Mendelova genetika v příkladech
Aplikace DNA markerů v mykologii a molekulárni taxonomii doc. RNDr. Michal Tomšovský, Ph.D., Ústav ochrany lesů a myslivosti, LDF MENDELU, Brno
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a Státním rozpočtem ČR InoBio – CZ.1.07/2.2.00/28.0018
Co je taxonomie? Dvě pojetí: A) Taxonomie = popis, klasifikace, a kategorizace organizmů podle pravidel nomenklatury. Systematika = taxonomie + evoluční vztahy mezi organizmy + biodiverzita B) Taxonomie = Systematika Nomenklatura = soubor pravidel, jak pojmenovávat a třídit organizmy – binomická nomenklatura (Linné, Systema Naturae 1758) obsažen v International Code of Nomenclature. Existují kódy nomenklatury botanické, zoologické a n. prokaryot.
Proč molekulární taxonomie? Základem klasifikace organizmu by měla být rekonstruovaná fylogeneze dané vývojové linie – taxonomický systém by měl být přirozený. Podobnost ≠ Příbuznost
Vodní obratlovce s hydrodynamickým tělem lze rozlišit podle anatomických znaků. U některých skupin organizmů anatomii použít nelze.
Pojetí druhu Dvě odlišné lidské kultury (domorodý národ a euroamerická vědecká komunita) rozlišují přibližně stejný počet druhů ptáků na Papue N. Guineji [Novotný V.: Papuánské (polo)pravdy 2004] Intuitivní rozlišování druhů na základě vnější podobnosti. Druh - základní taxonomická jednotka, ± přirozená Jaká kritéria se používají pro rozlišování druhů?
Kritéria pro rozlišování druhů Typologická definice druhu – druh vymezen nomenklatorickým typem (typový exemplář) podle pravidel nomenklatury na základě morfologických znaků (popis morfologických znaků).
Definice biologického druhu (Mayr 1982) – zástupci jednoho druhu se mezi sebou pohlavně rozmnožují, zástupci jiných druhů se nerozmnožují (špatně se to zjišťuje v praxi).
Představy o evoluční historii organizmů Pojetí druhu založené na historii
Původní představy byly analogické ke genealogickým Stromům šlechtických rodů.
Kladistika Přirozený systém na základě genealogické příbuznosti = kladogeneze (Hennig 1966) Kladogeneze = postupné odvětvování vývojových linií v rámci linií existujících → hierarchické uspořádání taxonů do vzájemně vnořených skupin. Kladisté nepovažují přítomnost rozlišovacích znaků (anageneze – evoluční novinky specifické pro nové vývojové větve) za důležité. Nevycházejí ze standardních taxonomických kategorií Kladistický druh vzniká odštěpením (speciací) a zaniká vymřením (extinkcí)
Evoluční systematika Spojuje požadavek na vývojovou příbuznost taxonů s požadavkem na přítomnost rozlišovacích znaků. Nepřípustné polyfyletické taxony, parafyletické taxony ± přípustné (nepřípustné v kladistice) Polyfyletický taxon – potomci různých předků
Parafyletický taxon – někteří potomci jednoho předka Monofyletický taxon – všichni potomci jednoho předka
Definice fylogenetického druhu Požadavek na monofyletičnost daného druhu a přítomnost diagnostického znaku (nebo kombinace více znaků) vhodného k rozlišení od jiných druhů. Fylogeneze = vznik a vývoj jednotlivých evolučních linií je předmětem fylogenetiky Nejčastější metodou fylogenetiky je analýza sekvencí DNA
Vznik nových druhů - speciace Alopatrická speciace – genetické rozdíly (reprodukční izolace) mezi druhy vzniknou díky geografické bariéře. Peripatrická s. – část populace druhu osídlí nově vzniklou ekologickou niku (ostrov). Parapatrická s. – část populace málo pohyblivých druhů se nekříží se zbytkem populace a vzniknou genetické rozdíly reprodukční izolace. Tento typ speciace bývá zpochybňován. Sympatrická s. – nový druh se formuje na stejném území. Polyploidizační speciace u rostlin.
Molekulární znaky v taxonomii Výhody: Velké množství znaků (sekvence velkého množství genů) Sekvence různých genů bývají na sobě nezávislé. Znaky jsou často selekčně neutrální = nehrozí nebezpečí vzniku podobných znaků nepříbuzných taxonů na základě selekčního tlaku. Univerzální použitelnost a relativní dostupnost PCR a sekvenování DNA.
Molekulární znaky v taxonomii Příklady využití: 1) Testování morfologického pojetí druhu – vztahy mezi variabilitou morfologickou a molekulární. 2) Testování biologického pojetí druhu – míra genetické příbuznosti kryptických druhů (druhy morfologicky podobné, ale vzájemně se nerozmnožující). 3) Výzkum vzájemných vývojových vztahů dobře odlišitelných druhů podle tradičních kritérií.
