Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Eegyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszer-tudományi Tanszék
Antioxidáns és szénhidrát transzport, illetve anyagcsere a növényi mitokondriumban és a mikroszómában
Habilitációs tézisfüzet 2014.
Szarka András Ph.D.
1. Bevezetés A C-vitamint, vagy más néven aszkorbinsavat mellékveséből, narancsból és káposztából elsőként Szent-Györgyi Albert izolálta 1928-ban. A tiszta formájában fehér kristályos anyag több fontos biokémiai reakció résztvevője. Kiemelkedő szereppel bír a sejtek antioxidáns kapacitásának biztosításában, mind a növények, mind az állatok esetében, illetve számos enzim kofaktora. Az ember néhány más emlőssel egyetemben (pl.: tengeri malac, gyümölcsevő denevér) elveszítette az aszkorbinsav bioszintézisének képességét, ezért megszerzésére külsődleges, elsősorban növényi, forrásokra szorulunk. Ezeket a tényeket figyelembe véve különösen érdekes, hogy az aszkorbát szintézisére képes állatokban (pl.: patkány) folyó reakciók mintegy négy évtizede ismeretesek, addig a növényekben folyó aszkorbát bioszintézis útvonala 1998-ig ismeretlen volt. Az útvonalat jellegzetes köztitermékeiről D-Mannóz/L-Galaktóz, vagy felfedezőiről SmirnoffWheeler útvonalnak nevezték el (Wheeler 1998). Röviddel a Smirnoff-Wheeler útvonal leírását követően egyértelművé vált, hogy nem ez az egyetlen aszkorbinsav bioszintetikus útvonal, alternatív, kisebb jelentőségű útvonalak is léteznek. Az alternatív útvonalakból származó aszkorbát, azonban nem képes a fő útvonal mutációiból fakadó alacsony aszkorbát szintet kompenzálni (Conklin 1999, Dowdle 2007, Szarka 2013). A Smirnoff-Wheeler útvonal lépései, az utolsó kivételével, a citoszólban játszódnak le. Az utolsó lépést katalizáló enzim, az Lgalaktono-γ-lakton dehidrogenáz (GLDH) a mitokondrium belső membránjában található, szoros kapcsolatban a mitokondriális elektrontranszferrel (Bartoli 2000). A megfelelő aszkorbát szint fenntartásában, a bioszintézis mellett, fontos szerepet kap az aszkorbát (oxidált formáiból történő) reciklálása (Szarka 2012). A bioszintetikus útvonal megismerésével nagyjából azonos időben, a glutation (GSH) függő aszkorbát regenerációs útvonal, az aszkorbát-glutation ciklus, mind a négy enzimének (aszkorbát peroxidáz, monodehidroaszkorbát reduktáz, dehidroaszkorbát reduktáz, glutation reduktáz) mitokondriális (és peroxiszómális) jelenléte is leírásra került (Jimenez 1997). Mindezen megfigyelések egyértelműen arra utaltak, hogy a mitokondrium központi szerepet tölt be a növényi aszkorbát anyagcserében.
2. Facilitált glükóz és dehidroaszkorbát transzport a növényi mitokondriumban A GLDH enzim topológiája ismeretlen, amennyiben aktív helye a mitokondriális mátrix felé néz, az egyrészt egy L-galaktono-1,4-lakton, másrészt egy aszkorbát transzporter létezését veti fel a mitokondrium belső membránjában, hiszen az enzim szubsztrátjának a mátrixba kell jutnia, termékének pedig ki kell onnan kerülnie. Specifikus aszkorbát transzporterre akkor is szükség van, ha az aktív hely a két membrán közti tér felé néz, hiszen az aszkorbinsav jelenlétét több más sejtszervecskével egyetemben a mitokondriumban is leírták (Jimenez 1998, Smirnoff 2000).
