalam kondisi normal dan kelompok AR (B) mengalami kenaikan rata-rata ekspresi IL-1β. Pemberian induksi CFA pada hewan model tikus artritis dapat menimbulkan respon imun berupa inflamasi. Peningkatan ekspresi sitokin IL-1β karena keberadaan antigen yang telah difagositosis oleh makrofag yang kemudian difragmen-fragmen sehingga dapat dikenali oleh MHC dalam setiap fragmen-fragmen antigen yang patogen untuk dipresentasikan APC ke sel T dengan mediator CD4+ sehingga sel T aktif. Aktifasi sel T akan berprolifasi menjadi sel T helper I yang menstimulasi makrofag untuk memproduksi sitokin IL-1β dan TNF-α (Baratawidjaja & Rengganis, 2009). Kelompok AR dengan terapi 750 mg/kg BB (C) dan terapi 1000 mg/kg BB (D) terjadi penurunan ekspresi IL-1β berturut-turut sebesar 70% dan 74%. Kelompok D (dosis terapi 1000 mg/Kg BB) menurunkan ekspresi IL- 1β yang lebih tinggi dikarenakan adanya

antioksidan lebih besar dibandingkan kelompok C (dosis terapi 750 mg/kg BB). Antioksidan bekerja melalui penghambatan reaksi autooksidasi lipid yang dihasilkan dari radikal bebas. Secara patomekanisme penyakit AR yang disebabkan karena adanya aktivitas senyawa radikal bebas ini dapat direduksi oleh senyawa antioksidan seperti polifenol dan tanin dalam menghambat kehadiran anion superoksida (O2*-) dan hidrogen peroksida (H2O2) yang berasal dari pembentukan radikal bebas di membran sel dengan cara memutus pembentukan reaksi peroksidasi lipid dan mengubahnya menjadi produk stabil (Xiang, 2011). Sehingga penghambatan mediator inflamasi oleh senyawa antioksidan di dalam mekanisme peradangan AR, dilihatkan dengan dari adanya penurunan kadar IL-1β pada tikus yang diterapi dengan buah kesemek junggo dosis 750 mg/kg BB dan 1000 mg/kg BB. Hasil penelitian tentang pengaruh pemberian ekstrak air buah kesemek (Diospyros kaki L.f.) terhadap gambaran histopatologi mengunakan pewarnaan Hemaktsilin-Eosin (HE) pada Gambar 2.

Gambar 2. Histopatologi membran sinovial. Keterangan: A = sendi kaki tikus kontrol; B = sendi kaki tikus AR; C = sendi kaki tikus AR+terapi dosis 750 mg/kgBB dan D = sendi kaki AR+terapi dosis 1000 mg/kgBB. Perbesaran 100x. Anak panah menunjukkan membran sinovial. 5

