ANIMAL PHYSIOLOGY 2012

Department of Animal Morphology, Physiology and Genetics Faculty of Agronomy Mendel University in Brno

ANIMAL PHYSIOLOGY 2012 Proceedings of International Conference

May 24-25th 2012 Lednice, Czech Republic

Animal Physiology 2012

May 24-25th 2012

ISBN 978-80-7375-616-1

2|P a g e


May 24-25th 2012

Scientific Program Committe: prof. MVDr. Zbyšek Sládek, Ph.D. Mendel University in Brno

doc. MVDr. Karel Jelínek, CSc. Mendel University in Brno

doc. Ing. Jiří Doskočil, CSc. Mendel University in Brno

prof. Ing. RNDr. Vlasta Kroupová, CSc. University of South Bohemia in České Budějovice

prof. MVDr. Ing. Pavel Suchý, CSc. University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno

prof. MVDr. Jaroslav Doubek, CSc. University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno

doc. MVDr. Alena Pechová, CSc. University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno

doc. Ing. Václav Kotrbáček, CSc. University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno

doc. Ing. Jiří Skládanka, Ph.D. Mendel University in Brno

dr. hab. Robert Stawarz, prof. Pedagogical University of Cracow

prof. MVDr. Ing. František Jílek, DrSc. Czech University of Life Sciences Pratur

prof. MVDr. Imrich Maraček, DrSc. University of Veterinary Medicine and Pharmacy in Košice

prof. RNDR. Michal Zeman, DrSc. Comenius University in Bratislava

prof. MVDr. Peter Massányi, Ph.D. Slovak University of Agriculture in Nitra

doc. Ing. Norbert Lukáč, Ph.D. Slovak University of Agriculture in Nitra

prof. Ing. Jan Trávníček, CSc. University of South Bohemia in České Budějovice

prof. MVDr. Ing. Petr Doležal, CSc. Mendel University in Brno

Organising Committee: Ing. Aleš Pavlík, Ph.D. Ing. Petr Sláma, Ph.D.

Reviewers: Ing. Aleš Pavlík, Ph.D. Ing. Petr Sláma, Ph.D. Dr. Ing. Zdeněk Havlíček Prof. MVDr. Zbyšek Sládek, Ph.D.

3|P a g e


May 24-25th 2012

4|P a g e


May 24-25th 2012

CONTENT

INFLUENCE OF OXYTOCIN ON RABBIT REPRODUCTIVE FUNCTIONS Balazi, A.et al. ..........................................................................................................................10 CONCENTRATIONS OF MONITORING INDICATORS IN THE BLOOD SERUM OF HORSES AND THEIR CORRELATION DEPENDENCY Čupka, P. et al. .........................................................................................................................15 EFFECT OF YEAST CULTURE ADDITION IN THE TMR OF PREGNANT COWS ON QUALITY OF COLOSTRUM Doležal, P. et al. .......................................................................................................................20 THE EFFECT OF INCREASED IODINE INTAKE ON THE LEVEL OF GLOBULINS IN SHEEP Dušová, H. et al........................................................................................................................28 THE EVALUATION OF SPERM BULL MOTILITY Filipčík R., Hanuláková Š. .......................................................................................................34 ENDOMETRIAL POTENTIAL FOR CONVERSION OF T TO E2 IN PREGNANT AND CYCLIC PIGS Franczak, A. et al. ....................................................................................................................40 EXPRESSION OF 3Β-HYDROXYSTEROID DEHYDROGENASE (3Β-HSD) AND ANDROSTENDIONE PRODUCTION IN PORCINE ENDOMETRIUM Franczak, A. et al. ....................................................................................................................42 DETECTION OF TILMICOSIN EFFECT ON CELL CULTURES IN VITRO Fülopová, D., et al....................................................................................................................43 ELECTRICAL CONDUCTIVITY AND DYNAMIC VISCOSITY OF STALLION EJACULATE IN THE DEPENDENCE TO QUALITATIVE AND QUANTITATIVE INDICATORS Hanuláková, Š. et al. ................................................................................................................49 THE EFFECT OF ZINC SUPPLEMENTATION ON RUMINAL METABOLISM IN SHEEP Hauptmanová, K. et al..............................................................................................................56 EFFECT OF HETEROTROPHIC CHLORELLA ON CONTENT OF AND LUTEIN ZEAXANTHIN ISOFORMS IN EGG YOLKS Hložková, J. et al. .....................................................................................................................60 5|P a g e


May 24-25th 2012

THE EFFECT OF WELL MANAGED EARLY PUERPERIUM ON HOLSTEIN COW REPRODUCTION AND MILK PERFORMANCE Hošek, M. et al..........................................................................................................................61 EFFECT OF FEED RESTRICTION ON DIGESTIBILITY OF NUTRIENTS AND DEVELOPMENT OF SMALL INTESTINE IN BROILER RABBITS Chodová, D., Tůmová, E. .........................................................................................................66 FOOD RESTRICTION POSITIVELY INFLUENCED CELL MEDIATED IMMUNITY OF JAPANESE QUAIL SELECTED FOR HIGH AND LOW TESTOSTERONE CONTENT IN EGG YOLK Kaňková, Z. et al. .....................................................................................................................72 THE EFFECT OF COPPER IONS ON THE MOTILITY AND SURVIVAL OF BULL SPERMATOZOA IN DIFFERENT CULTURE MEDIA Kňažická, Z. et al......................................................................................................................79 EVALUATION OF BIOCHEMICAL PARAMETERS OF EUROPEAN BROWN HARE (LEPUS EUROPAEUS) Kováčik, A. et al. ......................................................................................................................87 EVALUATION OF FATTY ACID COMPOSITION IN ORGANIC GOAT MILK DURING THE LACTATION PERIOD Králíčková, Š., Kuchtík, J. ........................................................................................................92 METAL CONTENTS IN CANCER OF HUMAN UTERINE CORPUS Kraska K. et al..........................................................................................................................98 DETERMINATION OF MORPHOLOGICALLY ALTERED SPERMATOZOA OF BULLS, RAMS AND STALLIONS Kročková, J., Massányi, P. .....................................................................................................103 THE EFFECT OF DIFFERENT PREPERATIONS FOR THE QUALITY PARAMETERS OF CLOVER SILAGES Kubát, V. et al.........................................................................................................................109 EFFECT OF RABBIT SPERMIOPHAGES ON SEMEN PARAMETERS Kuželová, L.............................................................................................................................115 EFFECT OF NONYLPHENOL AS ENDOCRINE DISRUPTOR ON THE MOTILITY OF BOVINE SPERMATOZOA IN VITRO Lukáčová, J. et al....................................................................................................................120 EXPOSURE OF GRANULOSA CELLS TO THE FUSARIUM TOXINS Medveďová, M. et al...............................................................................................................127 6|P a g e


May 24-25th 2012

HUMAN UMBILICAL VEIN ENDOTHELIAL CELLS IN PHYSIOLOGY RESEARCH Moravčík, R. et al. ..................................................................................................................133 DIFFERENTIAL DEPOSITION OF YOLK TESTOSTERONE IN THE SECOND LAYING CYCLE DEPENDS ON FEMALE QUALITY IN JAPANESE QUAIL Okuliarová, M. et al. ..............................................................................................................139 THE EFFECT OF SUPPLEMENTATION OF DIFFERENT FORMS OF COPPER ON THE GROWTH INTENSITY AND THE CONCENTRATION OF COPPER AND ZINC IN THE BODY OF KIDS Pechová, A. et al.....................................................................................................................145 MORPHOMETRIC PARAMETERS OF OVINE THYROID GLAND WITH DIFFERENT IODINE FOODBORNE INTAKE Peksa Z. et al. .........................................................................................................................151 EFFECT OF T-2 TOXIN ON SOME PARAMETERS OF ANTIOXIDANT STATUS OF PORCINE BLOOD IN VITRO Petruška, P., Capcarová, M. ..................................................................................................157 THE EFFECT OF LOW DOSES OF 2,3,7,8-TETRACHLORODIBENZO-P-DIOXIN (TCDD) AND GENISTEIN ON EXPRESSION OF ARYL HYDROCARBON RECEPTOR PROTEIN IN PORCINE GRANULOSA CELLS Piasecka J. et al......................................................................................................................162 THE LENGTH OF PREGNANCY IN WARMBLOOD MARES Pospíšilová, D. et al. ..............................................................................................................164 CANINE BEHAVIOR IN OPEN SPACES Řezáč, P. et al. ........................................................................................................................167 INFLUENCE OF THE SPECIES AND CONSERVATION ADDITIVES ON THE QUALITY AND SAFETY OF SILAGES Skládanka, J. et al. .................................................................................................................170 EXPRESSION OF CD14 SURFACE RECEPTOR ON APOPTOTIC RESIDENT AND INFLAMMATORY MACROPHAGES FROM BOVINE MAMMARY GLAND Sladek Z., Rysanek D..............................................................................................................176 THE EFFECT OF DIOSMECTITE SUPPLEMENTATION ON IMMUNE RESPONSE IN WEANED PIGLETS Slámová, R. et al.....................................................................................................................181 THE EFFECT OF GLYCEROL ON RABBIT SPERMATOZOA MOTILITY Slanina, T. et al. .....................................................................................................................187 7|P a g e


May 24-25th 2012

DIFFERENCES IN CHARACTERISTICS OF CALCIUM METABOLISM AND EGGSHELL QUALITY IN CZECH HEN AND HYBRID LOHMANN WHITE Svobodová J., Tůmová E. .......................................................................................................192 FUNCTIONAL PARAMETERS OF BULL SEMEN IN RELATION TO THE BODY CONDITION SCORE Špaleková, E. et al. .................................................................................................................196 THE PRENATAL APPLICATION OF RETINOIC ACID AND EMOTIONAL BEHAVIOUR Tomášová, L. et al. .................................................................................................................203 THE EFFECT OF INCREASED IODINE INTAKE ON THYROID ACTIVITY IN SHEEP Trávníček, J. et al. ..................................................................................................................206 THE RELATIONSHIP OF FAT CONTENT IN CARCASS, THIGH MEAT AND BLOOD BIOCHEMICAL PARAMETERS IN CZECH RABBIT GENETIC RESOURCES Tůmová, E. et al......................................................................................................................212 SELECTED SPERMATOZOA MOTILITY PARAMETERS VERSUS CATALASE AND GLUTATHIONE CONTENT IN BOVINE SEMINAL PLASMA Tvrdá, E. et al. ........................................................................................................................217 INFLUENCE OF FACTORS INVOLVED IN THE REGULATION OF PROLACTIN SECRETION ON THE EXPRESSION OF GENES – CODING FOR OPIOID PRECURSORS – IN ANTERIOR PITUITARY CELLS OF THE LATE FOLLICULAR PHASE GILTS IN VITRO Tworus, K. et al. .....................................................................................................................225 THE EVALUATION OF SEMEN COLLECTION AND EJACULATE QUALITY OF HUNTING DOGS Vágenknechtová, M. et al. ......................................................................................................226 FLOW-CYTOMETRIC DETECTION OF THE RABBIT HEMATOPOIETIC STEM CELLS Vašíček, J. et al.......................................................................................................................232 EFFECT OF CATTLE PRODUCTION TYPE ON BLOOD PLASMA BIOCHEMICAL PARAMETERS Vošterová, I. et al. ..................................................................................................................238

8|P a g e


May 24-25th 2012

THE EFFECT OF NUMBER OF LACTATION ON INCIDENCE OF CALF TWIN’S PARTURITION AND STILLBIRTH OF CZECH FLECKVIEH – SIMENTAL DAIRY COWS Zejdová, P. et al......................................................................................................................245 SELECTION APPROACH TO EVALUATION OF EFFECTS OF MATERNAL HORMONES ON PROGENY IN PRECOCIAL BIRDS Zeman, M. et al.......................................................................................................................250 THE MONITORING OF MANGANESSE CONCENTRATION IN GOAT COLOSTRUM AND MILK BY SUPPLEMENTATION OF DIFFERENT FORMS Zvonareva E. et al. .................................................................................................................255

9|P a g e

May 24-25th 2012


INFLUENCE OF OXYTOCIN ON RABBIT REPRODUCTIVE FUNCTIONS Balazi, A. 1,2, Sirotkin, A. V. 1,3 , Pivko, J.1 , Chrenek, P. 1,2 1

Animal Production Research Centre Nitra, Slovak Republic, 2 Faculty of Biotechnology and Food Sciences,

University of Agriculture in Nitra, Slovak Republic,

3

Constantine the Philosopher University, Nitra, Slovak

Republic

Abstract The aim of our study was to examine the influence of oxytocin (OT) administration on rabbit reproductive efficiency, as well as on ovarian folliculogenesis and atresia in rabbits, whose ovarian cycle and ovulation was induced by gonadotropins. Ovarian cycle and ovulation of control rabbits were induced by eCG (equine chorionic gonadotropin, 80IU/female), after 72 hours followed hCG (human chorionic gonadotropin, 150IU/female) administration. Experimental animals received eCG and hCG together with OT (at 50 µg/animal). The animals were euthanized 18-19 hours after artificial insemination. Histological sections of ovaries were prepared and the presence of not ovulated follicles in different stages of atresia was evaluated by light microscopy. The eggs were flushed from the oviducts and cultured up to blastocyst cell stage. Numbers of ovarian Corpora lutea, ovulated oocytes, oocyte-derived zygotes and embryos reaching hatched blastocyst stage were determined. Administration of oxytocin was able to increase the proportion of atretic follicles with luteinisation (34.6% vs. control 18.7%). Furthermore, oxytocin not increased/decreased number of corpora lutea, number of harvested oocytes, zygotes, embryos at morula and blastocyst stage derived from these zygotes after culture. These data demonstrate that oxytocin can stimulate rabbit ovarian follicle atresia, but not ovulation, oocyte, zygote and embryo yield and development.

Key words: oxytocin, follicular atresia, ovarian folliculogenesis, embryo development

Introduction In mammalian ovaries, more than 99% follicles degenerate at various stages of follicular growth and development (Kaipia et al. 1997). Atresia of antral follicles initially involves death of granulosa cells and subsequently thecal cells and oocytes and it involves apoptosis, autophagy and later necrosis and resorption of cell debris by macrophages. Development and atresia of mammalian ovarian follicles and oocytes is therefore a complex

10 | P a g e


May 24-25th 2012

process involving extensive tissue growth and remodelling, fluid accumulation, replication, specialization, differentiation and death of cells (Hatzirodos et al. 2012). Oxytocin belongs to the nonapeptide hormones group. Nonapeptide hormones are important autocrine, paracrine and endocrine regulators of ovarian secretory functions (Wathes and Denning-Kendall, 1992). In the ovary cells of pigs, cattle, rabbits, mice and humans they regulate the secretion of progesterone, estradiol, IGF-I (insulin-like growth factors), prolactin-like substances, prostaglandin F2α, cAMP and cGMP and ovarian autocrine mechanism that regulates folliculogenesis and luteogenesis (Schaeffer and Sirotkin, 1995; Makarevich et al., 2004). In addition, ovarian oxytocin plays a role in the ovulatory process through the formation of PGF2 alpha, which strengthen the contraction of smooth ovarian muscle (Viggiano et al., 1989; Makarevich et al., 2004). Oxytocin was shown to promote ovarian cell proliferation (Makarevich et al., 2004) suggesting their potential stimulatory action on ovarian follicular growth and development, therefore, on fecundity. Oxytocin can not only promote cAMP production, but effects of oxytocin can be mediated by cAMP/protein kinase A-dependent intracellular mechanisms (Makarevich et al., 2004). Therefore, it is possible, that oxytocin, like pharmacological activators of protein kinase A, can be used for stimulation of reproductive processes. Nevertheless, the data concerning effect of cAMP/protein kinase A-dependent mechanisms activators on reproductive efficiency are insufficient, whilst the effect of oxytocin on fecundity seems has not been studied yet. The aim of our study was to examine the influence of administration of oxytocin on reproductive efficiency, fertility and follicular atresia in female rabbits whose ovarian cycle and ovulation was induced by gonadotropins.

Materials and methods

Manipulations with animals New Zeland White rabbits, 3.5 month – 2 years old were bred in individual cages at the local rabbit farm of Animal Production Research Centre Nitra. Female rabbits in the control group were treated 3 days before artificial insemination with eCG ( Werfaser, Alvetra und Werfft AG, Vienna, Austria, at dose 80 IU/doe) followed after 72 hours by hCG (Werfachor, Alvetra und Werfft AG, Vienna, Austria at dose 150 IU/doe). Gonadotropins were dissolved in phosphate-buffered solution (PBS). Control animals were intramuscularly injected only with these gonadotropins (in 0.5 ml saline per doe), whilst experimental females received gonadotropins with oxytocin (Sigma, St. Louis, MI, USA, 50µg/doe in 0.5 ml PBS). 11 | P a g e


May 24-25th 2012

Immediately before administration of hCG females were inseminated by freshly diluted sperm (0.5 ml/female). The animals were euthanized 19-20 hours after artificial insemination. The ovaries were collected, numbers of corpora lutea in both ovaries were determinate by visual inspection and the ovaries were subjected to histological analysis. The pronuclear-stage eggs were flushed from the oviducts with PBS and washed in CIM medium + 10% FBS (Fetal bovine serum, Gibco BRL/Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA). The eggs were cultured in k-DMEM (knock out dulbecco modified eagle´s medium) + 10% FBS at 5% CO2 39°C up to the blastocyst cell stage. Stages of embryogenesis were determined at different time points of culture under a stereomicroscope at 40- or 100-fold magnification.

Histological analysis The ovaries were fixed in 10% formalin for 24 h, washed in flowing tap water for 2 h, dehydratedin 70%, 96% and 100% ethanol (2 h each) and embedded in paraffin or Technovit 7100 (Heraeus Kulzer GmbH&CoKG, Wehrheim/Ts., Germany) according to the manufacturer´s instructions. Thereafter, the ovaries were serially sectioned by using a standard rotation microtome at 5 µm thickness. The sections were subsequently dewaxed, rehydrated and stained with eosin-haematoxylin (Edward Gurr Ltd., London, UK) and embedded to entelan (Merck, Darmstadt, Germany) according Hayat (1993). All tertiary nonovulated follicles, as well as luteinized follicles present on the slides were examined and counted using a Jenaval (Carl Zeiss, Jena, Germany) light microscope. The following stages of their atresia were identified: (1) no or small atresia (no visible pathological changes or some disappearance of mitosis and appearance of nuclear vacuolization), (2) obliteral atresia (degeneration of granulosa layer and dominance of fibrocytes in theca layer), (3) cystic atresia (disappearance of epithelial cells in both granulose and theca layers) and (4) luteinization and atresia associated with luteinization (hypertrophy of both granulose and theca cells and their transformation to corpus luteum).

Statistics Differences between the experimental and control group by follicular atresia were evaluated by chi-square test. Differences of average number of corpora lutea, ovulated oocytes, zygotes, embryos at morula and hatching blastocyst stage per doe were statistically evaluated using t-test in SigmaPlot 11 (Systat Software Inc., Germany). Differences at p< 0.05 were considered as significant. Results are expressed in % or as means ± SEM.

12 | P a g e

May 24-25th 2012


Results Micromorfometric analysis of ovarian slices showed the influence of oxytocin treatment on the follicles occurrence of different classes in the ovary (Table. 1). There were occurred following signs (reduced cell proliferation and appearance of nuclear vacuolization, piknosis of nuclei, degeneration an disappearance of cells by obliteral and cystic atresia, degeneration the follicular wall, light cytoplasm, cell hypertrophy and intensive multiplication of cells by luteinisation and luteinisation-associated atresia), on which base the follicles were classified into four categories (material and methods). The histological data demonstrate that injections of gonadotropins with oxytocin addition significantly increased percentage of follicles with atresia-associated with luteinisation (34.6% vs. control 18.7%). Oxytocin reduced the proportion of healthy or follicles with small atresia, increased percentage of follicles with cystic atresia. On the other hand OT decreased percentage of follicles with obliteral atresia, but this data were insignificant.

Tab. 1: Histopathological changes of rabbit antral follicles after administration of oxytocin Non-

No or small

Obliteral

Cystic

Atresia with

ovulated

atresia

atresia

atresia

luteinisation

follicles

n/% n/%

n/%

n/%

n/% Control

181/100

59/32.6

38/21.0

16/8.8

34/18.8

Oxytocin

205/100

48/23.4

37/18.1

26/12.7

71/34.6*

Values are means±SEM. *- Significant (p≤0,001) differences with control

A treatment of females with gonadotropins and subsequent artificial insemination resulted in ovulation of ovarian follicles, formation of corpora lutea, expulsion of oocytes into the oviduct, and subsequent embryo development in vitro. Administration of gonadotropins with OT did not significantly affect female reproductive parameters. Although OT increased number of zygotes, number of embryos at the morula and hatching blastocyst stage (18.34±0.89 vs. 18.00±1.09; 18.34±0.89 vs. 18.00±1.09 and 18.34±0.89 17.86±1.08 respectively) in comparison to control group, the data were not significant (Table. 2).

13 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab. 2 Effect of oxytocin on rabbit embryo yield and development Corpora

Flushed

lutea/♀

eggs/♀

n

n

n

n

n

Control

23.06±0.95

19.74±1.01

18.00±1.09

18.00±1.09

17.86±1.08

Oxytocin

21.66±1.23

18.34±0.89

18.34±0.89

18.34±0.89

18.34±0.89

Zygotes/♀

Morula/♀

Hatching blastocyst/♀

Values are means±SEM. – without significant differences with control

Since positive effect of oxytocin on ovarian cell proliferation and ovarian hormones release has been well documented (see Introduction), it is not to be excluded, that further studies could show effect of oxytocin on reproductive efficiency.

Conclusion Administration of oxytocin was able to increase the proportion of atretic follicles with luteinisation, but not significantly affects embryos yield. However, it is possible that the effect of OT on reproductive parameters depends on its origin (endogenous or exogenous) and/or from its site of action (intraovarial or administered intramuscularly). Therefore, further examination of oxytocin effect on fecundity is required. Acknowledgement: This work was supported from the grants of Slovak Research and Development Agency: (APVV) LPP-0119-09. References Hatzirodos, N., Nigro, J., Irving-Rodgers, H.F., Vashi, A.V., Hummitzsch, K., Caterson, B., Sullivan, T.R., Rodgers, R.J. Glycomic analyses of ovarian follicles during development and atresia. Matrix Biol, 2012, 31, 45-56. Hayat, M.A. Chapter 7. Staining of Semithin Resin Section, Stains and Cytochemical Methods, Plenum Press, New York and London, 1993, 57-58, ISBN 0-304-44294-9. Kaipia, A., Hsueh, A.J. Regulation of ovarian follicle atresia. Annu Rev Physiol, 1997, 59, 349-363. Makarewich, A.V., Sirotkin, A.V., Franek, J., Kwon, H.B., Bulla, J. The role of oxytocin, protein kinase A, and ERK-related MAP-kinase in the control of porcine ovarian follicle functions, Exp Clin Endocrinol Diabetes, 2004, 112, 108-114. Schaeffer, H.J., Sirotkin A.V. The release of insulin-like growht factor-I by luteinized human granulosa cells in vitro: Regulation by growth hormone, oxytocin, steroids and cAMPdependent intracellular mechanisms, Exp Clin Endocrinol Diabetes, 1995, 103, 361-366. Viggiano, M., Franchi, A.M., Zicari, J.L., Rettori, V., Gimeno, M.A., Kozlowski, G.P., Gimeno, A.L. The involvement of oxytocin in ovulation and in the outputs of cyclooxygenase and 5-lipoxygenase products from isolated rat ovaries, Prostaglandins, 1989, 37 (3), 367-378. Wathes, D.C., Denning-Kendall, P.A. Control of synthesis and secretion of ovarian oxytocin in ruminants. J Reprod Fertil Suppl, 1992, 45, 39-52. 14 | P a g e


May 24-25th 2012

CONCENTRATIONS OF MONITORING INDICATORS IN THE BLOOD SERUM OF HORSES AND THEIR CORRELATION DEPENDENCY Čupka, P.1, Halo, M.2, Stawarz, R.3, Formicki, G.3, Massányi, P.1 1

Katedra fyziológie živočíchov, SPU Nitra, 2Katedra špeciálnej zootechniky, SPU Nitra, 3 Pedagogical

University in Krakow

Abstract In this study 26 sport horses (14 mares and 12 stallions) were included in the trial. The content of Ca, P, Mg, Na, K, Cl, Cu, Cd, Zn, Pb was determined in the blood serum. Levels of monitoring indicators in stallions and mares were balanced. Significant difference (P<0.05) was recorded only in chloride content between stallions and mares. Other differences were statistically non significant. Medium correlation was found between Cl:Cu (stallions, total), Cl:Cd (stallions), Cl:Pb (stallions), Cl:P (mares), Cl:Na (stallions), K:Cu (stallions, total), K:Zn (stallions, total), K:Pb (stallions), K:Ca (stallions, mares), K:P (mares), Na:Pb (stallions, mares), Na:Ca (mares, total), Na:Mg (stallions), Mg:Cd (mares), Mg:Zn (stallions), Mg:Pb (mares), Mg:Ca (stallions), Mg:P (mares, total), Ca:Cu (stallions), Ca:Cd (stallions), Ca:Zn (stallions), Ca:Pb (stallions), Pb:Cu (total), Pb:Cd (stallions), Zn:Cu (mares, total), Zn:Cd (mares, stallions, total), Cd:Cu (stallions, total). A high correlation was found between Cl:Na (mares, total), Pb:Cu (stallions) and Cd:Cu (mare).

Úvod Biochemické ukazovatele sa bežne stanovujú u koní z mnohých dôvodov. Slúžia jednak ako skríningové testy u klinicky zdravých zvierat, na diagnostiku choroby a posúdenia jej závažnosti a dôsledkov. Ich klinický význam a interpretácia je niekedy ťažká a zložitá. Na jednotlivé parametre môže významne vplývať veľa faktorov, ako napríklad pohlavie, vek, plemeno, výživa, fyzická aktivita a podobne. U koní významnú úlohu zohráva minerálny metabolizmus a zásobenie makroprvkami najmä počas tréningovej záťaže. Goščík (1994) uvádza, že počas záťaže dochádza k vyplavovaniu minerálnych látok z tela koňa formou potu. Zvýšeniu strát napomáha teplé a vlhké prostredie. Liter konského potu obsahuje 7,5 – 10,5 g NaCl a 1,5 – 3,5 g KCl. V období intenzívnej záťaže je športovým koňom potrebné zabezpečiť adekvátnu výživu s doplnkami elektrolytov a dostatok vody. Nakoľko sa v krmive vo vyššej miere nachádza draslík, treba dodržať pomer Na:K, ktorý je 4:1.

15 | P a g e


May 24-25th 2012

Cieľom našej práce bolo sledovanie zmien vybraných ukazovateľov v krvnom sére u žrebcov a kobýl, ako aj ich vzájomných korelačných závislostí.

Materiál a metodika Do pokusu bolo zaradených 26 športových koní, z toho 14 kobýl a 12 žrebcov. Od koní sme odoberali krv z v. jugularis 2 hodiny po rannom kŕmení. Krvné sérum sme získali centrifugáciou zrazenej krvi pri 3000 otáčkach za minútu počas 30 minút. Z krvného séra sme stanovili nasledovné parametre : Ca, P, Mg – spektrofotometricky Microlab (DiaSys); Na, K, Cl – ión selektívne – EasyLyte; Cu, Cd, Zn, Pb – atómová absorpčná fotometria. Zo získaných výsledkov sme vypočítali základnú štatistiku, t–test a korelačné závislosti.

Výsledky Priemerné hladiny sledovaných ukazovateľov uvádzame na obrázku 1. Obsah vápnika sa pohyboval od 3,39 (kobyly) do 3,43 (žrebce) mmol.l-1, fosforu od 1,20 (žrebce) do 1,25 (kobyly) mmol.l-1, horčíka 0,83 mmol.l-1 (vo všetkých skupinách), sodíka od 137,32 (žrebce) do 138,19 (kobyly) mmol.l-1, draslíka 4,01 mmol.l-1 (vo všetkých skupinách), chloridov od 101,27 (žrebce) do 102,99 (kobyly) mmol.l-1, medi od 12,59 (žrebce) do 14,16 (kobyly) µmol.l-1, kadmia od 1,87 (kobyly) do 1,96 (žrebce) µmol.l-1, zinku od 33,96 (kobyly) do 34,57 (žrebce) µmol.l-1 a olova od 8,16 (kobyly) do 12,11 (žrebce) µmol.l-1. Preukazný rozdiel (P<0,05) sme zaznamenali len pri obsahu chloridov medzi žrebcami a kobylami. Ostatné rozdiely boli štatisticky nepreukazné. V skupine 11 športových koní Hallo a kol. (2009) sledovali vplyv výživy a tréningu na ich metabolický profil. Tréning koní bol rozdelený na štyri obdobia: I. prípravné obdobie, II. začiatok športovej sezóny, III. koniec športovej sezóny, IV. aktívny odpočinok. Uvádzajú, že počas celého sledovaného obdobia sa obsah sodíka, draslíka a vápnika pohyboval v rámci referenčného rozpätia (Na 140,7 – 143,11, K 4,41 – 4,76, Ca 2,51 – 2,66, P 0,88 – 1,08), čo je v súlade s našimi zisteniami. Pri horčíku zaznamenali hodnoty pod referenčným rozpätím (0,26 – 0,68), čo je v rozpore s našimi zisteniami. El-Deeb a El-Bahr (2010) sledovali u 30 koní rozdelených do dvoch skupín zmeny v hladinách keratín kinázy, AST, LDH, triacylglycerolu, glukózy, celkových bielkovín, albumínu, globulínu, močoviny, kreatinínu, T3, Ca, Na, K, P, Cl u zdravých koní a koní chorých na rabdomyolýzu. U zdravých koní zistili nasledovné hladiny biochemických ukazovateľov: Ca (3,12 ± 0,23 mmol.l-1), Na (144,8 ± mmol.l-1), P (1,30 ± 0,11 mmol.l-1), K

16 | P a g e


May 24-25th 2012

(4,16 ± 0,12 mmol.l-1), Cl (107,50 ± 8,21 mmol.l-1). Nimi zistené údaje sú v plnom rozsahu zhodné s našimi zisteniami.

Obrázok 1 Obsah sledovaných ukazovateľov v sére koní (The content of the parameters in the serum of horses)

Asano et al. (2005) študovali vplyv atrioventrikulárneho bloku (AV blok) na stopové prvky sére koní u dvadsať päť prvkov. Zistili nasledovné hladiny ukazovateľov Ca (2,97 mmol.l-1), Cl (88,4 mmol.l-1), Cu (15,37 mmol.l-1), K (4,3 mmol.l-1), Mg (1,187 mmol.l-1), Na (132,8 mmol.l-1), P (1,15 mmol.l-1), Pb (0,47 mmol.l-1). Nezaznamenali žiadne významné rozdiely v obsahu prvkov v sére sledovaných skupín. Naše údaje sú v súlade s ich zisteniami, len pri chloridoch zaznamenali nižšie údaje v porovnaní s našimi údajmi. Noah et al. (1993) sledovali acidobázický stav, bilanciu tekutín a elektrolytov u plnokrvných dostihových koní po namáhavom výkone. Hladiny sodíka sa pohybovali od 140,4 do 144,8 mmol.l-1, draslíka od 4,06 do 4,18 mmol.l-1 a chloridov od 102,4 do 104,0 mmol.l-1, čo je v súlade s našimi zisteniami. Korelačné závislosti sledovaných ukazovateľov uvádzame na obrázku 2. Medzi Cl:Cu sme zaznamenali stredne silnú závislosť (žrebce 0,378, spolu 0,373), Cl:Cd stredne silnú závislosť (žrebce 0,512), Cl:Pb stredne silnú preukaznú závislosť (žrebce 0,577), Cl:P stredne silnú závislosť (kobyly –0,345), Cl:Na stredne silnú (žrebce 0,552) až silnú preukaznú závislosť (kobyly 0,692, spolu 0,695), K:Cu stredne silnú závislosť (žrebce 0,470; spolu 0,344), K:Zn stredne silnú (žrebce 0,339), stredne silnú preukaznú (spolu 0,382), K:Pb stredne silnú (žrebce 0,515), K:Ca stredne silnú (kobyly 0,420), negatívnu stredne silnú 17 | P a g e

May 24-25th 2012


(žrebce 0,474), K:P negatívnu stredne silnú (žrebce –0,358), Na:Pb stredne silnú (kobyly 0,416; žrebce 0,333), Na:Ca negatívnu stredne silnú (kobyly –0,362; spolu –0,333), Na:Mg stredne silnú (žrebce 0,571), Mg:Cd negatívnu stredne silnú (kobyly –0,441), Mg:Zn stredne silnú (žrebce 0,360), Mg:Pb stredne silnú (kobyly 0,416), Mg:Ca stredne silnú negatívnu (žrebce –0,352), Mg:P stredne silnú preukaznú (kobyly 0,663); stredne silnú vysoko preukaznú (spolu 0,510), Ca:Cu negatívnu stredne silnú (žrebce 0,350), Ca:Cd negatívnu stredne silnú (žrebce 0,447), Ca:Zn negatívnu stredne silnú preukaznú (žrebce –0,637), Ca:Pb negatívnu stredne silnú (žrebce –0,423), Pb:Cu silnú vysokopreukaznú (žrebce 0,798); stredne silnú preukaznú (spolu 0,486), Pb:Cd stredne silnú (žrebce 0,447), Zn:Cu stredne silnú preukaznú (kobyly 0,570; spolu 0,407), Zn:Cd stredne silnú preukaznú (kobyly 0,657; žrebce 0,571); stredne silnú vysokopreukaznú (spolu 0,627), Cd:Cu silnú vysokopreukaznú (kobyly 0,775); stredne silnú preukaznú (žrebce 0,613) a stredne silnú vysokopreukaznú závislosť (spolu 0,650). Ostatné korelačné závislosti boli slabé. Obrázok 2 Korelačné závislosti medzi ukazovateľmi (The correlation dependence between the variables) Cu Cd Zn Pb m 0,290 -0,099 -0,183 0,221 s 0,035 0,378 0,512 0,577+ t 0,078 -0,107 0,222 0,373 m 0,218 0,197 0,243 -0,314 K s 0,308 0,470 0,339 0,515 0,234 t 0,242 0,344 0,382+ m 0,283 0,047 0,093 Na 0,416 s -0,064 0,325 0,055 0,333 t 0,199 0,098 0,069 0,169 m -0,107 -0,276 Mg -0,441 0,416 s -0,122 0,300 0,072 0,360 t -0,111 -0,144 -0,025 0,167 m -0,111 -0,115 0,317 -0,015 P s 0,238 0,227 -0,039 0,029 t 0,083 -0,001 0,185 -0,030 m -0,240 -0,222 -0,019 -0,220 Ca s -0,350 -0,456 -0,637+ -0,423 t -0,296 -0,306 -0,250 -0,286 m 0,106 -0,167 -0,164 Pb s 0,254 0,798++ 0,447 t 0,197 0,082 0,486+ + + m Zn 0,570 0,657 s 0,277 0,571+ + t 0,407 0,627+++ ++ m Cd 0,775 s 0,613+ t 0,650+++ m = kobyly (mares); s = žrebce (stallions); t = spolu (total) Cl

Ca -0,217 -0,156 -0,205 0,420 -0,474 0,013 -0,362 -0,263 -0,333 -0,256 -0,352 -0,296 -0,271 0,026 -0,163

P -0,345 0,103 -0,110 0,252 -0,358 -0,015 -0,080 0,221 0,061 0,663+ 0,304 0,510++

Mg 0,058 0,035 0,045 0,128 -0,330 -0,090 0,110 0,571 0,241

Na 0,692++ 0,552 0,695+++ -0,293 -0,212 -0,242

K -0,111 0,263 0,033

18 | P a g e


May 24-25th 2012

Záver Hladiny sledovaných ukazovateľov boli u žrebcov a kobýl vyrovnané. Preukazný rozdiel (P<0,05) sme zaznamenali len v obsahu chloridov medzi žrebcami a kobylami. Ostatné rozdiely boli štatisticky nepreukazné. Stredne silné korelačné závislosti sme zistili medzi Cl:Cu (žrebce, spolu), Cl:Cd (žrebce), Cl:Pb (žrebce), Cl:P (kobyly), Cl:Na (žrebce), K:Cu (žrebce, spolu), K:Zn (žrebce, spolu), K:Pb (žrebce), K:Ca (žrebce, kobyly), K:P (kobyly), Na:Pb (žrebce, kobyly), Na:Ca (kobyly, spolu), Na:Mg (žrebce)Mg:Cd (kobyly), Mg:Zn (žrebce), Mg:Pb (kobyly), Mg:Ca (žrebce), Mg:P (kobyly, spolu), Ca:Cu (žrebce), Ca:Cd (žrebce), Ca:Zn (žrebce), Ca:Pb (žrebce), Pb:Cu (spolu), Pb:Cd (žrebce), Zn:Cu (kobyly, spolu), Zn:Cd (kobyly, žrebce, spolu), Cd:Cu (žrebce, spolu). Silné korelačné závislosti sme zistili medzi Cl:Na (kobyly, spolu), Pb:Cu (žrebce), Cd:Cu (kobyly).