2
A mitokondriális aszkorbát regenerációs gépezet működéséhez is elengedhetetlen egy mitokondriális belső membránban található dehidroaszkorbát (DHA)/aszkorbát transzporter, hiszen az oxidált formának a redukció helyszínére a mitokondriális mátrixba kell jutnia. A fenti háttérismereteket követően kezdtük el a feltételezett mitokondriális aszkorbát/DHA transzporter felderítését, karakterizálását. A redukált (aszkorbát) és az oxidált forma (DHA) felvételét összehasonlítva megállapíthattuk, hogy a DHA forma felvétele preferált. Mitokondriális koncentrációja, a felvétel állandósult állapotában, messze meghaladja az extramitokondriális koncentrációt (1 µl/mg fehérje mitokondriális térfogattal számolva (Li 2001)). Ezzel szemben, aszkorbát adagolását követően a mitokondriális koncentráció nem éri el az extramitokondriális szintet (1. ábra). Az aszkorbát felvétel oxidálószerekkel, mint például kálium-ferricianiddal, vagy aszkorbát oxidázzal stimulálható volt. Mind az aszkorbát, mind a DHA felvétel hőmérsékletfüggést mutatott. 1. ábra Aszkorbát (♦), dehidroaszkorbát (▲) és glükóz (■) felvétel a növényi mitokondriumba A kinetikai paraméterek Lineweaver–Burk kalkulációja szerint a DHA felvétel nagyobb affinitású és kapacitású, mint az aszkorbáté (1. táblázat). 1. táblázat A dehidroaszkorbát glukóz felvétel kinetikai paraméterei Ligand Aszkorbát Dehidroaszkorbát Glükóz
KM (mM) 36.1 6.3 9.2
mitokondriális
aszkorbát,
Vmax (nmol/min/mg protein) 2.3 3.3 28.1
Számos olyan anyag hatását megvizsgáltuk, amelyekről leírták, hogy növényi, illetve állati sejtben gátolják az aszkorbát és/vagy DHA transzportját. A nem specifikus anion transzport inhibitor DIDS és NEM nem gyakorolt hatást a DHA mitokondriális felvételére. Ugyanakkor a glükóz és a genistein hatásos gátlószernek bizonyult. A genistein az aszkorbát transzport esetében is hatásos gátlószerként viselkedett, azonban a DIDS és a NEM ez esetben sem mutatott gátlást. 2.1. Mitokondriális glükóz transzport A DHA transzportra gyakorolt gátló hatása miatt megvizsgáltuk a glükóz mitokondriális belső membránon keresztüli transzportját. A radioaktívan jelölt glükóz felvétele hozzávetőleg 25 perc
3
alatt elérte maximumát (1. ábra). A glükóz felvétel kétirányúnak bizonyult és Michaelis– Menten kinetikát mutatott (1. táblázat), továbbá az aszkorbát és DHA transzportfolyamatokhoz hasonlóan a glükóz transzport is hőmérsékletfüggőnek bizonyult. A mitokondriális glükóz transzport esetében a D-mannóz és a 3-O-metil-glükóz gyenge, de statisztikailag szignifikáns gátlást mutatott, míg a többi vizsgált glükóz analóg semmilyen hatást sem gyakorolt. A mitokondriális aszkorbát/DHA transzporthoz hasonlóan a genistein a glükóz transzportjára is markáns gátló hatást gyakorolt. A glükóz transzport inhibitor cytochalasin B részleges gátlást okozott. Mind a DHA, mind a glükóz transzportja hőmérséklet és időfüggést mutatott, kinetikai vizsgálatuk során telíthetőnek bizonyult, specifikus gátlószerekkel gátolható. Mindezen megfigyelések egyértelműen arra utalnak, hogy a transzportfolyamatok fehérje mediáltak. A GLUT gátlószer genistein DHA és glükóz transzportra gyakorolt erős gátló hatása, illetve a glükóz, DHA transzport esetében tapasztalt, gátló hatása arra utal, hogy a két molekula ugyanazon transzporter ligandjai lehetnek.
2.2. A mitokondriális légzés hatása a DHA és glükóz transzportra A mitokondriális transzportfolyamatok számos esetben befolyásolhatók a mitokondriális membránpotenciál megváltoztatásával. Ennek vizsgálata érdekében a mitokondriális DHA és glükóz transzportot nyomon követtük légzési szubsztrát (szukcinát), gátlószer (KCN) és szétkapcsolószer (2,4-dinitrofenol) jelenlétében. A KCN és a 2,4-dinitrofenol nem befolyásolta sem a glükóz, sem a DHA mitokondriális felvételét, a szukcinát az alkalmazott koncentrációban mérsékelten gátolta mindkét anyag transzportját. Az eredmények alapján kijelenthető, hogy a vizsgált transzportfolyamatok függetlenek a mitokondriális légzéstől, membránpotenciáltól.
2.4. Az aszkorbát, DHA és glükóz felvétele mitoplasztok esetében A transzportméréseket elvégeztük BY2 dohány mitokondriumokból készült mitoplasztok esetében is. Az így mért transzport aktivitások mind aszkorbát, mind DHA esetében a mitokondriális transzport aktivitásokhoz hasonlóak voltak, míg glükóz esetében enyhe csökkenést tapasztaltunk. A tény, amely szerint a transzportfolyamatok mitoplasztok esetében ugyanúgy fennállnak, mint mitokondriumok esetében, egyértelműen arra utalnak, hogy a transzporter(ek) a mitokondriális belső membránban foglalnak helyet.
3. A mitokondriális elektrontranszferhez kapcsolt DHA redukció növényi sejtekben A DHA transzporter tehát a mitokondriális mátrixba szállíthatja a döntően, az intermembrán térben keletkező DHA-t. Az ezredfordulót követően állati sejtekből származó mitokondriumok esetében felmerült, hogy a mitokondriális elektrontranszfer láncról származó elektronok is részt vehetnek a mitokondriális DHA redukcióban (Li 2001, 2002).
