Áramlási citometria elve Olyan műszer, amely • szuszpendált • egyedi sejtek • fluoreszcens és fényszórási paramétereit méri • nagy sebességgel (akár több ezer sejt/sec)
Fluoreszcens mikroszkópia szuszpendált és szuszpendált kitapadt egyedi sejtek (nincs egyedi sejtek szubcelluláris info.) szubcelluláris info. fluoreszcens és elsősorban fényszórás fluoreszcens Áramlási citometria
Sejtek típusa Sejtszintű feloldás Mért paraméter
Fluorimetria szuszpendált (v. kitapadt) populáció elsősorban fluoreszcens
Sebesség
több ezer sejt/sec
néhány sejt/perc
NA
Manipuláció
szortírozás
egyedi sejtek manipulációja
1/34
Áramlási citometria működési elve
eltérítő kondenzátor lemezek
2/34
Áramlási rendszer köpenyfolyadék
mintafolyadék A köpenyfolyadék koncentrikus körökben veszi körül a mintafolyadékot (lamináris áramlás). Ezáltal a mintafolyadékot az áramlási fej közepére fókuszálja (hidrodinamikai fókuszálás). A hidrodinamikai fókuszálás célja: a sejtek ott haladjanak, ahol a lézer megvilágítja őket. Tintasugár hidrodinamikai fókuszálása
köpenyfolyadék lézerfény
Az áramlási cella felülnézete
3/34
Sejtszeparálás A piezoelektromos kristály rezgése cseppekre bontja a folyadékoszlopot.
A cseppeket a mért fényszórás és fluoreszcens jelek alapján töltik fel pozitív vagy negatív töltéssel.
eltérítő kondenzátor lemezek: állandó feszültség van rajtuk.
4/34
jet-in-air (áramlás a levegőben):
Megvilágítás Az áramlási cella felülnézete
DETEKTOR áramlási fej
emittált fény
.
áramlás a levegőben lézerfény
áramlási fej
nagy NA-jú LENCSE
küvetta
küvetta: az emittált fény sokkal nagyobb %át detektáljuk
.
jet-in-air
lézerfény
kis NA-jú LENCSE
DETEKTOR
lézerfény
5/34
á am
es es n g
A fény és a fluoreszcencia tulajdonságai az elektromos tér iránya
A fény:
a ny á r ri té
mind az elektromos, mind a mágneses tér vektor, azaz van irányuk és nagyságuk
630 nm-es sávszűrő: hu llá mh oss z
fehér fény
at
Fluoreszcencia: gerjesztett állapot
alapállapot
520 nm-es felüláteresztő (LP):
620-640 nm
575 nm-es aluláteresztő (SP): er jed és
irá ny
fehér fény
>520 nm
550 nm-es dikroikus tükör:
>550 nm
a
fehér fény
<575 nm
fehér fény
gerjesztési szűrő
gerjesztési spektrum
<550 nm
emissziós szűrő emissziós spektrum
• A gerjesztést követően a molekula visszajut az első gerjesztett szint legalsó (ún. vibrációs) alszintjére. Minden további folyamat ebből a helyzetből indul. • A fluoreszcencia magasabb hullámhosszú, mint a gerjesztő fény.
hullámhossz 6/34
Detektorok foton
Fotodióda:
Φ
elsődleges (foto)-elektron
μ
elektronok száma × 100 fotonok száma elektronok végső száma × 100 • erősítés (μ): μ = fotoelektronok száma • kvantumhatásfok (Φ): Φ =
sok másodlagos elektron
pl. ha minden dinóda 10 másodlagos elektront bocsát ki, és 8 dinóda van:
depléciós zóna
-
+
μ = 108 • magas kvantumhatásfok
p-típusú
• nulla erősítés
n-típusú
fény indukálta impulzus
A
kétféle üzemmód: 1. nincs feszültség, 2. záró irányú feszültség
- + Fotoelektronsokszorozó (photomultiplier, PMT): katód
ablak •
anód felerősített jel
bejövő fotonok
dinódák a dinódák egyre pozitívabb feszültségen vannak, és a gyorsuló elektronok a dinódákba ütközve másodlagos elektronokat válatanak ki
•
alacsony kvantumhatásfok
•
magas erősítés
Lavina fotodióda (avalanche photodiode):
• a diódára magas záró irányú feszültséget kapcsolnak, és a fotoelektronok annyira felgyorsulnak, hogy másodlagos elektronokat váltanak ki (μ≠0) • a fotodióda és a PMT előnyös tulajdonságait kombinálja • magas kvantumhatásfok • magas erősítés • hátrány: magas sötétáram
7/34
Detektorok összehasonlítása
8/34
Detektorok elrendezése I. Azonos helyen történő gerjesztés esetén sávszűrők
PMT4
PMT3
575 BP
PMT2 525 BP
675 BP 600 DL
550 DL
dikroikus tükrök
PMT1 488 BP
megvilágító lézer cells
A dikroikus tükrökkel a közös sugárból leválasztanak egyet-egyet, amit még egy optikai filterrel tovább szűrnek.