Poďakovanie. Práca bola realizovaná s podporou projektu VEGA 1/0532/11

Použitá literatúra Goščík, Z.: Fyziologický základ tréningu koňa - Atléta. Nitra, Dominant s.r.o., 1994, 70 s. Halo, M., Hollý, A., Mlyneková, E., Polyaková, L., Horný, M., Kovalčík, E.: Vplyv výživy a tréningu na metabolický profil športových koní. J. Central Europ. Agriculture, 10, 2009, 4, 411–416. Wael, M., El-Deeb, A., Sabry M., El-Bahr, B.: Investigation of selected biochemical indicators of equine rhabdomyolysis in Arabian horses: pro-inflammatory cytokines and oxidative stress markers. Vet. Res. Commun., 34, 2010, 677–689 Asano, K., Suzuki, K., Chiba, M., Sera, K., Matsumoto, T., Asano, R., Sakai, T.: Correlation between 25 element contents in mane hair in riding horses and atrioventricular block. Biol. Trace Elem. Res., 108, 2005, 127–135. Noah, D., Cohen, A.J., Roussel, J.H., Lumsden, A., Cohen, C., Grift, E., Lewis, C.: Alterations of fluid and electrolyte balance in thoroughbred racehorses following strenuous exercise during training. Can. J. Vet. Res., 57, 1993, 9–13.

19 | P a g e

May 24-25th 2012


EFFECT OF YEAST CULTURE ADDITION IN THE TMR OF PREGNANT COWS ON QUALITY OF COLOSTRUM Doležal, P.1, Doležal, J.1, Zeman, L.1, Szwedziak, K.3, Fröhdeová, M.1, Tukiendorf, M.3, Havlíček, Z.2, Skládanka, J.1. 1

Department of Animal Nutrition and Forage Production; 2Department of Animal Morphoplogy, Physiology and

Genetics, Agronomy Faculty, Mendel University in Brno; 3Opole University of Technology, Faculty of Engineering, Poland

Keywords: cows, Saccharomyces cerevisiae culture, rumen fluid, colostrum quality Abstrakt The results can be stated that in our experiment were carried out confirmed the results of other authors, because the addition of yeast to the diet formulation cow had a positive effect on the density and overall quality of colostrum. The cause was apparently a better stabilization of the ruminal environment in experimental pregnant cows and better use of forage nutrient diet. There was no publication that would show a negative effect on the quality of colostrum, yeast, milk or animal health.

Keywords: cows, Saccharomyces cerevisiae culture, rumen fluid, colostrum quality

Úvod Úspěšný odchov telat je možný pouze tehdy, pokud je zaručena jednota v systému: kráva

tele

prostředí. Vzhledem k tomu, že telata se na svět rodí bez výbavy imunitních

látek, nejsou tudíž chráněna proti původcům nejrůznější infekce např. nákazy chřipkou, zápalu plic, zánětu gastrointestinálního traktu aj. Tele se totiž rodí bez jakékoliv imunity, protože plemenice přežvýkavců mají kotyledonovou syndesmochoriální placentu, která je charakterizována tím, že choriové klky vyrůstají pouze na určitých okrscích choria – kotyledonech, a to vždy proti bezžlázovým okrskům děložní sliznice – karunkulech, narušují povrchový slizniční epitel a pronikají do vaziva děložní sliznice. Místa spojení kotyledonů s karunkuly se označují jako placentomy. Krev matky je oddělena od krve plodu pěti bariérami. Tento typ placenty neumožňuje přechod imunoglobulinů z krve matky do plodu a mláďata se proto rodí bez protilátek (Marvan,1998). 20 | P a g e


May 24-25th 2012

Ochranné protilátky mohou telata získat po narození pouze včasným přijetím kvalitního mleziva. Zabezpečení dostatečného množství kvalitního mleziva již v prvních hodinách po narození je proto základním předpokladem budoucího úspěšného odchovu mláďat. Doba prvního zkrmování mleziva po narození je rozhodující, zda tele získá odpovídající pasivní imunitu a schopnost tak odolávat nemocem. Správné načasování zkrmování mleziva je podle Robinsona (1989) důležité ze dvou důvodů: 1) ztráty absorpční schopnosti střeva, 2) bakteriální kolonizace střeva. Z mleziva získané protilátky pak mohou telata chránit i před specifickými stájovými nemocemi. Složení vlastního mleziva je ovlivněno řadou faktorů, zejména pak věkem plemenice, plemenem, technologií chovu a výživou březích plemenic, délkou stání na sucho, kvalitou krmiv a složením krmné diety, jakož i zdravotním stavem plemenice. Zvláště negativně na kvalitu a složení mleziva působí zkrmování nekvalitních siláží (plesnivé, aerobně nestabilní, s neúspěšným fermentačním procesem), nekvalitní seno, nevyvážená dieta z hlediska poměru NL a energie, podávané zejména v době stání na sucho. Mlezivo je první sekret mléčné žlázy vylučovaný těsně před porodem a první 2 – 3 dny po porodu. Mlezivo je žlutě až hnědočervené barvy, lepkavé až šlemovité konzistence, mdlého zápachu a hořkoslané chuti. Žluté zbarvení vzniká vyšším obsahem beta-karotenu. Od zralého mléka se mlezivo liší vysokým obsahem bílkovin, beta-karotenu, vitaminu A, E, riboflavinu, niacinu, sodíku, hořčíku a draslíku. Zvýšený obsah solí, zejména hořečnatých, má mírně projímavý účinek. Při varu se sráží vlivem vysokého obsahu albuminů a globulinů. Kolostrum je významným zdrojem také mnoha dalších důležitých biologických složek, komponent imunitního systému, růstových látek, protizánětlivých složek a dalších hodnotných substancí (lysosym, blíže nespecifické faktory, hormony aj.). Obsažené vitaminy a minerální látky jsou důležité pro rozvoj funkce imunitního a nervového systému a zvýšení odolnosti vůči chorobám, kde působí jako účinné antioxidans. Nejvýznamnější složkou mleziva jsou imunoglobuliny (Ig), nebo také protilátky, což jsou proteiny nezbytné pro identifikaci a zničení patogenů zvířete. V mlezivu skotu se vyskytují 3 typy Ig: Ig G, Ig M a Ig A. Dodatečně tam jsou 2 isotypy Ig G: Ig G1 a Ig G2 (Burton, 1989).Tyto Ig se spolupodílejí na vytváření pasivní imunity telete, to je imunity zajišťované matkou a nikoliv samotným teletem, dokud si tele nevytvoří svou vlastní aktivní imunitu. Mlezivo dále obsahuje 70 – 80 % Ig G, 10 – 15% Ig M a 10 – 15% Ig A. Většinu Ig G v bovinním mlezivu představuje isotop Ig G1 (Burton,1989). Ig G1 a Ig G2 jsou transportovány z krve do mleziva vysoce specifickým transportním mechanismem (Thatcher,1989). Tento mechanismus přemísťuje velká množství Ig G (zejména Ig G1 ) z krve do vemene. V důsledku toho, 21 | P a g e


May 24-25th 2012

dochází dva až tři týdny před otelením k velmi prudkému poklesu koncentrace Ig G v séru matky. Dojnice potřebují několik týdnů pro resyntézu chybějícího Ig G. Ig M a Ig A jsou syntetizovány plazmacyty v mléčné žláze. Mlezivo obsahuje velké množství Ig G a méně Ig M a Ig A. Všechny 3 imunoglobuliny jsou pro tele důležité a jsou nezbytné pro minimalizaci chorob nebo úhynů telat. Včasný přechod na zaprahnutí v délce 8 týdnů před otelením umožňuje nahromadění ochranných látek ve vemeni (Doležal, 2006). Trvale dojené krávy nebo pozdní zaprahnutí plemenic způsobuje, že krávy nemohou vytvářet mlezivo požadovaném množství a především s odpovídajícím obsahem Ig.

Také

věk matek hraje významnou roli, mlezivo od starších krav vykazuje zvláště vysoký obsah Ig, zatímco u jalovic-prvotelek je tento obsah významně nižší. V neposlední řadě důležitým faktorem je také krmivo umožňující přežvykování a posiluje rovněž tvorbu Ig. Jednou z hlavních důvodů je problematika samotné průchodnosti střevní sliznice a prostupnost Ig do krevního řečiště. Je potvrzeno, že hned po narození telat dochází k pronikání E. coli bakterií z tlustého střeva do tenkého střeva, které je téměř do 5 hodin doslova kolonizováno. Kolonizace vede rovněž k tvorbě a uvolňování bakteriálních toxinů a zánětům střevní sliznice. Molekuly imunoglobulinů snadněji pronikají sliznicí tenkého střeva a v případě včasného podání mohou aktivně inhibovat činnost bakteriální mikroflóry. Schopnost průniku imunoglobulinů střevní sliznicí výrazně klesá hodinu po hodině, stejně jako klesá jejich obsah v samotném mlezivu. Dnes je známo přes 37 různých faktorů imunity bovinního kolostra, mezi které patří 5 základních imunoglobulinů, dále laktoferin, peptid bohatý na peroxidázy, leukocyty, interferon, cytokiny, lysosym, inhibitory trypsinu a proteáz a řada dalších. Obsažené růstové faktory v kolostru podporují mimo jiné rozvoj svalstva, růst kostí a dělení buněk. Růstové faktory kolostra jsou zcela nezbytné pro vývoj a regulaci imunitního systému, nebo se přímo podílí na obranných reakcích proti patogenním mikroorganismům. Těsně po porodu se u telat resorbuje z mleziva kolem 50 % protilátek, za následujících 20 hodin jen 15 % a za 36 hodin po porodu jen zanedbatelné množství. Asi po 24 hodinách je střevní sliznice a stěna téměř uzavřena a obranné protilátky nemají schopnost se dostávat do krevního oběhu. Obsah životně důležitých látek se v mlezivu od narození postupně snižuje. Z tohoto hlediska je proto vysoké nebezpečí vyšší kolonizace zažívacího traktu E. coli při pozdním zkrmování prvního podání kolostra. Koncentrace imunoglobulinů v mlezivu velmi rychle klesá, snižuje se i propustnost sliznice tenkého střeva pro tyto látky. K vytvoření účinné pasivní imunity telat je nutné, aby tele přijalo nejméně 250 g těchto imunoglobulinů. První napojení telete by z těchto důvodů mělo být provedeno do dvou hodin po narození. 22 | P a g e


May 24-25th 2012

Telata jsou krmena mlezivem od vlastní matky minimálně první dva dny života. Další tři až čtyři dny a více může být tele krmeno směsným mlezivem, na které navazuje nezralé popř. zralé mléko, které je vhodné krmit do věku pěti až sedmi dnů. Během 3–5 dnů přechází mlezivo v normální, tzv. ,,zralé mléko" (JELÍNEK a kol., 2003). Tele by mělo v prvých 24 hodinách přijmout do krve alespoň 60 g Ig. Kvalitnější mlezivo (s pestřejší skladbou imunoglobulinů) produkují většinou starší dojnice, protože mají stájově specifické protilátky. Materiál a metody V některých studiích se konstatuje také pozitivní vliv podávané kvasinkové kultury v dietách zaprahlých krav na kvalitu mleziva. Objektivnost této teorie jsme ověřovali v pokusu v praktických podmínkách. V našem pokusu jsme sledovali změnu hustoty mleziva v závislosti na přidání kvasinkového preparátu obsahující jako účinnou látku Saccharomyces cerevisce, kmen SC 47 do krmné dávky v množství 5 g na kus a den zamíchaný v jejich obvyklé krmné dávce. Pokus byl proveden na skupině suchostojných dojnic dva týdny před otelením a dále v mlezivovém období po porodu na dojnicích plemene Holštýn. Dojnice byly rozděleny do dvou skupin (kontrolní a pokusná) po šesti kusech. Výsledky jsme porovnávali s kontrolní skupinou, která byla krmena stejnou krmnou dávkou, ale již bez kvasinkového přípravku. Krmná dávka pro suchostojné dojnice obsahovala kukuřičnou siláž, jetelotravní senáž, luční seno a jadrnou směs. Březím kravám byl 3 týdny před porodem podán intramuskulárně Combinal selevit v dávce 20 ml. V našem pokusu jsme v praktických podmínkách studovali vliv přídavku kvasinkové kultury na kvalitu mleziva měřené změnou specifické hmotnosti a množstvím imunoglobulinů. Mlezivo bylo odebíráno ručně před napojením telete v časovém sledu 0, 2, 6, 12 a 24 hodin po porodu. Mlezivo nebylo nikdy zcela vydojeno. Krmná dávka pro dojnice v prvních 100 dnech laktace obsahovala kukuřičnou siláž s vyšším obsahem sušiny, jetelotravní siláž s vyšším obsahem sušiny, LKS siláž kukuřice, luční seno a produkční směs. Přípravek Biosaf (SC–47) byl homogenně zamíchán do krmné směsi v míchacím zařízení. Směsná krmná dávka byla připravena v mobilním míchacím krmném voze. Celý pokus trval 74 dní. Bachorové tekutiny byly odebrány před zahájením pokusu (2 týdny před porodem) a následně po 30ti denním zkrmování krmné dávky. Výsledky byly porovnány s kontrolní skupinou, která byla krmena shodnou krmnou dávkou, ale již bez kvasinkového přípravku.

23 | P a g e

May 24-25th 2012


Výsledky a diskuse Složení krmné dávky pro suchostojné dojnice dva týdny před očekávaným porodem dokumentuje tabulka 1. Tab 1. Krmná dávka pro suchostojné krávy složení Kukuřičná siláž Jetelotravní senáž Seno Sůl krmná Mikrop M3 Jadrná směs – (0,5 kg + 5 g Rumex – Pokus) ječmen oves otruby soja kvasinky

kg (pův. hm.) 5 12 5 0,02 0,18 35% 35% 18% 11% 1%

Kvalitativní ukazatele směsné krmné dávky jsou uvedeny v tabulce 2. Z výsledků vyplývá, že obsah sušiny je nižší (46,27 %), než doporučují jiní autoři. DOLEŽAL a kol. (2006) doporučují za optimální rozpětí sušiny TMR 50 – 60 %. KUDRNA a kol.,(1998) upozorňují, že celková spotřeba TMR značně závisí na její vlhkosti a za optimální rozpětí obsahu sušiny TMR považují 50 – 65 %. Podle některých amerických materiálů TMR se sušinou nižší, než 50 % omezuje její spotřebu. Obsah sušiny TMR, pokud je veškerá píce v krmné dávce ze siláží, by měl být udržován okolo 60 % (DOLEŽAL a kol., 2006). Zkušenosti z Dánska poukazují na to, že již 60% obsah sušiny v TMR omezoval příjem krmiva a tím se snižovala i užitkovost dojnic. Jako pozitivní zásah se v tomto případě ukázalo kropení krmiva vodou (KUDRNA a kol.,1998) Tento problém se vyskytuje v podnicích, kde se produkce píce s vysokým obsahem sušiny stala rutinní záležitostí. Hodnotu pH (5,01) lze hodnotit jako vyhovující. Obsah etanolu (0,21 %) je vyšší, než je doporučováno. Příčinou byla zřejmě kukuřičná siláž o průměrné kvalitě Poměr kyseliny mléčné k octové je 1,07. Poměr N – NH3 z celkového N byl vyšší (11,82 %) a byl způsoben jetelotravní siláží.

24 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab. 2 Kvalitativní ukazatele TMR (v 1 kg sušiny) Ukazatele Sušina pH KVV Kyselina mléčná Kyselina octová Σ kyselin

Hodnota 46,27 5,01 580 2,96 2,76 5,72

Jednotky % mg KOH/100g % % %

KM/KO Etanol LRC

1,07 0,21 0,10

% %

N-NH3 celkového N

11,82

%

Průměrné chemické složení a výživná hodnota zkrmovaných dávek uvádí tabulka 3. Z výsledků je patrné, že průměrný obsah NL v 1 kg sušiny diety byl 11,6 % což je v doporučeném rozmezí uváděném McCULLOUGH (1994). Bachorový metabolismus bílkovin krav je mimo jiné ovlivňován také úrovní bachorové degradovatelnosti proteinu, ale také podílem nedegradovatelného podílu. Bachorová degradovatelnost NL byla podle McCULLOUGH (1994) na horní hranici (66,52 %) jím doporučovaného rozmezí. Koncentrace vlákniny (28 %) leží v pásmu fyziologického rozmezí (SOMMER a PETRIKOVIČ, 2003). Obsah strukturální vlákniny byl 11,37 %. Hodnota ADF byla vyšší (31,9 %), než doporučuje McCULLOUGH (1994). Pro NDF doporučuje nejméně 37 % v 1 kg sušiny KD, což TMR splňuje (48,65 %). V krmných dávkách pro dojnice před otelením se doporučuje, aby obsah ADF byl mezi 25–28 % a NDF v rozmezí 37–40 %. Každá frakce vlákniny je degradována odlišnou rychlostí. Rychlost hydrolýzy je základním faktorem, který omezuje trávení vlákniny v bachoru. Vlastní rozsah trávení vlákniny v bachoru závisí na velikosti nestravitelných frakcí a na výsledku procesu degradace společně s pasáží tráveniny do dvanácterníku z bachoru (VARGA a WHITSEL, 1991). Naproti tomu je nezbytné vždy obsah NDF zvýšit až o 4 %, pokud je v krmné dávce použita siláž velmi jemně pořezána (TŘINÁCTÝ a kol., 2000). Tab. 3 Chemické složení a výživná hodnota TMR pro suchostojné krávy (v 1 kg sušiny) Degr. Degr. Σ Ukazatele Sušina NL NL St. VL ADF NDF BNLV škrobu škrob NEL Hodnoty 462,7 11,6 66,52 11,37 31,9 48,7 48,90 5,14 52,33 6,76 Jednotky g/kg % % % % % % % % MJ/kg TŘINÁCTÝ a kol. (2000) v této souvislosti konstatují a doporučují zvýšit obsah NDF v krmné dávce o 2 %, pokud jsou zkrmována krmiva lehce stravitelná (mladé pícniny), nebo 25 | P a g e

May 24-25th 2012


pokud je stravitelnost škrobu v bachoru vyšší než 80 %. Vzhledem k tomu, že bachorová degradovatelnost škrobu byla nízká (52,33 %), nebyly nutné žádné úpravy obsahu NDF v krmné dávce. V četných studiích se autoři zmiňují o pozitivním vlivu podávané kvasinkové kultury v dietách zaprahlých krav na kvalitu mleziva (KINAL a kol., 2007; PAVLATA a kol. (2005). Vliv přídavku kvasinkové kultury kravám stojícím na sucho na kvalitu mleziva je uvedena v tabulkách 4 a 5 a grafech 3 a 4. Z uvedených výsledků (graf 3) je zřejmé, že přídavek kvasinkové kultury měl pozitivní vliv na hustotu mleziva, tedy na kvalitu mleziva skupiny pokusných dojnic po porodu. Ihned po porodu mělo mlezivo u pokusné skupiny hustotu vyšší (1055±0,003) oproti kontrole (1050±0,009). Hustota mleziva u pokusné skupiny byla vyhovující. Naopak hodnota specifické hmotnosti mleziva kontrolní skupiny leží na spodní hranici doporučované hodnoty. K podobným závěrům dospěl také KINAL a kol. (2007). PAVLATA a kol. (2005) ve své práci uvádějí, že za kvalitativně vyhovující mlezivo je považováno takové, které má měrnou hmotnost větší než 1050 g/l . Po 24 hodinách klesla hustota mleziva na hodnotu 1035±0,003 g/l u pokusné skupiny a na 1032±0,001 g/l u kontrolní skupiny. Změny specifické hmotnosti mleziva v jednotlivých časových intervalech jsou uvedeny v tabulce 4. Tab. 4 Změna specifické hmotnosti mleziva ve sledovaných intervalech (g/l) Skupina Pokusná Kontrolní

Po porodu 1055±0,003 1050±0,009

Po 2 hod. 1050±0,004 1048±0,003

Po 6 hod. 1048±0,003 1045±0,002

Po 12 hod. 1038±0,005 1036±0,001

Po 24 hod. 1035±0,003 1032±0,001

Dalším důležitým kvalitativním faktorem je množství celkové bílkoviny, které by mělo přesahovat 120 g/l (PAVLATA a kol., 2005) a množství imunoglobulinů. Množství celkové bílkoviny u pokusné skupiny (109 g/l) bylo vyšší, než u kontrolní skupiny (104 g/l), ale neodpovídá doporučenému množství. Nižší hladina celkové bílkoviny v mlezivu je v korelaci s nižší hladinou imunoglobulinů.

Tab. 5 Změny množství imunoglobulinů v mlezivu v časových intervalech Skupina Pokusná Kontrolní

Období Ig (g/l)

Po porodu 60±0,82 57±0,82

Po 2 49±2,77 46±2,08

Po 6 27±1,53 25±2,31

Po 12 16±1,29 14±2

Po 24 hod. 8±1,53 6±1,63

Z výsledků uvedených v grafu 1 je zřejmé, že přídavek kvasinkové kultury měl pozitivní vliv na množství imunoglobulinů v mlezivu, tedy i na kvalitu mleziva krav pokusné skupiny po porodu. Hladina imunoglobulinů ihned po porodu byla u pokusné skupiny vyšší (60±0,82 g/l) oproti kontrole (57±0,82 g/l). Po 24 hodinách klesla hladina imunoglobulinů na 26 | P a g e

May 24-25th 2012


hodnotu 8±1,53 g/l u pokusné skupiny a na 6±1,63 g/l u kontrolní skupiny. V tabulce 13 jsou uvedeny změny množství imunoglobulinů v jednotlivých časových intervalech. Koncentrace imunoglobulinů v mlezivu dosahuje hodnoty až 100 g/l. Za minimální je považována koncentrace 60 g/l (PAULÍK, 2006). PAULÍK (2006) dále uvádí, že se množství imunoglobulinů u jalovic po porodu pobybuje v rozmezí 20 – 40 g/l. Proto je vhodnější řídké mlezivo prvotelek raději vůbec nepoužívat a použít čerstvé nebo zamražené mlezivo starších krav. Graf 1 Změny množství imunoglobulinů v mlezivu v časových intervalech 70

Ig (g/l)

60 50

Pokusná

40

Kontrolní

30

Lineární (Pokusná)

20

Lineární (Kontrolní) y = -13,7x + 73,1 r = 0,9861

10 0 Po porodu

Po 2

Po 6

Po 12

Po 24 hod.

y = -13,4x + 69,8 r = 0,9875

Období (hodiny)

Závěr Teleti musíme podávat pouze kvalitní mlezivo s obsahem imunoglobulinů vyšším jak 35 g/l. Imunoglobuliny zvyšují specifickou hmotnost mleziva, což umožňuje rychle zjistit jeho kvalitu. Kvalitní mlezivo má mít hustotu vyšší než 1,047, zatímco běžné mléko má hustotu nižší a to v rozmezí 1,028–1,032. Z výsledků lze konstatovat, že v námi provedeném experimentu byly potvrzeny výsledky jiných autorů, neboť přídavek kvasinkového preparátu do krmné dávky krav měl pozitivní účinek na hustotu a celkovou kvalitu mleziva. Příčinou byla zřejmě lepší stabilizace bachorového prostředí u pokusných březích krav a lepší využívání živin krmné diety. Nebyla nalezena žádná publikace, která by dokazovala negativní vliv kvasinek na kvalitu mleziva, mléka či zdravotní stav zvířat.

Příspěvek vznikl s podporou VZ MSM 621 564 8905

Použitá literatura u autorů

27 | P a g e

May 24-25th 2012


THE EFFECT OF INCREASED IODINE INTAKE ON THE LEVEL OF GLOBULINS IN SHEEP Dušová, H., Trávníček, J., Kroupová, V., Peksa, Z., Staňková, M., Richterová, J. Department of veterinary disciplines and quality of products, Agriculture Faculty, JU in České Budějovice

Abstract The paper is focused on the definition of immunity risks connected with increased iodine supplementation in ewes and their newborn lambs. The feed ration in control group (K) of ewes (n = 5) contained for 8 months 3.1 mg iodine per kg of dietary dry matter and for experimental group (P) of ewes (n = 5) 5.1 mg iodine per kg of dietary dry matter. Parallelly with different iodine supplementation the level of immunoglobulin G and gamma globulins in blood serum was examined in ewes and their lambs until 60 days after parturition. The significant decrease of immunoglobulin G of ewes until 60 days after parturition was more pronounced in the experimental group. The significant lower level (P<0.01) of gamma globulins until 60 days after parturition was found only in the group with iodine intake of 5.1 mg/kg dry matter of diet. The concentration of immunoglobulin G and gamma globulins in lambs of dams from experimental group was continually significantly lower for the entire period of 1-30 days only and demonstrated immunological risks of the excessive intake of iodine. The above results call for the need of more profound research and revision of immunity risks connected with the permitted upper limit of iodine supplementation in ruminants 5 mg per kg of 88% dry matter defined by Commission Regulation /EC/ No. 1459/2005. Úvod Rozvoj biochemických metod pro stanovení parametrů imunity umožňuje podrobné vymezení rizik nadbytečného příjmu jódu (Paulíková et al., 2002). Doporučovaný denní příjem jódu pro krávy o hmotnosti 600 kg byl dle Convey et al., (1978) 10 mg na kus. V současnosti je maximální povolená hranice koncentrace jódu pro přežvýkavce 5 mg v kg 88 % sušiny krmné dávky (Nařízení komise ES č. 1459/2005). V posledním desetiletí se uplatnění vysokého příjmu jódu na koncentraci IgG věnuje zvýšená pozornost. Podle Boland et al., (2008) a Rose et al., (2007) dochází při vysokém příjmu jódu u gravidních bahnic ke snížení koncentrace IgG u jehňat ovlivněném poklesem jejich intestinální resorpce z kolostra. Po podávání vysokých dávek jódu (5,5-21 mg/kg sušiny krmné dávky) došlo u jehňat po narození do 24 hodin po porodu k významnému poklesu koncentrace IgG v krevní plazmě. 28 | P a g e


May 24-25th 2012

V zájmu zajištění dostatečného množství IgG v krevní plazmě jehňat do 24 hodin po narození by proto neměl denní příjem jódu u bahnic přesahovat 9 mg na kus a den (Rose et al., 2007). V závěru 20. a od počátku 21. století se zajištění optimálního příjmu jódu a zajištění likvidace patofyziologických forem jeho nedostatku daří úspěšně řešit v rámci programu WHO/ICCIDD. K řešení jodového deficitu u lidí přispívá i suplementace jodu u hospodářských zvířat (Trávníček et al., 2006) a to především v mléce (Trávníček et al., 2010). Vzhledem k extrathyreoidálnímu uplatnění jódu v imunitě je vhodné věnovat vyšší pozornost patofyziologickému dopadu vysokého příjmu jódu jak v období březosti a porodu u matek tak postnatálnímu období u mláďat. Cílem práce bylo ověřit, zda dlouhodobé podávání zvýšených dávek jódu (nad úrovni horní hranice povolené normy 5 mg/kg 88 % sušiny krmné dávky) ovlivní koncentraci IgG a procentické zastoupení gamaglobulinů v krevním séru bahnic a novorozených jehňat.

Materiál a metodika Vliv nadbytečného příjmu jódu v množství 3,1 a 5,1 mg/kg sušiny krmné dávky na koncentraci IgG a procentické zastoupení gamaglobulinů byl sledován po dobu 8 měsíců u kontrolní skupiny bahnic K (n = 5) a u pokusné skupiny bahnic P (n = 5) a jejich narozených jehňat (ve skupině K 7 jehňat, ve skupině P 6 jehňat do šedesáti dnů věku). Do pokusu byly vybrány ovce na 5. laktaci o hmotnosti 48-53 kg plemene ovce šumavská. Složení základní krmné dávky v době před i v průběhu pokusu bylo totožné pro obě skupiny bahnic a základní krmná dávka před pokusem nebyla o jod obohacována. V době pokusu od 1-2 měsíce gravidity do 120-140 dnů po porodu bahnic se příjem jodu u kontrolní a pokusné skupiny lišil. Základní složky krmné dávky: 1 500 g luční seno, 240 g vojtěška granule, 270 g ovesná krupice, 9 g minerální doplněk byly pro obě skupiny bahnic stejné. Obsah jodu na 1 kg sušiny krmné dávky v době experimentu byl: skupina K 3.1 mg I, skupina P 5.1 mg I. Jód byl podáván ve formě jodičnanu vápenatého. Krev bahnic a jehňat pro stanovení sledovaných parametrů byla odebrána z hrdelní žíly mezi 7-9 hodinou ráno do zkumavek. Krevní sérum se použilo ke stanovení koncentrace IgG kdy byl využit ELISA Test, od firmy ELISA development, s.r.o. Pro výpočet procentuálního zastoupení gamaglobulinů bylo využito elektroforetické dělení krevních bílkovin na přístroji firmy Sebia Electrophorèse. Před experimentem byly krevní vzorky odebrány u bahnic 2 krát v intervalu 30 a 60 dní před jeho zahájením (tabulka 1 ukazuje průměr z těchto 2 odběrů) a den 1, 10, 30 po porodu

29 | P a g e

May 24-25th 2012


v průběhu pokusu (tabulka 2 ukazuje průměr z těchto 3 odběrů) a 60. den po porodu. Vzorky krve od jehňat byly odebírány pro všechna stanovení 1, 3, 10, 30 a 60 den po narození.. Data

byla analyzována

pomocí programu

Statistica 6.0 Cz software

(ANOVA

test, Tukey test). Hodnoty P<0,05 a nižší byly považovány za významné. Výsledky jsou vyjádřeny v průměrných hodnotách ± směrodatné odchylky.

Výsledky Před zahájením pokusu (tabulka 1) průměrná koncentrace IgG v krevním séru bahnic (mg/ml) a průměrné procentuální zastoupení gamaglobulinů v krevním séru nevykazovala významné rozdíly mezi skupinami K a P. U bahnic skupiny P došlo (tabulka 2) k významnému (P<0.01) snížení koncentrace IgG z 19.6 mg/ml před pokusem na 13.0 (1-30 dní po porodu) a na 9.8 mg/ml (60 dní po porodu) v průběhu experimentu. Rozdíl mezi průměrnou koncentrací IgG mezi skupinami K a P nebyl významný po celou dobu pokusu. Průměrná koncentrace gamaglobulinů v období po porodu byla nižší (P<0.01) ve skupině P v porovnání se skupinou K. Tab. 1 Úroveň globulinů v krevním séru bahnic před zahájením suplementace jodu (průměr ± SD) (Globulins in blood serum in ewes before (mean ± SD) Před experimentem Parametr bez suplementace jodu n K P mg/ml 10 18.2 ± 5.0 19.6 ± 3.9e IgG % 10 17.2 ± 3.3 16.8 ± 3.0 Gamaglobuliny Tab. 2 Úroveň (průměr ± SD) globulinů v krevním séru bahnic během suplementace jodu (The level (mean ± SD) of globulins in blood serum of ewes during supplementation of iodine) Parametr IgG Gamaglobuliny a:b; c:d; e:c,g P<0.01

Dny po porodu 1-30 dní po porodu 60 dní po porodu n K P n K P mg/ml 15 14.7 ± 5.8 13.0 ± 5.3f 5 11.4 ± 2.9 9.8 ± 3.8g % 15 15.7 ± 1.5a 12.7 ± 2.5b 5 17.2 ± 1.8 c 11.3 ± 1.6 d

K - kontrolní skupina 3.1 mg I/kg sušiny krmné dávky P - pokusná skupina 5.1 mg I/kg sušiny krmné dávky

Průměrná koncentrace IgG u jehňat (graf 1) byla významně nižší (P<0.01) u jehňat skupiny P (jehňata od matek s vyšším příjmem jodu - skupina P) v 1, 3, 10 a 30 dni po narození v porovnání se skupinou K (jehňata od matek skupiny K). Nejvyšší průměrná 30 | P a g e

May 24-25th 2012


koncentrace IgG (22.6 ± 6.0) byla zjištěna u jehňat skupiny K (od matek s nižším příjmem jodu)

3.

den

po

narození.

