Uji Efektivitas Antibakteri Ekstrak Daun Kamboja (Plumiera rubra) pada Konsentrasi yang Berbeda Terhadap Pertumbuhan Aeromonas hydrophila secara In Vitro (Antibacterial Effectiveness Test Leaf Extract Frangipani (plumiera rubra) at different concentrations on Growth of Aeromonas hydrophila In Vitro) Wan Nita Ulfani Barus1, Hasan Sitorus2, Indra Lesmana2
1. Program studi Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara 2. Staff pengajar Program studi Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara
ABSTRACT Indonesia the outbreaks of disease in red spotted fish is caused by A.hydrophila bacteria. Many efforts have been made by the experts to address this outbreak by both giving vitamins and giving probiotics and antibiotics. However a prolonged uncontrolled usage and improper dosage may lead to negative impacts to the species. Thus, the use of medicinal plants or fitofarmaka is a solution to overcome these problems. This research aims to know the effectiveness of Frangipani leaf extract (Plumeira rubra) on the growth of bacteria A. hydrophila and to determine the minimum dose of Frangipani leaf extract necessary to inhibit the growth of bacteria. The research was conducted at Laboratory of Fish Quarantine, Quality Control and Fisheries Product Safety Level I, Medan I. The research used a completely randomized experiment method with 6 treatment levels and 3 replications. The research shows that, the Frangipani leaf extract doses has highly significant effect on the growth of bacteria A .hydrophila, and the minimum dose to inhibit the bacteria is 2 % with a clear zone diameter of 6.4 mm. Key words : Effectiveness , Frangipani leaf extract, A. hydrophila
PENDAHULUAN Latar Belakang Potensi perikanan budidaya di Indonesia cukup besar, baik budidaya air tawar, air payau
maupun budidaya laut. Dalam dasa warsa terakhir, hasil tangkapan per satuan upaya (CPU) semakin menurun akibat di beberapa kawasan perairan Indonesia sudah mengalami tangkap lebih (over fishing). Untuk mengatasi hal tersebut, Kementerian Kelautan Perikanan sejak tahun 2010
telah mengembangkan program budidaya perikanan dengan 10 komoditas unggulan ikan budidaya. Program ini dengan berbagai bantuan dan kemudahan dalam penyediaan sarana produksi dan pemasarannya, telah mendorong berkembangnya usaha budidaya di masayarakat mulai dari teknologi tradisional plus hingga teknologi budidaya intensif. Dalam proses budidaya ikan oleh masyarakat, salah satu masalah yang dihadapi adalah terjadinya serangan hama dan penyakit ikan. Menurut Kordi (2010), berkembangnya penyakit ikan dalam proses budidaya ikan pada dasarnya disebabkan terjadinya ketidak seimbangan interaksi faktor lingkungan, mikroba air dan ikan. Ketidak seimbangan ini dapat disebabkan perubahan kualitas air menjadi buruk sehingga mikroba pathogen berkembang dalam air dan menyerang ikan budidaya. Penyakit bakterial pada ikan merupakan salah satu penyakit yang dapat menimbulkan kerugian yang tidak sedikit. Selain dapat mematikan ikan, penyakit ini dapat mengakibatkan menurunnya kualitas daging ikan yang terinfeksi. Bakteri patogen pada ikan dapat menyebabkan infeksi primer atau sekunder. Penyakit akibat infeksi bacteria di Indonesia ternyata dapat mengakibatkan kematian sekitar 50100% (Tanjung et.al., 2008). Tujuan Penelitian Adapun tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui efektivitas bakteristatik ekstrak daun kamboja (Plumiera rubra) terhadap pertumbuhan bakteri A. hydrophila, dan dosis hambat minimal pertumbuhan bakteri secara in vitro