488 DL FSC
Térben szétválasztott gerjesztés esetén detektorok a kék lézer által gerjesztett fotonok számára térben elválasztott lézersugarak
tükör detektorok a vörös lézer által gerjesztett fotonok számára tükör
detektorok a zöld lézer által gerjesztett fotonok számára
9/34
A jel detektálása
A detektoron mért jel:
terület
magasság
szélesség
10/34
Detektorok elrendezése II.
PMT 5
PMT 4 minta
dikroikus tükör
PMT 3
áramlási cella fényszórás detektor
PMT 2 PMT 1 sávszűrő
lézer
11/34
Az adatok tárolása Az adatok elmentése általában ún. FCS (flow cytometry standard) file-ban történik, ahol minden sejtről elmentik az összes mért adatot = list mode file
header $FIL=pi04.LMD $INST=EPICS DIVISION OF COULTER CORPORATION $CYT=Elite $DATE=04-Jan-80 $BTIM=19:21:30 $SRC=tr110901 $SMNO=1 TESTNAME=Peter FITC/pmt4 lin/log TESTFILE=Pe000093.PRO $BYTEORD=12 $DATATYPE=I $NEXTDATA=0 $MODE=L $P1N=FS $P1S=FS $P1R=1024 $P1B=16 $P1E=0,0 $P2N=PMT1 . . . $TOT=25114
adatok 1. sejt 2. sejt 3. sejt . . .
FSC 674 898 648
SSC 334 393 417
FL1 873 799 937
...
12/34
Az adatok megjelenítése I.
• összenyomja a skálát a magas értékeknél
Egydimenziós ábrázolási mód: hisztogram ugyanazon adatok logaritmikus skálán
A logaritmikus skála előnye:
• sok biológiai paraméter lognormális eloszlást mutat, ez log skálán haranggörbének látszik.
lineáris skálán
133
75
Hátránya:
50
• nulla és negatív számokat nem tud ábrázolni
Count
100
Count
177
89 44
25
0
• ún. binning artefaktum
0 0
10
1
10
2
10 FL4-H
3
10
4
10
1
501
1001 FL4-H
1500
200
Megoldás: olyan skála, amely alacsony értékeknél lineáris, magasaknál logaritmikus: hiperlog skála (Cytometry, 64A, 34)
Binning artefaktum: úgy tűnik, hogy az alacsony intenzitású populáció elnyúlik balra, és az első csatornában sok sejt halmozódik fel.
HL =
r ⎛ r⎞ lg⎜1 + x + b ⎟ d ⎝ d⎠ 13/34
Kétdimenziós ábrázolási módok:
Az adatok megjelenítése II.
1. dotplot: a két tengelyen egy-egy mért paramétert tüntetünk fel, az ábrán minden pont egy sejtnek felel meg.
2. density plot: az ábrán minden pont színe a sejtek számát jelenti 4
10
4
10
3
10 3
FL4-H
FL4-H
10
2
10
2
10
1
10 1
10
0
10 0
10
1
10
2
10 FL1-H
3
10
4
10
3. contour plot: az azonos sejtszámú pontokat vonalakkal kötik össze 4
10
1
10
2
10 FL1-H
3
4
10
10
4. 3D (surface, felszín) ábra: a sejtek számát a z tengelyen ábrázolják (ritkán alkalmazott) 18
3
14
Count
FL4-H
10
2
10
1
9
5
10
0 0
10
1
10
2
10 FL1-H
3
10
4
10
100
101
102 FL1-H
103
104
10E0
FL4-H
14/34
Kapuzás
1024
32
Az összes lemért sejt FL4 eloszlása.