Jak se pracuje s DNA? Izolace DNA z houbových buněk –mechanické drcení, extrakce DNA pomocí komerčních kitů (cena cca 100 Kč = 4 Eura / vzorek). Z celkové DNA je třeba namnožit požadovaný úsek genomu. metoda PCR – Polymerase Chain Reaction
(= Polymerázová řetězová reakce)
Sekvenace DNA Sekvenace DNA: Zjištění pořadí nukleotidů v daném úseku DNA … ATATATAGGCAAGGAATCTCTATTATTAAATCATT…
DNA sekvence je užitečná pro identifikaci neznámého organizmu = DNA barcoding. Pro identifikaci organizmu na úrovni biologického druhu je třeba zvolit tzv. konzervativní oblast DNA U hub často sekvenována tzv. ITS oblast ribozomální DNA (rDNA). Neznámou sekvenci DNA lze srovnat s údaji v internetové databázi GenBank pomocí webové aplikace BLAST www. ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html Rozvíjí se databáze UNITE (http://unite.ut.ee/)
Ribozomální DNA Různé podjednotky rDNA (18S, 28S), resp. úsek mezi nimi - tzv. ITS oblast – bývají často sekvenovány. Sekvence pro srovnání jsou volně přístupné na internetu www. ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html .
18S
5.8S
28S
ITS oblast 18S (SSU) a 28S (LSU) – malá a velká podjednotka jsou konzervativnější než ITS1 a ITS2. V taxonomii hub hlavně jaderná LSU (D1/D2 doména) a mitochondriální SSU
Aplikace BLAST – online identifikace sekvencí
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov
Aplikace BLAST – online identifikace sekvencí
Sekvence určena jako Heterobasidion annosum
Kódující sekvence Zpravidla se používají paralelně s ITS. Úseky obsahují exony i introny • • • • •
translační elongační faktor 1-alfa (EF1a;tefa) beta tubulin (tub) RNA polymeráza II, podjednotky 1 a 2 (RPB1, RPB2) glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenáza (GDH) mitochondriální ATP syntáza, 6 podjednotka (ATP6)
Fylogenetické stromy Diagramy znázorňující podobnost sekvencí = příbuznost zkoumaných jedinců. Různé metody zpracování stromů: Distanční metody – převod sekvencí na koeficienty podobnost (např. Neighbor-joining) Znakové metody – pracují s jednotlivými bázemi jako se samostatnými znaky a) Maximální parsimonie (PAUP placený software; MEGA, PhyML - freeware). Metodicky jde o hledání nejjednoduššího řešení a preferování jednodušších hypotéz před složitějšími. b) Maximální věrohodnost - Maximum Likelihood (PAUP; PhyML – freeware) c) Bayesovská analýza (Mr.Bayes - freeware)
Fylogenetické stromy Různé druhy fylogenetických stromů: • Kladogram (z řec. klados = větev) je základní typ stromu, který popisuje příslušnou hypotézu o příbuznosti, aniž by řešil, kdy došlo k štěpení jednotlivých linií a do jaké míry se jednotlivé evoluční linie liší. • Fylogram podává dodatečné (aditivní) informace ve formě délky větví. Délka větve tak odpovídá množství prodělaných evolučních změn. Rychlost mutací a vzniku evolučních novinek totiž není konstantní . Záleží na prostředí, délce trvání generačního intervalu a jiných faktorech. • Dendrogram představuje další formu grafického znázornění kdy koncové uzly představující recentní druhy jsou ve stejné rovině (představující současnost), stejně vzdálené od společného předka. Dendrogram ( z řec. dendron = strom) popisuje průběh evolučních změn v čase, z polohy uzlů lze odečíst kdy došlo ke štěpení jednotlivých evolučních linií. Dendrogramy se pužívají při populačních studiích na vnitrodruhové úrovni Upraveno podle: http://www.zoologie.frasma.cz/fylogeneze
Spongipellis – příkladová studie Fylogram ITS
http://mykoweb.prf.jcu.cz/polypores/photos/spongipellis_lits chaueri1.jpg
V Evropě 4 druhy. Někteří autoři nerozlišují S. litschaueri od S. delectans – ITS a LSU sekvence obou druhů se liší = jsou to odlišné druhy. Vztahy mezi S. litschaueri a S. unicolor ze Severní Ameriky: V USA 2 druhy – západní druh má shodnou ITS sekvenci s S. litschaueri (možná totožný druh). Východní druh = S. unicolor. Oba druhy se liší i velikostí výtrusů.
Spongipellis
LSU fylogram – založený na sekvencích velké podjednotky genu pro ribozomální RNA
S. spumeus – typový druh rodu je evolučně vzdálený od ostatních druhů rodu.
Úskalí molekulární taxonomie Molekulární metody umožňují zkoumat problematiku i biologům bez osobní zkušenosti s danou skupinou organizmů: Práce s herbářovými položkami a jiným archivovaným biologickým materiálem. Může dojít k chybné interpretaci výsledků, pokud chybí detailní znalost problematiky. Řešení: spolupráce mezi „klasickými“ taxonomy a molekulárními fylogenetiky.
Motto na konec ..Skutečnost, že sýkora koňadra má v pozici 30 cytochrom Coxidasy aminokyselinu valin, zatímco sýkora modřinka má ve stejné pozici leucin, může pomocí vhodného technického vybavení zjistit a publikovat i člověk, který se jinak v rybách vůbec nevyzná…. J. Flegr, Evoluční biologie 2005
Děkuji Vám za pozornost