4
Kísérleteink elején egyértelmű választ szerettünk volna kapni a kérdésre, hogy hasonló jelenség megfigyelhető-e növényi mitokondriumok esetében is? A BY2 dohánysejt mitokondriumok egyértelműen képesek voltak, DHA adagolását követően, szignifikáns redukált aszkorbát szint fenntartására (2. ábra), amely szukcinát mint légzési szubsztrát jelenlétében drasztikus mértékben fokozódott, az aszkorbát képződés első emelkedő szakasza pedig megnyúlt (2. ábra). 2. ábra DHA adagolás kiváltotta aszkorbát produkció növényi mitokondriumban szukcinát, mint légzési szubsztrát távollétében (□), illetve jelenlétében (■) A kísérletek következő fázisában külön-külön határoztuk meg a mátrix és a két membrán közötti tér aszkorbát koncentrációját. A mátrixban mérhető aszkorbát koncentráció elérte a millimolos koncentrációtartományt és hasonló időbeli lefutást mutatott, mint teljes mitokondrium esetén (2. ábra). Az extramitokondriális (IMS) aszkorbát koncentráció ettől jóval alacsonyabbnak bizonyult és 30 perc elteltével folyamatosan csökkent. A komplex I szubsztrát malát, a komplex I inhibitor rotenon, a komplex III inhibitor antimycin A, az alternatív oxidáz inhibitor szalicilhidroxamin (SHAM) sav és a szétkapcsolószer 2,4-dinitrofenol sem gyakorolt hatást a mitokondriális aszkorbát keletkezésre. A szukcinát dehidrogenáz kompetitív gátlószere, a malonát azonban gyakorlatilag teljesen felfüggesztette a szukcinát függő aszkorbinsav keletkezést a mitokondriumban. A komplex IV inhibitor KCN jelentős mértékben fokozta az aszkorbinsav felhalmozódását a mitokondriumban. NADH adagolás segítségével megállapítottuk, hogy sem a komplex I, sem az NDin(NADH), sem az NDex(NADH) nem vesz részt a redukciós folyamatban. A glükóz, a mitokondriális DHA transzport gátlószere mind szukcinát jelenlétében, mind távollétében gátolta a DHA adagolás kiváltotta aszkorbát képződést. ESR méréseink során 1 mM dehidroaszkorbátot tartalmazó mitokondriális szuszpenzióban aszkorbilgyök jelet tudtunk detektálni (3. ábra). 3. ábra Növényi mitokondriumok aszkorbil gyök szintje DHA jelenlétében (A), illetve távollétében (B) A gyökszintet a szukcinát nem befolyásolta, valamint 60 perces inkubációs időn keresztül végig megtartottnak bizonyult. Az aszkorbil gyök teljesen eltűnt KCN hatására. Az aszkorbát oxidációját, mint az aszkorbát koncentráció csökkenését megvizsgálva megállapítottuk, hogy KCN távollétében a mitokondrium rendkívül gyorsan eloxidálta a hozzáadott aszkorbátot, ugyanakkor KCN jelenlétében az aszkorbát szint megtartottnak
5
bizonyult. Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a dehidroaszkorbát hozzáadását követően mérhető aszkorbil gyök szint nem a dehidroaszkorbát redukciója során jön létre, hanem a redukció eredményeképp termelődött aszkorbát mitokondriális oxidációjának következménye. Végezetül az aszkorbát mátrixban, illetve extramitokondriális térben történő megjelenését vizsgáltuk meg a legpotensebb aktivátorok (szukcinát, KCN) jelenlétében. A két anyag eltérő aszkorbát eloszlást eredményezett (4. ábra). Az aszkorbát mátrixban mérhető koncentrációját nem befolyásolta a KCN, azonban 50%-kal megemelte a szukcinát kezelés (4. ábra). 4. ábra Szukcinát és KCN hatása a mitokondriális mátrix (üres terület) és az extramitokondriális tér (sraffozott terület) DHA kiváltotta aszkorbát produkciójára (koncentrációjára)Pontosan ellenkező eredményeket kaptunk az extramitokondriális aszkorbát szint esetében. A szukcinát nem befolyásolta, azonban KCN kezelés hatására az aszkorbát szint közel egy nagyságrenddel megemelkedett (4. ábra). Ezek a megfigyelések megerősítették korábbi sejtésünket, hogy míg a szukcinát a (II-es komplex függő) DHA redukciót fokozza addig a KCN az aszkorbát (két membrán közötti térben bekövetkező) oxidációját (fogyását) gátolja.
4. Kvantitatív adatok a glutation és a komplex II függő aszkorbát reciklálásról növényi mitokondriumban Növényi mitokondriumok esetében eddig két DHA redukciós folyamat, az aszkorbát-glutation ciklus, illetve a komplex II-függő folyamat került részletesen jellemzésre (Foyer 1976, Szarka 2007). A két útvonal inhibitorainak alkalmazása révén mennyiségi adatokat kívántunk nyerni ezen két útvonal DHA redukcióhoz történő hozzájárulásáról. Annak érdekében, hogy meghatározzuk a glutation-függő DHA redukció mértékét, BY2 dohány sejteket kezeltünk a gamma-glutamilcisztein szintetáz (GSH bioszintézist) gátló butioninszulfoximinnel (BSO). A kezelés hatására a celluláris glutation szint drámai mértékben lecsökkent (5. ábra). 5. ábra Kontroll és BSO kezelt BY2 sejtek (a) és belőlük származó mitokondriumok (b) glutation (GSH) tartalma A drámai közel 90%-os celluláris glutation szint csökkenéstől jóval mérsékeltebb glutation szint csökkenést tapasztaltunk