24
Count
512
16
lympho 256 8
0
0
256
512 FSC-H
768
1024
0 0
Csak a piros kapun (limfociták) belül levő sejtek FL4 eloszlása.
10
1
10
2
10 FL4-H
3
10
4
10
16
12
Count
SSC-H
768
8
4
0 0
10
1
10
2
10 FL4-H
3
10
4
10
15/34
Áramlási citométerek
Coulter Epics Elite
Becton Dickinson FacsVantage DiVa
Becton Dickinson FACScan
Becton Dickinson FacsArray
16/34
488 nm-es gerjesztés
543 nm-es gerjesztés
A488, exc. A488, em. A546, exc. A546, em
80
40
500-560 BP
A488channel = I A488 + I A546 × S A546→ A 488 A488channel – mért fl. int. az A488 csatornában
20 0 400
Ha egyszerre két fluoreszcens festéket (Alexa488, Alexa546) vizsgálunk, a legtöbb esetben a mért fluoreszcencia intenzitás mindkét festék hozzájárulását tartalmazza.
IA488, IA546 – az A488 és A546 festékek „tiszta” fluoreszcencia intenzitása 450
500
550
600
650
700
wavelength (nm)
SA546→A488 – spektroszkópiai állandó, ami meghatározza, hogy az A546 festék mennyire világít át az A488 csatornába
Hasonló egyenlet írható fel az A546 csatornára is:
A546channel = I A546 + I A 488 × S A488→ A546
3000 2500
Az S faktorokat egyszeresen (pl. csak A488) jelölt mintákkal határozzuk meg, melyek a kompenzáció után vagy vízszintesen vagy függőlegesen helyezkednek el az ábrán.
A546 channel
Fluorescence intensity
100
60
Kompenzáció I.
nem kompenzált
2000 1500 1000
kompenzált
500 0 0
2000
4000
6000
8000 10000
A488 channel
17/34
Kompenzáció II. Kompenzáció során tiszta, átvilágítástól mentes intenzitásokat számítunk ki. Egyszerű eset: egyirányú átvilágítás, tehát pl. SA546→A488≠0, SA488→A546=0
A488channel = I A488 + I A546 × S A546→ A 488 A546channel = I A546
I A 488 = A488channel − A546channel × S A546→ A 488
Bonyolultabb eset: kétirányú átvilágítás, tehát pl. SA546→A488≠0, SA488→A546 ≠ 0
A488channel = I A488 + I A546 × S A546→ A 488 A546channel = I A546 + I A 488 × S A488→ A546
Kétismeretlenes egyenletrendszert kell megoldani. I A488 =
A488channel − A546channel × S A546→ A488 1 − S A546→ A488 × S A488→ A546
I A546 =
A546channel − A488channel × S A488→ A546 1 − S A546→ A488 × S A488→ A546
A logaritmikus skála gyakran félrevezető képet mutat a kompenzációról: úgy tűnik, mintha alulkompenzált lenne.
18/34
Quantum dot-ok (qdot, QD) optikai tulajdonságai
A kompenzáció elkerülhető, ha olyan fluoreszcens festékeket használunk, melyeknek keskeny az emissziós spektrumuk, ezért csak egy fluoreszcens detektor detektálja őket. Ilyenek pl. a quantum dot-ok. exciton vezetési sáv Szélesgerjesztési gerjesztési •• Széles lyuk elektron spektrum
foton
vegyérték sáv
Bohr radius 5.6 nm (CdSe)
spektrum • Keskenyemissziós emissziós • Keskeny csúcs csúcs Nagyfotostabilitás fotostabilitás •• Nagy (nincs (nincs photobleaching) photobleaching)
A széles gerjesztési spektrum miatt egy, pl. 488 nm-es lézerrel több quantum dot gerjeszthető, és a keskeny emissziós spektrumok miatt a fluoreszcencia átfedés nélkül mérhető.