Gambaran histopatologi pada 4 kelompok tikus A (kontrol), B (AR), C (AR+terapi dosis 750 mg/kg BB), dan D (AR+terapi dosis 1000 mg/kg BB) pada masing-masing kelompok perlakuan memperlihatkan terdapat perbedaan pada bagian membran sinovial. Hasil penelitian pada tikus kontrol (Gambar 2.A) menunjukkan bentuk normal membran sinovial. Tikus AR (Gambar 2.B) yang diberi CFA menunjukkan kerusakan pada membran sinovial yang di tandai dengan penebalan. Pemberian CFA memberikan pengaruh terhadap hewan coba yang ditunjukkan dengan kerusakan membran sinovial. Hal ini sesuai dengan tulisan Koopman (1997) yang menyatakan bahwa pemberian CFA pada tikus menyebabkan kerusakan membran sinovial dan infiltrasi sel mononuklear yang menyebabkan penenebalan. Kerusakan membran sinovial disebabkan karena pemberian CFA menyebabkan peningkatan sitokin IL-1β yang mampu memicu ekspresi molekul pada sel endotel sehingga leukosit emigrasi didalam membran sinovial. Leukosit didalam jaringan akan mefagositosis antigen yang terdapat didalam sel sehingga menyababkan kerusakkan sel-sel di dalam membran sinovial sehingga membran sinovial menjadi menebal (Burrage et al., 2006). Tikus AR dengan terapi 750 mg/kg (Gambar 2.C) memperoleh hasil perbaikan pada membran sinovial dibandingkan dengan tikus artritis. Tikus AR dengan terapi 1000 mg/kg (Gambar 2.D) menunjukkan perbaikan yang lebih baik daripada tikus terapi 750 mg/kg. Perbaikan membran sinovial yang ditandai dengan penurunan ketebalan dan bentuk yang rata pada tepi membran, perbaikan membran sinovial pada sendi tikus kelompok terapi karena adanya pengaruh pemberian ekstrak air buah kesemek junggo. Ekstrak air buah kesemek junggo memiliki kandungan antioksidan yang mampu mengurangi radikal bebas sehingga dapat mambantu perbaikkan membran sinovial. Antioksidan dalam ekstrak air buah kesemek yaitu polifenol terutama komponen epigallochatekin (EGC), cathekin (C) dan epicathekin (EC). Epigallocatechin-3-Gallate menghambat aktifasi produksi MMP menjadi menurun sehingga kerusakan sendi berkurang (Singh et al., 2002).

KESIMPULAN Pemberian Ekstrak Air Buah Kesemek Junggo (Diospyros kaki L.f.) diperoleh perbedaan yang signifikan terhadap tikus artritis terapi ekstrak air buah kesemek junggo dengan menurunkan ekspresi interleukin 1beta (IL-1β) dan memperbaiki jaringan membran sinovial yang rusak pada sendi tikus artritis. UCAPAN TERIMAKASIH Peneliti mengucapkan terimakasih kepada analis, staff Laboratorium Biokimia dan Laboratorium Molekuler FMIPA Universitas Brawijaya yang telah membantu dan memfasilitasi dalam penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA Burrage, PS, Mix KS, Brinckerhoff CE. 2006. Matrix metalloproteinase: role in arthritis. Front Biosci 11:529–543 Bratawijaya, K.G. 2004. Imunologi Dasar: Autoimunitas. 6 th Jakarta: Gaya baru: p.218 Green, EA & Flavell RA. 2000. The Temporal Importance Of Tnf-A Expression In The development Of Arthritis Reumatoid. J Immunity 12: 459-469. Koopman, W.J. 1997. Arthritis And Allied Condition. A Text Book Of Rheumatology. Prabowo, S. 2005. Pengaruh Stresor Dingin Terhadap Proses Keradangan Pada Arthritis Ajuvan: Penelitian Eksperimental Pada Arthritis Ajuvan (Model Hewan Untuk Arthritis Rematoid). [Tesis]. Iptunair J. Pharm. Singh R, Ahmed S, Islam N, Goldberg VM, and Haqqi TM. 2002. Epigallocatechin3-gallate inhibits interleukin-1β-induced expression of nitric oxide synthase and production of nitric oxide in human chondrocytes: suppression of nuclear factor-κB (NF-κB/p65) activation by inhibiting IκB-α degradation. Arthritis Rheum 46: 2079–2086 Suryana, BPP. 2008. Keseimbangan Sitokin Pro Inflamasi Dan Anti Inflamasi Pada Destruksi Sendi Rheumatoid. Kumpulan 6

makalah temu Jakarta:1-4.

ilmiah

reumatologi.

Steel, R.D.G & J.H. Torrie. 1995. Principles And Procedures Of Statistic. A biometrical Approach. 2nd Edition. Mc Graw Hill Book Co. New York. Xiang N.C., S.H. Wan, H.X. Yuan, B.G. Lin, B.J. Wen. 2011. Antioxidant Research of Persimmon Extraction in Ionizing Radiatio Mice. Abstract J.Advanced Materials Research, 343-344, 1198

7