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret - April 2013. Kegiatan ekstraksi daun kamboja dilakukan di Laboratorium Kimia Bahan Alam, Fakultas Matematika Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara, sedangkan proses uji biokimia bakteri serta uji antibakteri ekstrak daun kamboja terhadap bakteri A. hydrophila dilakukan di Balai Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Medan. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah daun kamboja, Isolat Murni Bakteri yang di dapat dari Balai Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Medan I, Media Umum (TSA), akuades, alkohol 70%, Larutan crystal violet, larutan Iodine lugol, larutan safranin, reagen oksidase, O/F basal medium, kertas label, RS medium, larutan KOH 3%, cakram disk, kertas cokelat/kertas ubi, kertas label, plastik, alumunium foil. Alat yang digunakan adalah : cawan petri, laminarflow, rak tabung reasksi, pipet tetes, gelas ukur, tabung reaksi. Bunsen, incubator, jarum ose, preparat, sentripuse, micropore, erlenmeyer, blender, kertas saring, pipet tetes, refrigerator. Prosedur Percobaan Sterilisasi Alat Alat-alat yang akan disterilisasi dicuci terlebih dahulu dengan menggunakan detergen setelah itu dikeringkan. Sebelum dimasukkan kedalam autoklaf,
cawan petri dibungkus dengan kertas sampul dan tabung reaksi ditutup dengan kapas, kemudian dibungkus dengan kertas dan diikat. Alat dimasukkan kedalam ranjang autoklaf, kemudian autoklaf dihidupkan dengan suhu 121 °C selama 20 menit Daun Kamboja Daun Kamboja segar dicuci dan dibersihkan kotoran lain dengan menggunakan air bersih, kemudian daun kamboja diblender sehingga diperoleh air perasannya. Daun Kamboja kemudian disaring dengan menggunakan centrifuse dan ditampung dalam erlenmeyer. Pembuatan Media Media ditimbang 8 g kemudian dilarutkan dengan 200 ml aquades dalam Erlenmeyer kemudian dimasukkan kedalam autoclave digital, kemudian Erlenmeyer ditutup dengan alumunium foil dan disterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 1210C selama 15 menit. setelah selesai media didinginkan di waterbath, Setelah selesai media TSA dituang kedalam petridist didalam Laminary Flow agar tidak terjadi kontaminasi. Uji Biokimia Bakteri Menurut Badan Standarisasi Nasional Indonesia (2009), Uji ini dilakukan untuk mengetahui sifat atau karakteristik bakteri dengan media. Adapun pelaksanaannya sebagai berikut : a. Pewarnaan Gram Cara kerja dari pewarnaan Gram yaitu suspensikan bakteri dengan ose, kemudian letakkan pada obyek dan difiksasi, tetesi dengan larutan Gram A yang mengandung kristal violet, kemudian tetesi dengan larutan Gram B yang mengandung lugol, tetesi dengan larutan Gram C
yang mengandung alkohol, dan yang terakhir tetesi dengan larutan Gram D yang mengandung safranin. b. Uji Motilitas Satu ose bakteri ditanam secara tegak lurus di tengah Medium SIM dengan cara ditusukkan, diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Bila timbul kekeruhan seperti kabut menandakan bakteri bergerak. c. Uji oksidase Menguji oksidase sebelumnya disediakan kertas filter yang telah ditetesi dengan reagent oksidase dan ditempatkan dalam petridisk dan disimpan dalam freezer. Untuk pengujian diambil sedikit isolat murni bakteri menggunakan ose steril lalu diletakkan ke kertas filter tersebut. Selanjutnya diamati perubahan warna yang terjadi, apabila menjadi ungu maka dikatakan positif menghasilkan enzim oksidase, sebaliknya apabila tidak berubah warna maka negatif. d. Uji O/F Ambil isolat murni bakteri dengan ose steril kemudian diinokulasikan pada media O/F dengan cara tusukan kemudian disimpan pada inkubator. Setelah 24 jam penyimpanan, kemudian di amati perubahan warna yang terjadi. Jika kedua tabung media O/F tersebut berubah menjadi kuning, maka bakteri bersifat oksidatif. Jika media tanpa parafin berubah menjadi warna kuning dan media berparafin berubah menjadi biru maka bakteri bersifat oksidatif. Jika media berparafin berubah menjadi kuning dan media tanpa paraffin tetap berwarna hijau, maka bakteri bersifat fermentatif. Apabila keduanya tidak mengalami perubahan maka bakteri dikatakan negatif.