3 nm
5.5 m
19/34
Immunfenotipizálás áramlási citometriával •
szuszpenziós ill. könnyen szuszpendálható sejtek vizsgálatára alkalmas
•
sejtfelszíni antigéneket (ill. fixált és permeabilizált sejtek intracelluláris antigénjeit) monoklonális antitesttel megjelöljük. Klinikai alkalmazásokban általában elsődlegesen jelölt antitesteket használnak.
B
A
C
zöld intenzitás
B
vörös intenzitás
sejtszám
A
C
C B – double negative A – single positive C – double positive B
A Felhasználás: zöld intenzitás
• leukémiák diagnózisa • AIDS diagnosztika (CD4+ limfocita szám) 20/34
Sejtciklus és DNS tartalom analízis sejtmag
1. a sejteket fixáljuk és permeabilizáljuk, hogy a DNS festék hozzáférjen a DNS-hez 2. a DNS festék (pl. propidium jodid) eljut a sejtmagba, és ott sztöchiometrikusan kötődik a DNS-hez 3. a mért fluoreszcencia intenzitás arányos a sejt DNS tartalmával Alkalmazási terület: • daganatos sejtek • a normálisnál magasabb DNS tartalommal rendelkeznek • magasabb S és G2/M aránnyal rendelkeznek • apoptotikus sejtek sub-G1 DNS tartalommal rendelkeznek
G1%=79% S%=16% G2/M%=3% G1 intensity=216
humán diploid sejt
G1%=40% S%=39% G2/M%=20% G1 intensity=309
JIMT-1 (humán emlőtumor sejtvonal) 21/34
FRET donor
akceptor
gerjesztett állapot
alapállapot • A gerjesztést követően a molekula visszajut az első gerjesztett szint legalsó (ún. vibrációs) alszintjére. Minden további folyamat ebből a helyzetből indul. • FRET esetében a donor molekula közelében található egy akceptor molekula, amely sugárzásnélküli energiaátadással átveszi a donor energiáját. • a FRET abban nyilvánul meg, hogy a donor gerjesztését követően az akceptor emittálja a fotont
A FRET sebességi állandóját a következő egyenlet írja le:
k FRET = konst ⋅ Jn −4 k f R −6κ 2 22/34
A FRET mérése áramlási citometriával I. Szenzitizált emisszió: az akceptor gerjesztése a donoron keresztül (az akceptor fluoreszkál a donor gerjesztését követően, FAD – akceptor fluoreszcencia intenzitás donor jelenlétében; FA – akceptor fluoreszcencia intenzitás donor nélkül)
⎛ FAD ⎞ ε Ac A − 1⎟⎟ E = ⎜⎜ ⎝ FA ⎠ ε D cD donor emissziós
Probléma: • nem lehet specifikusan a donort gerjeszteni • nem lehet csak az akceptor fluoreszcenciáját detektálni
Az egyes csatornák közötti átvilágításra korrigálni kell.
akceptor emissziós
akceptor donor gerjesztési gerjesztési akceptor emissziós szűrő
hullámhossz donor gerjesztési donor emisszió az hullámhossz direkt akceptor akceptor csatornában gerjesztés 23/34
A FRET mérése áramlási citometriával II.
I1 (λex , D , λem , D ) =I D (1 − E ) + I A S 4 + I D Eα S 4 S2
donor csatorna
I 2 (λex , D , λem , A ) =I D (1 − E ) S1 + I A S 2 + I D Eα
FRET csatorna
I 3 (λex , A , λem , A ) =I D (1 − E ) S 3 + I A + I D Eα S 3 S1
akceptor csatorna
donor jel akceptor jel FRET jel
S1 =
I 2, D I1, D
S3 =
I 3, D I1, D
S2 =
I 2, A I 3, A
S4 =
I1, A I 3, A
α=
I 2 ε D LD I1 ε A L A
1 ⎡ I1 ( S1 − S 2 S3 ) + I 2 ( S3 S 4 − 1) + I 3 ( S 2 − S1S 4 ) ⎤ E = A= ⎢ 1− E α ⎣ I1 ( S 2 S3 / S1 − 1) + I 2 ( S 4 / S 2 − S3 S 4 / S1 ) ⎥⎦ 24/34
A FRET mérése áramlási citometriával III.