6
mitokondriális szinten (5. ábra). Ez a megfigyelés igen jól szabályozott mitokondriális glutation transzport meglétére utal, mivel a glutation bioszintézise a citoszolban és a plasztiszban folyik. A BSO kezelt és a kontroll sejtekből származó mitokondriumok, DHA redukciós kapacitása között, még kisebb különbséget tapasztaltunk, mint glutation szintjük között. Ez a jelenség megerősíti az alternatív, nem glutation-függő DHA redukciós folyamatok meglétét növényi mitokondriumban. A mitokondriális glutation, DHA redukcióhoz való hozzájárulását, a mitokondriális glutation szint DHA hozzáadására kiváltott változásának nyomon követésével határoztuk meg (6. ábra). 6. ábra Mitokondriális GSH (a) és aszkorbát (b) szint DHA adagolás előtt és 20 perc inkubációs időt követően A metabolizmus bármely szubsztrátjának hiányában ilyenkor a tisztán glutation-függő DHA redukcióról kaphatunk képet a növényi mitokondriumban. A mitokondriális glutation tartalom csökkenése hozzávetőlegesen az aszkorbát produkció egyötödét tette ki (6. ábra). A glutation (csökkenés) így durván az aszkorbát produkció 20%-áért lehet felelős. A DHA redukció fennmaradó része nem glutationfüggő módon valósulhat meg. Az elektron transzferlánc szerepe, kiválóan tanulmányozható az inkubációs közeghez adott II-es komplex szubsztrát, szukcinát, illetve II-es komplex inhibitor malonát és TTFA (thenoiltrifluoroaceton) hatása által. Szukcinát hozzáadására az aszkorbát produkció mintegy 90%-kal megemelkedik, amelyet szinte teljes mértékben fel lehet függeszteni TTFA, vagy malonát együttes adagolásával (7. ábra). 7. ábra Mitokondriális II-es komplex szubsztrát (szukcinát) és gátlószerek (TTFA, malonát) hatása a mitokondriális DHA redukcióra. A megfigyelt szukcinát hatására bekövetkező lökésszerű aszkorbát termelődés egyértelműen a megnövekedett elektronátadás eredménye. Elmondhatjuk, hogy a mitokondriális elektrontranszfer lánc szerepét a glutation-függő mitokondriális aszkorbát reciklálásban eleddig méltatlanul alulbecsülték.
7
5. Fokozott ROS termelés és aszkorbát fogyasztás a PPR-40 Arabidopsisban A mitokondriális elektrontranszfer láncban létrejövő bármilyen elektronáramlási nehézség, vagy blokk az elektronok torlódását, redukáltabb elektrontranszfer lánc komponenseket és ezáltal fokozott reaktív oxigénvegyület (ROS) képződést idéz elő (Szarka 2012, 2013, 2014). Kimutattuk, hogy az egyetlen jelenleg ismert mitokondriális III-as komplex mutáns ppr-40 Arabidopsisban, a III-as komplexnél bekövetkező elektron áramlási blokk igen jelentős mértékű reaktív oxigénvegyület (elsősorban H2O2) szint emelkedéssel és lipidperoxidációval jár együtt. A csökkent mértékű III-as komplexen keresztüli elektronáramlás csökkent mértékű légzést (elektrontranszfert) fokozott IV-es komplex (CCO) és alternatív oxidáz (AOX) aktivitást és fokozott (IV-es komplexen bekövetkező) aszkorbátfogyást eredményez (8. ábra). 8. ábra Komplex III blokk következtében kialakult csökkent légzés, fokozott IVes komplex (CCO), alternatív oxidáz (AOX) aktivitás és fokozott (IV-es komplexen bekövetkező) aszkorbátfogyás ppr-40 Arabidopsis mitokondriumokban Az aszkorbátfogyás sebessége tehát több ok miatt is megnő a mutáns növényekben. Egyrészt a magasabb ROS szint eliminálása, másrészt a megnövekedett IV-es komplex aktivitás fogja az aszkorbát DHA-tá (és MDHA-tá) történő oxidációját fokozni. Ennek megfelelően mind mitokondriális, mind sejtszinten jóval csökken és oxidáltabb lesz a Cvitamin szinteket tudtunk mérni a ppr-40 növények (és sejtek) esetében. Ezen előzmények ismeretében nem volt meglepő, hogy az aszkorbát (DHA-ból történő) regenerációjáért felelős glutation függő folyamat, a aszkorbát-glutation ciklus minden enzimének emelkedet aktivitását tapasztaltuk a mutáns növényekben és az azokból izolált mitokondriumokban a vad típusú növényekhez viszonyítva (9. ábra). A ciklus enzimeinek emelkedett aktivitása együtt járt a redukcióhoz elektronokat szolgáltató (elektrondonor) glutation mitokondriális szintjének emelkedésével a mutáns növényekben.