Tomuto

nálezu

odpovídalo

i

procentuální

zastoupení gamaglobulinů (graf 2) u jehňat. Jehňata ve skupině P (matek s vyšším příjmem jodu)

vykazovaly

již

od

narození

trvale nižší

(P<0,01) procentuální

zastoupení

gamaglobulinů a to až do 30. dne po narození než skupina K.

IgG (mg/ml krevního séra)

Graf 1 Koncentrace IgG v krevním séru u jehňat (IgG concentrations in blood serum of lambs) skupina C

30

skupina E

c

25 20

a

h

15

e

b

10

f

ch

d

5 0 1

3

10

30

60

Den po narození a:b, c:d, e:f, h:ch

P < 0.01

Graf 2 Procentuální zastoupení gamaglobulinů v krevním séru u jehňat (The percentage of gamma globulins in blood serum of lambs) Gama globuliny (% krevního séra)

skupina C 40

skupina E

a

35 30

c

25

e

20

g

15 10

b

5

h

f

d

0 1

3

10

30

60

De n po naroze ní

a:b; c:d; e:f; g:h; i:j

P< 0.01

Diskuze Koncentrace IgG a procentické zastoupení gamaglobulinů u bahnic (tabulka 1) před zahájením definované suplementace jódu 3 mg/kg sušiny v kontrolní skupině K a 5 mg I/kg sušiny v pokusné skupině P se nelišily. Rámcově se zjištěné výsledky pohybují ve fyziologickém rozmezí (Jagoš a Bouda 1981). Teprve po opakovaném vyšetření těchto parametrů po dobu 60 dnů po porodu (tabulka 2) byl na úrovni koncentrace IgG a procentuálního zastoupení gamaglobulinů (P<0.01) 31 | P a g e

May 24-25th 2012


zaznamenán pokles při suplementaci 5 mg jódu na kilogram sušiny krmné dávky. Na tomto poklesu IgG a gamaglobulinů (P<0.05) se především podílely jejich snížené koncentrace do 30 dnů po porodu (tabulka 2). K podobnému poklesu IgG při vysokém příjmu jódu u bahnic a jejich jehňat dospěli Rose et al., (2007) a Boland et al., (2008). Koncentrace IgG (graf 1) byl u jehňat skupiny P (jehňata matek s vyšším příjmem jodu 5 mg/kg sušiny) nižší (P<0.01) v 1, 3, 10 a 30 dni po narození v porovnání se skupinou K (jehňata matek s nižším příjmem jodu 3 mg/kg sušiny). Souběžně byly statisticky významné změny zaznamenány u procentického zastoupení gamaglobulinů (graf 2). Koncentrace IgG v krevním séru jehňat (graf 1) odpovídala dynamice zastoupení gama globulinů (graf 2) a poukazuje na imunologická rizika nadbytečného příjmu jódu počínaje již při intrauterinním vývoji plodu a v ranném postnatálním období (Haggard et al., 1980). Podrobné dlouhodobé sledování výše uvedených parametrů v období funkční zátěže organismu, kterou mimo jiné představuje finální období gravidity a postnatální vývoj jedince. Plošná suplementace jódu u hospodářských zvířat v rámci řešení jeho nedostatku vyžaduje souběžně vymezení rizik jeho nadbytku. Dle nařízení komise ES č. 1459/2005 představuje 5 mg jódu v kg 88% sušiny horní povolenou hranici jeho denního příjmu. V předložené práci byly u bahnic v peripartálním období a u jejich jehňat zjištěny v souladu s nálezy jiných autorů rizikové změny v koncentraci IgG a procentickém zastoupení gamaglobulinů. U bahnic se při suplementaci 5 mg I na kg sušiny jednalo o statisticky nevýznamný pokles koncentrace IgG a nižší zastoupení gamaglobulinů (P<0.01) do 60. dne po porodu. U jehňat skupiny P došlo k významnému poklesu IgG (P<0.01) až do 30. dne po narození. Zastoupení gamaglobulinů bylo významně nižší od 1. až do 30. dne po narození u jehňat skupiny P. Změny koncentrace IgG a procentického zastoupení gamaglobulinů u bahnic a jejich jehňat zjištěné při příjmu 5,1 mg I/kg sušiny krmné dávky (především významný pokles koncentrace imunoglobulinu G a zastoupení gamaglobulinů u jehňat po narození) upozorňují v souladu s aktuálními a významnými

nálezy Rose et al. (2007) a Boland et al. (2006, 2008)

na významné snížení imunity v časném postnatálním období u matek a zvláště u narozených mláďat v souvislosti s dlouhodobým nadměrným příjmem jódu.

Poděkování Tato studie byla podporována z grantu NAZV QH 81 105 Ministerstva zemědělství a z projektu 022/2010/Z Grantové agentury Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích.

32 | P a g e


May 24-25th 2012

Použitá literatura Boland, T.M., Callan, J.J., Brophy, P.O., Quinn, P.J., Crosby, T.F. Lamb serum vitamin E and immunoglobulin G concentrations in response to various maternal mineral and iodinesupplementation regiment. Anim. Sci., 2006, 82, 319-325. Boland, T.M., Hayes, L., Sweeney, T., Callan, J.J., Baird, A.W., Keely, S,, Crosby, T.F. Theeffects of cobalt and iodine supplementation of the pregnant ewe diet on Ig G, vitamin E, T3 and T4 levels in the progeny. Animal., 2008, 2, 197-206. Haggard, D.L., Stowe, H.D., Conner, G.H., Johnson, D.W. Immunologic effects of experimental iodine toxicosis in young cattle. Am. J. Vet. Res., 1980, 41, 539-543. Jagoš, P., Bouda, J. Základní biochemické a hematologické hodnoty u domácích zvířat a nové způsoby vyjadřování výsledků laboratorních vyšetření. SVS, Oddělení Veterinární Osvěty, Pardubice, 1981. Nařízení Komise (ES) č. 1459/2005 ze dne 8. září 2005, kterým se mění podmínky pro povolení některých doplňkových látek v krmivech, které patří do skupiny stopových prvků. OJEU., 2005. Paulíková, I., Kováč, G., Bíreš, J., Paulík, Š., Seidel, H., Nagy, O. Iodine toxicity in ruminants. Vet. Med-Czech., 2002, 12, 343-350. Rose, M.T., Wolf, B.T., Haresign, W. Effect of the level of iodine in the diet of pregnant ewes on the concentration of immunoglobulin G in the plasma of neonatal lambs following the consumption of colostrum. Br. J. Nutr., 2007, 97, 315-320. Trávníček, J., Herzig, I., Kursa, J., Kroupová, V., Navrátilová, M. Iodine content in raw milk. Vet. Med. – Czech., 2006, 51, 448-453. Trávníček, J., Kroupová, V., Konečný, R., Staňková, M., Šťastná, J., Hasoňová, L., Mikulová, M. Iodine status in ewes with the intake of iodine enriched alga Chlorella. Czech J. Anim. Sci., 2010, 55, 58-65.

33 | P a g e


May 24-25th 2012

THE EVALUATION OF SPERM BULL MOTILITY Filipčík R., Hanuláková Š. Department of Animal Breeding, Agronomy Faculty, Mendel University in Brno

Abstract The aim of this work was to compare the thawing methods of a cattle insemination dose in relation to bull sperm motility and patomorfological changes of sperm. The highest ratio of sperm motility immediately after the thawing was found at the standard preparation method for insemination doses (32. 9 %). The sperm motility ratio after the thawing and leaving in cold was 31. 3 %. The least suitable method was the straw defrosting in a palm where the sperm motility was just 23. 8 %. The evaluation 30 minutes post thawing established nearly comparable figures like at the evaluation done immediately after the thawing of the insemination doses. The highest active sperm number was found 60 minutes post thawing. (36. 3; 35. 7, respectively 23. 4 % at thawing in a palm). The second part of this experiment was to evaluated on the structure of sperm. Significant change was not found.

Key words: bull sperm, sperm survival, sperm motility, Czech Fleckvieh Úvod U skotu se k inseminaci používá inseminační dávka dlouhodobě konzervovaná v tekutém dusíku při teplotě -196 ºC. Semeno určené ke zpracování musí odpovídat ČSN 46 7111. Zralé a integritní spermie se prezentují v ejakulátu pohybem, který označujeme jako souosý dopředný – progresivní (VĚŽNÍK et al., 2004). ŘÍHA a kol., (2004) doplňuje, že s prodlužující se dobou po odběru dochází u ejakulátu k tzv. vitální degeneraci spermií, při které se rychlost přímočarého pohybu zpomaluje a ten se mění na pohyb kruhový, postupně následuje pohyb přerušovaný a trhavý, později pohyb ustává. U nativních ejakulátů určených k přímé inseminaci nebo určených ke konzervaci se požaduje minimální aktivita 70 %. Aktivita spermií v rozmražené inseminační dávce musí být minimálně 30 %. Cílem práce bylo vyhodnotit aktivitu a morfologickou stavbu býčích spermií ve vztahu ke způsobu rozmrazování inseminační dávky a závislosti na době ponechání rozmražené inseminační dávky v laboratorních podmínkách.

34 | P a g e


May 24-25th 2012

Materiál a metodika K analýze byly použity inseminační dávky deseti býků českého strakatého skotu. Od každého býka bylo hodnoceno 60 hluboce zmrazených inseminačních dávek vyrobených z jednoho odebraného ejakulátu. Pro pokus byly zvoleny tři metody rozmrazování inseminačních dávek. První metodou bylo standardní rozmrazení pejety ve vodní lázni při teplotě 38 ºC. Doba rozmražení byla 20 sekund. Po vyjmutí z lázně byla pejeta osušena buničitou vatou, byl odstřižen zatavený konec a dávka byla vložena do zavaděče. Následně byla překryta plastovou krytkou, což byla finální úprava dávky před jejím následným hodnocením. Druhým způsobem bylo rozmrazení inseminační dávky v sevřené dlani. Doba rozmrazování byla 20 sekund. Poté byla pejeta vložena do zavaděče. U třetího způsobu bylo použito standardního způsobu rozmražení pejety ve vodní lázni o teplotě 38 ºC. Následně byl zavaděč s inseminační dávkou vložen na dobu 5 minut do chladničky, kde byla teplota 0 °C. Tímto způsobem byla simulována situace, kdy chovatel rozmrazí v zimě více inseminačních dávek současně, a než proběhne vlastní inseminace, tak dojde k ochlazení rozmražené pejety, což je nežádoucí. Od každého býka bylo použito vždy 20 inseminačních dávek pro každou metodu přípravy. Aktivita spermií byla posuzována mikroskopicky při 200 – 300 násobném zvětšení s využitím výhřevné destičky (teplota 39 ºC ± 1 ºC). Aktivita byla hodnocena vždy ze 3 zorných polí a odhadem se stanovilo procentické zastoupení spermií pohybujících se přímočaře vpřed za hlavičkou. Aktivita byla hodnocena ve třech časech, aby bylo zjištěno, jak dlouho po rozmražení bude zachována předepsaná minimální 30% aktivita spermií po rozmražení. Poprvé bylo provedeno hodnocení ihned po rozmražení (čas t0). Druhé hodnocení proběhlo po 30 minutách (čas t30). Třetí hodnocení proběhlo po jedné hodině od rozmražení (čas t60). Po dobu čekání na další hodnocení byly katetry s inseminačními dávkami odloženy v laboratoři při teplotě 20 ºC ± 3 ºC. Přestože tato teplota neodpovídá standardnímu testování aktivity spermií, byla touto teplotou simulována situace, kdy chovatel ponechá ležet delší dobu zavaděč s rozmraženou inseminační dávkou ve stáji, kde se teplota prostředí pohybuje okolo 20 °C. Po rozmražení každé pejety byl zhotoven nátěr na podložní sklíčko, který byl obarven metodou podle B. T. Farellyho. Následně proběhlo morfologické vyšetření jednotlivých preparátů, kdy byl sledován počet normálních (nezměněných) spermií, změny na hlavičce, akrozomu, degenerativní změny, poruchy bičíku, poruchy spojovací části a výskyt nezralých spermií. U každého preparátu bylo hodnoceno vždy 200 spermií. Procenticky byl vyjádřen počet morfologických změn na příslušném hodnoceném oddílu spermie. 35 | P a g e


May 24-25th 2012

Statistické vyhodnocení bylo provedeno pomocí statistického balíku STATISTICA 9.0. s využitím analýzy variance. K určení průkazností mezi metodami byl použit Scheffeho test. Výsledky a diskuse Nejvyšší aktivita spermií ihned po rozmražení inseminační dávky (t0 = 32,9 ± 10,9 %) byla zjištěna u inseminačních dávek rozmražených standardní metodou přípravy (tab. 1). Obdobný podíl aktivních spermií byl stanoven u třetí metody přípravy inseminační dávky, kdy po standardním rozmražení byl vložen zavaděč s pejetou po dobu 5 min. do chladničky (t0 = 31,3 ± 7,9 %). V případě obou těchto metod byly dodrženy předepsané požadavky na aktivitu spermií (min. 30% podíl aktivních spermií) po rozmražení inseminační dávky. Tento kvalitativní parametr ovšem nesplňovaly inseminační dávky rozmrazované v dlani, kde byla zjištěna průkazně (p < 0,01) nižší aktivita spermií (23,8 ± 9,7 %). BALLESTER et al., (2007) hodnotili aktivitu spermií u býků švédského červeného skotu. Pejety byly rozmraženy ve vodní lázni o teplotě 35 °C po dobu 12 s. Sperma bylo analyzováno ihned po rozmražení, kde autoři zjistili hodnotu motilních spermií 49,5 ± 13,9 %. Experiment založený na různých způsobech rozmražení inseminační dávky provedl také CONTRI et al., (2010). Inseminační dávky býků švýcarského hnědého skotu rozmrazoval po dobu 10 min ve vodní lázni o teplotě 37 °C (standardní metoda přípravy inseminační dávky v Itálii). Druhým způsobem bylo rozmrazení pejety ve vodě o teplotě 37 °C po dobu 1 min, a jako třetí způsob rozmrazoval 5 sekund při teplotě 70 °C. Při standardní metodě rozmrazení naměřil průměrnou hodnotu motilních spermií 48,1 ± 7,6 %. U druhé metody zaznamenal podíl progresivně pohybujících se spermií 45,0 ± 5,0 %. U třetí metody zaznamenal hodnotu (45,5 % ± 8,1 %). MEHMOOD et al., (2009) publikovali aktivitu býčích spermií ihned po rozmrazení ve výši 38,5 ± 4,9 %. Při hodnocení motility spermií v době 30 minut od rozmrazení inseminační dávky byla zjištěna nejvyšší aktivita (31,5 ± 11,7 %) u inseminačních dávek rozmražených standardní metodou přípravy inseminační dávky. U metody, kdy pejety byly rozmrazovány v dlani, nebylo zvýšení počtu aktivních spermií tak výrazné jako u předchozí metody (+1,2 %). U třetí metody přípravy inseminační dávky byla zjištěna aktivita 30,9 % s variabilitou 8,5 %. Při vyhodnocování aktivity spermií, kdy rozmražené inseminační dávky byly 60 minut ponechány v laboratorních podmínkách při teplotě 20 ºC ± 3 ºC, bylo zjištěno výrazné (+ 4,8 %) zvýšení počtu aktivních spermií u inseminačních dávek rozmrazovaných standardní metodou (t60 = 36,3 ± 14,7 %) a u metody přípravy, kdy byly pejety po rozmrazení vloženy do chladničky (t60 = 35,7 ± 9,2 %). Nejhorší (p < 0,01) výsledky byly prokázány při

36 | P a g e

May 24-25th 2012


rozmrazování inseminačních dávek v dlani, kdy se aktivita spermií zvýšila pouze o 0,3% (t60 = 23,4 %) v porovnání s motilitou spermií v čase 30 minut po rozmrazení inseminační dávky.

Tab. 1 Aktivita spermií v závislosti na způsobu přípravy inseminační dávky (Effect of preparation of insemination dose on sperm activity) METODA PŘÍPRAVY INSEMINAČNÍ DÁVKY Standardní Inkubace ČAS (min) Rozmražení v dlani rozmražení v chladničce (%) (%) (%) t0 sx

32,9 A

23,8 B

31,3 A

10,9

9,7

7,9

31,5 A

23,1 B

30,9 A

11,7

8,8

8,5

36,3 C

23,4 B

35,7 C

14,7

10,0

9,2

t30 sx

t60 sx

A, B, C = signifikantní diference (p < 0,01) mezi metodami rozmrazování a mezi časy hodnocení aktivity

Statisticky průkazné diference (p < 0,01) byly prokázány mezi aktivitou spermií hodnocenou v čase t0, t30 a hodnocením v čase t60 u metody standardní přípravy inseminační dávky a u metody, kdy po rozmrazení byly pejety vloženy do chladničky. U obou těchto metod byly také prokázány signifikantní diference v jednotlivých časech vůči aktivitě spermií v

inseminačních dávkách rozmazovaných v

dlani. UNDERWOOD et al., (2009)

vyhodnocovali aktivitu spermií v hodinových intervalech od rozmrazení. V čase 60 minut od přípravy inseminační dávky uvádí podíl progresivně pohybujících se spermií na úrovni 20 %. Tento výsledek je srovnatelný s našimi výsledky, respektive s aktivitou spermií, kdy inseminační dávky byly rozmrazovány v dlani. BERAN et al., (2010) publikovali obdobné výsledky aktivity spermií (37,2 %) v čase t60, přestože inseminační dávky uchovával v termoboxu při vyšší teplotě (38 °C). Výsledky morfologického hodnocení stavby spermií jsou uvedeny v tabulce 2. Z výsledků je patrné, že vlivem odlišné přípravy inseminační dávky nedošlo k výrazné změně ve výskytu morfologických vad ve stavbě spermií, kdy všechny hodnocené parametry odpovídaly normě, pouze byl zjištěn zvýšený výskyt vad v utváření bičíků, což však mohlo být způsobeno při výrobě nátěru na podložní sklíčko. Výrazných rozdílů dosáhl ve svém experimentu VĚŽNÍK et al., (2000), který uvádí výrazně nižší hodnoty poškození bičíků 37 | P a g e

May 24-25th 2012


(stočení bičíku = 0,33 % ± 0,61 %, svinutí bičíku = 0,55 % ± 0,94 %). AL-MAKHZOOMI et al., (2008) uvádí podíl vad ve stavbě bičíku na úrovni 0,9 % ± 0,4 %.

Tab. 2 Hodnocení morfologické stavby býčích spermií (The evaluation on morphological structure of sperm) Normální spermie (%)

Hlavička

Akrozóm

Spoj. část

Bičík

Deg. změny

nezralé spermie

Standard 86,12 ± 4,7

1,28 ± 0,8

0,06 ± 0,09

1,34 ± 1,2

9,78 ± 3,3

0,6 ± 0,4

0,82 ± 0,6

Dlaň

86,56 ± 7,0

1,3 ± 0,7

0,22 ± 0,3

1,18 ± 1,1

9,2 ± 5

0,68 ± 0,5

0,88 ± 0,8

5 min v 0°C

88,12 ± 5,8

0,92 ± 0,4

0,1 ± 0,1

0,98 ± 0,6

8,36 ± 4,8

0,6 ± 0,3

0,94 ± 0,8

Metoda

Patologické změny ve stavbě spermií (%)

Závěr Z výsledků práce vyplývá, že je nutné používat pouze standardní způsob přípravy inseminační dávky skotu, kdy je zajištěn nejvyšší podíl aktivních spermií. Ponechání správně rozmražené inseminační dávky v chladu nezpůsobuje výrazný (signifikantní) pokles aktivity býčích spermií. V žádném případě nesmí být použit k rozmražení inseminační dávky způsob rozmrazování pejet v sevřené dlani, kdy nedojte k dostatečnému rozmrazení ejakulátu, ve spermiích nezačnou probíhat v požadované míře biochemické procesy vedoucí k jejich progresivnímu pohybu, což v konečném důsledku povede ke zhoršení zabřezávání plemenic. Způsob rozmražení inseminační dávky nemá vliv na patomorfologické vyšetření ejakulátu. Poděkování Práce byla vytvořena s podporou grantu Interní grantové agentury AF Mendelu v Brně TP1/2012. Použitá literatura Al-Makhzoomi, A., Lundeheim, N., Haard, M., Rodríguez-Martínez, H. Sperm morphology and fertility of prognen – tested AI dairy bulls in Sweden. Theriogenology, 2008, 70, 682 – 691. Ballaster, J., Johannisson, A., Saravia, F., Haard, M., – Gustafsson, H., Bajramovic, D., Rodríguez-Martínez, H. Post-thaw viability of bull AI –doses with low-sperm numbers. Theriogenology, 2007, 68, 934 – 943. Beran, J., Stádník, L., Ducháček, J., Louda, F. Comparison of four diluents for cry conservation of bull semen and their effect on sperm survival. In: Mezinárodní vědecká konference “MendelNet 2010”, Mendelova univerzita v Brně, 2010, 204 - 210. Contri, A., Valorz, C., Faustini, M., Wegher, L., Carluccio, A. Effect of semen preparation on casa motility results in cryopreserved bull spermatozoa. Theriogenology, 2010, 74, 424 435.

38 | P a g e


May 24-25th 2012

Mehmood, A., Anwara, M., Saqlan Naqvib, S.M. Motility, acrosome integrity, membrane integrity and oocyte cleavage rate of sperm separated by swim-up or Percoll gradient method from frozen–thawed buffalo semen. Anim. Reprod. Sci, 2009, 111, 171 - 148. Říha, J., Jakubec, V., Jílek, F., Illek, J., Kvapilík, J., Hanuš, O., Čermák, V. Reprodukce v procesu šlechtění skotu. Asociace chovatelů masných plemen Rapotín, 2004, ISBN 80903143-5-X. Underwood, S.L., Bathgate, R., Maxwell, W.M.C., Evans, G. In vitro characteristics of frozen-thawed, sex-sorted bull sperm after refreezing or incubation at 15 or 37 °C. Theriogenology, 2009, 72, 1001 - 1008. Věžník, Z., Švecová, D., Zajícová, A., Přinosilová, P. Repetitorium spermatologie a andrologie, metodiky spermatoanalýzy. Výzkumný ústav veterinárního lékařství, Brno, 2004, 258 s. Věžník, Z., Švecová, D., Zajícová, A., Bendová, J., Faldíková, L., Zralý, Z., Netolická, S., Pospíšil, L., Diblíková, I., Zudová, D., Matoušková, O. Hodnocení semene pro asistovanou reprodukci a výběr plemeníků. Výzkumný ústav veterinárního lékařství, Brno, 2000, 141 s.

39 | P a g e

May 24-25th 2012


ENDOMETRIAL POTENTIAL FOR CONVERSION OF T TO E2 IN PREGNANT AND CYCLIC PIGS Franczak, A., Wojciechowicz, B., Kołakowska, J., Kotwica, G. Department of Animal Physiology, University of Warmia and Mazury in Olsztyn, Oczapowskiego 1 A, 10-718 Olsztyn, Poland

Abstract Steroid hormones are produced by porcine endometrium during early pregnancy and the estrous cycle. It is hypothesized, that uterine-derived steroids are involved in the regulation of processes leading to the maternal recognition of pregnancy, maintenance of corpus luteum, successful implantation of embryos and upholding of gestation. The regulation of steroidogenesis pathway in the porcine uterus remains unknown, therefore the aim of presented study was to describe the endometrial potential for conversion of T to E2 in pregnant and cyclic pigs. The slices of endometrium were dissected from pregnant (n = 4) and cyclic (n = 4) gilts on days 15 to 16 of both period, immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C until total RNA isolation. Extracted RNA was designed to examine genomic profiles of pregnant and cyclic porcine endometrium with use of Agilent’s Porcine (V2) Gene Expression Two-color microarrays. After extraction of differentially expressed genes involved in steroidogenesis process, the expression changes of chosen ones were confirmed with qPCR. In the next experiment, the fresh slices (200-210 mg) of endometrium were placed in M199 medium, preincubated for 18 h and incubated for the next 6 h in 37°C and in an atmosphere of 95% O2 and 5% CO2 with or without (control) progesterone (10-5 M). The 17β-estradiol and testosterone (T) concentrations were measured with RIA in collected medium. Microarrays data analysis revealed, that the gene CYP19A3 encoding P450 aromatase isoform 3, the enzyme converting T into E2, is down-regulated (2.67 fold) in endometrium obtained from pregnant pigs when comparing to cyclic ones. This result was subsequently confirmed with qPCR. The production of T by pregnant endometrium was significantly lower than production by cyclic tissue (p < 0.05). This trend was reversed after supplementation with progesterone (P4). The higher (p < 0.05) T concentration was measured in medium after incubation of pregnant tissues with P4. The pregnant endometrium produced more E2 than the cyclic one both during incubation without and with progesterone (p < 0.05). Presented results provide novel evidences supporting our concept about endometrial production of T and E2. The lower expression of CYP19A3 gene in pregnant tissue may suggest that instead of testosterone aromatization, the conversion of estrone into E2 may be 40 | P a g e


May 24-25th 2012

predominant mechanism of endometrial E2 synthesis. Further studies need to be conceived to confirm this hypothesis. The study was supported by National Science Centre within the grant No. N N311 526940 (2011-2013).

41 | P a g e


May 24-25th 2012

EXPRESSION OF 3Β-HYDROXYSTEROID DEHYDROGENASE (3Β-HSD) AND ANDROSTENDIONE PRODUCTION IN PORCINE ENDOMETRIUM Franczak, A., Kołakowska, J., Wojciechowicz, B., Kotwica, G. Department of Animal Physiology, University of Warmia and Mazury in Olsztyn, Oczapowskiego 1 A, 10-718 Olsztyn, Poland

Abstract During early pregnancy and the estrous cycle the porcine uterine tissues (endometrium and myometrium) possess potential to synthesize and secrete sex steroids. Steroids of uterine origin may help to ensure the optimal local environment for developing embryos and support the maintenance of early pregnancy in pigs. The aim of the study was to examine the potential for androstenedione (A4) production by endometrium on days 15 to 16 of pregnancy and the estrous cycle. The slices of endometrium were dissected from pregnant (n = 4) and cyclic (n = 4) gilts on days 15 to 16 of both period, immediately frozen in liquid nitrogen and stored at 80°C until total RNA isolation. Extracted RNA was used to examine genomic profiles of pregnant and cyclic porcine endometrium with use of Agilent’s Porcine (V2) Gene Expression Two-color microarrays. After appointment of differentially expressed genes involved in steroidogenesis process, the expression changes of chosen ones were confirmed with qPCR and at protein level with immunofluorescence. Moreover, the fresh slices (200210 mg) of endometrium were placed in M199 medium and incubated in vitro. After 18 h of preincubation and 6 h of incubation in 37°C and in an atmosphere of 95% O2 and 5% CO2 with or without (control) progesterone (10-5 M). Androstendione concentration in collected medium was measured with RIA. Microarrays data analysis revealed, that the gene encoding 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (HSD3B1) is significantly up-regulated in endometrium obtained from pregnant pigs when comparing to cyclic ones (1.3 fold). The up-regulation of HSD3B1 was confirmed with qPCR. Additionally, when comparing the areas of immunofluorescent reaction, the 3βHSD protein was more abundant in pregnant endometrium. Pregnant endometrium was higher source of A4 than tissue obtained during the estrous cycle both after incubation with and without progesterone (p < 0.05). Presented results support our concept of endometrial steroidogenesis in pigs. The higher endometrial HSD3B1 expression, 3βHSD quantity and A4 production during early pregnancy suggest the induction of steroid hormones biosynthesis pathway in this tissue at initial stages of gestation. The study was supported by National Science Centre within the grant No. N N311 526940 (2011-2013). 42 | P a g e

May 24-25th 2012


DETECTION OF TILMICOSIN EFFECT ON CELL CULTURES IN VITRO Fülopová, D.,1,2 Kováčik, A.,1 Kováčová, R.,1,2 Čupka, P.,1 Tušimová, E.,1 Massányi, P.1 1

Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Katedra fyziológie

živočíchov, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra 2

Ústav štátnej kontroly veterinárnych biopreparátov a liečiv Nitra, Biovetská 34, 949 01 Nitra

Abstract Tilmicosin is in veterinary practice indicated for treatment of various diseases. In this study the effect of various concentration of tilmicosin (50 – 2000 µg.ml-1) was analyzed in 3 cell types (BHK, FE, VERO) in vitro. The effect was evaluated after 24 hours of culture. Results clearly describe negative effect which is dose and cell dependent. BHK cells are most sensitive and a significant decrease of vital cells was detected in the lowest concentration of tilmicosin. Similar tendency was detected for FE cells. The most resistant were VERO cells, with a significant decrease of vital cells at the concentration 300 µg.ml-1. In BHK cells biochemical analysis showed significant decrease in the concentration of chlorides and total proteins in almost all experimental groups. For FE cells no significant differences were found. At the highest concentrations of tilmicosin in VERO cells significant increase of all analyzed elements and total proteins in medium was detected, suggesting negative effect of tilmicosin. Key words: tilmicosin, cell cultures, mineral profile, total proteins, cholesterol

Úvod Životné prostredie buniek musí dosahovať určité chemické a biochemické parametre, aby

bunka

mohla

žiť

a plniť

svoju

funkciu.