e. Uji Rimmler-Shotts (RS) Isolat bakteri diambil dengan jarum ose steril dan goreskan pada media RS, Kemudian inkubasikan pada suhu 37oC selama 18 jam sampai dengan 24 jam kemudian amati koloni yang tumbuh, apabila bewarna kuning tanpa warna hitam ditengah koloni berarti bersifat positif A. hydrophila. Pembuatan Agar Miring Kedalam tabung reaksi steril dimasukkan 3 ml media TSA steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai sediaan memadat pada posisi miring kira-kira 45 oC (Ditjen POM diacu oleh Mierza, 2011). Peremajaan Biakan Murni Satu koloni bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose steril, lalu ditanam pada media TSA miring dengan cara menggoreskan jarum ose yang mengandung bakteri A. hydrophila kemudian diinkubasi selama 18 - 24 jam pada suhu 3637oC dalam inkubator (Ditjen POM diacu oleh Mierza, 2011). Pembuatan Larutan Suspensi Pembuatan suspensi dilakukan dengan cara mengambil 1 sampai 2 koloni A. hydrophila yang dimasukkan ke dalam larutan NaCl 0,9%. Kemudian, kekeruhan suspensi tersebut dibandi ngkan dengan larutan standar 0,5 McFarland secara berdampingan dengan latar belakang garis-garis bewarna hitam menggunakan mata tanpa bantuan alat. Bila kekeruhan suspensi tersebut tidak cocok dengan turbiditas larutan standar maka dapat ditambahkan koloni A. hydrophila pada suspensi atau mengencerkan suspensi tersebut dengan menambahkan NaCl 0,9%.
Penanaman Bakteri Penanaman Bakteri menggunakan metode cawan sebar (spread plate) . Pada metode cawan sebar, 1 ml suspensi bakteri yang telah diencerkan disebar pada media TSA yang telah disiapkan. Selanjutnya, suspensi dalam cawan petri disebarkan dengan spreader atau hockey stick pada suhu (37 oC) selama 1-2 hari. Uji Daya Hambat Media padat yang telah dipanaskan hingga mencair, didinginkan sampai suhu ± 40OC, dan dituang dalam cawan petri steril. Kemudian ditambahkan 0,1 mL larutan biakan aktif bakteri dan dihomogenkan kemudian dibiarkan hingga memadat. Kertas cakram (diameter 5 mm) diresapkan dalam ekstrak . Kertas cakram tersebut kemudian diletakkan di atas permukaan media bakteri menggunakan pinset dan ditekan sedikit. Media bakteri yang sudah dipasangi bahan antibakteri O diinkubasi pada suhu 37 C selama 18-24 jam. Pembacaan awal dapat dilakukan setelah 6-8 jam. Perhitungan Jumlah Sel Bakteri Sediakan tabung reaksi yang berisi konsentrasi ekstrak daun kamboja sebanyak 6 tabung masingmasing 1 ml kemudian tambahkan larutan yang berisi suspensi bakteri sebanyak 1 ml pada masing- masing tabung di inkubasi 24 jam, kemudian lakukan pengenceran bertingkat dari 10-1, dst. Kemudian pipet 0,1 ml dari masing-masing pengenceran dan letakkan pada cawan petri yang berisi media PCA 15 ml dengan teknik cawan tuang, lakukan dengan memutar dari
kiri ke kanan, lakukan secara duplo diinkubasi 24 jam. Cara menentukan jumlah mikroorganisme per ml suspensi dilakukan dengan jumlah koloni terhitung dengan volume suspensi yang diinokulasi dan dikali dengan pengenceran yang digunakan Analisis Data Validasi Data Untuk mengetahui apakah data-data hasil percobaan homogen atau tidak dan memenuhi asumsi yang telah ditetapkan maka dilakukan analisis homogenitas ragam galat dengan uji Barlett. Bila uji signifikansi memperlihatkan pengaruh nyata atau sangat nyata maka dilanjutkan dengan Uji LSD untuk mengetahui dosis ekstrak daun kamboja yang mengasilkan daya hambat tertinggi terhadap pertumbuhan bakteri A. hydrophila.
terlihat buram dan masih terdapat bintik-bintik).