8
9. ábra aszkorbát-glutation ciklus enzimeinek aktivitása vad típusú és ppr-40 mutáns növényekben, sejtekben és mitokondriumokban. A ppr-40 mutáns növényekben a GLDH enzim mRNS szintje nem változott, viszont aktivitása 25%-kal megemelkedett (10. ábra). Ez a komplex III hiányos mutánsban magyarázható a citokrom c magasabb oxidáltsági fokával. 10. ábra GLDH expresszió (A) és aktivitás (B) vad típusú és ppr-40 mutáns növényekben
9
6. Eltérő mechanizmusú DHA és glükóz transzport Arabidopsis thaliana szuszpenziós sejtkultúrában A mitokondriális rendszerrel kapcsolatban felgyűlt tapasztalatok alapján megkíséreltük a plazmamembránon keresztül zajló C-vitamin és glükóz transzportfolyamatok részletesebb jellemzését. Különböző redox státuszú 14C jelölt C-vitamint (aszkorbát, DHA keveréket) állítottunk elő redukáló/oxidáló szerek segítségével. Lineáris összefüggést találtunk a külső inkubációs közeg DHA tartalma és a transzportra kerülő radioaktivitás (DHA) között (11. ábra). 11. ábra A külső inkubációs közeg DHA tartalma (redox státusza) és a DHA felvétel kapcsolata Ez egyértelművé teszi a sejtek a C-vitamin oxidált formája, a DHA irányába mutatott preferenciáját. Ezt követően az állati sejtek esetében az aszkorbát felvételt gátló 6-bromo-6deoxi-aszkorbát (Corpe 2005) hatását vizsgáltuk meg. Méréseink egyértelműn arra utaltak, hogy a növényi sejtek esetében a gátlószer hatástalan. A következőkben kimutattuk, hogy a DHA transzport telítési kinetikát mutat, egyúttal meghatároztuk a transzport kinetikai paramétereit (Km: 42.9 µM, Vmax: 99.5 µmol/min/mg). A mitokondriális transzporter kinetikai paramétereihez képest a plazmamembrán transzporter jóval nagyobb affinitást és transzport kapacitást mutatott. 100-szoros glükóz és 10-szeres DHA felesleget alkalmazva sem tudtunk kompetíciót kimutatni a két anyag transzportja között. Ezek a megfigyelések eltérő transzportrendszerekre utalnak. A potenciális transzport gátló anyagok közül a phloretin és a cytochalasin B csekély, nem szignifikáns, viszont a genistein koncentrációfüggő módon szignifikáns gátlást mutatott a növényi sejtek glükóz felvétele esetében. A DHA transzport esetében pont ellentétes gátlási profilt figyelhettünk meg, a genistein nem, viszont a cytochalasin B és a phloretin szignifikáns mértékben gátolta a transzportot. Megfigyeléseink igen érdekes eredménnyel zárultak, elsőként írtuk le, hogy a növényi sejtekben két különböző típusú nagy affinitású DHA transzportrendszer létezik: a mitokondriális, amely nagy valószínűség szerint hasonló a glükóz transzporterekhez, illetve a plazmamembránban található, amely egyértelműen különbözik a glükóz transzporterektől.
10
7. Hipotetikus modellünk: A mitokondrium, a mitokondriális elektrontranszfer szerepe a C-vitamin szintézisben, regenerációban; az aszkorbát/DHA redox páros szerepe a mitokondriális elektrontranszferben Eddig elért eredményeink alapján a következő modell valószínűsíthető: a mitokondriális két membrán közötti térben, az APX aktivitás révén keletkező DHA, egy glükóz transzporter segítségével, jut át a belső membránon. A DHA, ezt követően a mitokondriális mátrixban aszkorbáttá redukálódik az aszkorbát-glutation ciklus, vagy a komplex II-ről származó elektronok révén. Az aszkorbát egy része, jelenleg nem pontosan tisztázott körülmények között elhagyja a mitokondriális mátrixot. A két membrán közötti térbe visszajutott (vagy ott lévő) aszkorbát elektronjait a komplex IV-re juttatva oxidálódik (12. ábra). 12. ábra Az aszkorbát-DHA kör hipotetikus összefoglaló modellábrája
A hipotetézis legkevésbé tisztázott eleme az aszkorbát mátrixból történő kijutása. A körfolyamat limitáló lépése minden valószínűség szerint pont ez a lépés, mivel a DHA redukció eredményeként keletkező aszkorbát a mátrixhoz képest jelentős késedelemmel jelenik csak meg az extramitokondriális térben (IMS-ben). Az aszkorbát/DHA redox páros által képviselt elektron áram, egyféle alternatív elektron áramlási útvonalat jelenthet a komplex II bármilyen sérülése, blokkja esetén, elektronokat véve fel a komplex II-nél (a DHA aszkorbáttá történő reduciójával) és elektronokat adva (ezen a kerülő úton keresztül) a komplex IV-nek (az aszkorbát DHA-tá oxidálásával). Összegezésképp elmondhatjuk, hogy a növényi mitokondriális elektron transzfer lánc nemcsak az aszkorbát bioszintézisben, hanem annak regenerációjában is fontos szerepet játszik.
11
8. Mitokondriális invertáz aktivitás és a vele összefüggő cukortranszport folyamatok In silico és genetikai adatok arra utaltak, hogy az invertázok egyik alcsoportja, esetlegesen mitokondriális lokalizációval rendelkezhet (Murayama 2007). Kísérleteink során inveráz aktivitást találtunk frissen izolált csicsóka mitokondrium mátrix alfrakciójában (2. táblázat). 2. táblázat Az invertáz és a mitokondriális markerenzim, fumaráz szubmitokondriális eloszlása csicsóka mitokondriumban Szubmitokondriális frakció Mátrix Belső membrán Külső membrán
Invertáz aktivitás (nmol min-1mg-1) 19.55 ± 0.22 (6) 0.54 ± 0.10 (6) 0.77 ± 0.02 (6)
Fumaráz aktivitás (nmol min-1mg-1) 689 ± 21 (6) 22 ± 12 (6) 26 ± 16 (6)
Az enzimaktivitás pH optimuma, kinetikai paraméterei, valamint inhibitor profilja (a tipikus alkalikus invertáz inhibitorok gátolták a mitokondriális invertáz aktivitást is) alapján az újonnan leírásra került enzim a neutrális invertázok családjába sorolható (13. ábra). 13. ábra A mitokondriális invertáz aktivitás pH optimuma, kinetikai sajátságai Az enzim topológiája miatt vizsgálatainkat kiterjesztettük szubsztrátjának, valamint termékeinek mitokondriális belső membránon keresztüli transzportjára. Bidirekcionális, telíthető, valamint mitokondriális membránpotenciáltól független szacharóz, glükóz és fruktóz transzportot találtunk a mitokondriális belső membránban. A szacharóz transzportot nem tudtuk befolyásolni az ismert proton-szacharóz transzporter gátlókkal. A különböző kinetikai paraméterek, valamint a kereszt-gátlás hiánya arra utalnak, hogy a transzportfolyamatokat három egymástól független transzporter mediálja (3. táblázat). Bakteriális analóg rendszerek alapján arra a vélekedésre jutottunk, hogy a mitokondriális invertáz rendszer – amely a mátrixban található invertáz aktivitásból, valamint a hozzátartozó cukor transzporterekből áll – szerepet játszhat ozmoregulációs folyamatokban, valamint az intermedier anyagcserében.