Prostredie

eukaryotických

buniek

v mnohobunkovom organizme môže byť narušené prítomnosťou niektorých baktérií, ktoré narušia rovnovážny stav a môže dôjsť k deštrukcii buniek. Antibiotiká sú chemické substancie, ktoré sú toxické pre bunky rôznym spôsobom. Boli vyvinuté na zabíjanie baktérií, ale snáď neexistuje terapeutická látka, ktorá zabije len bakteriálnu alebo anomálnu bunku bez nežiaduceho vplyvu na zdravú bunku. Toxický vplyv antibiotík na zdravé eukaryotické bunky je často závislý od ich koncentrácie, teda od dávky, ktorá je do tela vpravená. Pod pojmom „mechanizmus účinku látky“ rozumieme biochemické a biofyzikálne celulárne pochody, ktoré sú podkladom účinku. Mechanizmus účinku objasní účinok látky na základe jej zásahu do známych fyziologických alebo biochemických pochodov (Lüllmanne et al., 2003). Rozdiel medzi enzýmami používaných na syntézu nukleových kyselín u prokaryotov a eukaryotov dáva význam selektívnemu pôsobeniu antibiotík, ktoré inhibujú syntézu nukleových kyselín, 43 | P a g e


May 24-25th 2012

napr. rifampicín, sulfonamidy, trimethoprim, sulfóny, pyrimethamín, ciprofloxacín, norofloxacín, kyselina nalidixová (Mayer, 2010). Prirodzené makrolidové antibiotiká boli predpisované v podobných indikáciách ako penicilín, pretože majú skoro rovnaké spektrum účinku. Prirodzené antibiotiká sa musia podávať vo vysokých dávkach a ostávajú účinné len niekoľko hodín. Tieto vysoké dávky majú veľa sprievodných nežiaducich účinkov, ktoré môžu byť letálne. Makrolidy obsahujú 14, 15, 16 – členný laktónový kruh doplnený niekoľkými amino– alebo neutrálnymi cukrami. 14 členný kruh Erythromycínu je si najznámejší makrolid. Josamycín a spiramcín zastupujú 16 členné makrolidy (Kaiser, 2009). Na ich priamy inhibičný účinok na mikroorganizmy makrolidy uplatňujú rôzne druhy účinku subinhibičných koncentrácií (sub–MIC), ktoré začínajú byť stále viac považované za dôležité faktory ich terapeutického účinku (Krist, 1997). Sú to inhibítory syntézy proteínov. Ich mechanizmus účinku spočíva v inhibícii syntézy bakteriálnych proteínov zabraňovaním peptidyltransferáze pridať peptidyl pripojený k tRNA k ďalšej aminokyseline (Kaiser, 2009). Táto inhibícia je spôsobená väzbou na 50S subjednotku ribozómu. Väzba je reverzibilná, vedie k nahromadeniu di– a tri– peptidov v bunke, ktorá nie je schopná ich syntetizovať na potrebnú bielkovinu a hynie. Ďalším potenciálnym mechanizmom účinku je predčasné oddelenie, disociácia, peptidyl– tRNA od ribozómu (Tenson et al., 2003). Vzájomné pôsobenie makrolidov a statínov (používaných na znižovanie cholestreolu) nie je odporúčané, pretože môže viesť k oslabujúcej myopatii. Je to tak preto, lebo makrolidy sú inhibítormi cytochrómu P450, konkrétne CYP 3A4. Makrolidy, hlavne erythromycín a clarithromycín predlžujú interval QT, čo môže viesť k torsade de pointes t.j typickej forme ventrikulárnej tachykardie. Vykazujú enterohepatálnu recykláciu, čo znemená, že látka je absorbovaná v čreve, poslaná do pečene, následne vylúčená do duodena v žlči. Toto môže viesť ku kumulácii účinnej látky a spôsobiť nauzeu (Sathsivam a Lecky, 2008). Základným cieľom našej práce bolo zhodnotiť cytotoxicitu tilmikozínu na troch rozličných bunkových kultúrach in vitro. Materiál a metódy Použili sme bunkové línie BHK 21, FE a VERO, ktorých pasáže sú uskladnené v tekutom dusíku na oddelení biopreparátov ÚŠKVBL Nitra. Bunky sme oživili podľa ŠPP ÚŠKVBL Nitra 007. Po oživení sme bunky preniesli do sterilných Roux fliaš a uložili ich do termostatu pri teplote 37°C. Po 24 hodinách sme kontrolovali intenzitu prichytenia o dno a množenie buniek. Podľa intenzity rastu buniek a tvorby jednovrstvy sme bunky spracovali ďalej alebo nechali ešte rásť v médiu na Roux fľaši. Keď bola jednovrstva buniek súvislá, 44 | P a g e

May 24-25th 2012


oddelili sme bunky do dna poľa postupu ŠPP 007. Stanovili sme denzitu buniek. Podľa počtu buniek sme nariedili suspenziu buniek na konečnú hodnotu: BHK – 1,7 x 106 v 1 ml, VERO – 7,6 x 105 v 1 ml a FE 3,6 x 105 v 1 ml. Suspenziu sme získali zriedením uvoľnených buniek kultivačným médiom obohateným bovinným fetálnym sérom. Po stanovení denzity buniek sme stanovili koncentráciu potrebnú na získanie jednovrstvy po adekvátnej dobe kultivácie. Získanú suspenziu sme rozpipetovali do 48 jamkových platničiek v objeme 500 µl na jamku. Platničky sme vložili späť do termostatu nastaveného na 37°C. Na hodnotenie toxicity antibiotík sme

použili bunkové línie zo

zvieracích tkanív: VERO bunky, t.j. bunky z obličky druhu Makak Rhesus, FE bunky, mačacie embryonálne bunky a BHK 21 bunkovú líniu z obličiek mladých chrčkov. Po inkubácii buniek v živnom médiu s obsahom fetálneho séra sme bunky skontrolovali mikroskopicky. Keď bola jednovrstva súvislá, v závislosti od druhu buniek a ich nárokov na rast, toto médium sme zliali a na bunky sme navrstvili čerstvo pripravené antibiotiká. Z makrolidovej skupiny sme vybrali tilmikozín, ktorý je používaný vo veterinárskej medicíne (Elanco). Koncentrácie, ktoré sme použili v pokuse sme získali na základe poznatkov o minimálnych inhibičných koncentráciách vybraných antibiotík účinných na baktérie a LD50 pre laboratórne zvieratá. Tieto koncentrácie sú pre eukaryotické bunky netoxické, preto sme ich zvýšili 1000 krát. Potom sme ich upravili na koncentráciu, ktorá bola toxická pre všetky bunky, LD100. Takto získané koncentrácie sme použili ako nulté riedenie. V titrácii sme pokračovali desiatkovým riedením. Na to, aby sme získali širšiu škálu, pokračovali sme dvojkovým riedením. Nakoniec sme vybrali koncentrácie, ktoré pokrývali rozsah od minimálnej, takmer nulovej toxicity, po koncentráciu, ktorá zabila do 24 hodín takmer 100% buniek. Tento postup sme opakovali pre všetky bunkové línie, pretože každý typ buniek je citlivý na inú koncentráciu. Konečné riedenia antibiotík sme získali riedením nultej koncentrácie ATB v živnom médiu bez pridania bovinného fetálneho séra. V práci boli použité nasledovné koncentrácie tilmikozínu: Koncentrácia µg.ml-1 BHK

Vitalita

Biochémia

50; 100; 200; 300; 500

50; 100; 125; 200; 250; 300; 500; 1000; 2000

FE VERO

50; 75; 100; 200; 500

50; 75; 100; 200

125; 250; 300; 350; 400; 450; 500

300; 350; 400; 450

Po aplikácii rôznych koncentrácií tilmikozínu sme kontrolovali stav buniek v jamkách pod mikroskopom pri zväčšení 25x a 40x. Na základe štruktúry buniek sme hodnotili zastúpenie vitálnych, subvitálnych a mŕtvych buniek. Po 24 hodinovom pôsobení na bunky sme pipetou odsali kultivačné médium a v eppendorfových skúmavkách sme ho zamrazili na 45 | P a g e


May 24-25th 2012

20 °C. Zamrazené médium sme použili na biochemické skúšky, ktorými sme chceli zistiť vplyv antibiotík na metabolizmus buniek. Sledovali sme koncentráciu Ca, Mg, Na, K, Cl, celkových bielkovín a cholesterolu (Massányi et al., 2009). Na analýzu sodíka, draslíka a chloridov sme použili automatický analyzátor EasyLyte (Medica, Bedford, USA), ostatné sledované parametre sme zisťovali poloautomatickým analyzátorom Microlab 300 (Vilat Scientific, Dieren, The Netherlands). Na porovnanie výsledkov sme použili štatistický Scheffeho test a štandardný štatistický Studentov t–test. Preukaznosť rozdielov sme hodnotili na hladine preukaznosti p<0,05; 0,01 a 0,001.

Výsledky a diskusia Tilmikozín vo veterinárskej medicíne je indikovaný na liečbu ochorení spôsobených rôznymi patogénmi (Pasteurella multocida, P. haemolytica, Mycoplasma sp., Actinobacilllus pleuropneumoniae a pod.). Analyzovali sme účinok koncentrácií v rozsahu 50 – 2000 µg.ml-1. Hraničné koncentrácie sú extrémy so 100% prežívateľnosťou alebo úmrtnosťou. Z výsledkov (Grafy 1 – 3) je zrejmé, že tilmikozín negatívne ovplyvňuje životné podmienky buniek. Bunky v priebehu 24 hodín menia morfológiu a začínajú umierať. Z grafov je zjavné, aké množstvo buniek prežilo pôsobenie jednotlivých koncentrácií tilmikozínu. Došlo však k veľmi odlišným tendenciám v odpovediach, ktoré sú závislé od typu buniek. BMK bunky sú najsenzitívnejšie a k preukaznému poklesu vitálnych buniek dochádza už pri koncentrácii 50 µg.ml-1. Podobná, ale miernejší účinok bol sledovaný aj u FE buniek. Najodolnejšie boli VERO bunky, kde preukazný pokles vitálnych buniek sme zaznamenali až pri koncentrácii 300 µg.ml-1. Pri BHK bunkách sme zistili sledovaním biochemických ukazovateľov v médiu pokles koncentrácie chloridov a celkových bielkovín takmer pri všetkých použitých koncentráciách tilmikozínu. U ďalšieho typu buniek – FE, sme však nezistili žiadne preukazné odchýlky sledovaných parametrov v porovnaní s kontrolnou skupinou. Pri najvyšších použitých koncentráciách tilmikozínu u buniek VERO sme zistili preukazné zvýšenie všetkých elementov (Ca, Mg, Na, K, Cl) a celkových bielkovín v médiu, čo potvrdzuje negatívny účinok sledovaného antibiotika a koreluje s výsledkami cytomorfológie. Graf 1 Hodnotenie kvality buniek a biochemických ukazovateľov v médiu – BHK (Evaluation of cell quality and biochemical parameters in the medium – BHK)

46 | P a g e

May 24-25th 2012


2,5

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

2 1,5 1 0,5 0 0

50

100 vitálne

200

subvitálne

300

500

0

mŕtve

50 Ca

Mg

100

125

Na (:100)

200

250

K (:10)

300

500

Cl (:100)

1000

CB (:10)

2000 Chol

Graf 2 Hodnotenie kvality buniek a biochemických ukazovateľov v médiu – FE (Evaluation of cell quality and biochemical parameters in the medium – FE) 100

2,5

80

2

60

1,5

40

1

20

0,5

0

0 0

50

75

vitálne

100

subvitálne

200

500

0

m ŕtve

Ca

50 Mg

Na (:100)

75 K (:10)

100 Cl (:100)

200 CB (:10)

Chol

Graf 3 Hodnotenie kvality buniek a biochemických ukazovateľov v médiu – VERO (Evaluation of cell quality and biochemical parameters in the medium – VERO) 100

2,5

80

2

60

1,5

40

1

20

0,5

0

0 0

125

250

vitálne

300

350

subvitálne

400

m ŕtve

450

500

K Ca

300 Mg

Na (:100)

350 K (:10)

400 Cl (:100)

450 CB (:10)

Chol

Makrolidové antibiotiká sú klinicky užitočné antibiotiká, ktoré sa všetky viažu na veľkú podjednotku ribozómu blízko jadra peptidyl tansferázy. Toto jadro sa tvorí blízko RNA a katalyzuje tvorbu peptidových väzieb počas predlžovania proteínu (Tenson et al., 2003). Najnovšie, ketolidy (telithromycín) so širším spektrom aktivity proti patogénom boli vyvinuté z makrolidov so 14 členným kruhom. Tieto látky obsahujú keto– skupinu namiesto kladinózy na pozícii 3 laktónového kruhu a majú alkyl–aryl–ové bočné reťazce. Makrolidy erytrhromycínovej skupiny neinhibujú reakciu per se (cez seba), skôr blokujú vstup do tunela 47 | P a g e


May 24-25th 2012

vo veľkej podjednotke ribozómu, cez ktorú, veľa, ak nie všetky novovzniknuté peptidy opúšťajú ribozóm. Blokovanie východu z tunela makrolidmi vyvolá predčasné oddelenie peptidyl–tRNA od ribozómu. Takáto zhoršená (drop–off) situácia nastáva po začatí syntézy proteínu, keď je vzniknutý polypeptidový reťazec krátky. Naproti tomu ribozómy, do ktorých vstúpili polyzómy sú pre liečivo neprístupné (Tenson et al., 2003). Spoznanie chemickej štruktúry prirodzených antibiotík umožnilo ich modifikáciu, väčšinou naviazaním postranných reťazcov, aby sa získali látky s menej nežiaducimi účinkami. Takto pozmenené semisyntetické antibiotiká vrátane makrolidov už nemajú mnohé z nevýhod prirodzeného erythromycínu, ktorý spôsobuje nevoľnosť, zvracanie a interferuje s niektorými inými liečivými látkami (Havlík, 2008). Makrolidové antibiotiká pôsobia bakteriostaticky, sú rýchlo absorbované z tráviaceho traktu, sú slabo toxické, neprenikajú do mozgovomiešnej tekutiny a sú účinné aj na atypické mikróby bez bunkovej steny.

Poďakovanie Táto práca bola riešená v rámci grantového projektu VEGA 1/0532/11.

Použitá literatúra Havlík, J. Význam makrolidových antibiotik. Lékařské listy, 5, 2008, 7–9. Kaiser, G. Protein synthesis inhibitors: macrolidesmechanism of action animation. Classification of agents. Lippincott´s Illustrated Reviews: Pharmacology, LWW 2008. Krist, H.A. Informa healthcare. In Expert opinion on investigational drugs, http://informahealthcare.com/doi/abs/10.1517/14712598.2010.510510, 1997. Lüllmann, H., Mohr, K., Wehling, M. Farmakologie a toxikologie. Vydavateľstvo GRADA, 2004, pp. 728. Massányi, P., Slamečka, J., Lukáč, N., Capcarová, M., Mertin, D., Jurčík, R. Seasonal variations in the blood biochemistry in brown hare. Med. Wet., 2009, 65, 389–393. Mayer, G. Bacteriology – Chapter six antibiotics: Protein synthesis, nucleic acid synthesis and metabolism. The Board of Trustees of the University of South Carolina, 2010. Sathasivam, S., Lecky, B. Statin induced myopathy. Br. Med. J., 337, 2008, 979–982. Tenson, T., Lovmar, M., Ehrenberg, M. The mechanism of action of macrolides, lincosamides and streptogramin B reveals the nascent peptide exit path in the ribosome. J. Mol. Biol., 330, 2003, 1005–1014.

48 | P a g e

May 24-25th 2012


ELECTRICAL CONDUCTIVITY AND DYNAMIC VISCOSITY OF STALLION EJACULATE IN THE DEPENDENCE TO QUALITATIVE AND QUANTITATIVE INDICATORS Hanuláková, Š., Mamica, O., Filipčík, R., Hošek, M., Vágenknechtová, M., Máchal, L., Chládek, G. Department of Animal Breeding, Agronomy Faculty, Mendel University in Brno

Abstract The basic precondition of the artificial insemination in horse breeding is the selection of quality stallions that produce enough of ejaculate of a good quality. Many methods of ejaculate quality evaluation have been developed for this purpose. One of possible methods, additional examination of stallion sperm, is the object of this dissertation. Monitoring of physical qualities of ejaculate was performed in 11 clinically healthy breeding stallions that are employed within breeding program of Czech warmblood. 95 samples were collected for further examination of the electrical conductivity and the dynamic viscosity measurement and assesment of basic qualitative and quantitative indicators. Measured electrical conductivity of stallion ejaculate varied from 0,32 S.m-1 to 0,55 S.m-1. The mean value for whole experiment was 0,38 S.m-1. The dynamic viscosity showed range from 88 mPa.s to 189 mPa with the mean value of 130,19 mPa.s. Highly statistically significant positive linear dependence between the electrical conductivity of ejaculate and sperm concentration (; rp = 0,69; P ≤ 0,01) is evident from the results. The results also showed significant negative correlation between the electrical conductivity of ejaculate and its volume (rp = -0,38 P; ≤ 0,05). Positive linear correlation was proved between the electrical conductivity of ejaculate and sperm motility (rp = 0,42; P ≤ 0,05). Concerning the dependence between the dynamic viscosity and the basic indicators of ejaculate, only the concentration of hydrogen inos showed significant negative correlation (rp = - 0,46; P ≤ 0,05).. Úvod Jedním ze základních předpokladů úspěšné inseminace v chovu koní je výběr kvalitních plemenných hřebců, kteří produkují dostatečné množství ejakulátu v dobré kvalitě. Stále se zvyšující počet dostupných diagnostických metod nám dává možnost přesnějšího hodnocení spermatu plemeníků (Ball et al., 2008; Brito et al., 2007). Stanovení základních parametrů ejakulátu jako je např. objem ejakulátu, koncentrace spermií, motilita spermií aj. a 49 | P a g e

May 24-25th 2012


šetrné vyšetření zdravotního stavu samotných hřebců, jsou stále nejdůležitější součástí hodnocení plemenných hřebců ( Morrell et al., 2008; Quientero-Moreno., 2002; Angela et al., 2002). Otázkou elektrické vodivosti a dynamické viskozity ejakulátu se ve svých studiích zabývalo pouze několik autorů (Bravo et al., 2000; Garnica et al., 1993; Andrade-Rocha, 2005; Esfandiari et al., 2006).

Elektrická vodivost biologického materiálu je netriviální

funkcí kmitočtu. Tato funkce umožňuje vyšetřovat strukturu a složení buněčných tkání. Přitom je třeba zaměřit svou pozornost především na oblasti vyšších kmitočtů – radiovln a mikrovln, ve kterých vznikají dielektrické vlastnosti biologických materiálů (Milion a Blahovec, 1984). Viskozita kapaliny je charakteristickou vlastností reálné kapaliny. Je důsledkem smykového napětí, vznikajícího mezi jednotlivými vrstvami kapaliny při jejím toku. (Máchal a Křivánek., 2002; Máchal et al., 1977). Tento experiment si kladl za cíl zjistit vztah vybraných kvalitativních a kvantitativních ukazatelů ejakulátu k elektrické vodivosti ejakulátu a k dynamické viskozitě ejakulátu. Lze uvažovat o možnosti využití těchto metod v praxi jako dalšího eventuálního způsobu doplňujícího vyšetření ejakulátu plemenných hřebců.

Materiál a metodika

Biologický materiál a experimentální prostředí Experiment byl proveden na 11 klinicky zdravých plemenných hřebcích působících v reprodukční stanici Zemského hřebčince Tlumačov s.p. v rámci šlechtitelského programu českého teplokrevníka. Hřebci byli různé plemenné příslušnosti ve věku od 10 do 26 let. Po celou dobu experimentu byli plemeníci ustájeni ve stejných podmínkách. Krmná dávka obsahovala objemnou složku, kterou bylo luční seno a vojtěškotravní senáž a část jadrnou, která se skládala z ovsa a granulované krmné směsi obohacené o minerální látky a vitamíny. Podíl jadrné složky byl závislý na pohybové aktivitě plemenných hřebců

Odběr spermatu Hřebci byli odebíráni na fantom do umělé vagína typu Missoury, vyrobené firmou Minitüb. Pro odběr každého plemenného hřebce byla do vnitřního prostoru umělé vagíny použita jednorázová vložka z PVC. Umělá vagína byla před odběrem temperována na teplotu v rozmezí 40°C až 42°C. Pro přirozenou kluzkost vnitřního prostoru byla použita bílá vazelína.

50 | P a g e


May 24-25th 2012

Kvalitativní a kvantitativní vyšetření ejakulátu Bezprostředně po odběru ejakulátu od hřebce bylo provedeno základní vyšetření ejakulátu. Objem spermatu byl stanoven v kalibrované kádince, která byla temperována na tělesnou teplou 39º C ± 1º C. Koncentrace vodíkových iontů ve spermatu hřebců byla měřena pomocí stolního přístroje CyberScan Ion 510 se sondou Polilyte Lab. K měřící sondě byl vložen teplotní senzor, který zaznamenával teplotu vzorku a hodnota pH vzorku byla automaticky kompenzována. Hodnocení motility spermií bylo provedeno subjektivní metodou pozorování vzorku ejakulátu pod mikroskopem. Hodnocena byla minimálně 3 zorná pole při 200 – 300 násobném zvětšení. Stanovení koncentrace spermií v ejakulátu bylo provedeno hemocytometrickou metodou počítáním v Bürkerově komůrce.

Stanovení měrné vodivosti ejakulátu Měrná vodivost ejakulátu hřebců byla stanovena bioimpedančním spektroskopickým analyzátorem, který umožňuje měřit elektrickou vodivost jako funkci frekvence o rozsah měření 10 Hz až 100 kHz. Je tedy možné stanovit i případný fázový posuv elektrického signálu uvnitř vzorku a kapacitní složku vodivosti. Pro vyloučení chyby z přechodové impedance, byla pro měření použita speciální čtyřkontaktní sonda. Pro čtyřkontaktní měření byly použity dvě napájecí a dvě snímací elektrody. U vzorků byla zjišťována frekvenční závislost vodivosti pomocí vnitřní elektroniky, přístroje Z01, který je schopen přelaďovat frekvenci automaticky s krokem 10 s.

Stanovení dynamické viskozity ejakulátu Dynamická viskozita ejakulátu hřebců byla stanovena pomocí rotačního viskozimetru TR9. V případě rotačního viskozimetru je vzorek podrobován smyku mezi dvěma definovanými plochami, z nichž jedna vykonává otáčivý pohyb, přičemž se vyhodnocuje brzdný účinek vzorku při různých rychlostech otáčení. Otáčky viskozimetru se pohybovaly v rozpětí od 0,3 do 200 ot./min.

Statistická analýza Získané hodnoty byly vyhodnocené pomocí statistického balíku STATISTICA 9.0

51 | P a g e

May 24-25th 2012


Výsledky Podkladem pro zpracování výsledků bylo 95 vzorků nativního ejakulátu získaného odběrem od 11 klinicky zdravých plemenných hřebců, kteří působili v rámci šlechtitelského programu českého teplokrevníka. Kvalitativní a kvantitativní ukazatele ejakulátu Průměrné hodnoty naměřené při laboratorním vyšetření vzorků ejakulátu jsou uvedeny v Tabulce 1. Objem získaného ejakulátu kolísal v rozpětí hodnot od 10 cm3 – 160 cm3. Průměrná hodnota ejakulátu za celé sledované období byla 50,39 cm3 ± 25,5 cm3. Motilita spermií se pohybovala v rozmezí hodnot od 50 % do 85 %. Za celé sledované období byla zjištěná průměrná hodnota 68,4 % ± 7,92 %. Koncentrace vodíkových iontů vykazovala rozpětí hodnot od 6,64 do 7,43 s průměrnou hodnotou 7,04 ± 0,13. Koncentrace spermií v ejakulátu byla v rozmezí od 0,02.109.cm-3 do 0,4.109.cm-3s průměrnou hodnotou 0,11.109.cm-3 ± 0,08.109.cm-3. Celkový zjištěný počet spermií v ejakulátu charakterizuje rozpětí od 0,49.109 do 15,60.109. Průměrná hodnota za sledované období byla 4,65.109 spermií ± 2,87.109 spermií. Celkový počet aktivních spermií se v ejakulátu pohyboval v rozmezí od 0,29.109 do 10,92.109. Průměrná hodnota celkového počtu aktivních spermií v ejakulátu byla 3,21.109 ± 2,05. 109 aktivních spermií.

Fyzikální vlastnosti ejakulátu V Tabulce 1 jsou uvedeny průměrné hodnoty zjištěné při hodnocení elektrické vodivosti a dynamické viskozity hřebčího ejakulátu. Naměřená elektrická vodivost byla v rozpětí hodnot od 0,32 S.m-1 do 0,55 S.m-1. Průměrná hodnota za celé sledované období byla 0,38 S.m-1 ± 0,04 S.m-1. Dynamická viskozita ejakulátu hřebců se pohybovala v rozmezí hodnot od

88 mPa.s do 189 mPa.s. Zjištěná hodnota dynamické viskozity ejakulátu

hřebců byla za celé sledované období v průměru 130,19 mPa.s-1 ± 37,3 mPa.s-1.

Vztah fyzikálních vlastností ejakulátu ke kvalitativním a kvantitativním ukazatelům Vztahy mezi zjištěnými kvalitativními, kvantitativními ukazateli a fyzikálními vlastnostmi ejakulátu byly vyjádřeny pomocí Pearsonových korelačních koeficientů a jsou uvedeny v Tabulce 2. Z výsledků je patrná vysoce statisticky významná kladná lineární závislost mezi elektrickou vodivostí ejakulátu a koncentrací spermií v ejakulátu (rp = 0,69; P ≤ 0,01). Statisticky významné záporné korelace byly vypočteny mezi elektrickou vodivostí ejakulátu a objemem ejakulátu (rp = -0,38 P; ≤ 0,05). Pozitivní, statisticky významná, lineární 52 | P a g e


May 24-25th 2012

závislost byla prokázána mezi elektrickou vodivostí ejakulátu a motilitou spermií ( rp = 0,42; P ≤ 0,05 ). Mezi dynamickou viskozitou ejakulátu a základními ukazateli ejakulátu byl zjištěn statisticky významný záporný vztah pouze v případě vztahu ke koncentraci vodíkových iontů ( rp = - 0,46; P ≤ 0,05 ). Diskuze Problematikou základního vyšetřením spermatu se zabývala celá řada autorů (Morrell et al., 2008; Sieme et al., 2003; Angela et al., 2002;

Parlevliet et al., 1991; Gamčík,

Kozumplík et al., 1992; Kliment, 1989). Otázkou fyzikálních vlastností ejakulátu se ve svých publikacích zabývalo pouze několik autorů (Bravo et al., 2000; Garnica et al., 1993; Andrade-Rocha, 2005; Esfandiari et al., 2006). Máchal a Křivánek (2000) sledovali měrnou elektrickou vodivost ejakulátu býků a dospěli k závěru, že její průměrná hodnota za sledované období byla 0,84 S·m-1. Stejnou problematikou se zabývali i ve svém druhém experimentu kdy hodnotili fyzikální vlastnosti spermatu kohoutů a zjistili, že hodnota měrné elektrické vodivosti ejakulátu kohoutů se pohybovala v rozpětí od 0,84 S·m-1 do 1,02 S·m-1 (Máchal a Křivánek, 2002). V předkládané disertační práci byla hodnocena měrná elektrická vodivost ejakulátu hřebců. Její průměrná hodnota byla 0,38 S.m-1 ± 0,04 S.m-1, tato hodnota je nižší než v případě ejakulátu býků a kohoutů, kteří vykazují vyšší koncentraci spermií. Průměrná hodnota dynamické viskozity ejakulátu hřebců byla za sledované období 130,19 mPa.s-1 ± 37,3 mPa.-1

Závěr Výsledky, které jsou prezentovány v předložené práci, jsou výsledky prvotní studie, zabývající se fyzikálními vlastnostmi ejakulátů hřebců. Z tohoto důvodu byla komparace s jinými autory jen velmi omezená. Dosavadní výsledky otevírají možnost orientačního odhadu kvalitativních a kvantitativních ukazatelů ejakulátu na základě zjištěných fyzikálních vlastností. Před zavedením tohoto doplňujícího vyšetření hřebčího spermatu do praxe je však nutné ověření dalšími experiment. Poděkování Práce byla vytvořena s podporou grantu Interní grantové agentury AF Mendelu v Brně TP1/2012.

53 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab.1 Průměrné hodnoty kvalitativních, kvantitativních a fyzikálních ukazatelů ejakulátu (Average values of qualitative, quantitative and physical sperm parameters) OBJEM [cm3]

MOTILITA [%]

pH

KONCENTRACE [109·cm-3]

CPS [·109]

CPAS [·109]

VODIVOST [S·m-1]

VISKOZITA -1 [mPa·s ]

50,39

68,4

7,04

0,11

4,65

3,21

0,38

130,19

25,50 7,92 0,13 0,08 2,87 CPS – celkový počet spermií, CPSA – celkový počet aktivních spermií

2,05

0,04

37,30

µ SX

Tab. 2 Fenotypové korelace zjištěných hodnot hřebčího ejakulátu (Correlation dependences of stallion sperm parameters) objem objem motilita pH koncentrace

motilita -0,05

pH

Koncentr.

0,13

-0,42

-0,03

0,44

+

+

-0,34

CPS

CPSA

vodivost +

viskozita

0,35

0,34

-0,38

0,16

0,33

0,42

+

-0,38

-0,19

-0,19

-0,21

-0,46

0,50

++

CPS CPSA vodivost

++

0,14

0,56

++

0,69

0,98

++

0,28

0,15

0,34

0,09

+

-0,14

-0,24

viskozita CPS – celkový počet spermií, CPSA – celkový počet aktivních spermií

Použitá literatura Andrade-Rocha, F.T. Physical analysis of ejaculate to evaluate the secretory activity of the seminal vesicles and prostate. Clin. Chem. Lab. Med., 2005, 43, 1203‒1210. Angela, C., Pommer, J., Rutllant, J., Meyers, S.A. The role of osmotic resistance on equine spermatozoal function. Theriogenology, 2002, 58, 1373−1384. Ball, B.A. Diagnostic Methods for Evaluation of Stallion Subfertility: A Review. J. Equine Vet. Sci., 2008, 11, 650−665. Bravo, P.W., Ccallo, M., Garnica, J. The effect enzymes on semen viscosity in Liamas and Alpacas. Small Ruminant Res., 2000, 38, 91−95. Brito, L.F.C. Evaluation of Stallion Sperm Morphology. Clin. Tech. Equine Pract., 2007, 6, 249−264. Esfandiarri, N., Gotlieb, L., Casper, R.F. Seminal hyperviscosity is associated with poor outcome of controlled ovarian stimulation and intrauterine insemination. Int. J. Fertil Womens Med., 2006, 51, 21−27. Gamčík, P., Kozumplík, J. et al. Andrológia a umelá inseminácia hospodárskych zvierat. Príroda Bratislava. 1992, 299 s., ISBN 80-07-00540-4. Garnica, J., Achata, R., Bravo, P.W. Physical and biochemical characteristics of alpaca semen. Anim. Reprod. Sci., 1993, 32, 85−90. Kliment, J. et al. Reprodukcia hospodárskych zvierat. Príroda Bratislava. 2.vyd., 1989, 378 s. ISBN 80-070-0027-5.

54 | P a g e


May 24-25th 2012

Máchal, L., Křivánek, I., Chládek, G., Doležal, P. Korelace mezi relativní permitivitou, konduktivitou a kvantitativními indikátory býčího a kančího ejakulátu. J. Anim. Feed Sci., 1977, 6, 13–22. Máchal, L., Křivánek, I. Dielektrické vlastnosti ejakulátu a semenné plazmy býků. Acta univ. agric.et silvic. Mendel. Brun., 2000, 48, 7−13. Máchal, L., Křivánek, I. Indicators of semen quality of roosters of three parental layer lines and specific conductivity of the semen. Acta Vet. Brno, 2002, 71, 109−116. Milion, J., Blahovec, J. Příspěvek ke studiu elektrických vlastností hlíz brambor. Sborník mechanizační fakulty, VŠZ Praha, 1984. Morrell, J.M., Johannisson, A., Dalin, A.M., Hammar, L., Sandebert, T., RodriguezMartinez, H. Sperm morphology and chromatin integrity in Swedish warmblood stallions and their relationship to pregnancy rates. Acta Vet. Scand., 2008, 50, 1–7. Parlevliet, J.M., Kemp, B., Colenbrander, B. Reproductive characteristics and semen quality in maiden Deutch Warmblood stallions. J. Am. Vet. Med. Assoc., 1991, 199(6), 753−754. Sieme, H., Katila, T., Klug, E. Effect of semen collection practices on sperm characteristics before and after storage and on fertility of stallions. Reprod. Domest. Anim., 2003, 38(4), 305−311. Quientero-Moreno, A., Miró, J., Teresa, Rigau, A., Rodríguez-Gil, J.E. Identification of sperm subpopulations with specific motility characteristics in stallion ejaculates. Biol. Reprod., 2002, 67 (2), 648−654.

55 | P a g e

May 24-25th 2012


THE EFFECT OF ZINC SUPPLEMENTATION ON RUMINAL METABOLISM IN SHEEP Hauptmanová, K.,1 Panev, A.,1 Dvořák, R.,1 Pavlata, L.,1 Pechová, A.,1 Filípek, J.2 1

Klinika chorob přežvýkavců a prasat, 2 Laboratoř pro velká zvířata, Fakulta veterinární medicíny, Veterinární a

farmaceutická univerzita Brno

Abstract Pokus byl prováděn na dvou skupinách ovcí po osmi zvířatech. První skupině (A) byla podávána krmná směs s organickou formou zinku (Bioplex, Alltech, USA), druhé skupině (B) krmná směs s anorganickou formou zinku (ZnO) v dávce 0.3 kg směsi na kus a den. Nejprve byla zvířata krmena po dobu dvou týdnů krmnou směsí s optimální dávkou zinku (180 mg/kg sušiny směsi). Poté byla krmena po dobu čtyř týdnů krmnou dávkou se sníženou koncentrací zinku (30 mg/kg sušiny směsi). V druhé polovině experimentu byla po dobu čtyř týdnů krmena krmná směs se zvýšeným obsahem zinku (500 mg/kg sušiny směsi). V průběhu experimentu byla 14., 42., 43. a 70. den odebírána a vyšetřována bachorová tekutina. Aktuální příjem zinku makroorganismem se parciálně odrážel v koncentraci v bachorové tekutině a výrazně v koncentraci v bachorové biomase. Vliv na obsah zinku v bachoru měla forma, v jaké byl zinek podáván. Po podávání bioplexu zinku došlo k většímu nárůstu koncentrace zinku jak v bachorové tekutině, tak v biomase, oproti oxidu zinečnatému. V bachorové biomase byly zjištěny při aplikaci jak organické, tak anorganické formy Zn mnohonásobně vyšší koncentrace Zn než v bachorové tekutině. Podávání zinku nemělo na bachorový metabolismus negativní dopad.

Úvod Zinek je v organismu všech zvířat jedním z esenciálních mikroprvků. Má mnoho různých funkcí, hlavně je součástí metaloenzymů a metaloproteinů. Důležitý je také pro bachorovou mikroflóru (Eryavuz a Dehority 2009). Dietetické faktory, které ovlivňují biologickou dostupnost zinku pro přežvýkavce, nejsou zcela objasněny (Spears et al. 2004, Pavlata et al. 2005). Vstřebávání organické a anorganické formy zinku je obdobné, zvláště u deficitních zvířat. Nicméně vylučování zinku je nižší při dotaci v organické formě (Rojas et al. 1995, Spears 2003). Při podávání organické formy zinku byly zjištěny vyšší koncentrace zinku v orgánech (Henry et al. 1997, Gressley 2009). Tato práce má za cíl zhodnotit vliv množství a formy zinku na vybrané ukazatele bachorové tekutiny u ovcí. 56 | P a g e


May 24-25th 2012

Materiál a metodika Pokus byl prováděn na dvou skupinách ovcí po osmi zvířatech. Před pokusem byly všechny ovce krmeny stejně, pouze senem a napájeny vodou. Ovce byly ustájeny společně ve dvou výbězích podle skupin. První skupině (A) byla podávána krmná směs s organickou formou zinku (Bioplex, Alltech, USA), druhé skupině (B) krmná směs s anorganickou formou zinku (ZnO). Nejprve byla zvířata krmena po dobu dvou týdnů krmnou směsí s optimální dávkou zinku (180 mg/kg sušiny směsi), aby došlo k adaptaci bachorové mikroflóry na nové krmivo (adaptační fáze). Poté byla krmena po dobu čtyř týdnů krmnou dávkou se sníženou koncentrací zinku (30 mg/kg sušiny směsi). Jednalo se pouze o přirozený obsah Zn v jednotlivých krmivech obsažených v krmné směsi (fáze I). V druhé polovině experimentu (fáze II) byla po dobu čtyř týdnů krmena krmná směs se zvýšeným obsahem zinku (500 mg/kg sušiny směsi). Krmná dávka na jednoho skopce a den se skládala ze dvou kilogramů lučního sena (zinek 11 mg/kg sušiny) a 0.3 kg doplňkové krmné směsi s přídavkem zinku (Biosta s.r.o., Blučina). V průběhu pokusu byly prováděny odběry bachorové tekutiny 14., 42., 43. a 70. den. Byly vyšetřovány následující parametry: pH, celková acidita, počet nálevníků, koncentrace kyseliny mléčné, amoniaku, těkavých mastných kyselin, zastoupení jednotlivých kyselin, aktivity ALP, ALT, AST, LDH a amylázy a koncentrace zinku v tekutině a v bachorové biomase.