Gambar 3. Zona hambat A.hydrophila
Perhitungan Populasi Bakteri Berdasarkan pengamatan yang telah dilakukan selama penelitian, didapatkan hasil perhitungan jumlah bakteri A.hydrophila dengan teknik pengenceran sebelum dan sesudah perlakuan ekstrak daun kamboja yang diperlihatkan pada Tabel 4 Bakteri A. hydrophila Sebelum Setelah Perlakuan Perlakuan Perlakuan (sel/ml) (sel/ml) F (10%) 72.0 x 10 4 18.5 x 10 4 4 E (8%) 72.0 x 10 21.0 x 10 4 D (6%) 72.5 x 10 4 26.0 x 10 4 4 C (4%) 72.5 x 10 31.0 x 10 4 B (2%) 72.5 x 10 4 33.5 x 10 4 4 A (0%) 72.0 x 10 297.5 x 10 4 Tabel 4. Populasi
Analisi Variansi Analisi yang digunakan terhadap data yang dikumpulkan adalah analisis variansi, data yang dianalisis adalah data penghambatan pertumbuhan bakteri A. hydrophila. Analisis variansi terhadap data penelitian didasarkan pada model linear aditif Rancangan Acak Lengkap dengan 6 perlakuan dan 3 ulangan. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Pengaruh Ekstrak Daun Kamboja Terhadap Bakteri A. hydrophila Berdasarkan pengamatan yang telah dilakukan selama penelitian, terdapat daerah hambatan, yaitu daerah yang benar-benar tidak ditumbuhi bakteri dan zona yang masih ditumbuhi oleh bakteri yang
Pemberian ekstrak daun kamboja bersifat menghambat pertumbuhan bakteri A.hydrophila, seperti pada Gambar 3 diatas dapat dilihat adanya zona hambat dari ekstrak daun kamboja terhadap bakteri A.hydrophila, hal ini selaras dengan pernyataan Rolliana (2010) yang mengatakan bahwa adanya senyawa flavonoid yang terdapat dalam daun kamboja berfungsi sebagai penghambat pembelahan sel bakteri melalui jalur transduksi dari membran ke inti sel bakteri. Selain
flavonoid, beberapa senyawa yang terkandung dalam daun kamboja yang bersifat bakteristatik adalah alkaloid, terpenoid, dan glikosid. Menurut Saifudin (2006), senyawa alkaloid merupakan salah satu senyawa yang bersifat antibakteri karena dapat merusak dinding sel bakteri, sehingga pembelahan sel terhambat. Berdasarkan pada Tabel 4 tersebut diketahui semakin tinggi ekstrak daun kamboja maka akan semakin sedikit jumlah bakteri yang hidup. Hal ini dapat terlihat pada jumlah bakteri A.hydrophila pada konsentrasi 10%, jumlah bakteri hidup paling rendah, sementara pada perlakuan yang tidak diberikan ekstrak daun kamboja (kontrol), pertumbuhan bakteri berlimpat ganda setelah dilakukan inkubasi. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan : 1. Perlakuan dosis ekstrak daun kamboja berpengaruh sangat nyata terhadap pertumbuhan bakteri A. hydrophila . 2. Daya hambat terbesar dijumpai pada perlakuan dosis ekstrak 10% dengan diameter zona hambatnya 12.2 mm, sedangkan dosis hambat minimal adalah 2 % dengan zona hambat 6.4 mm. 3. Rata-rata zona hambat pertumbuhan bakteri dengan pemberian dosis ekstrak daun kamboja mengalami penurunan seiring dengan menurunnya dosis ekstrak. 4. Dosis hambat minimum adalah 2 % dan populasi jumlah bakteri A.hydrophila yang paling
rendah adalah pada konsentrasi ekstrak daun kamboja 10%. Saran Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan maka dapat disarankan untuk melihat efektifitas ekstrak daun kamboja dalam pengendalian serangan bakteri A. hydrophila pada kegiatan budidaya ikan air tawar, maka perlu dilakukan penelitian lanjutan secara in vivo.
DAFTAR PUSTAKA KKP.
2010. Program Pengembangan Perikanan Budidaya Nasional. Direktorat Jenderal Perikanan Budidaya. Jakarta.
Kordi, M. G.H. 2008. Budidaya Perairan. PT. Citra Aditya Bakti. Bandung Mierza, V. 2011. Uji Antibakteri Ekstrak Etanol dan Fraksi Umbi Bawang Sabrang (Eleutherine Palmifolia Merr.). Tesis. Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. Medan. Rolliana, E.R. 2010. Uji Toksisitas Akut (Plumeria alba L.)Terhadap Larva Artemia salina Leach dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BST). Skripsi. Fakultas Kedokteran UNDIP. Semarang.. Saifudin, A. 2006. Alkaloid : Golongan Paling Prospek Menghasilkan Obat Baru. Departemen Farmakologis.
Gorleus Laboratory. University Leiden. Jerman. SNI,
2009. Badan Standarisasi Nasional Indonesia. Jakarta.
Tanjung,N.K, Sudarno, dan Laksmi, S. 2008. Efektifitas Ekstrak Kulit Jeruk Lemon(Citrus limonum) Terhadap Daya Hambat Pertumbuhan Aeromonas hydrophila Secara In Vitro. Jurnal Berkala Ilmiah Perikanan Vol 3 No 1 April 2008.