12
3. táblázat A mitokondriális fruktóz, szacharóz és glükóz felvétel kinetikai paraméterei Ligand Km (mM) vmax (nmol min-1mg-1 protein) Fruktóz 8.4 3.65 Szachatóz 57.1 15.13 Glükóz 10.4 2.89
9. FAD transzport és a FAD szerepe a mikroszómális oxidatív folding elektrontranszfer folyamatában A szekrécióra kerülő fehérjék tekintélyes számú diszulfidkötést tartalmaznak, amelyek szükségesek megfelelő térszerkezetükhöz, stabilitásukhoz és funkcionalitásukhoz. Ezen fehérjék diszulfid kötései az eukarióta sejtek endoplazmás retikulumában (ER) alakulnak ki (Szarka 2011). A cisztein oldalláncok tiol csoportjainak oxidációja folyamatos, a végső elektronakceptor(ok) irányába, folyó elektronáramot kíván meg. Ez az elektronáram egy elektrontranszfer láncon keresztül valósul meg, amely fehérjékből illetve kis mol súlyú komponensekből áll (Szarka 2011, Szarka 2014b). Jól lehet az oxidatív folding gépezet kulcs fehérje komponenseit már azonosították, a kis mol súlyú molekulák, mint lehetséges kofaktorok kémiai természete jelenleg is vita tárgyát képezi. Élesztősejtek esetében felmerül, hogy a FADnak fontos szerepe lehet a folyamatban. Emlős sejtek esetében azonban sem a FAD ER membránon keresztüli transzportját, sem a FAD mikroszómális fehérjékre gyakorolt oxidatív hatását nem vizsgálták még. Ezért célul tűztük ki, hogy ezen folyamatokat patkány mikroszómális vezikulákon megvizsgáljuk. A FAD felvételt a korábbi mitokondriális transzport vizsgálatokhoz hasonlóan végeztük el. A különbség ez esetben az volt, hogy radioaktív jelölés helyett a FAD saját fluoreszcenciáját használtuk fel a molekula detektálására. A kezdeti szakaszt követően a FAD felvétel nagyjából 10 percet követően elérte maximumát (14. ábra). 14. ábra A mikroszómális FAD felvétel időfüggése (A) kontrol (■) DIDS mentes pufferrel mosva (▲), alameticinnel permeabilizálva (⌂) és kiáramlás időfüggése (B) DIDS tartalmú (♦) és DIDS mentes (■) pufferrel mosva.
13
A transzport kétirányúnak bizonyult, az előzetesen FAD-dal feltöltött vezikulák kihígítását követően gyors FAD áramlást tudtunk megfigyelni (14. ábra). A FAD felvételt a DIDS és az atraktilozid szignifikáns mértékben gátolta, míg a NEM és a flufenamát nem mutatott gátló hatást. A FAD adagolás igen kifejezett fehérje tiol oxidációt váltott ki. A FAD felvétel atraktiloziddal történő gátlása megakadályozta a FAD kiváltotta fehérje tiol oxidációt. Így sikerült igazolnunk a FAD felvételt, illetve a FAD szerepét a fehérje tiolok oxidációjában emlős ER vezikulák esetében.