Výsledky a diskuse Výsledky vyšetření obsahu zinku v bachorové tekutině u obou skupin v průběhu celého pokusu jsou uvedeny v tabulce 1. Vyšetřované biochemické parametry bachorové tekutiny se pohybovaly bez ohledu na množství nebo formu podávaného zinku v referenčních rozmezích. Námi podávané množství zinku v organické nebo v anorganické formě nemělo negativní vliv na bachorový metabolismus ovcí. Podobných výsledků dosáhli Eryavuz et al. (2002) i Froetschel et al. (1990). Naprostá většina zinku se nacházela v bachorové biomase, v tekutině se nacházelo asi pětsetkrát méně zinku než v biomase. K podobným výsledkům dospěli u býků i Kennedy et al. (1993), což naznačuje rychlý přesun zinku do mikrobiálního prostoru nebo jeho vysrážení. Výsledky našeho experimentu neprokázaly statisticky významnou korelaci mezi obsahem zinku v bachorové tekutině a v bachorové biomase (n=64, r=0.32, p>0.05), pravděpodobně

57 | P a g e


May 24-25th 2012

v důsledku toho, že koncentrace zinku v tekutině byla po dobu celého pokusu poměrně stabilní a koncentrace zinku v bachorové biomase citlivě reagovala na příjem zinku. Koncentrace zinku v bachorové tekutině byly vyšší po podávání organické formy zinku než po podávání anorganické formy. Stejně i v biomase po podávání zvýšené dávky zinku se u skopců, kteří dostávali organickou formu zinku, zjistila vyšší koncentrace zinku než u skopců, kterým jsme podávali anorganickou formu zinku (tab. 1). Také Kennedy et al. (1993) zjistili u býků, že po podávání organické formy zinku (polysacharidový komplex zinku) došlo k výraznějšímu zvýšení koncentrace zinku jak v bachorové tekutině, tak v biomase, než po podávání anorganické formy (ZnO). Spears et al. (2004) u skotu zjistili podobně jako my, že při použití anorganické formy zinku je koncentrace zinku v bachorové tekutině nižší než při dotaci organickými formami. Metabolické procesy v bachoru nebyly významným způsobem ovlivněny. Všechny zjišťované parametry se pohybovaly ve fyziologickém rozmezí (tab. 1), nedošlo ani ke zvýšení aktivity enzymů následkem příjmu zvýšeného množství zinku (ALP 0.39±0.22, ALT 0.06±0.05, GMT 0.11±0.04, LDH 0.24±0.22, amyláza 0.16±0.12 µkat/l). Vyšší koncentrace anorganické formy zinku podávaného přímo do bachoru bachorovou kanylou způsobilo zvýšení zastoupení kyseliny propionové a snížení poměru mezi kyselinou octovou a propionovou (Arelovich et al., 2000). Naše výsledky ukazují mírný nárůst zastoupení kyseliny propionové v průběhu celého pokusu u obou skupin (tab. 1), pravděpodobně se jedná o důsledek krmení jadrným krmivem, protože k nárůstu došlo i v době krmení nejnižší dávkou zinku.

Poděkování Tato práce vznikla za finanční podpory MŠMT ČR v rámci řešení výzkumného záměru č. MSM 6215712403.

Použitá lLiteratura Arelovich, H.M., Owens, F.N., Horn, G.W., Vizcarra, J.A. Effects of supplemental zinc and manganese on ruminal fermentation, forage intake, and digestion by cattle fed prairie hay and urea. J. Anim. Sci., 2000, 78, 2972-2979. Eryavuz, A., Dehority, B.A. Effect of supplemental zinc concentration on celulose digestion and cellulolytic and total bacterial numbers in vitro. Anim. Feed Sci. Technol., 2009, 151,175-183. Eryavuz, A., Durgun, Z., Keskin, E. Effects of ration supplemented with zinc on some rumen and blood parameters mohair production and quality in faunated and defaunated Angora goats (Turkish). Turk. J. Vet. Anim. Sci., 2002, 26, 753-760.

58 | P a g e


May 24-25th 2012

Froetschel, M.A., Martin, A.C., Amos, H.E., Evans, J.J. Effects of zinc sulfate concentration and feeding frequency on ruminal protozoaa numbers, fermentation patterns and amino acid passage in steers. J. Anim. Sci., 1990, 68, 2874-2884. Gressley, T.F. Zinc, copper, manganese, and selenium in dairy cattle rations. Proc. 7th Annual Mid-Atlantic Nutr. Conf., 2009, 65-71. Henry, P.R., Littell, R.C., Ammerman, C.B. Effect of high dietary concentration and lenght of zinc feeding on feed intake and tissue zinc concentration in sheep. Anim. Feed Sci. Technol., 1997, 66, 237-345. Kennedy, D.W., Craig, W.M., Southern, L.L. Ruminal distribution of zinc in steers fed a polysaccharide-zinc complex or zinc oxide. J. Anim. Sci., 1993, 71, 1281-1287. Pavlata, L., Podhorský, A., Pechová, A., Chomat, P. Differences in the occurrence of selenum, copper and zinc deficiencies in dairy cows, calves, heifers and bulls. Vet. Med. – Czech, 2005, 50, 390-400. Rojas, L.X., McDowell, L.R., Cousins, R.J., Martin, F.G., Wilkinson, N.S., Johnson, A.B., Velasquez, J.B. Relative bioavailability of two organic and two inorganic zinc sources fed to sheep. J. Anim. Sci., 1995, 73, 1202-1207. Spears, J.W. Trace mineral bioavailability in ruminants. J. Nutr., 2003, 133, 1506S-1509S. Spears, J.W., Schlegel, P., Seal, M.C., Lloyd, K.E. Bioavailability of zinc sulfate and different organic zinc sources and their effects on ruminal volatile fatty acid proportions. Livestock Prod. Sci., 2004, 90, 211-217.

59 | P a g e

May 24-25th 2012


EFFECT OF HETEROTROPHIC CHLORELLA ON CONTENT OF AND LUTEIN ZEAXANTHIN ISOFORMS IN EGG YOLKS Hložková, J.1, Kotrbáček, V.1, Kopecký, J.2, Hudečková, P.3, Uhríková, I.1, Doubek, J.1 1 2

Department

of

Physiology,

University

of

Veterinary

and

Pharmaceutical

Sciences

Brno

Institute of microbiology, Academy of Sciences of the Czech Republic

3

Department of nutrition, animal husbandry and hygiene, University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno

Abstract Background: Carotenoids are known for their positive effects on the body. The spatial arrangement of their trans and cis molecules affects the mechanism of action and has various biological effects such as absorption, bioavailability, ability to absorb UV radiation, etc. Material and Methods: The aim of the study was to assess the effect of chlorella as a feed supplement on the concentration of lutein and zeaxanthin isoforms in egg yolks. 24 laying hens (Hisex Brown) were devided into 3 groups. Control group (K) was fed complete feed mixtures for laying hens (KS). KS for the experimental groups was supplemented with 1% (P1) or 2% (P2) of disintegrated fresh water algae chlorella. The dietary treatment was kept for 8 weeks, eggs were collected daily. The levels of total carotenoids were measured spectrophotometrically and different types of lutein and zeaxanthin stereoisomers were determined by HPLC. The data were statistically evaluated by F and T test. Results: Concentrations of total carotenoids in the egg yolks of hens supplemented with chlorella were significantly increased at the end of the first (P2) and the second week (P1) of the trial. The concentrations culminated in the 4th week, when they were 1.5 times (P1) and twice (P2) higher in comparison with K. More than 90% of carotenoids were xanthophylls - lutein and zeaxanthin, mainly in their trans forms. A smaller proportion of cis forms was found. The ratio of cis to the trans-zeaxanthin was significantly lower in P2 group after one week of chlorella supplementation in comparison with K (P2 11.3 : 1.8 µg/g yolk, K 7.0 : 0.6 µg/g yolk). The ratios did not significantly differ between groups at the end of the trial. The ratio of trans to the cis-lutein forms had predominantly upward trend in P1 and P2 groups, whilst it was declined in K. Conclusion: Supplementation of the feed mixture with heterotrophic chlorella significantly increased deposition of xanthophylls - lutein and zeaxanthin in egg yolks, without any clear effect on their trans and cis forms ratio.

60 | P a g e

May 24-25th 2012


THE EFFECT OF WELL MANAGED EARLY PUERPERIUM ON HOLSTEIN COW REPRODUCTION AND MILK PERFORMANCE Hošek, M.,1 Vágenknechtová, M.,1 Filipčík, R.,1 Máchal, L.,1 Hošková, Š.2 1

Department of Animal Breeding, Agronomy Faculty, Mendel University in Brno

2

Department of Animal Nutrition and Forage Production, Agronomy Faculty, Mendel University in Brno

Abstract The aim of this work is focused on management of early puerperium, which is reducing problematic reproduction of cows and its future infertility or sterility. Our results shows, that veterinarian help was need only in 6 cases from 592 cows in evaluation, other 452 cows was calved without men help or with slightly men help. Is visible, that difficult calving have bad impact on postpartum status of reproduction organs and can affect somatic cells count in milk too. Foot, finger, hoof and udder health after parturition have impact on somatic cells too. Increased body temperature have totally 9% animals, and it is still time first and excellent indicator of complete health status of individuum. The systhematic, long term management of puerperium bring less problems with return cows to succesfull reproduction process and can bring more money for farmer. Key words: holstein cow, puerperium, problematic reproduction, body temperature Material and methods The 592 holstein cows from Uhercice farm (Agrofert Group, a.s.) on first and second and other lactations was in our evaluation, which was done from November 2009 to December 2010. Each cow was evaluated and diagnostics was targeted on collection lot of information about cow reproduction health and status. The farm management has great interest on uterus involution and multilevel heat detection as way for fast and effective cow return to reproduction proces. On each cow was measured morning rectal body temperature regularly in interval 3th and 5th day after parturition. On each Wednesday veterinarian make control all of these cows and evaluate their total health status. For other evaluations is collected urine and pH, ketons and proteins are detected by orientation paper strips tests as metabolic profile of cow. Results are:0 – without problem, normal; 1 – 1. worst level, 2 – 2. worst level; 3 a 4 – infection, retentio secundin, antibiotics (antibiotics without save protection time in animals with milk production). Simultanously is collected milk on orientation NK-test and somatic cell number (SCN), evaluated is number of problematic udder quarters 1- 4 too. When is cow in fixation 61 | P a g e


May 24-25th 2012

box, is judged foot and hoof status and if is necessary correct it or vet intervention to hoofs. Foots are judged: 0 – correct foots; 1 – functional correction is necessary; 2 – problem, edema, functional correction; 3 – edema, antibiotics. On each cow are vaginally, rectally and or ultrasonogrphically detected reproduction organs: 0 – physiological status; 1 – 1x antibiotics application – slight smell in vagina; 2 – vaginal issue smell, nonphysiological status, antibiotics, 4 uterus boluses two time; 3 – retentio secundin, without decay tissue, antibiotics; 4 – temperature increased, retentio secundin, strong decay smell, antibiotics. In Czech has each cow for central evidention of animal evaluated its parturition. Parturition is evaluated in three steps: 1 – without help or with slight help one person; 2 – parturition with help more persons or with parturition helps – lever; 3 – parturition with help of veterinarian – repositions, ceasars cuts etc. As next information was collect about each cow calving interval (from parturition to parturition) and milk performance in normal lactation (305 days). Results and discussion The evaluation of parturition difficulty shows, that hepl of veterinarian was necessary only in 6 cases from 592 cows (Sch. I). Parturitions with more helpers and with help of parturition lever was on 134 cows and normal physiological parturitions with slight help or without man help was in 452 cows. On our results is visible, that parturition complications directly correlate with postpartal status of cow reproduction organs in early puerperium, when body temperature increasing was not so intensive. Between groups of cows with problematic reproduction organs was found statistic significant (P≤0,01) differences. Calving interval was not affected. Difficult course of parturition is reason for selection 10,9% all cows from farms (Kvapilik et al., 2006). The trend for decreasing of SCN was supported by decreasing trend for average status of udder health. Cows was divided to groups based on SCN – over 1 million in 1 ml, SCN over 400 thousands in 1 ml and SCN under 400 thousands in 1 ml. Is excelent, that 2/3 of cows has SCN under 400 thousands per 1 ml and milk is saleable to milk factory. Very important fact is, that udder health status, calving interval and milk performance was not by SCN affected. From this reason is important, that highest chance for long producing live have cows with SCN in milk 200 – 400 thousands in 1ml of milk (Říha, 2000). Reproduction organs health status after parturition is directly affected by parturition difficulty. This is dirrectly visible on results of parturition course after sorting cows depend on health status reproduction organs in early puerperium, when from worst organ statuses 62 | P a g e


May 24-25th 2012

numbers decreased on better levels, it is mean in parturitions on easier parturition courses. This trends are strong supported by statistic significant (P≤0,01, P≤0,05) differences between groups for parturition course (Sch. III). Thanks intensive care about cows in early puerperium was in evaluation find only 7 cases of strong infections with decay tissue in uterus. With status of reproduction organs is connected its different strong inflammation processes with increased body temperature. Between nonproblematic and problematic groups of cows was found statistic significant (P≤0,01) differences for body temperature in 3th and 5th day after parturition. Říha (2003) find out, that increasing milk performance leads in more reproduction problematic cows in herd. In sooner paper Říha (2000) find out higher SCN in first half of lactation with higher frequency endometritis of reproduction organs, ovarial cysts and luteal cysts on ovaries. Increased body temperature shows in animals on health problem. Increased body temperature had in our evaluation 3th day after parturition 53 cows. Other animals had body temperature physiological normal – 37,5 – 39,5 °C. 5th day after parturition had increased temperature 55 cows. Difference between this groups of cows was statistic significant (P≤0,01) (Sch. IV). Very important is, that there are signs on reproduction organs and in parturition difficulties too. Conclussions We have evaluated on standard lowland farm in Czech on holstein cows with well managed systhematic control of early puerperium possibilities how to fast detect problematic cow reproduction as method for saving later infertility.

Is strong visible, that only

systhematic fast help in cows after parturition can lead in 40 days after parturition in first heat and in 60 days after parturition in insemination and pregnancy. Cooperation between veterinarians and zootechnics, owen artefitial insemination cows by zootechnics can leads in increasing reproduction and production parameters of holstein cow herd. Problematic reproduction affect milk performance only in some cases.

Acknowledgements The research was supported by IGA TP 1/2012.

63 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab. 1 Hodnocení časného puerperia dle obtížnosti porodu (The early puerperium evaluation by course of parturition) Evaluated parameters Cows Temp 3.d Temp 5.d SCN Udder Rep org Part Calving n (ks) (°C) (°C) (thnds) status course interval a A 6 39,03 38,93 1593,66 0,33 2,83 3 374,33 x sx 0,38 0,58 1157,95 0,47 1,21 0 24,31 A B x 134 38,93 38,95 921,88 0,73 1,54 2 415,12 0,67 0,55 1413,60 1,08 1,19 0 66,16 sx a A AB 452 38,77 38,77 707,87 0,66 0,35 1 403,95 x sx 0,56 0,53 1203,10 1,06 0,69 0 61,56 a, b, c – (P≤0,05); A, B, C – (P≤0,01)

Tab. 2 Hodnocení časného puerperia dle hodnot somatických buněk mléka (The early puerperium evaluation by SCN) Evaluated parameters Calving Cows SCN Udder Part Temp Temp Milk perf interval Rep org 3.d (°C) 5.d (°C) (thnds) (kg) n (ks) status course (days) AB AB a 38,85 2855,42 1,66 0,79 1,31 401,75 9192,01 x 38,81 119 0,52 0,56 1486,01 1,33 1,13 0,51 64,78 1398,82 sx 38,79 38,79 642,04AC 1,06 AC 0,73 1,35 b 406,69 9491,18 x 92 0,59 0,43 184,85 1,17 1,10 0,52 61,01 1888,11 sx 38,81 38,80 142,23BC 0,56 0,56 100,66 a, b, c – (P≤0,05); A, B, C – (P≤0,01)

381

x sx

0,27 BC 0,61

1,20 ab 0,40

0,58 0,92

406,35 61,92

9302,13 1536,16

7

38,93 38,96 sx 0,29 0,48 35 39,18A 39,09A x 0,72 0,53 sx B b 82 38,97 38,91 x sx 0,66 0,69 86 38,92C 38,96C x 0,57 0,62 sx ABC AbC 382 38,71 38,73 x sx 0,48 0,47 a, b, c – (P≤0,05); A, B, C – (P≤0,01)

x

1804,28 2083,81 1050,51 1182,47 809,66 1330,19 791,45 1312,01 704,71 1204,78

0 0 0,85 1,31 0,73 1,15 0,68 1,10 0,63 1,02

4 0 3 0 2 0 1 0 0 0

2,28abC 0,69 1,88DF 0,32 1,53aDEGH 0,55 1,28bEGI 0,47 1,09CFHI 0,30

412,00 58,84 447,00 69,09 401,63 59,53 419,13 69,32 401,87 60,32

Milk perf (kg)

Calving interval (days)

Part course

Rep org

Udder status

SCN (thnds)

Temp 3.d (°C)

Cows n (ks)

Temp 5.d (°C)

Tab. 3 Hodnocení časného puerperia dle stavu reprodukčních orgánů (The early puerperium evaluation by reproduction organs status) Evaluated parameters

8082,14 2302,07 8703,94 1434,36 9165,13 1370,70 9196,08 1476,55 9432,01 1588,43

64 | P a g e


May 24-25th 2012

Tab. 4 Hodnocení časného puerperia dle tělesné teploty krav 3. a 5. den po otelení (The early puerperium evaluation by body temperature 3th and 5th day) Evaluated parameters Calving Cows SCN Udder Part Temp Temp Milk perf interval Rep org 3.d (°C) 5.d (°C) (thnds) (kg) n (ks) status course (days) A A A a 39,28 746,30 0,47 1,38 1,42 425,25 9401,15 x 40,02 53 0,34 0,61 1272,31 0,83 1,12 0,49 62,19 1537,45 sx x 38,69A 38,77A 767,16 0,69 0,57A 1,23a 404,55 9301,97 539 0,41 0,51 1258,11 1,08 0,96 0,44 62,21 1575,78 sx 39,28B 39,92B 790,11 0,65 1,09 B 1,38b 408,88 8835,42 x 55 0,62 0,32 1231,25 1,18 1,05 0,52 54,29 1518,12 sx x 38,76B 38,69B 762,75 0,67 0,60 B 1,23b 405,56 9358,99 537 0,52 0,42 1262,22 1,05 0,98 0,44 62,72 1570,27 sx a, b, c – (P≤0,05); A, B, C – (P≤0,01)

References Kvapilík, J., Pytloun, J., Bucek, P. Ročenka 2005 – Chov skotu v České republice, Praha, 2006, 110 s. ISBN 80-239-7080-1 Říha, J. Plemenitba hospodářských zvířat. Výzkumný ústav chovu skotu Rapotín, 2003. 151 s. ISBN 80-903143-4-1 Říha, J. Reprodukce v procesu šlechtění skotu. Výzkumný ústav chovu skotu Rapotín, 2000. 144 s.

65 | P a g e


May 24-25th 2012

EFFECT OF FEED RESTRICTION ON DIGESTIBILITY OF NUTRIENTS AND DEVELOPMENT OF SMALL INTESTINE IN BROILER RABBITS Chodová, D., Tůmová, E. Katedra speciální zootechniky, Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů, Česká zemědělská univerzita v Praze

Abstract The aim of this study was to evaluate the effect of quantitative feed restriction on digestibility of nutrients, length and histological parameters of small intestine in broiler rabbits. After weaning (35 days of age), rabbits were divided into three groups: ADL – ad libitum fed, R50 was restricted on 50 g feed per rabbit per day and group R65 was restricted on 65 g per rabbit per day. Restriction was applied from 42nd to 49th days of age. Before and following of restriction, rabbits were fed ad libitum. Digestibility of nutrients was detected by a quantitative method. First balance period was from 42nd to 49th day of age (feed restriction) and second balance period was from 49th to 56th day of age (realimentation). Nutrient composition of feed and faeces was defined according to AOAC methods. At 49, 56 and 70 days of age, 8 rabbits from each group were slaughtered for determination of small intestine characteristics. The digestibility of nutrients was not affected by feeding technique, but by age. Digestibility of crude protein, fat and NDF was better in time of feed restriction. The length of small intestine significantly increased with age. The longest intestine was measured at 70 days of age (331 – 340 cm). There was determined interaction group × age in height of villi and depth of crypts. The biggest (P≤0.001) villi height had R65 group at 56 days of age (630.98 µm) and ADL at 70 days of age (614.46 µm). But these groups had the lowest villi height at 49 days of age. The greatest villi depth was determined in R65 group at 56th and 70th day (150.4 µm and 148.8 µm). Restricted groups had significantly (P≤0.001) highest depth of crypts at 70 days of age.

Úvod U brojlerových králíků se restrikce krmiva využívá především z důvodu zlepšení konverze krmiva, omezení množství tuku v jatečně upraveném trupu a také omezení trávicích obtíží u králíčat v období odstavu. Poruchy trávicí trubice bývají častou příčinou vysoké mortality. Restrikce krmiva může být kvalitativní nebo kvantitativní, popřípadě časová. Ovlivnění růstových schopností a s nimi spjatých dalších parametrů závisí na době začátku a 66 | P a g e

May 24-25th 2012


intenzitě restrikce a na délce trvání restrikčního období. Na intenzitě a délce restrikce závisí také spotřeba krmiva. Spolu se vzrůstající intenzitou restrikce klesá spotřeba a konverze krmiva. Zlepšení konverze krmiva pozorovali například Matics et al. (2008) a Metzger et al. (2011) u časově restringovaných králíků. Nižší spotřeba krmiva byla i při intenzivnější restrikci (Tůmová et al., 2003; Gidenne et al., 2009). V době realimentace je srovnatelná spotřeba krmiva. Zlepšení stravitelnosti živin u restringovaných králíků je zejména kvůli delšímu retenčnímu času tráveniny v trávicí soustavě. Spolu s růstem a spotřebou krmiva je ovlivněn také zdravotní stav králíků. Boisot et al. (2003) prokázali snížení epizootického střevního onemocnění králíků vlivem restrikce. Podobně Gidenne et al. (2009) uvádějí snížení morbidity u intenzivně restringovaných králíků v době restrikce. Cílem práce bylo zjistit vliv krátkodobé kvantitativní restrikce na stravitelnost živin, délku tenkého střeva a histologické parametry sliznice tenkého střeva.

Materiál a metodika D

o pokusu bylo zařazeno 192 brojlerových králíků Hyplus. Po odstavu v 35. dni věku

byli králíci rozděleni do třech skupin: skupina ADL byla krmena po celou dobu pokusu ad libitum, skupina R50 byla restringována na 50 g krmiva/ks/den a skupina R65 na 65 g krmiva/ks/den. Restrikce byla aplikována od 42. do 49. dne věku. Před a po skončení restrikce byly všechny skupiny krmeny ad libitum. Králíci byli ustájeni v klecovém systému po třech kusech (0,16 m2/ks) a krmeni granulovanou krmnou směsí (18,1 % N-látek, 16,7 % vlákniny a 3,6 % tuku). Podmínky mikroklimatu odpovídaly běžným požadavkům pro ustájení králíků. Konec pokusu byl realizován v 70-ti dnech věku porážkou. Stravitelnost živin byla zjišťována bilančním pokusem rozděleným na dvě etapy. Bilance 1 v období restrikce (42. – 49. den věku) a bilance 2 v době realimentace (49. – 56. den věku). Během bilancí byla denně zaznamenávána spotřeba krmiva a odebírány výkaly, jež byly skladovány při teplotě 18 °C až do analýz. Živinové složení krmné směsi a výkalů bylo zjištěno pomocí metod AOAC. Sušina a popeloviny byly stanoveny dle AOAC (1995), dusíkaté látky pomocí Kjeltec Auto A1030 Analyser (Tecator AB, Švédsko), tuk přístrojem Soxtec (Tecator AB, Švédsko) a vláknina byla stanovena dle metody Van Soest a Wine (1967). Koeficienty stravitelnosti byly vypočítány dle následujícího vzorce:

[(množství krmiva x množství živin v krmivu) – (množství výkalů x množství živin ve výkalech)]×100 (množství krmiva x množství živin v krmivu)

67 | P a g e


May 24-25th 2012

Po porážce byla změřena délka tenkého střeva a byly odebrány vzorky sliznice tenkého střeva (dvanáctníku) vždy od osmi králíků z každé skupiny, tj. celkem od 72 králíků pro pozdější histologické stanovení hloubky a výšky střevních klků. Při stanovení byly nařezány na 5 µm silné řezy, které byly obarveny hematoxylin-eosinem. Pomocí programu Nis-Elements byla vyhodnocena výška klků a hloubka krypt. Výška klků byla měřena od vrcholu klků po přechod v kryptu a hloubka krypt byla vyjádřena dle invaginací mezi dvěma klky. Ke statistickému vyhodnocení výsledků byla použita analýza variance – metoda ANOVA s interakcí skupina × věk programu SAS (SAS Institute Inc., 2003).

Výsledky a diskuze Výsledky stravitelnosti živin jsou uvedeny v tabulce 1. U stravitelnosti živin nebyly zjištěny průkazné interakce mezi skupinou a bilancí. Stravitelnost byla ovlivněna především bilancí, tj. věkem králíků. Na stravitelnost dusíkatých látek měla vliv pouze doba bilance. V období restrikce byla stravitelnost dusíkatých látek průkazně (P≤0,007) vyšší než v době realimentace. Podobné výsledky byly zaznamenány také u stravitelnosti tuku a bezdusíkatých látek výtažkových (BNLV). Naproti tomu acidodetergentní vláknina (ADF) nebyla ovlivněna technikou krmení ani dobou bilance. Stravitelnost neutrálně detergentní vlákniny (NDF) byla signifikantně (P≤0,009) ovlivněna pouze bilačním obdobím. V době restrikce byla stravitelnost NDF vyšší než v týdnu následujícím po restrikci. Přestože stravitelnost jednotlivých živin nebyla průkazně ovlivněna technikou krmení, restringované skupiny měly vyšší stravitelnost těchto živin. Rovněž Tůmová et al. (2003, 2007) zjistili nejlepší stravitelnost živin v době restrikce. Na rozdíl od našich výsledků ovšem uvádějí průkazně lepší stravitelnost živin u skupin s restrikcí na dobu 1 – 2 týdnů. V době realimentace již nezaznamenali rozdíly mezi jednotlivými skupinami. Také Gidenne et al. (2009) nezjistili průkazné rozdíly mezi králíky s odlišnou technikou krmení, pouze stravitelnost dusíkatých látek byla mírně vyšší u skupin s intenzivnější restrikcí. Naproti tomu Di Meo et al. (2007) zaznamenali zlepšení stravitelnosti sušiny, NDF a ADF u kvantitativně restringovaných králíků ve srovnání s ad libitně krmenými.

68 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab. 1 Vliv restrikce a bilančního období na stravitelnost živin (The effect of feed restriction and balance period on digestibility of nutrients) Doba bilance (dny) Sušina 42 – 49 (%) 49 – 56 N-látky 42 – 49 (%) 49 – 56 42 – 49 Tuk (%) 49 – 56 BNLV 42 – 49 (%) 49 – 56 42 – 49 ADF (%) 49 – 56 42 – 49 NDF (%) 49 – 56 Živiny

Skupina ADL 56,95 54,97 73,54 70,13 89,95 89,23 95,04 90,38 22,02 18,58 26,01 22,22

R50 58,91 56,32 77,69 74,02 91,9 89,88 95,41 94,98 23,44 19,2 26,43 24,5

Průkaznost R65 58,53 56,82 77,14 75,09 91,2 89,92 95,23 95,33 21,69 20,67 25,75 24,56

Skupina

Bilance

Skupina × bilance

0,971

0,099

0,363

0,123

0,007

0,084

0,368

0,001

0,54

0,279

0,046

0,314

0,608

0,112

0,394

0,691

0,009

0,379

Délka tenkého střeva byla průkazně (P≤0,001) ovlivněna pouze věkem. Se stoupajícím věkem se délka tenkého střeva prodlužovala. Tenké střevo restringovaných králíků bylo neprůkazně delší než u ad libitně krmené skupiny, což je v souladu s Sabatakou et al. (2007), kteří uvádějí prodlužování délky tenkého střeva s rostoucím věkem. Histologické parametry tenkého střeva byly ovlivněny technikou krmení, věkem a byly zaznamenány také interakce mezi technikou krmení a věkem. Průkazně (P<0,001) nejvyšší výška klku sliznice tenkého střeva byla zaznamenána u králíků R65 56. den věku (630,98 µm) a u ad libitně krmených králíků 70. den věku (614,46 µm). Naproti tomu průkazně nejnižší výšku klků měly tyto dvě skupiny 49. den věku (448,01 µm u R65, 466,89 µm u ADL). Na konci pokusu se restringované skupiny nelišily od ad libitum krmených králíků. Na rozdíl od našich výsledků, Martignon et al. (2010) nezaznamenali vliv restrikce na vývoj střevní sliznice králíků. Rovněž hloubka krypt byla průkazně ovlivněna technikou krmení, věkem a byly také zaznamenány interakce skupina×věk. Průkazně největší hloubku krypt měli králíci s restrikcí na 65 g krmiva 56. a 70. den věku (150,4 µm a 148,8 µm). Avšak na začátku pokusu byla hloubka krypt u této skupiny průkazně nejnižší (115,38 µm). Restringované skupiny měly v 70-ti dnech průkazně větší hloubku krypt než ad libitně krmená skupina. Martignon et al. (2010) nezaznamenali průkazné rozdíly mezi restringovanými a ad libitum krmenými králíky. Tito autoři uvádějí pouze zvyšující se hloubku krypt s věkem králíků.

69 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab. 2 Vliv restrikce a věku na parametry tenkého střeva (The effect of feed restriction and age on small intestine characteristics) Skupina

ADL

R50

R65

49

Délka tenkého střeva (cm) 264

56

312

516,37

70

340

614,46

49

266

506,01

56

340

501,57

70

337

601,91

49

273

448,01

56

346

630,98

70

331 8 0,19 <0,001 0,599

Věk

SEM Průkaznost skupina věk skupina*věk a,b,c,d,e

Výška klku (µm)

Hloubka krypt (µm)

d

123,11

d

c

126,36

d

ab

121,43

c

120,09

c

142,36

b

134,31

c

d

115,38

e

a

150,40

a

601,14 128

b

148,80 49

<0,001 <0,001 <0,001

0,001 <0,001 <0,001

466,89

de de b

ab

P≤0,05

Závěr Na stravitelnost živin neměla restrikce krmiva průkazný vliv. Stravitelnost dusíkatých látek, tuku, bezdusíkatých látek výtažkových a neutrálně detergentní vlákniny byla průkazně lepší v době restrikce. Délka tenkého střeva se průkazně zvětšovala pouze s věkem. U histologických parametrů sliznice tenkého střeva byly zaznamenány průkazné interakce. Po skončení restrikce měly restringované skupiny průkazně vyšší střevní klky, ovšem s přibývajícím věkem se rozdíly mezi jednotlivými skupinami vyrovnaly. Naproti tomu hloubka klků byla i na konci pokusu vyšší u restringovaných králíků. Pomocí zvýšení profilu střevní sliznice v době restrikce se zvětšila plocha pro resorpci živin.

Poděkování Příspěvek byl zpracován za podpory výzkumného záměru MSM 6046070901.

Použitá literatura AOAC. Official Methods of Analysis. Association of Official Analytical Chemists, 16th ed., Arlington, Virginia, USA, 1995. Boisot, P., Licois, D., Gidenne, T. Feed restriction reduces the sanitary impact of an experimental reproduction of Epizootic Rabbit Enteropathy syndrome (ERE) in the 70 | P a g e


May 24-25th 2012

growing rabbit. In: Proceedings of the 10th French Rabbit Days, 19-20 November 2003, Paris, France, pp: 267-270. Di Meo, C., Bovera, F., Marono, S., Vella, N., Nizza, A. Effect of feed restriction on performance and feed digestibility in rabbits. Ital. J. Anim. Sci., 2007, 6, 765–767. Gidenne, T., Feugier, A. Feed restriction strategy in the growing rabbit. 1. Impact on digestion, rate of passage and microbial activity. Animal, 2009, 3, 501–508. Martignon, M. A., Combes, S., Gidenne, T. Digestive physiology and hindgut bacterial community of the young rabbit (Oryctolagus cuniculus): Effect of age and short-term intake limitation. Comp. Biochem. Phys. A, 2010, 156, 156–162. Matics, Zs., Dalle Zotte, A., Radnai, I., Kovács, M., Metzger, Sz., Szendrö, Zs. Effect of restricted feeding after weaning on the productive and carcass traits of growing rabbits. In: Proceedings 9th World Rabbit Congress, Verona – Italy, June 10-13 2008, 741–746. Metzger, Sz., Bianchi, M., Cavani, C., Petracci, M., Szabó, A., Gyovai, M., Biró-Németh, E., Radnai, I., Szendrö, Zs. Effect of nutritional status of rabbit kits on their productive performance, carcass and meat quality traits. Livest. Sci., 2011, 137, 210–218. Sabatakou, A. O., Xylouri, M. E., Sotirakoglou, A. K., Fragkiadakis, G. M., Noikokyris, N. P. Histochemical and biochemical characteristics of weaning rabbit intestine. World Rabbit Sci., 2007, 15, 173–178. SAS Institute Inc. The SAS System for Windows. Release 9.1, 2003. Tůmová, E., Skřivanová, V., Skřivan, M. Effect of restricted feeding time and quantitative restriction in growing rabbits. Arch. Geflügelkd., 2003, 67, 182–190. Tůmová, E., Zita, L., Skřivanová, V., Fučíková, A., Skřivan, M., Burešová, M. Digestibility of nutrients, organ development and blood picture in restricted and ad libitum fed broiler rabbits. Arch. Geflügelkd., 2007, 71, 6–12. Van Soest, P. J., Wine, R. H. Use of detergents in the analysis of fibrous feeds. IV. Determination of plant cell wall constituents. J. Assoc. Off. Agric. Chem., 1967, 50, 50–55.