akceptor
FRET
donor
gerjesztés
Donor (pl. CFP)
antitesttel vagy Fab-vel
FRET
emisszió
Akceptor (pl. YFP)
GFP-vel és spektrális variánsaival jelölt fúziós fehérjékkel 25/34
A FRET alkalmazása intracelluláris enzimaktivitás és ionkoncentráció mérésére
Proteáz szenzorok:
Kalcium szenzorok:
FRET YFP
CFP CFP
YFP - Ca2+ pl. kaszpáz szenzitív linker
+ 4 Ca2+
YF
P
FRET
CFP
CFP
nincs FRET YFP
Nature, 388, 882.
26/34
FRET-en alapuló szortírozás Cytometry, 67A, 86.
Unsorted
1000
A
800
800
600
600
FRET
Nem szortírozott gombasejtek populációja, melyben FRET-et mutató és nem mutató sejtek keverednek egymással.
1000
CFP-Kip1
Gomba sejteket YFP-CDK2-vel és CFPKip1-gyel transzfektálunk.
400 200
200 0 0
200 400 600 800 1000
0
200 400 600 800 1000
YFP-Cdk2 1000
CFP-Kip1
Sorted
1000
C
800
800
600
600
FRET
CFP-Kip1
• volt donor és akceptor • nagy volt a FRET csatornában az intenzitás
400 200
Sorted
D
400 200
0
0 0
200 400 600 800 1000
0
200 400 600 800 1000
Relative frequency of cells
YFP-Cdk2
A szortírozott sejtekben csak FRET-et mutató sejtek voltak.
B
400
0
A sejteket az A és B részben feltüntetett kapuknak megfelelően szortíroztuk, és a szortírozást ellenőriztük. Olyan sejteket választottunk ki, ahol
Unsorted
CFP-Kip1
E Sorted
0.08 Unsorted
0.06 0.04 0.02 0.00 0
20
40
60
FRET (%)
27/34
Ionkoncentrációk, membránpotenciál és intracelluláris enzimaktivitás mérése 1. Az indikátor hidrofób, acetoximetilészter (AM) formája átjut a sejtmembránon.
MDR1 pumpa
2. Intracellulárisan aspecifikus észterázok hidrolizálják.
indikátor aspecifikus észteráz
3. A felszabaduló, hidrofil indikátor nem képes az elő sejtek membránján átjutni, ezért intracellulárisan felhalmozódik.
indikátor-AM
4. Az indikátorok egy részének fluoreszcenciája a környezet ionkoncentrációjától függ.
oxonoloxonol5.
6.
oxonol-
indikátor-AM
multidrog rezisztencia mérése: az MDR pumpák kipumpálják a sejtekből az indikátort és/vagy annak AM formáját. A calcein olyan indikátor, amely nem indikál semmit, tehát csak a felhalmozódását mérjük, ill. annak hiányát MDR-t mutató sejtekben. A negatív töltésű oxonol a membránpotenciálnak (Nernst egyenlet) megfelelően oszlik meg a membrán két oldalán. Depolarizáció esetén nő a sejtben levő oxonol mennyisége, így nő a sejtek fluoreszcencia intenzitása.
Indikátor neve
Mért paraméter
BCECF
pH
FURA-2, INDO-1, Fluo-3
Ca2+
SBFI
Na+
PBFI
K+
fluoreszcein-diacetát (FDA)
életképesség, mivel a festék nem (nagyon) érzékeny semmire, csak a felhalmozódását mérjük elő sejteken belül
calcein
multidrog rezisztencia
oxonol
membránpotenciál
28/34
Multiplex bead analízis
bead 2 citokin B
bead 1 citokin A
bead 2 citokin B
bead 1 citokin A
intenzitás 2
3
1
intenzitás 1
bead 2 citokin B
4
2
bead 3 citokin C
bead 3 citokin C
bead 3 citokin C
Minden bead populációt külön-külön analizálunk.
sejtszám
bead 1 citokin A
bead 4 citokin D
Különböző színű bead-ek, melyekhez különböző citokinekre specifikus antitest van kötve.
bead 4 citokin D
A beadek keverékéhez egy sejt lizátumát adják. A beadekhez a lizátumban levő mennyiséggel arányos mennyiségű citokin kötődik.
bead 4 citokin D
A mintához a bead-ek színétől eltérű színű fluoreszcens festékkel jelölt, citokin ellenes detektáló antitestet adnak, ami kötődik a bead-hez már kikötött citokinhez.