14
Irodalomlista Bartoli CG, Pastori GM, and Foyer CH. Ascorbate biosyn-thesis in mitochondria is linked to the electron transport chain between complexes III and IV.Plant Physiol123: 335–344, 2000. Conklin PL, Norris SR, Wheeler GL, Williams EH, Smirnoff N, and Last RL. Genetic evidence for the role of GDP-mannose in plant ascorbic acid (vitamin C) biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A96: 4198–4203, 1999. Corpe, C.P., Lee, J.-H., Kwon, O., Eck, P., Narayanan, J., Kirk, K.L. and Levine, M. (2005) 6-Bromo-6-deoxy-L-ascorbic acid an ascorbate analog specific for Na+-dependent vitamin C trans-porter but not glucose transporter pathways. J. Biol. Chem. 280, 5211–5220. Dowdle J, Ishikawa T, Gatzek S, Rolinski S, and Smirnoff N. Two genes inArabidopsis thalianaencoding GDP-L-galactose phosphorylase are required for ascorbate biosynthesis and seedling viability.Plant J52: 673–689, 2007. Foyer CH and Halliwell B. The presence of glutathione and glutathione reductase in chloroplasts: a proposed role in ascorbic acid metabolism. Planta133: 21–25, 1976. Jimenez A, Hernandez JA, Del Rio LA, and Sevilla F. Evi-dence for the presence of the ascorbate-glutathione cycle in mitochondria and peroxisomes of pea leaves.Plant Physiol 114: 275–284, 1997. Jimenez A, Hernandez JA, Pastori G, del Rio LA, Sevilla F. Role of the ascorbate-glutathione cycle of mitochondria and peroxisomes in the senescence of pea leaves Plant Physiol. (1998) 118:1327-1335. Li X, Cobb CE, Hill KE, Burk RF, May JM (2001). Mitochondrial uptake and recycling of ascorbic acid.Arch Biochem Biophys 387: 143–153. Li X, Cobb CE, May JM (2002) Mitochondrial recycling of ascorbic acid from dehydroascorbic acid: dependence on the electron transport chain. Arch Biochem Biophys 403: 103–110 Murayama S, Handa H (2007) Genes for alkaline/neutral invertase in rice: alkaline/neutral invertases are located in plant mitochondria and also in plastids. Planta 225:1193–1203 Smirnoff N, Wheeler GL. Ascorbic acid in plants: biosynthesis and function. Crit Rev Biochem Mol Biol. (2000) 35: 291-314 Szarka A, Bánhegyi G (2011) Oxidative folding: recent developments BioMol Concepts 2: 379-390. Szarka A, Banhegyi G, Asard H. (2013) The inter-relationship of ascorbate transport, metabolism and mitochondrial, plastidic respiration. Antioxid Redox Signal, 19(9):1036-44. Szarka A, Bánhegyi G, Sümegi B. Mitochondria, oxidative stress and aging. Orv Hetil. 2014 Mar 23;155(12):447-52. Szarka A, Lőrincz T (2014b) The role of ascorbate in protein folding. Protoplasma 251(3):489-97 Szarka A, Tomasskovics B and Bánhegyi G (2012) The ascorbate-glutathione-α-tocopherol triad in abiotic stress response Int. J. Mol. Sci., 13, 4458-4483. IF: 2.598 Szarka A., Horemans N., Kovács Z., Gróf P., Mayer M., Bánhegyi G. (2007) Dehydroascorbate reduction is coupled to the respiratory electron transfer chain. Physiol. Plant. 129: 225-232. Wheeler GL, Jones MA, Smirnoff N. The biosynthetic pathway of vitamin C in higher plants. Nature. 1998. 393: 365-369.
15
Tézispontok (új tudományos eredmények) 1.
A növényi mitokondrium mind az aszkorbátot, mind a dehidroaszkorbátot felveszi. Az oxidált forma felvétele preferált. A transzport időfüggő, telítési kinetikát mutat és gátolható. Ez alapján kijelenthető, hogy a felvétel, fehérje mediált transzport.
2.
A növényi mitokondrium kétirányú, idő és hőmérsékletfüggő, gátolható glükóz transzportot mutat. A GLUT gátlószer genistein DHA és glükóz transzportra gyakorolt erős gátló hatása, illetve a glükóz, DHA transzport esetében tapasztalt, gátló hatása arra utal, hogy a két molekula ugyanazon transzporter ligandjai lehetnek.
3.
A mitokondriális DHA és glükóz transzport mitoplasztok esetében is megfigyelhető, tehát a belső membránban lokalizált transzporter mediálja, amely működése a mitokondriális membránpotenciálétól (légzéstől) független.
4.
A mitokondriális elektrontranszfer lánc részt vesz a DHA mitokondriális redukciójában. A légzési elektrontranszfer lánc-függő DHA redukció helyszíne a mitokondriális mátrix, elektrondonora a komplex II.
5.
DHA redukció során keletkezett aszkorbát kijut a mitokondriumból és az intermembrán térben hozzájárul a komplex IV elektronellátásához.
6.
A mitokondriális DHA redukcióhoz a glutation függő folyamatok mintegy 20%-ban járulnak hozzá, míg a komplex II függő redukció ettől lényegesen nagyobb mértékű.
7.
A mitokondriális III-as komplex mutáns ppr-40 Arabidopsisban, a III-as komplexnél bekövetkező elektron áramlási blokk igen jelentős mértékű reaktív oxigénvegyület (elsősorban H2O2) szint emelkedéssel és lipidperoxidációval jár együtt.
8.
A ppr-40 Arabidopsisban tapasztalt csökkent mértékű III-as komplexen keresztüli elektronáramlás, csökkent mértékű légzést (elektrontranszfert) fokozott IV-es komplex (citokróm c oxidáz, CCO) és alternatív oxidáz (AOX) aktivitást és fokozott (IV-es komplexen bekövetkező) aszkorbátfogyást eredményez.
9.
A ppr-40 növényeket mind mitokondriális, mind sejtszinten jóval alacsonyabb és oxidáltabb C-vitamin szintek jellemzik.
10. Az aszkorbát (DHA-ból történő) regenerációjáért felelős glutation függő folyamat, a Foyer-Halliwell-Asada ciklus minden enzimének aktivitása megemelkedik a ppr-40 mutáns növényekben és az azokból izolált mitokondriumokban, a vad típusú növényekhez viszonyítva. A ciklus enzimeinek emelkedett aktivitása együtt jár a redukcióhoz elektronokat szolgáltató (elektrondonor) glutation mitokondriális szintjének emelkedésével a mutáns növényekben.