71 | P a g e

May 24-25th 2012


FOOD RESTRICTION POSITIVELY INFLUENCED CELL MEDIATED IMMUNITY OF JAPANESE QUAIL SELECTED FOR HIGH AND LOW TESTOSTERONE CONTENT IN EGG YOLK Kaňková, Z.1, Okuliarová, M.1, Zeman, M.1,2 1

Katedra živočíšnej fyziológie a etológie, Prírodovedecká fakulta UK, Bratislava, Slovensko, 2Ústav biochémie a

genetiky živočíchov, SAV, Ivanka pri Dunaji, Slovensko

Abstract Transfer of information from the mother to her offspring by maternal androgens is a part of adaptation processes enabling organisms to cope with constantly changing environment. Maternal testosterone offers young individuals an advantage in the form of stimulation of body growth and different behavioural effects. However, some negative effects of testosterone on the immune system were suggested and these negative influences may constrain the increase of maternal testosterone levels in an egg yolk, keeping them in distinct limits. Somatic growth stimulated by testosterone, as well as development and stimulation of the immune response, is energetically costly and can lead to a suppression of one of these mechanisms in the environment with limited food resources. Therefore, our experiments focussed on consequences of high and low maternal testosterone content on the immune response of Japanese quail exposed to the qualitative food restriction. We did not observed any detrimental effects of the food restriction or elevated yolk testosterone content on immunoreactivity of the chicks. Both factors even stimulated the immune response to phytohemagglutinine, indicating an improved cell mediated immunity.

Úvod Maternálne androgény môžu významne prispievať k transgeneračnému prenosu informácii o aktuálnych podmienkach prostredia. Depozíciou rozdielnych množstiev maternálnych androgénov môže byť vytváraná široká fenotypická variabilita, ktorá umožňuje živočíchom pružne reagovať na rýchlo sa meniace prostredie (Groothuis a Schwabl, 2008). Depozícia maternálneho testosterónu sa stala atraktívnou témou, pretože gonadálne steroidy sú schopné ovplyvňovať nielen samotnú pohlavnú diferenciáciu mladých jedincov (Arnold, 1996), ale zohrávajú dôležitú úlohu v ovplyvňovaní vývinu organizmu, či už prostredníctvom aktivačných alebo organizačných účinkov (Duffy a kol., 2002). Ideálny model pre štúdium maternálnych efektov predstavujú vtáčie embryá, ktorých vývin mimo tela

72 | P a g e

May 24-25th 2012


matky poskytuje excelentné možnosti priameho ovplyvnenia vajcového obsahu pôsobiaceho na vývin embrya, bez ďalšieho ovplyvnenia zo strany matky. Početné experimentálne skupiny sa zaoberajú vplyvom maternálnych androgénov na rast (Navara a kol., 2005) a správanie (Eising a Groothuis, 2003), ako aj manifestáciu sekundárnych pohlavných znakov (Eising a kol., 2006). Mnohé z uvedených experimentov potvrdili pozitívne účinky týchto hormónov na vývin mláďat, hoci na druhej strane existujú štúdie, ktoré podávajú dôkazy o ich negatívnom pôsobením napríklad v podobe potlačenia imunitného systému (Müller a kol., 2005). Výsledky v tejto oblasti sú však často nejednotné, v rozmedzí od negatívnych až po pozitívne (Cucco a kol., 2008). Táto rôznorodá manifestácia účinkov maternálneho testosterónu môže byť dôsledkom jednak medzidruhovej špecificity a rôznorodosti experimentálnych prístupov, ale môže byť daná aj napríklad podmienkami prostredia, ktorým je mladý jedinec v skorých postnatálnych štádiách vystavený. Podľa teórie prerozdelenia zdrojov môže dochádzať k potlačeniu vývinu a reaktivity imunitného systému v prostredí, ktoré nie je schopné poskytnúť dostatok zdrojov na uspokojene požiadaviek organizmu na zrýchlený rast, výraznejšie pohlavné znaky a prípadnú aktiváciu imunitného systému mláďat, nakoľko sú všetky uvedené procesy pre vyvíjajúci sa organizmus veľmi energeticky náročné (Lochmiller a Deerenberg, 2000). V našej predošlej experimentálnej práci sme nezaznamenali na nami vypracovanom modeli prepelíc japonských divergentne selektovaných na vysoký a nízky obsah testosterónu vo vajcovom žĺtku (Okuliarova a kol., 2011), negatívne pôsobenie maternálneho testosterónu na imunitný systém mláďat (Kankova a kol., 2012).

Preto sme sa rozhodli sledovať

schopnosť aktivácie imunitného systému u týchto dvoch línií v podmienkach potravovej reštrikcie, aby sme odhalili prípadné interakcie medzi pôsobením maternálneho testosterónu a nepriaznivých podmienok prostredia.

Materiál a metodika Experimentálnym

modelom

bola

F5

generácia

prepelíc

japonských

(Coturnixjaponica), selektovaných na vysoký (HET) a nízky (LET) obsah testosterónu vo vajcovom žĺtku z chovu Ústavu biochémie a genetiky živočíchov SAV (ÚBGŽ SAV) v Ivanke pri Dunaji (Okuliarova a kol., 2011). Vajcia boli inkubované za štandardných podmienok v liahni BIOSKA (Sedlčany, ČR). Po vyliahnutí boli mláďatá premiestnené do chovných boxov podľa príslušnosti k chovnej línii a potravovej skupine (HET: n = 40; LET: n = 40). Prvé tri dni mali všetky zvieratá neobmedzený prístup k vode a krmivu (HYD 13 - kompletná kŕmna zmes na výkrm 73 | P a g e

May 24-25th 2012


moriek). Štvrtý deň po vyliahnutí bola u polovice mláďat zavedená potravová reštrikcia (30% piliny z tvrdého dreva + 70% HYD 13). Zvieratá boli počas experimentu pravidelne vážené. Imunokompetentnosť mláďat bola testovaná v dvoch nezávislých experimentoch. Experiment 1: V prvom experimente bola pozorovaná imunokompetentnosť dvoch línií voči fytohemaglutínu (PHA), látke stimulujúcej bunkovú imunitnú odpoveď. Vo veku 14 dní bol u 20 zvierat HET línie a 20 zvierat LET línie vykonaný test PHA-indukovaného opuchu kožnej blany na krídle mláďat. Pred počiatočným meraním hrúbky patágia mikrometrom (Vogel, Nemecko, 5 meraní na krídlo) bola kožná blana oboch krídel zbavená peria. Následne bolo do pravého krídla subkutánne aplikovaných 100 µg PHA (Sigma, USA) v 20 µl sterilného fyziologického roztoku (PBS) a do ľavého krídla 20 µl čistého PBS. Opakované meranie hrúbky krídla bolo vykonané 24 hodín od aplikácie PHA. Miera schopnosti odpovedať na tento stimul bola vypočítaná podľa nasledujúceho vzorca: PHAindex =

PostPHA − postPBS ( prePBS + prePHA) / 2

[I.] PostPHA - hrúbka blany po aplikácii fytohemaglutinínu (PHA), postPBS - hrúbka blany po aplikácii PBS, prePBS - hrúbka blany pred aplikáciou PBS, prePHA - hrúbka blany pred aplikáciou PHA. (PostPHA – thickness of the wing after phytohemagglutinine (PHA) administration, postPBS thickness of the wing after PBS administration, prePBS - thickness of the wing before PBS administration, prePHA - thickness of the wing before PHA administration).

Experiment 2: Akútna

odpoveď

mláďat

na

stimuláciu

imunitného

systému

lipopolysacharidom (LPS), bola testovaná 14. až 15. deň veku mláďat. Zvieratám bolo intraperitoneáulne podaných 1,5 mg LPS (LPS, Sigma USA) na 1 kg živej váhy v 100 µl PBS. Kontrolná skupina pozostávala s jedincov, ktorým bol rovnakým spôsobom podaný čistý PBS (100 µl na jedinca). Konkrétna dávka LPS bola vybraná s úmyslom vyvolať imunitnú reakciu organizmu, bez vážnejších patologických prejavov (Kautsos a Klasing, 1992). Pokusné zvieratá boli usmrtené tri hodiny po podaní LPS rýchlou dekapitáciou, pričom bola odobraná krv do heparinizovaných skúmaviek (Heparin, Léčíva Praha, ČR). Zvieratá boli podrobené anatomickej pitve, počas ktorej bolo zistené pohlavie zvierat a bola vypreparovaná Fabríciova burza. Z časti krvi boli vytvorené krvné preparáty, na základe ktorých sme stanovili pomocou diferenciálneho počtu bielych krviniek pomer heterofilov a lymfocytov. Krvné nátery boli fixované a farbené Pappenheimovou panoptickou metódou a následne vyhodnocované pod svetelným mikroskopom (CARL ZEISS, Jena, Nemecko), pri 1000-násobnom zväčšení s použitím imerzného oleja. Zvyšok krvi bol centrifugovaný pri 2500 ot/min, 4oC, 10 minút a uskladnený pri -20oC až do doby vykonania merania obsahu kortikosterónu. Hladiny kortikosterónu v krvnej plazme boli stanovené pomocou komerčnej súpravy na meranie kortikosterónu (DRG RatCorticosterone 125I) podľa pokynov výrobcu. 74 | P a g e

May 24-25th 2012


Výsledky Experiment 1: Potravová reštrikcia mala preukázateľný účinok na hmotnosti experimentálnych zvierat (F3,354=18,54; p<0,001), čo sa prejavilo nižšími hmotnosťami reštringovaných zvierat, v porovnaní s kontrolnou skupinou od ôsmeho dňa veku zvierat (8. deň: p<0,001; 14. deň: p<0,001) (Obr. 1b). Faktor línie nemal v tomto prípade signifikantný vplyv na sledovaný parameter (F3,354=0,88; p=0,450). Ku koncu experimentu sa začali medzi jedinca prejavovať pohlavné rozdiely v hmotnosti tela (F3,354=8,23; p<0,001) (Obr. 1a). V deň ukončenia pokusu boli samice ťažšie v porovnaní so samcami (samice: 48,37±0,58 g; samce: 46,27±0,58 g). Opakovaná analýza rozptylu nepreukázala signifikantný vplyv interakcie faktorov línie a reštrikcie na hmotnosti zvierat (F3,354=0,67; p=0,574). 70

Hmotnosť tela (g)

60

a

LET HET

50

Kontrola Potravová reštrikcia

b

***

40 30

***

20 10 0 1. deň

4. deň

8. deň

14. deň

1. deň

4. deň

8. deň

14. deň

Obrázok 2 Hmotnosti prepelíc japonských selektovaných na vysoký (HET) a nízky (LET) obsah testosterónu vo vajcovom žĺtku počas trvania prvého experimentu s podaním fytohemaglutinínu; (a) rozdiely medzi líniami, (b) rozdiely medzi potravovými skupinami. *** p<0,001. (Body mass of Japanese quail selected for high and low yolk testosterone content during the first experiment with phytohemaglutinine administration; (a) differences between lines, (b) differences between food groups. *** p<0.001).

U mláďat vystavených potravovej reštrikcii sme zaznamenali výraznejšiu odpoveď na stimuláciu imunitného systému fytohemaglutinínom (F1,74=11,374; p<0,01; PHA index kontrola: 1,143±0,06; PHA index reštrikcia: 1,433±0,07). Väčší opuch krídlovej blany sme taktiež zaznamenali u zvierat HET línie (F1,74=11,592; p<0,01; PHA index HET línia: 1,427±0,06; PHA index LET línia: 1,141±0,06). Interakcie týchto dvoch faktorov (línia × reštrikcia) však nebola signifikantná (F1,74=0,471; p<0,49). Experiment 2: Opakovaná analýza rozptylu aj v tomto prípade potvrdila signifikantný účinok potravovej reštrikcie na hmotnosti mláďat (Obr. 2b) (F3,216=7,13; p<0,001). Ku koncu pokusu sa prejavili rozdiely medzi líniami, ktoré sa manifestovali vo forme vyšších hmotností zvierat selektovaných na vysoký obsah testosterónu (F3,216=5,45; p<0,01) (Obr. 2a).

75 | P a g e

May 24-25th 2012


Hmotnosť tela (g)

80 a

LET HET

b

Kontrola Potravová reštrikcia

60

* ***

*** 40

* ** 20

0 1. deň

4. deň

8. deň

1. deň

14. deň

4. deň

8. deň

14. deň

Obrázok 3 Hmotnosti prepelíc japonských selektovaných na vysoký (HET) a nízky (LET) obsah testosterónu vo vajcovom žĺtku počas trvania druhého experimentu s podaním lipopolysacharidu; (a) rozdiely medzi líniami, (b) rozdiely medzi potravovými skupinami. ** p<0,01; *** p<0,001. (Figure 2: Body mass of Japanese quail selected for high and low yolk testosterone content during the second experiment with lipopolysaccharide administration; (a) differences between lines, (b) differences between food groups. ** p<0,01; *** p<0.001).

Interakcia faktorov línie a reštrikcie neovplyvnila signifikantne sledovaný parameter (F3,216=0,61; p=0,611). Vplyv pohlavia na hmotnosti bol v tomto prípade tesne nad hranicou signifikantnosti s podobným trendom ako bol preukázaný v prvom experimente (F3,216=2,33; p=0,075; samice: 49,47±0,63 g; samce: 48,07 g v 14. deň experimentu). Hmotnosti Fabríciovej burzy korigované na hmotnosť tela vykazovali signifikantné rozdiely medzi líniami (F1,72=5,42; p<0,05) aj medzi potravovými skupinami (F1,72=4,34; p<0,05). Jedince HET línie mali po prepočte na hmotnosť tela signifikantne ľahšiu burzu v porovnaní s LET líniou (HET: 0,87±0,04 mg/g hmotnosti tela; LET: 0,98±0,05 mg/g hmotnosti tela). Reštrikcia spôsobila u oboch línií nárast v hmotnostiach tohto lymfatického orgánu (Obr. 3).Pohlavie sledovaných zvierat (F1,72=2,73; p=0,103), ani interakcia medzi

Fabríciova burza (mg/g hmotnosti tela)

líniou a reštrikciou neovplyvnila hmotnosti Fabríciovej burzy (F1,72=1,63; p=0,206). 2,0 LET HET

1,5

* 1,0

0,5 20

20

20

20

0,0 Kontrola Potravová reštrikcia

Obrázok 4: Hmotsnosti Fabríciovej burzy upravené vzhľadom na telesnú hmotnosť prepelíc japonských selektovaných na vysoký (HET) a nízky (LET) obsah testosterónu vo vajcovom žĺtku. * p<0,05. (Figure 4: Weight of bursa of Fabricius corected for body mass of Japanese quail selected for high and low yolk testosterone content. * p<0.05).

76 | P a g e


May 24-25th 2012

Tri hodiny po podaní LPS sme nezaznamenali vplyv potravovej reštrikcie (F1,72=0,40; p=0,527; kontrola: 10,12±2,60 ng/ml; reštrikcia 7,44±1,60 ng/ml), línie (F1,72=1,74; p=0,192; HET: 8,42±1,44 ng/ml; LET: 9,14±2,71 ng/ml), ani ich vzájomnej interakcie (F1,72=0,04; p=0,834) na hladiny kortikosterónu v plazme. Podanie LPS zvýšilo hladiny kortikosterónu v plazme, avšak tento rozdiel nebol štatisticky signifikantný (F1,72=3,03; p=0,086). Podanie LPS výrazne zvýšilo pomer heterofilov k lymfocytom, ale tento parameter nebol ovplyvnený ďalšími faktormi zahrnutými do celkovej štatistickej analýzy (línia: F1,72=0,68; p=0,412; reštrikcia: F1,72=0,95; p=0,331), ani ich vzájomnými interakciami. Záver Hoci mala použitá potravová reštrikcia signifikantný vplyv na hmotnosti mláďat, nepredstavovala limitujúci faktor pre vývin ich imunitného systému. Výsledky dokonca poukazujú na pozitívny účinok reštrikcie a zvýšeného obsahu maternálneho testosterónu v žĺtku na odpoveď mláďat na podanie PHA, aj keď ich interakcia nebola signifikantná. Poďakovanie Práca bola podporená grantmi: APVV 0047-10 a VEGA 1/0686/12. Zoznam použitej literatúry Arnold, A.P. Genetically triggered sexual differentiation of brain and behavior. Horm. Behav., 1996, 30, 495–505. Cucco, M., Guasco, B., Malacarne, G., Ottonelli, R., Tanvez, A. Yolk testosterone levels and dietary carotenoids influence growth and immunity of grey partridge chicks. Gen. Comp. Endocrinol., 2008, 156, 418-425. Dufty, A.M., Clobert, .J, Moller, A.P. Hormones, developmental plasticity and adaptation. TREE, 2002, 17, 190–196. Eising, C.M., Groothuis, T.G.G. Yolk androgens and begging behaviour in black-headed gull chicks: and experimental field study. Anim Behav, 2003, 66, 1027–1034. Eising, C.M., Muller, W., Groothuis, T.G.G. Avian mothers create different phenotypes by hormone deposition in their eggs. Biol. Lett., 2006, 2, 20–22. Groothuis, T.G.G., Schwabl, H. Hormone-mediatedmaternal effects in birds: mechanisms mater but what do we know of them? Philosophical Transactions of the Royal Society BBiological Sciences, 2008, 363, 1647-1661. Kankova, Z., Zeman, M., Okuliarova, M. Growth and innateimmunity are notlimited by selection for high egg testosterone content in Japanese quail. J. Exp. Biol., 2012, 215, 617-622. Koutsos, E.A., Klasing, K.C. The acute phase response in Japanese quail (Coturnix coturnix japonica). Comp. Biochem. Physiol., 2001, 128C, 255-263. Lochmiller R.L., Deerenberg C. Trade-offs in evolutionary immunology: just what is the cost of immunity? Oikos, 2000, 88, 87–98. Mousseau, T.A., Fox, C.W. The adaptive significance of maternal effects. Trends Ecol. Evol., 1998, 13, 403-407. Müller, W., Groothuis, T.G.G., Dijkstra, C., Kasprzik, A., Alatalo, R.V., Siitari, H. Prenatal androgen exposure modulates cellular and humoral immune function of black-headed gull chicks. Proc. R. Soc. Lond., B, Biol. Sci., 2005, 272, 1971–1977. 77 | P a g e


May 24-25th 2012

Navara, K.J., Mendonça, M.T., Hill, G.E. Variable effects of yolk androgens on growth and immunity in eastern bluebird nestlings. Physiol. Biochem. Zool., 2005, 78, 570–578. Okuliarova, M., Groothuis, T.G.G., Skrobanek, P., Zeman, M. Experimental evidence for genetic heritability of maternal hormone transfer to offspring. Am. Nat., 2011, 177, 824834.

78 | P a g e


May 24-25th 2012

THE EFFECT OF COPPER IONS ON THE MOTILITY AND SURVIVAL OF BULL SPERMATOZOA IN DIFFERENT CULTURE MEDIA Kňažická, Z., 1 Lukáč, N., 1 Lukáčová, J., 1 Tvrdá, E., 1 Hashim, F., 1 Greń, A., 2 Massanyi, P.1 1

Department of Animal Physiology, Faculty of Biotechnology and Food Sciences, Slovak University of

Agriculture, Nitra, Slovak Republic 2

Department of Animal Physiology and Toxicology, Faculty of Biology and Geography, Pedagogical University,

Cracow, Poland

Abstract The target of this in vitro study was to determine the effect of copper (Cu) on the motility and viability of spermatozoa in the presence of different culture media. The percentage of motile spermatozoa was determined after exposure to concentrations of 3.9; 7.8; 15.6; 31.2; 62.5; 125; 250; 500; 1000 µM/L of Cu2+ using the Sperm VisionTM CASA system during different time periods (0h, 1h, 24h). The cell viability was measured by the MTT (metabolic activity) assay after 1h. The initial spermatozoa motility in the presence of Cu2+ in physiological saline solution (PS) showed slightly increased values at doses ≤ 31.20 µM/L of Cu2+ compared to the control group. The long-term cultivation (Time 24h) reduced the average motility values in all experimental groups (P<0.001). The cell viability was decreased significantly (P<0.001) in all experimental groups with added of Cu2+. The culture medium containing 20% bovine serum albumin (BSA), triladyl and 5% glucose increased the overall percentage of spermatozoa motility after 1h of cultivation. A concurrently BSA maintained motility of spermatozoa (≤ 62.50 µM/L of Cu2+) during Time 24h, which confirms the protective effect of albumin binding to the Cu2+. The obtained data point out that Cu2+ at high doses is a toxic element on the spermatozoa motility, which subsequently disrupts the viability of cells. However, using a suitable culture medium containing an energy component and protein rich substrate, the spermatozoa motility could increase. Key words: copper, culture media, bovine spermatozoa, motility, viability

INTRODUCTION Copper (Cu) is an important microelement for the animal and human organism, because it has a great positive role in physiological and regulatory processes (Dobrzanski et al., 1996). Copper plays in important role in male and female reproduction system (Wong et al., 2001). The excessive Cu intake has a negative effect on the organs of reproduction 79 | P a g e


May 24-25th 2012

(Katayose et al., 2004). The high concentrations of copper ions (Cu2+) have a toxic effect on the epididymis (Xu et al., 1985), testes, scrotum of mammals (Eidi et al., 2010) as well as spermatozoa function (Machal et al., 2002). The negative effect on the reproductive organs of males and females may ultimately lead to a reduced fertility (Pesch et al., 2006). Spermatozoa are extremely sensible to ex vivo conditions and on the loss of exogenous energy sources therefore different culture media are used on the viability prolongation of spermatozoa (Knazicka et al., 2012). Semen culture media usually contain glucose or fructose as the dominant energy substrate (Matsuoka et al., 2006) and bovine serum albumin (BSA) as a protein alternative to egg yolk (Peters et al., 1975). Recently several researchers investigated interactions between Cu2+ with serum albumin, due to the importance of Cu for various biological and chemical processes (Pinto et al., 2008). Therefore, the purpose of this in vitro study was to provide additional information on the impact of Cu2+ on the spermatogenesis in the presence of different media. Specifically, we evaluated the dose- and time-dependent effects of this trace metal on the motility and viability of spermatozoa during different time periods. Furthermore, it was also necessary to examine the possible cytotoxicity effect of Cu2+ on these cells.

Materials and methods Semen samples and in vitro culture Bull semen samples were obtained from 8 adult breeding bulls (Slovak Biological Services, Nitra, Slovak Republic). After collecting the samples, they were stored in the laboratory at room temperature (22-25°C). Each sample was diluted in physiological saline solution (PS) (sodium chloride 0.9% w/v, Bieffe Medital, Italia), using a dilution ratio of 1:40, depending on the original spermatozoa concentration. The cells were incubated in different culture media (Table 1) with various concentrations of copper (3.9; 7.8; 15.6; 31.2; 62.5; 125; 250; 500; 1000 µM/L), in the form of copper sulphate (CuSO4.5H2O; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Spermatozoa were cultivated in the laboratory at room temperature (22-25°C). We compared the control (Ctrl) group (medium without Cu2+) with the experimental groups (exposed to different concentrations of Cu2+).

Tab. 1 Culture media used for the experiment. Medium 1. 2.

Composition physiological saline solution (sodium chloride 0.9% w/v, Bieffe Medital, Italia) 20% BSA (bovine serum albumin, Sigma-Aldrich, USA), triladyl (MiniTüb, Germany), 5% glucose (D-glukosa monohydrat p.a, Penta, Chrudim, Czech Republic) and redistilled water

80 | P a g e


May 24-25th 2012

Spermatozoa motility The motility analysis was carried out using a CASA (Computer Assisted Semen Analyzer) system – SpermVisionTM program (MiniTőb, Tiefenbach, Germany) with the Olympus BX 51 microscope (Olympus, Japan) at cultivation Times 0h, 1h and 24h. Each sample was placed into the Makler Counting Chamber (deph 10 µm, Sefi-Medical Instruments, Izrael) and was evaluated percentage of motile spermatozoa (motility > 5 µm/s; MOT). This study was performed in eight replicates at each concentration (n = 8).

Cytotoxicity evaluation The viability of the cells exposed to Cu2+ in vitro was evaluated by the metabolic activity (MTT) assay (Mosmann, 1983; Byun et al., 2008). In brief, the cultured 109 cells/mL (in 200 µL medium per well) in 96-well plates (MTP, Greiner, Germany) were stained with MTT tetrazolium salt (Sigma, St. Louis, USA). MTT was dissolved in PBS (Dulbecco´s Phosphate Buffer Saline, Sigma, St. Louis, USA) at 5 mg/mL and added to the cells (in 20 µL per well). After 1h incubation (37 ºC), the cells and the formazan crystals were dissolved in 80 µL of isopropanol (2-propanol, p.a. CentralChem, Bratislava, Slovak Republic). The optical density was determined at a measuring wavelength of 570 nm against 620 nm as reference by a microplate ELISA reader (Multiskan FC, ThermoFisher Scientific, Finland). The data were expressed in percentage of control (i.e., optical density of formazan from cells not exposed to Cu2+) (Knazicka et al., 2012). Results from the analysis were collected during two repeated experiments at each concentration.

Statistical analysis Obtained data were statistically analysed by PC program GraphPad Prism 3.02 (GraphPad Software Incorporated, San Diego, California, USA). One-way analysis of variance (ANOVA) and the Dunnett´s multiple comparison test were used for statistical evaluations. The level of significance was set at *** (P<0.001); ** (P<0.01); * (P<0.05).

Results Evaluation of spermatozoa motility in the presence of Cu2+ in PS culture medium The initial (Time 0h) the percentage of spermatozoa motility showed slightly increased values at doses ≤ 31.20 µM/L of Cu2+ compared to the control group (Table 2). The

81 | P a g e

May 24-25th 2012


long-term cultivation (Time 24h) reduced the average motility values in all experimental groups (P<0.001) in comparison to the control group.

Tab. 2 Spermatozoa motility (%) in the presence of copper in PS culture medium during different time periods. Groups

Ctrl K

3.9 I

7.8 H

15.6 G

31.2 62.5 F E µM/L Cu2+

125 D

250 C

500 B

1000 A

Time 0h x 92.45 96.13 96.42 96.36 96.82 85.59 82.75 78.48A 65.55A 62.44A minimum 81.94 92.85 92.44 91.53 93.68 63.15 35.00 30.43 18.18 17.02 maximum 97.47 98.44 98.39 99.30 98.50 99.37 99.08 99.26 97.43 98.70 S.D. 4.28 1.69 1.67 2.19 1.12 11.55 20.35 18.72 29.62 29.43 CV (%) 4.63 1.76 1.74 2.20 1.16 13.50 24.59 23.85 45.18 47.13 Time 1h x 83.13 86.11 95.64C 89.46 81.80 73.30C 71.12C 59.47A 32.82A 22.93A minimum 40.00 57.14 87.58 73.33 50.70 40.00 45.45 16.21 10.38 10.00 maximum 98.42 98.49 100.0 98.03 96.62 98.62 98.90 97.93 66.50 59.09 S.D. 14.33 11.88 3.02 7.67 16.18 16.47 18.48 28.86 19.37 14.20 CV (%) 17.24 13.80 3.16 8.57 19.79 22.47 25.99 48.54 59.02 61.93 Time 24h 11.41A 6.88A 4.64A 2.56A 2.45A 2.22A 1.73A 1.15A 0.91A x 27.32 minimum 11.78 3.63 1.65 1.44 1.01 0.85 0.50 0.00 0.00 0.00 maximum 55.60 15.35 14.86 9.41 5.20 4.61 8.33 5.88 3.38 2.56 S.D. 13.04 3.22 4.13 2.22 1.26 1.05 1.59 1.49 1.04 0.87 CV (%) 47.72 28.21 59.97 47.80 49.26 42.96 71.78 86.12 90.14 96.20 Legend: x – mean, SD – standard deviation, CV (%) – coefficient of variation, AP<0.001; BP<0.01; CP<0.05.

Evaluation of spermatozoa motility in the presence of Cu2+ in BSA culture medium The spermatozoa motility showed similar values in all experimental groups but no significant differences were found between these groups and the control group (Time 0h). The percentage of motile spermatozoa increased after 1h of cultivation in all groups with Cu2+ added compared to the control group (Table 3). A concurrently BSA maintained motility of spermatozoa at doses ≤ 62.50 µM/L of Cu2+ during the long-term in vitro cultivation.

Evaluation of viability spermatozoa in PS culture medium After 1h cultivation we recorded that doses (≤ 15.60 µM/L of Cu2+) significantly increased the spermatozoa motility, but have negative effect on viability of cells. The lowest survival of spermatozoa was determined after the addition of dose 62.50 µM/L of Cu2+ (Figure 1).

82 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab 3 Spermatozoa motility (%) in the presence of copper in BSA culture medium during different time periods. Groups

Ctrl K

3.9 I

7.8 H

15.6 31.2 G F µM/L Cu2+

62.5 E

125 D

250 C

500 B

1000 A

Time 0h x 90.21 88.23 86.70 88.61 90.20 89.15 89.66 90.96 93.38 93.68 minimum 71.05 65.38 65.88 76.29 80.89 66.27 77.68 76.47 87.50 84.61 maximum 98.94 96.03 97.26 94.83 97.65 98.91 96.89 96.80 99.14 98.49 S.D. 5.50 7.12 7.27 4.65 4.67 8.02 5.53 4.28 2.80 2.59 CV (%) 6.10 8.07 8.38 5.25 5.18 9.00 6.17 4.70 3.00 2.77 Time 1h x 79.89 83.30 87.31A 84.49C 81.68 83.92 85.51A 83.11A 87.21A 86.60A minimum 62.22 68.75 76.31 59.18 63.63 75.55 73.46 71.05 73.63 69.23 maximum 97.87 96.66 94.44 98.14 92.80 92.10 96.55 96.93 96.96 96.15 S.D. 8.63 6.46 5.38 8.80 7.23 4.22 6.06 6.45 5.00 6.90 CV (%) 10.81 7.76 6.16 10.41 8.85 5.03 7.08 7.75 5.73 7.96 Time 24h x 70.10 76.81 74.91 76.02 74.40 76.28 61.65A 41.78A 34.32A 23.92A minimum 37.25 52.83 62.50 53.96 63.24 61.94 55.66 16.45 0.00 7.69 maximum 93.75 90.90 82.22 86.66 86.13 85.52 77.92 62.31 74.44 52.50 S.D. 15.41 9.48 5.94 7.19 6.65 6.60 5.76 13.92 23.24 13.04 CV (%) 21.98 12.34 7.94 9.46 8.93 8.65 9.34 33.33 67.72 54.51 Legend: x – mean, SD – standard deviation, CV (%) – coefficient of variation, AP<0.001; BP<0.01; CP<0.05.

Figure 1 Effect of various doses of copper on the viability of spermatozoa (in PS culture medium) after 1h.

Discussion Currently, trace elements are a highly discussed topic, because they significantly affect the reproductive system, which can be strongly reflected in the process of spermatogenesis (Knazicka et al., 2012). Several experimental studies demonstrated the adverse effects of Cu2+ on spermatozoa motility (Wong et al., 2001; Machal et al., 2002; Sakhaee et al., 2011). Katayose et al. (2004) claimed that higher concentrations of Cu had significant adverse effects 83 | P a g e


May 24-25th 2012

on the spermatozoa motility. Our experiment indicates similar results and also confirms that Cu2+ is a toxic element on spermatogenesis. The high doses of Cu (≥ 62.50 µM/L) in PS culture medium reduced the spermatozoa motility, but also had a negative effect on the survival of these cells. These concentrations decreased the mitochondrial activity or enzymatic complex, which includes the production of ATP. In the present study we evaluated also the percentage of spermatozoa motility in the presence of Cu2+ with culture medium addition in composition of 20% BSA, triladyl and 5% glucose. This culture medium increased the bovine spermatozoa motility during the shortterm of cultivation in spite of the presence of high doses of Cu2+. This observation could be explained binding of copper ions to albumin, which confirms previous experimental studies (Bradshaw et al., 1968; Masuoka and Saltman, 1994). The role of albumin is protective as a result of its ability to trap toxic substances in the culture media (Yamane et al., 1976). The binding of metals to proteins is a defense to reduce toxicity by preventing availability of the metals (Davidson et al., 2007). Several authors consider bovine serum albumin as a suitable protein supplement for the long-term spermatozoa cultivation, because it has protective functions (Yamane et al., 1976) and in addition a good essential amino acid profile (Peters et al., 1975). Regarding our results we can confirm, that the percentage of motile spermatozoa at doses ≤ 62.50 µM/L of Cu2+ was maintained during the long-term of in vitro cultivation. It could be explained by a high concentration of energy and protein substrates in the medium. From our study, the highest sensitivity of spermatozoa to Cu was found when activating in BSA containing the highest doses (500 µM; 1000 µM) of Cu2+. An appropriate energy substrate (Knazicka et al., 2010), protein supply, as well as optimal laboratory conditions are important factors for a successful in vitro spermatozoa motility and viability (Tvrda et al., 2010).

Conclusions Our results support the idea that Cu at high doses (≥ 62.50 µM/L of Cu2+) causes a significant reduction of motility spermatozoa. However, adding an energy and protein substrate (20% BSA, triladyl, 5% glucose) to the culture medium increases the spermatozoa motility despite the presence of Cu at higher doses. A concurrently BSA maintained motility of spermatozoa at doses ≤ 62.50 µM/L of Cu2+ during 24 h, which confirms the protective effect of albumin binding to the copper ions. Findings of the present study demonstrate that Cu at high concentrations acts as a toxic element on the spermatozoa motility and it has a destructive effect on the mitochondrial complex. 84 | P a g e


May 24-25th 2012

Acknowledgments This work was supported by the SPP Foundation (The Scholarship Programme Smart Heads).