3 és 2
1
antitest fluoreszcencia int.
4
A bead-eket egyszerre lehet az áramlási citométeren futtatni. Előny: egy sejten belül egyszerre sok citokin (vagy más fehérje) szintje mérhető. 29/34
FCB: fluorescent cell barcoding (fluoreszcens sejt vonalkódolás) Nat. Methods, 3, 361 kevés kék, kevés zöld (A)
kontroll sok kék, kevés zöld (B)
stimulus 1
kevés kék, sok zöld (C)
stimulus 2 sok zöld, sok kék (D)
stimulus 3
A sejteket összekeverjük, és megjelöljük egy eltérő színnel megjelölt antitesttel.
A sejteket fixáljuk, permeabilizáljuk, és megjelöljük különböző színű és koncentrációjú festékekkel.
A
D
B
kék intenzitás
Minden populációt külön-külön analizálunk.
Előny: sejtszám
zöld intenzitás
C
B
D
A
C
• alacsonyabb antitest felhasználás • egyszerre sok minta vizsgálható
antitest fluoreszcencia int.
30/34
In vivo áramlási citometria Daganatsejtek követhetők nyomon nyirokerekben in vivo. Cancer Res 67:8223 (2007) In vivo imaging
Olympus OV100
Fluoreszcensen jelzett sejtek vizsgálhatók élő állatban, és az áramlási citometriához hasonló ábrák készíthetők. Cancer Res 64:5044 (2004), Nat. Rev. Canc. 3: 921 (2003)
31/34
Átmenet a mikroszkópia és az áramlási citometria között
Áramlási citometria: • sok szuszpenziós sejt analízise gyorsan, automatikusan • szubcelluláris felbontóképesség nélkül
Képalkotó áramlási citometria: • áramló sejtekről képeket készít • a sejtek fluoreszcencia intenzitását az áramlási citométerhez hasonlóan megméri, áramlási citométerhez hasonló hisztogram és dot plot formájában megjeleníti • az egy és kétdimenziós hisztogramon kiválasztott sejtek képeit vissza lehet keresni • a sejteken kolokalizációs és morfológiai analízist is lehet végezni
Mikroszkópia: • kevés kitapadt sejt analízise jelentős felhasználói munka árán • szubcelluláris információ Lézer scanning citométer (LSC): • tárgylemezen levő sejteket vizsgál • az egész tárgylemezt (tehát nemcsak egy mikroszkóp látóteret) beszkennel alacsony NA-jú objektívvel • a sejteket automatikusan azonosítja • a sejteken morfológiai és kolokalizációs vizsgálatokat is lehet végezni • a sejtek fluoreszcencia intenzitás adatait az áramlási citométeren megszokott egy- és kétdimenziós hisztogram formájában is meg lehet jeleníteni
sok sejt mérése automatikusan szubcelluláris felbontóképességgel
32/34
Képalkotó áramlási citometria (imaging flow cytometry) 1. A sejtek az áramlási citometriában 3. A sejtek képeit a készülék elmenti... megszokotthoz hasonló áramlási cellában áramlanak. 2. Az áramlási cellában a sejteknek nemcsak az összes (vagy maximális) fluoreszcencia intenzitását mérjük meg, hanem róluk kép is készül. 4. ... és a sejtek fluoreszcencia adatait az áramlási citométerhez hasonlóan elemezhetjük.
33/34
Laser scanning cytometry (LSC) 1. A mikroszkóp tárgylemezt a lézersugár végigpásztázza.
2. Magfestés alapján a sejtmagokat a szoftver azonosítja, és a magot, ill. a körülötte levő citoplazmát körülrajzolja (szegmentálás).
3. A sejtek fluoreszcencia intenzitás értékeit a gép kiszámolja, és az áramlási citométeren megszokotthoz hasonlóan elemzi.
34/34