16
11. A C-vitamin bioszintézis utolsó lépését katalizáló, mitokondriális L-galaktono-1,4lakton dehidrogenáz enzim mRNS szintje nem változik meg a ppr-40 mutáns növényekben, azonban aktivitása mintegy 25%-kal megemelkedik feltehetően az oxidáltabb citokrom c miatt. 12. Növényi sejtek esetében a plazmamembránon keresztüli C-vitamin transzport lineáris összefüggést mutat a külső inkubációs közeg DHA tartalma és a transzportra kerülő DHA mennyisége között, amely egyértelműen bizonyítja a sejtek, a Cvitamin oxidált formája, a DHA irányába mutatott transzport preferenciáját. 13. 100-szoros glükóz és 10-szeres DHA felesleget alkalmazva sem mutatható ki kompetíció a két anyag plazmamembránon keresztüli transzportja között. Ez, valamint az eltérő inhibíciós profil bizonyítja, hogy a növényi sejtekben két különböző típusú nagy affinitású DHA transzportrendszer létezik: a mitokondriális, amely nagy valószínűség szerint hasonló a glükóz transzporterekhez, illetve a plazmamembránban található, amely egyértelműen különbözik a glükóz transzporterektől. 14. A növényi mitokondriumban egy aszkorbát/DHA redox párból álló komplex III-at megkerülő elektrontranszfer út létezhet. A kerülőút limitáló lépése nagy valószínűség szerint az aszkorbát mátrixból történő kijutása. Ezt bizonyítja, hogy a DHA redukció eredményeként keletkező aszkorbát a mátrixhoz képest jelentős késedelemmel jelenik csak meg az extramitokondriális térben (IMS-ben). 15. A növényi mitokondriális mátrixban inveráz aktivitás mutatható ki. Az enzimaktivitás pH optimuma, kinetikai paraméterei, valamint inhibitor profilja alapján az újonnan leírásra került enzim a neutrális invertázok családjába sorolható. 16. A mitokondriális invertáz aktivitás kiszolgálására kétirányú, telíthető, valamint mitokondriális membránpotenciáltól független szacharóz, glukóz és fruktóz transzport található a mitokondriális belső membránban. A különböző kinetikai paraméterek, valamint a kereszt-gátlás hiánya arra utalnak, hogy a transzportfolyamatokat három egymástól független transzporter mediálja. 17. Kétirányú FAD transzport létezik az emlős mikroszómális membránon keresztül. A transzport a mitokondriális FAD transzport gátló atraktiloziddal illetve az aniontranszporter gátló 4,4’-Diizotiociano-2,2’-stilbén diszulfonsavval (DIDS-sel) gátolható. 18. A FAD felvétel atraktiloziddal történő gátlása megakadályozza a FAD kiváltotta fehérje tiol oxidációt, amely igazolja a FAD szerepét a fehérje tiolok oxidációjában emlős mikroszómális vezikulák esetében.
17
A tézisekhez kapcsolódó publikációk
1.
Szarka A (2013) Quantitative data on the contribution of GSH and Complex II dependent ascorbate recycling in plant mitochondria Acta Physiol Plant 35: 32453250. IF: 1.524
2.
Szarka A, Banhegyi G, Asard H. (2013) The inter-relationship of ascorbate transport, metabolism and mitochondrial, plastidic respiration. Antioxid Redox Signal, 19(9):1036-44. IF: 7,667
3.
Zsigmond L, Tomasskovics B, Deák V, Rigó G, Szabados L, Bánhegyi G, Szarka A (2011) Enhanced activity of galactono-1,4-lactone dehydrogenase and ascorbate – glutathione cycle in mitochondria from Complex III deficient Arabidopsis. Plant Physiol Biochem 49: 809-815. IF: 2,838
4.
Szarka A, Horemans N, Passarella S, Tarcsay Á, Örsi F, Salgó A, Bánhegyi G. (2008) Demonstration of an intramitochondrial invertase activity and the corresponding sugar transporters of the inner mitochondrial membrane in Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus L.) tubers. Planta 228:765-775. IF: 3,06
5.
Horemans N, Szarka A, De Bock M, Raeymaekers T, Potters G, Levine M, Banhégyi G, Guisez Y. (2008) Dehydroascorbate and glucose are taken up into Arabidopsis thaliana cell cultures by two distinct mechanisms. FEBS Lett. 582:2714-2718. IF: 3,263
6.
Zsigmond L, Rigó G, Szarka A, Székely Gy, Ötvös K, Darula Zs, Medzihradszky KF, Koncz Cs, Koncz Zs, Szabados L (2008) The Arabidopsis PPR domain protein PPR40 connects abiotic stress responses to mitochondrial electron transport Plant Physiol. 146:1721-1737. IF: 6,37
7.
Szarka A., Horemans N., Kovács Z., Gróf P., Mayer M., Bánhegyi G. (2007) Dehydroascorbate reduction is coupled to the respiratory electron transfer chain. Physiol. Plant. 129: 225-232. IF: 2,192
8.
Szarka A., Horemans N., Bánhegyi G., Asard H. (2004) Facilitated glucose and dehydroascorbate transport in plant mitochondria. Arch. Biochem. Biophys. 428: 73-80. IF: 2,635
9.
Varsanyi M, Szarka A, Papp E, Makai D, Nardai G, Fulceri R, Csermely P, Mandl J, Benedetti A, Banhegyi G. (2004) FAD transport and FAD-dependent protein thiol oxidation in rat liver microsomes. J Biol Chem. 279: 3370-3374. IF: 6,482
18