References Bradshaw, R.A., Shearer, W.T., Gurd, F.R.N. Sites of binding of copper (II) ion by peptid (124) of bovine serum albumin. J. Biol. Chem., 1968, 243(14), 3817-3825. Byun, J.W., Choo, S.H., Kim, H.H., Kim, Y.J., Hwang, Y.J., Kim, D.Y. Evaluation of boar sperm viability by MTT reduction assay in beltsville thawing solution extender. AsianAust. J. Anim. Sci,. 2008, 21(4), 494-498. Davidson, T., Ke, Q., Costa, M. Selected molecular mechanisms of metal toxicity and carcinogenity. In: Handbook on the toxicology of metals (Nordberg, G.F., Fowler, B.A., Nordberg, M., Friberg, L.T., eds.). Amsterdam: Academic Press, 2007, pp. 529-546. Dobrzanski, Z.; Kołacz, R.; Bodak, E. Heavy metals in animal environment. Medycyna Wet. 1996, 52, 570-574. Eidi, M., Eidi, A., Pouyan, O., Shahmohammadi, P., Fazaeli, R., Bahar, M. Seminal plasma levels of copper and its relationship with seminal parameters. Iran J. Reprod. Med., 2010, 8(2), 60-65. Katayose, H., Shinohara, A., Chiba, M., Yamada, H., Tominaga, K., Sato, A. Effects of various elements in seminal plasma on semen profiles. J. Mam. Ova. Res., 2004, 21, 141148. Knazicka, Z., Tvrda, E., Bardos, L., Lukac, N. Dose- and time-dependent effect of copper ions on the viability of bull spermatozoa in different media. In Journal of Environmental Science and Health, Part A, 2012, 47, ISS 9 (in press). Knazicka, Z., Tvrda, E., Kerti, A., Bulla, J., Massanyi, P., Lukac, N. Influence of energy components to culture media on the bovine spermatozoa motility parameters in vitro. Acta fytotechnica et zootechnica., 2010, 13(1), 1-6. Machal, L., Chladek, G., Strakova, E. Copper, phosphorus and calcium in bovine blood and seminal plasma in relation to semen quality. Journal Anim. Feed Sci., 2002, 11, 425-435. Masuoka, J., Saltman, P. Zinc (II) and Copper (II) binding to serum albumin: A comparative study of dog, bovine and human albumin. J. Biol. Chem., 1994, 269(41), 2557-2561. Matsuoka, T., Imai, H., Kohno, H., Fukui, Y. Effects of bovine serum albumin and trehalose in semen diluents for improvement of frozen-thawed ram spermatozoa. J. Reprod. Dev., 2006, 52, 675-683. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and surrival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal Immunol. Methods, 1983, 65, 55–63. Pesch, S., Bergmann, M., Bostedt, H. Determination of some enzymes and macro- and microelements in stallion seminal plasma and their correlations to semen quality. Theriogenology, 2006, 66, 307-313. Peters, T. Jr., Feldhoff, R.C., Reed, R.G. Immunochemical studies of fragments of bovine serum albumin. J. Biol. Chem., 1975, 252(23), 8464-8468. Pinto, E.M., Soares, D.M., Brett, CH.M.A. Interaction of BSA protein with copper evaluated by electrochemical impedance spectroscopy and quartz crystal microbalance. Electrochimica Acta, 2008, 53, 7460-7466. Sakhaee, E., Emadi, L., Abshenas, J., Kheirandish, R., Azari, O., Amiri, E. Evaluation of epididymal sperm quality following experimentally induced copper poisoning in male rats. Andrologia, 2011, 44(1):1-7. 85 | P a g e


May 24-25th 2012

Tvrda, E., Knazicka, Z., Massanyi, P., Stawarz, R., Formicki, G., Lukac, N. Bovine serum albumin as a potential protein supplement for in vitro cultivation of spermatozoa. MendelNet 2010. Brno, 2010, 964-969. Wong, W.Y., Flik, G., Groenen, P.M., Swinkels, D.M., Thomas, C.M., Copius-Peereboom, J.H., Merkus, H.M., Steegers-Theunissen, R.P. The impact of calcium, magnesium, zinc and copper in blood and seminal plasma on semen parameters in men. Reproductive Toxicology, 2001, 15, 131-136. Xu, Y., Xiao, F.L., Xu, N., Qian, S.Z. Effect of intra-epididymal injection of copper particles on fertility, spermatogenesis and tissue copper levels in rats. Int. J. Androl., 1985, 8(2), 168-174. Yamane, I., Murakami, O., Kato, M. „Serum-free“ culture of various mammalian cells and the role of bovine albumin. Cell Structure and Function. 1976, 1, 279-284.

86 | P a g e

May 24-25th 2012


EVALUATION OF BIOCHEMICAL PARAMETERS OF EUROPEAN BROWN HARE (LEPUS EUROPAEUS) Kováčik, A.,1Trusinová, M.,2Gašparík, J.,2Slamečka, J.,3Jurčík, R.,3Čupka, P.,1 Tušimová, E.,1Bulla,J.1 1

Department of Animal Physiology, Faculty of Biotechnology and Food Sciences,

2

Department of Poultry

Science and Small Animal Husbandry, Faculty of Agrobiology and Food Resources, Slovak University of Agriculture in Nitra, 3Animal Production Research Centre, Nitra, Slovak Republic

Abstract The aim of this study was to determine blood serum biochemical values for a population of free-living European brown hares (Lepus europaeus) and to investigate differences related to sex and age. The blood samples were collected from 17 hares that were caught in the West Slovak Lowland. The serum was used for the evaluation of selected parameters of mineral profile (Ca, P, Na, K, Cl) and other biochemical parameters (urea, total proteins, glucose, cholesterol, and bilirubin). Concentration of phosphorus was significantly higher and concentration of potassium was significantly lower in adults than in young hares. Concentrations of chloride, urea, total protein and total bilirubin were also higher in adults than in young hares and glucose and cholesterol concentrations were lower in comparison to young hares. Concentrations of Ca, Na, Cl and bilirubin were higher in male compared to female hares and P, K, urea, glucose and cholesterol concentration were lower. Concentration of total proteins was significantly higher in females than in male hares.

Key words: biochemical parameters, blood serum, European brown hare, Lepus europaeus.

Introduction The European brown hare (Lepus europaeus) is a species of hare naturally occurring in northern, central and western Europe and southwestern Asia. It is a mammal adapted to temperate, open country. The hare likes warm and dry parts of plains and hills (Slamečka et al., 1997). The brown hares are very important for their economic and hunting aspects. Populations of European brown hares (Lepus europaeus) have declined dramatically over the past 50 years (Wintzen Jensen, 2009). Biochemical and mineral values can be useful for evaluating the health of free-living European brown hares populations, but information about these parameters is fragmented and incomplete (Marco et al. 2003). 87 | P a g e


May 24-25th 2012

The study of the metabolic profile, a good indicator of the physiological and nutritional condition of the reared animals and wild hares during the winter season, but winter food availability is probably not a limiting factor (Paci et al., 2007). The aim of this study was to determine blood serum biochemical values for a population of free-living European brown hares and to investigate differences related to sex and age. Deviation between old and young hares may be the result of worse health status.

Material and methods The blood samples were collected from 17 hares (Lepus europaeus) that were caught in the West Slovak Lowland (Čataj, Veľká Mača, Piešťany, Lehnice). In our experiments we used 12 adult (9 males and 3 females) and 5 young (3 males and 2 females) brown hares. Animals were caught in December 2011. Blood samples were obtained by heart tap. Blood was left to clot at room temperature (21°C). The blood serum was separated using centrifugation at 3000 rpm for 20 minutes and kept at 4°C until arrival at the laboratory, where it was stored at -20°C until analysis. The serum was used for the evaluation of selected parameters of mineral profile (calcium, phosphorus, sodium, potassium, chloride) and other biochemical parameters (urea, total proteins, glucose, cholesterol, and bilirubin). Sodium, potassium and chloride were measured by the automated analyzer EasyLyte (Medica, Bedford, USA), other parameters were measured by the semi-automated analyzer Microlab 300 (Vilat Scientific, Dieren, The Netherlands). Statistical analysis was performed with statistical software SAS. To compare results, the analysis of variance Student´s t-test was used.

Results and discussion In this study, we evaluated blood serum biochemical values in a single group of animals, with the same methodologies and at the same time. Baseline data are necessary to assess the health of wildlife hares. Comparison of selected biochemical parameters in brown hare by age is given in Table 1. The higher calcium concentration in blood serum was observed in the adult hares (3.25mmol/l). Similar findings were indicated by Massányi et al. (2009) (3.22 mmol/l), who analyzed the brown hare seasonally. Significant differences (p < 0.01) between juvenile (1.85mmol/l) and adult hares (2.67 mmol/l) were determined in phosphorus concentrations. The concentration of sodium was also higher in the adult hares (135.93mmol/l). Significantly 88 | P a g e

May 24-25th 2012


higher (p < 0.01) concentration of potassium in blood serum was measured in juvenile hares (12.26 mmol/l) compared to adult hares (8.82 mmol/l). Concentrations of chloride, urea, total protein and total bilirubin were also higher in adults than in young hares and glucose and cholesterol concentrations were lower in comparison to young hares.

Tab. 1 Selected biochemical blood serum parameters of brown hare by age Young Hares (n=5)

Parameter

Adult Hares (n=12)

Mean ± SD

Reference Interval

Mean ± SD

Reference Interval

3.18± 0.31

2.85-3.56

3.25± 1.01

1.76-4.87

Phosphorus (mmol/l)

1.85± 0.49**

1.23-2.60

2.67± 0.55**

1.76-3.46

Sodium (mmol/l)

132.34± 5.97

124.00-139.80

135.93± 11.82

113.30-157.90

Potassium (mmol/l)

12.26± 1.09**

10.59-13.51

8.82± 2.28**

5.44-13.44

Chloride (mmol/l)

107.58± 3.53

104.10-112.30

109.23± 3.99

102.10-114.60

Calcium (mmol/l)

Urea (mmol/l)

5.06± 2.11

1.90-7.70

6.79± 2.29

4.40-12.00

Total protein (g/l)

65.31± 11.78

56.07-85.90

67.77± 13.83

55.22-96.26

Glucose (mmol/l)

10.62± 2.77

8.10-15.20

9.02± 2.36

5.20-12.30

Cholesterol (mmol/l)

1.18± 0.57

0.81-2.16

1.04± 0.55

0.32-1.92

Bilirubin (mmol/l)

4.03± 0.57

3.54-4.90

4.91± 1.62

2.73-8.20

Paci et al. (2007) observed brown hares (Lepus europaeus Pallas) in several areas by age and sex. No significant influence of age on mineral profile was determined. These findings correspond to ours, except of phosphorus and potassium concentrations, which were slightly higher. The higher concentrations of total proteins in the adult brown hares compared to young hares were described by Marco et al. (2003). Increase of total proteins level is associated with adolescence (Kaneko et al., 1997), which corresponds to our findings. In our study, concentrations of glucose in the brown hares were higher than previously published values (Slamečka et al., 1997, Massányi et al., 2009). Marco et al. (2003) observed higher glucose concentration in adult hares in comparison to young hares, which does not correspond to our results. The same author indicated higher concentration of cholesterol and bilirubin in infantile hares. Comparison of selected biochemical parameters in brown hare by sex is given in Table 2. Concentrations of calcium, sodium, chloride and bilirubin were higher in male compared to female hares and potassium, urea, glucose and cholesterol concentration were lower. Slightly higher concentration of phosphorus was found in female hares. After statistical comparison

89 | P a g e

May 24-25th 2012


we found significant differences (p < 0.01) in total proteins, where higher level in female hares was observed (78.88 g/l).

Tab. 2 Selected biochemical blood serum parameters of brown hare by sex. Parameter Calcium (mmol/l) Phosphorus (mmol/l) Sodium (mmol/l) Potassium (mmol/l) Chloride (mmol/l) Urea (mmol/l) Total protein (g/l) Glucose (mmol/l) Cholesterol (mmol/l) Bilirubin (mmol/l)

Female Hares (n=5)

Male Hares (n=12)

Mean ± SD

Reference Interval

Mean ± SD

Reference Interval

3.16 ± 0.37 2.48 ± 0.92 133.24 ± 10.05 10.68 ± 2.39 107.36 ± 3.02 6.90 ± 3.74 78.88 ± 18.75** 9.62 ± 4.05 1.28 ± 0.56 4.33 ± 0.88

2.69-3.59 1.23-3.46 120.30-145.50 8.11-13.51 104.10-110.30 1.90-12.00 55.22-96.26 5.20-15.20 0.56-2.19 3.55-5.42

3.26 ± 1.01 2.41 ± 0.54 135.56 ± 10.87 9.48 ± 2.63 109.33 ± 4.10 6.03 ± 1.58 62.12 ± 5.05** 9.43 ±1.80 1.00 ± 0.54 4.79 ± 1.63

1.76-4.87 1.70-3.29 113.30-157.90 5.44-13.44 102.10-114.60 4.40-9.40 55.72-73.59 5.30-11.70 0.32-1.92 2.73-8.20

Our mineral profile results by sex correspond to findings of Paci et al. (2007). Author did not find out any significant difference. Levels of mineral parameters were slightly higher in comparison to results of Nicpon et al. (2007), who indicated average values: calcium 2.55 mmol/l, phosphorus 1.37 mmol/l, sodium 146.5 mmol/l, potassium 3.77 mmol/l, chloride 108 mmol/l. Paci et al. (2007) determined significant (p < 0.01) differences in glucose concentration by age and sex in Lepus europaeus Pallas, while higher concentration was observed in the adult hares, what corresponds to our findings. Authors Marco et al. (2003) and Paci et al. (2007) indicated level of cholesterol 0.40 mmol/l and 0.50 mmol/l. Our results are similar to findings of Slamečka et al. (1997), who observed average cholesterol concentrations of 1.34 mmol/l and Massányi et al.(2009) (1.22 mmol/l). The different cholesterol concentrations in the hares of our study, compared to other studies results, could be related to diet, seasonality and stress.

Conclusion All evaluated blood biochemical parameters of brown hares were within the physiological range with relatively low differences. These differences might be explained by the different grasslands, meadows, and crops in the various areas. It would be appropriate to

90 | P a g e


May 24-25th 2012

verify observed results on more free-living hares of various areas, as well as on subjects bred in captivity.

Acknowledgement This work was supported by projects APVV 0368-10, VEGA No. 1/0790/11, VEGA No. 1/1101/11 and KEGA 035 Spu-4/2012.

References Marco, I., Cuenca, R., Pastor, J., Velarde, R., Lavin, S. Hematology and Serum Chemistry Values of the European Brown Hare.Veterinary Clinical Pathology, 2003, 32 (4), 195-198. Massányi, P., Slamečka, J., Lukáč, N., Capcarová, M., Mertin, D., Jurčík, R. Seasonal variations in the blood biochemistry of brown hare.Medycyna Wet., 2009, 65 (6), 389-393. Nicpon, J.; Sławuta, P.; Nicpon, J.; Noszczyk-Nowak, A. Hematological, biochemical and acid-base equilibrium parameters of the European Brown Hare. Medycyna Wet., 2007, 63 (10), 1239-1241. Paci, G., Lavazza, A., Ferretti, M., Bagliacca, M. Relationship between habitat, densities and metabolic profile in brown hares (Lepus europaeus Pallas), Ital. J. Anim. Sci., 2007, 6, 241255 Slamečka, J., Hell, P., Jurčík, R. Brown hare in the West Slovak lowland. Acta Sci. Nat. Brno, 1997, 31, 115 pp. Wintzen Jensen, T. L., Identifying causes for population decline of the brown hare (Lepus europaeus) in agricultural landscapes in Denmark. Aarhus University, Denmark, 2009, 193 pp. ISBN: 978-87-7073-105-8

91 | P a g e

May 24-25th 2012


EVALUATION OF FATTY ACID COMPOSITION IN ORGANIC GOAT MILK DURING THE LACTATION PERIOD Králíčková, Š., Kuchtík, J. Ústav chovu a šlechtění hospodářských zvířat, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, 630 00 Brno

Abstract The aim of this study was to evaluate the effect of stage of lactation on the content of individual fatty acids, also on the most important gorups of fatty acids in goat milk. The study was carried out on organic farm Olešenka during the year 2011. The experiment involved 9 goats of Brown short-haired breed, all goats were on the second lastation and gave birth to twins. Daily feeding ration was based on pasture (ad libitum) with the addition of organic oat (0.5 kg per goat) and mineral lick (ad libitum). Fatty acids were determinated using gass chromatography. Under the study it was found that the stage of lactation had a significant effect on contents of all monitored individual fatty acids. Also all interpolated groups of fatty acids were significantly affected by stage of lactation. In goat milk fat were the most represented palmitic acid (34,49 %) and oleic acid (26,24 %). CLA content was highest (1,01 %) in the middle of the monitoring. Úvod Současný životní styl klade velký důraz na zdravou výživu. Tento tlak měl v nedávné minulosti na konzumenty zásadní vliv vedoucí k omezení konzumace mléka a mléčných výrobků. Naštěstí mnohé studie dokázaly, že mléko a mléčné výrobky obsahují řadu zdraví prospěšných a nenahraditelných látek. Mléčný tuk je nejen nositelem chuti, ale obsahuje řadu mastných kyselin (MK), jejichž vliv na lidské zdraví je v poslední době velmi diskutován. Mezi významné MK patří zvláště ty esenciální, které si lidský organismus neumí sám syntetizovat a je nutno je přijímat potravou. Konkrétně se jedná o kyselinu linolovou, α-linolenovou a konjugovanou kyselinu linolovou (CLA), které je přisuzován pozitivní protirakovinný vliv, vliv na snižování hladiny cholesterolu nebo pozitivní vliv při léčbě diabetes (Keresteš, 2009 a Podsedníček et al., 2010).

Materiál a matodika Sledování bylo realizováno na ekologické farmě Olešenka na vysočině v průběhu roku 2011. Do pokusu bylo zapojeno 9 koz plemene hnědá krátkosrstá, přičemž všechny kozy byly 92 | P a g e

May 24-25th 2012


na druhé laktaci a z pohledu četnosti vrhu porodily dvojčata. Základem denní krmné dávky byla od dubna do konce září pastva na trvalých travních porostech, dále seno (ad libitum), mačkaný oves (1 kg/kus), minerální liz a sůl (ad libitum). Během dojení byly kozy přikrmovány Bio směsí pro kozy dojící (VK Drcman) v množství cca 0,5 kg/kus. V zimě byly kozy krmeny senem a senáží (ad libitum), minerálním lizem a solí (ad libitum). Všechny kozy byly po celou dobu sledování chovány v identických podmínkách. S dojením koz se započalo na začátku dubna, přičemž individuální vzorky kozího mléka byly odebrány sedmkrát v průběhu měsíců duben až říjen 2011. Jednotlivé odběry odpovídaly průměrnému 61., 89., 124., 160., 187., 222. a 257. dni laktace. Vzorky mléka byly ihned po odebrání zchlazeny na ± 5 °C a v termoboxu převezeny do rozborových laboratoří MENDELU. Obsahy sušiny a tuku (%) byly stanoveny na Ústavu technologie potravin dle ČSN ISO 6731 a 2446. Tuk pro stanovení mastných kyselin (MK) byl získán odstředěním cca 10 ml kozího mléka v chlazené odstředivce při 4000 otáčkách po dobu 15 minut. Analýza jednotlivých MK proběhla po převedení vyextrahovaného tuku (50 mg) na FAME‒s (fatty acid methyl esters), po přídavku NaCl byly FAME‒s vytřepány do isooktanu a analyzovány metodou kapilární plynové chromatografie. V rámci analýz na Ústavu chemie a biochemie byly stanoveny obsahy následujících MK (%): dodekanová (C12:0), tetradekanová (C14:0), tetradecenová (C14:1), pentadekanová (C15:0), hexadekanová (C16:0), hexadecenová (C16:1), oktadekanová (C18:0), trans-oktadecenová (C18:1n9t), cisoktadecenová (C18:1n9c), trans-oktadeka-9,12-dienová (C18:2n6t), cis-oktadeka-9,12dienová

(C18:2n6c),

oktadeka-9,12,15-trienová

(C18:3n3),

oktadeka-9,11-dienová

(C18:2/9,11/), oktadeka-10,12-dienová (C18:2/10,12/). Po skončení analýz byly dopočítány celkové obsahy těchto skupin MK: nasycené ∑SFA (C12:0 + C14:0 + C15:0 + C16:0 + C18:0); mononenasycené ∑MUFA (C14:1 + C16:1 + C18:1n9t + C18:1n9c); polynenasycené ∑PUFA (C18:2n6t + C18:2n6c + C18:3n3 + C18:2/9,11/ + C18:2/10,12/); n-3 ΣPUFAn3 (C18:3n3), n-6 ΣPUFAn6 (C18:2n6t + C18:2n6c), celkové nenasycené ∑UFA (∑MUFA + ∑PUFA) a celkový obsah konjugované kyseliny linolové ΣCLA (C18:2/9,11/ + C18:2/10,12/). Zjištěné údaje byly statisticky analyzovány s pomocí metody nejmenších čtverců (SAS; PROC GLM variant ss4), přičemž byl zohledněn systematický efekt fáze laktace (7 tříd). Pro výpočty byl použit matematicko-statistický program Statistica 9.0.

93 | P a g e

May 24-25th 2012


Výsledky a diskuze Zhodnocení vlivu fáze laktace na obsah a zastoupení mastných kyselin znázorňuje Tab. 1. Z výsledků naší studie především vyplývá, že fáze laktace měla statisticky průkazný vliv na obsahy všech sledovaných mastných kyselin (MK), což je v souladu s výsledky studie Talpura et al. (2008). Také Nudda et al. (2003) zaznamenal statisticky průkazný vliv fáze laktace na kyseliny C18:0, C18:1, C18:2, C18:3 a C18:2/9,11/. Tab. 1 Vliv fáze laktace na obsahy mastných kyselinv kozím mléce (v % veškerých MK) (Effect of the stage of lactation on contents of fatty acids in goat milk (% of total FA) 1. odběr 2. odběr 3. odběr 4. odběr 5. odběr 6. odběr 7. odběr

Ø

SD

F test

Sušina

12,40

Tuk

A

3,90

3,60

AC

C12:0

3,86

C14:0

10,28A

C14:1

0,12

A

ac

C15:0

1,22

C16:0

31,58

A

A

C16:1

0,57

C18:0

16,70A

C18:1n9t

1,16

C18:1n9c

A

25,79

ac

0,63

A

C18:2n6c

5,76

A

C18:2/9,11/

0,62abc

C18:2n6t

C18:2/10,12/

C18:3n3 ∑SFA

0,05

A

1,66

A

63,65

∑MUFA

27,64

11,62

AB

A

ac

a

3,90

AB ac

1,40

32,90 0,66

AC

A

27,13 0,45 4,54

abe

B

AC

22,78

c

CD

0,25

3,70

BC

BC

0,01

1,12

B

64,52 28,86

A

bc

b

∑PUFAn6

A

0,67

0,55

BC

1,12B

∑CLA

1,05

BC

0,39bc

1,66A

ab

38,30

B

0,51bc

∑PUFAn3

36,35

1,91

b

BC

6,62

∑UFA

0,24

B

AB

8,72

A

13,03B

11,63B

∑PUFA

6,39

5,60

4,99

AC

35,48

A

ac

0,52

0,01

C

0,54

70,48 24,63 4,90

B

ae

cd

0,54C 3,95

AB

BC

4,02

9,30A

10,63A

0,14

AB a

0,99

29,35 0,68

A

A

18,34A 1,21

A

30,57 0,62 3,69

bd

A

BC

0,98a 0,03

AB C

0,67

61,41

A

32,60 5,99

b

bc

0,67C 4,31

BC

38,59

b

1,01

A

0,21

11,32

AB

3,39

AC

3,42

ac

0,39

AB

3,65

C

B

29,52

11,71

3,57

AB

15,79A 0,92

11,22

2,92

AC

10,52A 0,14

10,88

B

AB ac

1,19

7,03

3,39

B

14,82B C

0,38

1,45

c

A

40,30

AB

C

31,75

14,18

C

B

6,52

B

14,44B

11,90

1,028

**

3,49

0,282

NS

4,91

1,347

**

11,86

2,040

**

C

0,24

0,116

**

c

1,38

0,270

*

34,49

3,796

**

0,44

1,49 37,26

BC

C

1,29

1,38

1,34

0,296

**

15,91A

8,75B

9,27B

13,77

3,545

**

BC

C

0,80

0,282

**

0,87

0,75

30,04 0,36 3,10

ad

BC

BD

0,46

21,68

c

CD

0,23

2,56

BD

0,55

BC ce

26,24

3,100

*

0,21

D

0,39

0,166

**

1,94

D

3,61

1,174

**

25,68

0,70ac

0,50bc

0,19b

0,56

0,230

*

BC

BC

C

0,02

0,016

**

C

0,01

C

0,45

63,49 31,88 4,63

A

bd

cd

0,45C 3,46

BD

36,51

A

ab

0,71

0,01

C

0,54

72,34

B

23,82 3,84

a

de

0,54C 2,79

BD

0,00

0,80

0,405

**

B

66,41

3,837

**

cde

0,62

68,98

28,21

3,061

*

e

5,38

1,776

*

0,62C

0,80

0,405

**

D

4,01

1,308

**

33,59

3,837

**

0,57

0,241

*

28,06 2,96

2,15

B

31,02

ac

c

27,66 0,51

0,19

B

Mezi hodnotami v řádcích s rozdílnými písmeny (A, B, C, D) je statisticky vysoce průkazný (P≤0,01) rozdíl; (a, b, c, d, e) statisticky průkazný (P≤0,05) rozdíl, ** P≤0,01; * P≤0,05; NS nesignifikantní.

Z tabulky 1 je také patrný průkazný vliv fáze laktace na všechny dopočítané skupiny MK. Např. ve studiích, které uskutečnili Tsiplakou et al. (2006) a Ataşoğlu et al. (2009) byl zjištěn

také průkazný vliv

tohoto

faktoru

na obsahy MK nasycených

(SFA),

mononenasycených (MUFA), celkových nenasycených (UFA) a n-3 kyselin. Naproti tomu 94 | P a g e


May 24-25th 2012

v obou výše zmiňovaných zahraničních studiích nebyl zjištěn průkazný vliv fáze laktace na CLA, což je v rozporu s výsledky naší studie. U řady MK byl jejich nejnižší obsah ve čtvrtém odběru a nejvyšší obsah v šestém odběru, konkrétně se jednalo o nasycené kyseliny dodekanovou (C12:0), tetradekanovou (C14:0) a hexadekanovou (C16:0). Naproti tomu opačný trend, kdy ve čtvrtém odběru byla zjištěna nejvyšší hodnota a v šestém odběru nejnižší hodnota, byl zaznamenán u kyseliny oktadekanové (C18:0), trans-oktadecenové (C18:1n9t) a cis-oktadecenové (C18:1n9c). Nejvyšší obsahy v sedmém odběru, tedy na konci sledování, byly zjištěny u kyselin tetradecenová (C14:1) a hexadecenová (C16:1), zatímco Talpur et al. (2008) zaznamenali ve své studii nejvyšší obsahy těchto kyselin uprostřed sledování. Obecně lze konstatovat, dle výsledků uvedených v Tab. 1, že kyseliny C12:0, C14:0, C14:1, C16:0 a C16:1 vykazovaly během sledování podobný trend, když od počátku do konce sledování průměrné hodnoty těchto MK rostly, s výjimkou čtvrtého a pátého odběru, kdy byl zaznamenán pokles jejich hodnot. Naopak u kyselin C18:0, C18:1n9t, C18:2n6t a C18:2/9,11/ byl zaznamenán opačný trend. Průměrné obsahy těchto MK v průběhu laktace klesaly s výjimkou čtvrtého a pátého odběru, kdy byl zaznamenán jejich výraznější nárůst. Poměrně vyrovnaný trend hodnot v průběhu celé laktace byl zaznamenán v případě kyseliny oktadeka10,12-dienová (C18:2/10,12/). Kyselina linolová (C18:2n6c) vykazovala v průběhu laktace klesající trend hodnot, zatímco v případě studie Talpura et al. (2008) byl zaznamenán naopak vzrůstající trend hodnot ve stejném časovém období, tedy od jara do podzimu. Park et al. (2007) uvádějí, že u kozího mléka je velmi nízký obsah linolové kyseliny, která je z výživového hlediska velmi významná. To potvrzuje například studie Talpura et al. (2008), kde byl zaznamenán opravdu nízký průměrný obsah této kyseliny za celou laktaci (0,70 %). Ve studii Baroše a Števonkové (1990) byla zaznamenána mírně vyšší průměrná hodnota C18:2n6c za celou laktaci (1,12 %) a ve studiích Nuddy et al. (2003) a Podsedníčka et al. (2010) se hodnoty kyseliny linolové v průběhu laktace pohybovaly kolem 2 %. Tudisco et al. (2010) zjistil ve své studii, že mléko koz chovaných v ekologickém systému má vyšší průměrný obsah kyseliny linolové (2,77 %) oproti mléku koz získaného z konvenčního hospodářství (2,07 %). Co se týká naší studie, obsahy kyseliny linolové byly v průběhu laktace poměrně vysoké, nejvyšší obsah byl zjištěn v prvním odběru 5,76 % a nejnižší v sedmém odběru (1,94 %). Hlavní charakteristikou mléčného tuku malých přežvýkavců je vysoký obsah MK s krátkým a středně dlouhým řetězcem, obzvláště v mléčném tuku koz, který má nejméně dvakrát takový obsah C6-C10 MK, než tuk kravského mléka (Chilliard et al., 2007). 95 | P a g e


May 24-25th 2012

Dopočtený obsah SFA byl nejnižší ve čtvrtém odběru a nejvyšší v šestém odběru, stejně jako u většiny jednotlivých nasycených MK (C10:0 až C16:0). Obsah MUFA kolísal v průběhu celého sledování. Co se týká obsahu polynenasycených MK (PUFA), zde byl zaznamenán podobně klesající trend hodnot jako u jednotlivých kyselin C18:2n6t, C18:2n6c a C18:2/10,12/. Nejvyšší obsah UFA v mléčném kozím tuku je dle Parka et al. (2007) v letních měsících. Také v rámci naší studie byl obsah UFA nejvyšší v měsíci červenci. Obsah CLA byl poměrně vyrovnaný v průběhu laktace, s výjimkou 4. odběru, kdy se obsah CLA výrazněji zvýšil (1,01 %) a naopak v 7. odběru, tedy na konci laktace, byl obsah CLA nejnižší (0,19 %). Ataşoğlu et al. (2009) ve své studii zaznamenali také poměrně vyrovnaný trend hodnot, ovšem jimi zjištěné obsahy CLA byly v porovnání s našimi údaji vyšší; v průběhu celé laktace se pohybovaly v rozmezí 1,15 % až 1,40 %, přičemž nejvyšší obsah CLA byl zaznamenán na konci laktace. Park et al. (2007) uvádějí celkový obsah CLA nejvyšší v mléčném tuku ovcí (1,08 %), krav (1,01 %) a koz (0,65 %), přičemž obsah CLA u pasoucích se zvířat je výrazně zvýšený během dubna a května (Tsiplakou et al., 2006). V případě naší studie bylo výraznější zvýšení obsahu CLA zaznamenáno ve čtvrtém odběru, tedy až v měsíci červenci. Závěr Ze studie především vyplývá, že fáze laktace měla statisticky vysoce průkazný vliv na obsahy všech sledovaných mastných kyselin (MK), stejně jako na dopočtené obsahy jednotlivých skupin mastných kyselin. Živočišné tuky obsahují velké množství nasycených mastných kyselin (SFA) a mnohem méně zdraví prospěšných nenasycených mastných kyselin (UFA), což potvrdila také naše studie, kdy obsah SFA činil 66,41 % a UFA 33,59 %. Ze všech nenasycených MK jsou pak pro zdraví nepostradatelné některé polynenasycené MK, zvláště n-3, jejichž množství bylo v případě kozího mléka mírně nižší, než uvádí zahraniční studie. Nejvyšší obsah CLA byl zaznamenán uprostřed sledování, tzn. během letních měsíců (1,01 %). Poděkování Sledování bylo realizováno s podporou interního grantového projektu AF MENDELU, TP 1/2012 a s podporou projektu MZe QH91271.

Použitá literatura Ataşoğlu, C., Çiğdem, U., Yonca, K. Changes in milk fatty acid composition of goats during lactation in a semi-intensive production system. Arch. Tierzucht, 2009, 52 (6), 627−636.

96 | P a g e


May 24-25th 2012

Baroš, V., Števonková, E. Obsah mastných kyselín v tuku kozieho mlieka a jeho zmeny v priebehu laktácie. Živoč. Výr., 1990, 35, č. 9, 825−831. Chilliard, Y., Glasser, F., Ferlay, A., Bernard, L., Rouel, J., Doreau, M. Diet, rumen biohydrogenation and nutritional quality of cow and goat milk fat. Eur. J. Lipid. Sci. and Technol., 2007, 109, 828−855. ČSN ISO 2446. Mléko – Stanovení obsahu tuku (Rutinní metoda). Český normalizační institut, Praha, 2010, 16 str. ČSN ISO 6731. Mléko, smetana a zahuštěné mléko – Stanovení obsahu sušiny (Referenční metoda). Český normalizační institut, Praha, 1998, 8 str. Keresteš, J., et al. Biotechnológie, výživa a zdravie. Považská Bystrica, 2009. ISBN 978-80970205-9-0. Nudda, A., Mele, M., Battacone, G., Usai, M.G., Macciotta, N.P.P. Comparasion of conjugated linoleic acid (CLA) content in milk of ewes and goats with the same dietary regimen. Ital. J. Anim. Sci., 2003, 2 (1), 515−517. Park, Y.W., Juaréz, M., Ramos, M., Haenlein, G.F.W. Physico-chemical characteristics of goat and sheep milk. Small Ruminant Res., 2007, 68, 88−113. Podsedníček, M., Čermák, B., Král, V., Vondrášková, B. Vliv výživy na obsah mastných kyselin v mléčném tuku koz. Náš chov, 2010, 1, 44−47. Talpur, F.N., Bhanger, M.I., Khooharo, A.A., Zuhra Memon, G. Seasonal variation in fatty acid composition of milk from ruminants reared under the traditional feeding systém of Sindh, Pakistan. Livest. Sci., 2008, 118, 166−172. Tsiplakou, E., Mountzouris, K.C., Zervas, G. Concentration of Conjugated Linoleic Acid in Grazing Sheep and Goat Milk Fat. Livest. Sci., 2006, 103, 74−84. Tudisco, R., Cutrignelli, M.I., Calabró, S., Piccolo, G., Bovera, F., Guglielmelli, A., Moniello, G., Infascelli, F. Influence of organic systems on milk fatty acid profilr and CLA in goats. Small Ruminant Res., 2010, 88, 151−155.

97 | P a g e


May 24-25th 2012

METAL CONTENTS IN CANCER OF HUMAN UTERINE CORPUS Kraska K.1, Supeł M.2, Formicki G.1, Stawarz R.3, Greń A.1, Głogowska M.3, Kopańska M. 1 1

Department of Animal Physysiology and Toxicology; Cracow Pedagogical University, ul. Podbrzezie 3, 31-054

Kraków 2

Piotrków Trybunalski Viovodeship Hospital

3

Department of Zoology of Vertebrates and Human Biology, Cracow Pedagogical University, ul. Podbrzezie 3,

31-054 Kraków

Abstract We aimed at determination of cadmium, lead, magnesium, zinc, calcium, copper, iron and nickel in cancer of human uterine corpus of patients from Piotrków Trybunalski Viovodeship Hospital. Cancerous and healthy fragments of uterine corpus were taken from 47-85 women. Our results did not indicate significant differences in metal content between cancerous and normal uterine. Thus it seems that the metabolism of metals in cancerous cells was not changed significantly. The obtained results should be interpreted as bio-monitoring data indicating exposure of human populations to heavy metals. Introduction Heavy metals pose a serious risk to human health. They accumulate in different tissues all life, on the other hand depuration of toxic metals in human is a very slow process (Lach i Bany, 2001). Accumulation of metals may result in enzyme inhibition, disturbances in mineral content balance, disturbances in pro-oxidant/antioxidant balance, signal transduction, mutation. Of all the harmful results of heavy metals mutations leading to cancer induction belong to the most dangerous. It is suggested that mechanisms of cancer induction by heavy metals are very complex. Generally disturbances in signal transduction and oxidative stress induced by metals seem to play main role in carcinogenesis (Waalkes, 2003). Tumour development is a very slow process. Some kinds of tumours reach detectable size more than 20 years after induction. This, makes cancerous tissues interesting material for monitoring of metal accumulation. Additionally the changed metabolism of cancerous cells may have influence of the concentration of essential metals. Taking above into consideration we aimed at determination of cadmium, lead, magnesium, zinc, calcium, copper, iron and nickel in cancer of human uterine corpus.

Material and methods

98 | P a g e

May 24-25th 2012


Cancerous and healthy fragments of uterine corpus were taken from 47-85 women in Piotrków Trybunalski Viovodeship Hospital. Total number of the studied patients was 10. All the tissues were submitted to pathomorphological studies. Before the metal content analysis the tissues were dried at 105˚C until dry mass was stabilised. Then the material was mineralised in 65% HNO3 at 90˚C for 120 min using VELP Scientifica device. The mineralised tissues were filled with deionised water to the volume of 10 ml. Metal analysis was performed in so prepared dilutions using Cole-Parmer BUCK 200A atomic absorption spectrometer. Standards and reference material were provided by BUCK Scientific. The distribution of the results was checked with Shapiro-Wilk test. Homogeneity of variances was estimated with Levene ANOVA. The results were compared with one way ANOVA. Statistical significance was defined at p<0.05. Results Mean cadmium content in healthy uterus was 0.62±0.25 µg·g-1 d.m (dry mass). Higher concentration of cadmium was found in cancerous tissues – 0.98±0.27 µg·g-1 d.m. On the other hand the differences in cadmium content were insignificant (F=2.76; p=0.17). Insignificant differences between healthy and changed tissues occurred in Pb content too (F=0.38; p=0.57). Lead content was higher in normal tissue (5.77±2.70 µg·g-1 d.m) comparing to cancer tissue (4.65±1.59 µg·g-1 d.m). Zinc, iron, magnesium, copper and calcium contents were higher in cancerous tissue than in normal uterus. On the other hand the studied differences were statistically insignificant. Table 1 Metal content in cancer of human uterine in comparison to healthy tissues. Metal

Zn Cu Fe Cd Mg Ca Pb

Uterin Corpus

Average Standard deviation Average Standard deviation Average Standard deviation Average Standard deviation Average Standard deviation Average Standard deviation Average Standard deviation

Cancer tissue 60,48 10,92 13,18 5,96 70,83 22,93 0,98 0,27 410,89 80,30 269,76 119,58 4,65 1,59

Normal tissue 54,00 8,32 5,06 1,17 50,39 28,43 0,62 0,25 228,33 105,13 183,68 29,82 5,77 2,70

99 | P a g e


May 24-25th 2012

Figure 1 Content of cadmium in normal tissues and cancer tissues in uterin corpus (µg·g-1 s.m.)

Figure 2 Content of lead in normal tissues and cancer tissues in uterin corpus (µg·g-1 s.m.)

Discussion All the tested metals were present in healthy tissues as well as in cancerous tissues. The presence of essential metals in the studied material was predictable. All the more so, there was no differences in essential metals between normal and cancerous uterus. More interesting was the presence of trace elements. Nowadays, heavy metals are often indicated in human organism (DróŜdŜ, 2005). Cadmium and lead are taken up through respiratory and digestive systems in human. Both metal can bind to metallothionein and other peptides, such as GSH or aminoacids such as methionine (Lach and Bany, 2001). On the other hand their distribution in organs is different. Cadmium accumulates in liver and kidneys in the highest concentrations. Kidneys may accumulate about 50% of total cadmium content in human organism (Lach and Bany, 2001). Lead occurs both in soft tissues and bones. The highest lead content is often indicated in bones which can accumulate up to 90% of total lead content in human organism (Jakubowski et al., 1997). It is clear that the presence of heavy metals in human organism is related to environmental pollution, and especially to the presence of trace elements in food. Some highly processed food may contain as much as 0.03 mg Cd per kg (Dziadkiewicz et al., 100 | P a g e


May 24-25th 2012

2011). It was also indicated that significant amounts of heavy metals may be introduced to human organism with drinks such a tea or coffee (Dziadkiewicz et al., 2011). These concentrations seem to be significant taking into consideration that accumulation of metals proceeds all the life, and their removal is very slow (Lach i Bany, 2001). Toxic metals such as cadmium and lead can induce carcinogenesis (Oliński, 1993). There are several mechanisms engaged in metal related formation of cancerous cells. Most important are enzyme inhibition, oxidative stress, antagonistic interactions with essential metals , disturbances in signal transduction in cells, and direct or indirect damage to DNA (Waalkes, 2003). It is impossible to state whether, metals present in cancer tissue of uterus took part in cancer induction. Nonetheless, cadmium concentrations were somewhat higher in tumours than in normal tissues. Its higher content in tumours may be related to changed metabolism of cancerous cells most probably (Lorenc-Koci, 2003). For instance it was found that reduced glutathione concentrations (GSH) are significantly higher in carcinoma tissue compared to normal tissues (Wong et al., 1994). Taking into consideration GSH role in metal distribution, it is possible that one of the reasons of higher Cd content in tumours was related to increased GSH content. All the more so, there are some information that methallothionein gene expression is downregulated in cancerous cells (Ariaga et al., 2012). On the other hand such interpretation does not fit to lead distribution between normal and cancerous cells. In conclusion, our results indicate that concentration of metals differs insignificantly between cancerous and normal parts of uterus in human. Somewhat higher concentrations of cadmium in cancerous tissue may be related to abnormal metabolism of cancerous cells. On the other hand our results should be interpreted as bio-monitoring data indicating exposure of human populations to heavy metals. References Ariaga J.N., Levy E.M., Bravo A.I., Bayo S.M., Amat M., Aris M., Hannois A., Bruna L., Roberti M.P., Loria F.S., Pairola A., Huertas E., Mordoh J., Bianchini M. 2012. Metallothionein expression in colorectal cancer: relevance of different isoforms for tumor progression and patient survival. Hum. Pathol., 43, 197-208. DroŜdŜ R., Tworzenie reaktywnych form tlenu jako wyraz zaburzenia dynamicznej równowagi systemu antyoksydacyjnego transferyny i ceruloplazminy, Śląska Akademia Medyczna, Katowice, 2005. Dziadkiewicz K., Formicki G., Greń A., Stawarz R.,2011. Metals In different kinds of human diet. Xenobiotics, Enviromental exposure, toxicity and physiological response, 60-73. Jakubowski M., Marek K., Piotrowski J.K., IŜycki J., Zalecenia dotyczące rozpoznawania i profilaktyki medycznej ołowicy, Instytut Medycyny Pracy im. prof. dra med. Jerzego Nofera w Łodzi Instytut Medycyny Pracy i Zdrowia Środowiskowego, Sosnowiec, 1997. Lach J., Bany J. red., Metale cięŜkie a zdrowie, Polskie Towarzystwo Higieniczne, Warszawa, 2001. 101 | P a g e


May 24-25th 2012

Lorenc-Koci E., Czy stres oksydacyjny i deplecja glutationu mogą stanowić wspólne podłoŜe schorzeń neurologicznych?, Instytut Farmakologii PAN, Kraków, 2003. Oliński R., Molekularne podstawy i środowiskowe uwarunkowania transformacji nowotworowej komórki, Wydawnictwo Uczelniane AM, Bydgoszcz, 1993. Waalkes M. P. 2003. Cadmium carcinogenesis. Mutation research, 533, 107-120. Wong D.Y.K., Hsiao Y.L., Poon C.K., Kwan P.C., Chao S.Y., Chou S.T., Yang C.S. 1994. Glutathione concentration in oral cancer tissues. Cancer Lett., 81, 11-116.

102 | P a g e

May 24-25th 2012


DETERMINATION OF MORPHOLOGICALLY ALTERED SPERMATOZOA OF BULLS, RAMS AND STALLIONS Kročková, J., Massányi, P. Department of Animal Physiology, Faculty of biotechnology and food sciences in Nitra

Abstract Artificial insemination in the world fulfills its role in improving the performance of the animal genetic resources and veterinary care of the reproductive process. Spermatogenesis is sensitive "barometer" for the manifestation of the effects of various agents and factors that may not manifest in other organs or tissues of the body. The aim of our study was to determine the incidence of morphologically altered spermatozoa in bull, stallion and ram semen. For microscopic evaluation, we stained semen preparations with Giemsa solution. For each sire, we evaluated 1,000 spermatozoa. Our results show that most morphologically altered spermatozoa were in bulls (10.98%), then in rams (10.56%) and in stallions (11.19%). Of all the head changes the most frequently occurred small heads. The most frequently flagellum changes were head without flagellum in bulls and rams and the knob twisted flagellum in stallions. Second most numerous change was flagellum torso in bulls, knob twisted flagellum in rams and head without flagellum in stallions. Furthermore, we observed a broken flagellum and other malformations. According to our results we can conclude that monitored dam are quality and suitable for inclusion in the insemination process.

Úvod Umelá inseminácia na celom svete plní svoju úlohu pri zlepšovaní genofondu úžitkových

vlastností

zvierat

a veterinárnej

starostlivosti

o reprodukčný

proces.

Spermatogenéza je citlivým „barometrom“ na prejavenie sa účinkov rôznych látok a faktorov, ktoré sa nemusia prejaviť na iných orgánoch alebo tkanivách tela. Podľa Goulda et al. (1975) spermie býka, barana, kanca a žrebca sa zaraďujú do tretej skupiny cicavčích spermií charakteristických pravidelne oválnou, sploštenou a rovnako hrubou hlavičkou. Akákoľvek odchýlka od normálneho tvaru a štruktúry sa pokladá za anomáliu. Pri vzniku defektných spermií sa uplatňuje vplyv celého radu činiteľov toxicko-infekčného, fyzikálnochemického, alimentárneho a genetického pôvodu. Príkladom môžu byť práce viacerých autorov ako Courtens et al. (1980), ktoré dokazujú poškodenie morfogenézy spermatíd býkov po podávaní etyléndibromidu. Dokázalo sa, že kadmium vyvoláva nekrózu parenchýmu 103 | P a g e

May 24-25th 2012


semenníka ako dôsledok ischémie, poškodením krvného riečišťa semenníka (Massányi et al., 1991). Pri niektorých vírusových pohlavných chorobách možno pozorovať vyššie percento malformácií hlavičiek spermií. Príčinou rôznych zmien na spermiách môže byť aj chronický zápal semenníka a prisemenníka (Massányi, 1988). Staršie akrozómy sa uvoľňujú a praskajú, najmä ak sú nesprávne konzervované alebo sú spermie hlboko zmrazené (Salah et al., 1992). Belokar et al. (1990) uvádzajú, že sezóna výrazne ovplyvňuje percento abnormálnych a mŕtvych spermií. Zmeny v morfológii spermií delíme na primárne a sekundárne. Primárne vznikajú počas spermiogenetického cyklu až po príchod spermií do chvosta prisemenníka (degeneratívne formy spermií, zmeny tvaru hlavičky, zmeny v nukleoplazme, na akrozóme, vývojové anomálie). Sekundárne zmeny vznikajú napríklad pri dlhšom pobyte spermií v chvoste prisemenníka, v momente ejakulačného reflexu až po posúdenie ejakulátu a artefakty vyvolané nesprávnym zhotovením preparátu (napučiavanie, uvoľnenie, roztrhanie akrozómu a hlavičky, roztrhaný bičík, torzie bičíka rozličného stupňa a nezrelé formy spermií). Degeneratívne (teratoidné) spermie nemajú vyvinutý typický tvar hlavičky a bičíka (Lin et al., 2012). Objavujú sa ako odpad (nepodarok), ktorý vzniká pri produkcii spermií (Gamčík a Kozumplík et al., 1984). Diploidné spermie - s hrubšou hlavičkou a dvoma bičíkmi sa nachádzajú v ejakuláte normálne fertilných býkov. Príčinou vzniku týchto defektov je nerovnomerné rozdelenie jadrovej hmoty počas spermatogenézy. Anomália, pri ktorej sa hlavičky oddelia od bičíka, sa nazýva dezintegrácia spermií (dekapitácia). Vzniká ako následok zápalových procesov prisemenníkov alebo jako genetická chyba. Anomáliu Dag defekt, charakterizuje otočenie bičíka rôzneho stupňa. Do tvarových zmien patria zdvojené, ztrojené bičíky. Torzie, flexie rôzneho stupňa sú tiež dôležitou zmenou spermií, kľučkovite otočený bičík, nalomený bičík. Do skupiny nezrelých foriem patria spermie so zadržanou

protoplazmatickou

kvapkou,

ktoré

pochádzajú

z vývojového

štádia

spermiogenetického cyklu (Weiss et al., 2010).

Materiál a metodika V práci sme použili ejakuláty od 20 býkov, 10 baranov a 7 žrebcov. Odber ejakulátov sa vykonal pomocou umelej vagíny, pričom jej teplota bola 38 až 40 °C. Po získaní ejakulátu do zberača sa posúdila aktivita, koncentrácia a vzhľad. Počas spracovania ejakulátu sa v laboratóriu udržiavala teplota 20 – 25 °C. Ejakulát sme riedili pomocou laktózového riedidla. Množstvo glycerínu sme upravili podľa individuálnych vlastností ejakulátu, hlavne podľa hustoty. Súčasne s riedením dochádzalo k ochladzovaniu. Po zriedeni sme ejakuláty umiestnili do chladničky s teplotou 1 – 3 °C po dobu 90 minút. Ejakulát bol zmrazený na hranoloch suchého ľadu, pričom doba zmrazovania bola 7 minút. Rozmrazovanie peliet sme 104 | P a g e


May 24-25th 2012

uskutočnili v 1 cm3 roztoku citrátu sodného s teplotou 39 °C počas 15 – 30 sekúnd. U baranov a žrebcov sme zmrazovali nakvapkaním do jamôk. Nakvapkávali sme 0,1 cm3 do jednej jamky, pri rozmrazovaní sme pilulku vybrali pinzetou, vložili do skúmavky predhriatej na 40 °C a vo vodnom kúpeli sme ju rozmrazili „na sucho“. K rozmrazenej pilulke sme pridali asi 1,5 cm3 citrátu sodného o teplote 39 °C. Jednu kvapku z rozmrazenej inseminačnej dávky sme rozotreli na podložnom sklíčku a nechali usušiť na ohrievacej doske (38 °C). Suchý preparát sme fixovali 30 minút Hancockovým roztokom a nátery sme premyli destilovanou vodou. Farbenie sme vykonávali Giemsovým roztokom 3 hodiny a opláchli sme nátery destilovanou vodou. Preparáty sme posudzovali na optickom mikroskope pri 1500-násobnom zväčšení. Počet hodnotených spermií u jedného samca bol 1000.

Výsledky Z našich výsledkov vyplýva, že najviac morfologicky zmenených spermií bolo u býkov (10,98 %), potom u baranov (10,56 %) a najmenej u žrebcov (11,19 %). Zo zmien na hlavičke sa najčastejšie vyskytovali malé hlavičky. Z celkového počtu hodnotených spermií býkov malo zmeny na hlavičke 0,98 %, u baranov tvorili zmeny na hlavičke 0,43 % a u žrebcov 0,43%. V práci Sekoniho a Gustavsona (1987) sa uvádza, že abnormality hlavičiek býkov predstavovali 1,34 – 3,72 % z celkového počtu všetkých hodnotených spermií. Zmeny na bičíku tvorili u býkov 8,83 %, u baranov 9,8 % a u žrebcov 10,49 % z celkového počtu hodnotených spermií. Malformácie na bičíku spermií býkov sa pohybovali v rozmedzí 2,91 % na jar a 4,60 % v lete (Sekoni a Gustavson, 1987). Percento spermií s abnormalitami krčku, stredovej a koncovej časti bičíka u holsteinského dobytka bolo priemerne 3,1; 4,2 a 3,0 (Terawaki et al., 1991). Najmenej sa vyskytovali veľké hlavičky u býkov aj baranov, kým u žrebcov sa najmenej vyskytovali akrozomálne zmeny v množstve. Najčastejšie zmeny na bičíku boli hlavička bez bičíka u býkov aj u baranov. U žrebcov to bolo kľučkovité stočenie bičíka. Druhou najpočetnejšou zmenou bolo u býkov torzo bičíka, u baranov kľučkovité stočenie bičíka a u žrebcov hlavička bez bičíka. Ďalšou častou zmenou bol zlomený bičík. Najmenej početnou zmenou bolo u žrebcov torzo bičíka, u baranov zvinutie bičíka a u býkov retencia cytoplazmatickej kvapky. Z iných patologických zmien to boli najčastejšie spermie s viacerými bičíkmi, napučaný akrozóm, zhrubnutie bičíka a priľnutie bičíka k hlavičke. Soderguist et al. (1991) poukazujú na to, že zmeny na hlavičke spermií predstavovali 3,8 % zo všetkých zmien pozorovaných u 47 býkov čiernostrakatých švédskych, ale predstavovali iba 1 % zo všetkých spermií. 105 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab. 1 Percento morfologicky zmenených spermií u jednotlivých druhov zvierat Počet spermií Druh

Percento zmien

morfologicky

hodnotených

zmenených

Býk

20 000

2 196

10,98

Baran

10 000

1 056

10,56

Žrebec

7 000

783

11,19

ŽREBCI

BARANI

BÝCI

Tab. 2 Výskyt jednotlivých malformácií spermií v % AZ

HBB

KĽ

T

KB

ZB

RC

MH

VH

I

Spolu

Priemer

0,40

3,35

1,82

1,98

0,61

0,61

0,47

0,54

0,04

1,18

10,98

Sd

0,24

2,21

1,54

1,08

0,84

0,38

0,40

0,37

0,06

0,84

6,11

Vc

59,69

66,03 84,63 54,55 137,73 61,75

84,87

68,24 145,77 71,35 55,64

Minimum

0,00

0,50

0,40

0,60

0,00

0,00

0,00

0,20

0,00

0,30

4,50

Maximum

1,00

9,90

7,10

5,20

3,60

1,50

1,50

1,70

0,20

3,80

34,40

Medián

0,40

2,80

1,40

1,85

0,30

0,55

0,45

0,40

0,00

0,90

10,10

Priemer

0,21

4,77

2,45

1,66

0,10

0,64

0,18

0,15

0,07

0,33

10,56

Sd

0,22

2,68

2,05

1,06

0,12

0,40

0,18

0,10

0,11

0,17

4,26

105,30 56,11 83,61 63,82 118,32 62,97

98,76

68,31 157,14 50,80 40,31

Vc Minimum

0,00

1,80

0,50

0,30

0,00

0,10

0,00

0,00

0,00

0,10

4,80

Maximum

0,60

11,20

7,90

3,40

0,30

1,30

0,50

0,30

0,30

0,60

19,20

Medián

0,10

4,35

1,75

1,25

0,05

0,55

0,15

0,15

0,00

0,35

9,90

Priemer

0,01

2,80

4,59

0,49

1,21

0,90

0,50

0,24

0,17

0,27

11,19

Sd

0,03

2,23

1,92

0,48

0,89

0,70

0,40

0,18

0,17

0,20

5,09

244,95 79,47 41,79 98,69

73,45

77,89

80,71

75,79

97,18

72,93 45,52

Vc Minimum

0,00

0,10

2,00

0,10

0,30

0,00

0,10

0,00

0,00

0,00

5,00

Maximum

0,10

7,00

6,80

1,60

3,10

2,10

1,30

0,40

0,50

0,60

18,30

Medián

0,00

2,00

4,10

0,30

0,80

0,60

0,40

0,40

0,10

0,20

8,60

Legenda: AZ – akrozomálne zmeny na hlavičke, HBB – hlavička bez bičíka, KĽ – kľučkovité stočenie bičíka, T – torzo bičíka, KB – zvinutie bičíka, ZB – zlomený bičík, RC – retencia cytoplazmatickej kvapky, MH – malá hlavička, VH – veľká hlavička, I – iné morfologicky zmenené spermie, Sd – smerodajná odchýlka, Vc – variačný koeficient.

Petac a Kosec (1989) uvádzajú, že z 9,8 % všetkých abnormálnych spermií malformácie hlavičky predstavovali 4 %. Najčastejšie zmeny boli pozorované na hlavičke 1,4 %, krčku 3,1 %, stredovej časti 4,2 % a koncovej časti bičíka

3,0 %. Salah et al. (1992)

uvádzajú, že najčastejšie zmeny sa vyskytli na bičíkoch a to zvinuté a nalomené bičíky. U kancov Wekerle (1987) zistil najčastejšiu abnormalitu spermií na proximálnej a distálnej 106 | P a g e

May 24-25th 2012


časti bičíka, pričom výskyt týchto zmien sa pohyboval od 10 do 30 %. Krajňák (1983) pri pozorovaní kancov zistil percentuálny výskyt abnormálnych spermií 18,3; 13,5; 15,55 a spermií s excentricky nasadeným bičíkom 34,51; 22,4; 32,25. Massanyi et al. (1992) zistili u býkov priemerné percento výskytu morfologicky abnormálnych spermií 7,21. Medzi hlavné zmeny patrili dezintegrácie hlavičky 31,02 %, kľučkovité stočenie bičíka

12,39 % a torzo

7,39 % z celkového počtu zmien. Lukáč et al. (2003) analyzovali výskyt patologických foriem spermií kancov. Autori uvádzajú, že z celkového počtu patologicky zmenených spermií bolo v sledovaných ejakulátoch najviac hlavičiek bez bičíka (39,21 %), kľučkovitého stočenia bičíka (27,86 %) a torza bičíka (10,85%).

Graf 1, 2, 3 Zastúpenie najčastejších morfologicky zmenených spermií z celkového počtu hodnotených spermií u býkov (1), baranov (2) a žrebcov (3) 1

2

3

Legenda: VP – všetky patologické spermie; HBB – hlavička bez bičíka; T – torzo bičíka; KĽ – kľučkovité stočenie bičíka; I – iné patologické zmeny; ZB – zlomený bičík; KB – zvinutie (klbko) bičíka; MH – malá hlavička; RC – retencia cytoplazmatickej kvapky; AZ – akrozomálne zmeny; VH – veľká hlavička.

Massányi et al. (2004) pozorovali výskyt patologických spermií v inseminačných dávkach býkov v spojitosti so zastúpením Cd, Cu, Pb a Zn v týchto vzorkách. Pozorovali 9,83 % patologicky zmenených spermií. Z celkového počtu patologických spermií zistili, že 29,79 % tvoria hlavičky bez bičíka, 28,97 % torzo bičíka, 17,69 % kľučkovité stočenia bičíka, 5,33 % malé hlavičky, 4,48 % zvinutia bičíka, 3,98 % retencia cytoplazmatickej kvapky, 3,71 % veľká hlavička, 2,12 % akrozomálne zmeny, 2,03 % zlomené bičíky a 1,90 % tvorili iné formy patologických spermií.

Záver Z dosiahnutých výsledkov vyplýva, že percentuálny výskyt patologických spermií sa pohyboval v priemere 10,98 % u býkov, 10,56 % u baranov a 11,19 % u žrebcov. Najvyššie 107 | P a g e


May 24-25th 2012

percento teda bolo u žrebcov a najnižšie u býkov. Za fyziologický výskyt možno považovať množstvo zmien do 20 %. Morfologické zmeny vyvolávajú poruchy plodnosti vtedy, keď sa vyskytujú vo veľkom množstve trvale pri tom istom plemenníkovi. Podľa našich výsledkov zistených možno zaradiť sledovaných býkov, baranov a žrebcov medzi kvalitných.

Použitá literatúra Belokar, P.M. et al. 1990. Studies on seminal and mensurational characteristics of spermatozoa and their interrelationships with freezability and fertility in crossbred bulls. J. PVK-Research, 1990, 2, 14, 165-173. Courtens, J.L. et al. Abnormal spermiogenesis in bulls treated with ethylene dibromine. An ultrastructural and ultrachemical study. J. Ultrastr. Res., 1980, 71, 103-115. Goulda, K.G. et al. Mammalian spermatozoon. In : Hafez, E.S.E. Scanning electron microscopis atlas of mammalian reproduction, Stuttgart, Georg Thieme, 1975. Gamčík, P., Kozumlík, J. et al. Andrológia a inseminácia hospodárskych zvierat, Bratislava, Príroda, 1984. Krajňák, P. Morfologické zmeny spermií kancov a ich vplyv na plodnosť ošípaných. Kandidátska dizertačná práca. VŠP Nitra, 1983. Lin, Y.H., Wang, Y.Y., Chen H.I. et al. 2012. SEPTIN12 Genetic Variants Confer Susceptibility to Teratozoospermia. PLoS One. 2012, 7, 3, 34011. Lukáč, N., Massányi, P., Trandžík, J. et al. 2003. Vybrané stopové rizikové prvky v ejakulátoch kancov. Rizikové faktory potravového reťazca III, Nitra, SPU Nitra, 2003. Massányi, L. Morfogenéza flexie bičíka bovnnej spermie v oblasti cytoplazmatickej kvapy. Živočíšna výroba, 1988, 33, 417-426. Massányi, L. et al. Rizikové faktory prostredia pôsobiace na spermatogenézu - Kadmium. Poľnohospodárstvo, 1991, 9-10, 830-848. Massányi, P., Maretta, M., Trandžík, J. et al. 2004. Kontaminácia inseminačných dávok býkov kadmiom, meďou, olovom a zinkom a jej vzťah ku kvalite spermií. Rizikové faktory potravového reťazca IV, Nitra, SPU Nitra, 2004. Petac, D., Kosec, M. Some morphological charakcers of bull spermatozoa and their effect on fertility. Veterinárstvo, 1989, 1, 65-72. Salah, M.S. et al. 1992. Efect of water sprinkling during the hot-dry summer season on semen quality of Holstein bulls in Saudi Arabia. Animal Reprod., 1992, 1, 59-63. Sekoni, V.O., Gustafsson, B.K. Seasonal variations in the incidence of sperm morphological abnormalities indairy bulls regulary used for artifical insemination. British Veter. J., 1987, 4, 312-317. Soderguist, L. et al. Sperm morphology and fertility in Al bulls. J. Veter. Medic., 1991, 7, 534-543. Terawaki, Y. et al. Repeatability of morphologically abnormal spermatozoa with cytoplasmic droplets in Holstein bulls in Hokkaido. Anim. Sci. & Technol., 1991, 11, 1069-1073. Weiss, P., Brichcín, S., Čepická, B. et al. Sexuologie, Praha, Grada Publishing a.s. 2010, 142.

108 | P a g e

May 24-25th 2012


THE EFFECT OF DIFFERENT PREPERATIONS FOR THE QUALITY PARAMETERS OF CLOVER SILAGES Kubát, V.,1, 2 Petrášková, E.,1 Jančík, F.,2 Čermák, B.,1 Hnisová, J.,1 Homolka, P.,2 Lád F.1 1

Department of Genetics, Animal Breeding and Nutrition, Faculty of Agriculture, University of South Bohemia,

Studentská 13, 370 05 České Budějovice, Czech Republic, 2)

Department of Nutrition and Feeding of Farm Animals, Institute of Animal Science, Přátelství 815, 104 00

Praha Uhříněves, Czech Republic

Abstract The set of samples of red clover silages from the second cut was divided into seven groups; each of them had 4 samples. First group of the samples was untreated (K); no preservations were used on these samples. Into the second group of the samples were included the silages treated with BIOSTABIL (BIOS) preparations. The dosage of BIOPOLYM was recommended 0.02 l BIOPOLYM + 2 l water. m-3 (1 : 100). The third group

contained

the

silage

samples

treated

with

combination

of

BIOSTABIL

and BIOPOLYM 1 : 100 (BIOS + B) preparations. The fourth group contained the silage samples treated with BIOPOLYM 1 : 10 (B 10), fifth group BIOPOLYM 1 : 100 (B 100), sixth group BIOPOLYM 1 : 200 (B 200) and seventh BIOPOLYM 1 : 500 (B 500). In the second cut were achieved the best results in the group BIOS. Very high statistical significance (P < 0.001) was found for pH in group BIOS compared with B 10, B 100, B 200 and B 500. The lowest value of pH showed of group BIOS (4.26).

Key words – silage, red clover, seaweed, Ascophyllum nodosum, rumen

Úvod Silážování je v současné době nejužívanější metodou konzervace jetelovin. Tímto způsobem se konzervuje více než 75 % objemných krmiv. Důvodem je, že tento proces konzervace je v porovnání se sušením rychlejší, což je v době nejistoty počasí velmi důležitý faktor. V dnešní době krmných dávek založených na bázi směsných krmných dávek (TMR) dostává tento způsob konzervace přednost před zeleným krmením. Důvodem je stálá kvalita siláže v čase. Konzervovaná objemná krmiva, která tvoří hlavní podíl sušiny krmné dávky přežvýkavců, rozhodují výraznou měrou o výši užitkovosti. 109 | P a g e

May 24-25th 2012


Tyto skutečnosti se mj. promítly do současného náhledu na hodnocení

kvality

silážovaných krmiv. Dnes už krmiva neposuzujeme pouze podle obsahu energie a živin, ale zaměřujeme se také na kvalitu fermentačního procesu. Cílem práce je hodnocení kvalitativních ukazatelů jetelových siláží ze 2. seče a vyhodnocení účinků přípravkem BIOPOLYM na kvalitu silážního procesu. Pozornost je věnována hodnocení fermentačního procesu na základě vybraných ukazatelů (sušina, pH, kyselina mléčná, kyselina octová, kyselina propionová, kyselina máselná a NH3).

Materiál a metodika Sklizeň druhé seče jetele červeného (Trifolium pratense) se uskutečnila 7. 9. 2010. Na podzim a v zimě roku 2010 bylo provedeno vyhodnocení faktorů, které ovlivňují kvalitativní ukazatele jetelových siláží. Ve druhé seči byla průměrná sklizňová sušina 45 %. Délka řezanky byla mezi 40 – 80 mm. Vzorky byly odebrány v provozních podmínkách, ošetřeny přípravkem BIOPOLYM – extrakt hnědé mořské řasy Ascophyllum nodosum a/nebo přípravkem

BIOSTABIL

–

konzervační

přípravek

na

bázi

homofermentativních

a heterofermentativních bakterií mléčného kvašení. Následně byly vzorky zasilážovány do skleněných lahvích o objemu cca 3,7 l. Výchozí dávkování bylo doporučeno 0,02 l BIOPOLYMu + 2 l vody . m-3 (1 : 100). Ve 20., 22., 24. a 26. týdnu byly tyto vzorky vyhodnoceny. Analýzy vzorků byly provedeny v laboratoři katedry genetiky, šlechtění a výživy zvířat v Českých Budějovicích. Vzorky krmiv byly odebrány dle vyhlášky Mze č. 415/2009 Sb., kterou se provádí zákon o krmivech. Analýza siláží byla provedena dle metodik ÚKZÚZ ,,Metody laboratorního zkoušení krmiv“. Kyseliny v siláži byly stanoveny

pomocí izotachoforetického analyzátoru. Smyslové posouzení siláží bylo

hodnoceno Normou 2004, kterou doporučuje AgroKonzulta Žamberk a EKO-LAB Žamberk (Doležal et al., 2006; Pozdíšek et al., 2008). Kvalitativní ukazatele silážovaných krmiv byly sledovány na 28 vzorcích jetelových siláží. Tyto vzorky byly rozděleny do 7 skupin po 4 vzorcích. Rozdělení vzorků bylo následující: •

skupina (kontrolní) neošetřená – K

•

skupina ošetřená BIOSTABILem – BIOS

•

skupina ošetřená BIOSTABILem a BIOPOLYMem v koncentraci 1 : 10 – BIOS + B

•

skupina ošetřená BIOPOLYMem v koncentraci 1 : 10 – B 10

•

skupina ošetřená BIOPOLYMem v koncentraci 1 : 100 – B 100

•

skupina ošetřená BIOPOLYMem v koncentraci 1 : 200 – B 200 110 | P a g e


•

May 24-25th 2012

skupina ošetřená BIOPOLYMem v koncentraci 1 : 500 – B 500 U každé skupiny byly sledovány následující ukazatele: obsah sušiny, pH, obsah

kyseliny mléčné, kyseliny octové, kyseliny propionové, kyseliny máselné a NH3. Skupiny byly porovnány mezi sebou. Byl použit Levenův test homogenity rozptylů. U některých ukazatelů byla provedena analýza rozptylu a nakonec test homogenních skupin pomocí Tukey HSD test. Výsledky práce byly zpracovány pomocí počítačového programu STATISTICA 9.1.

Výsledky a diskuze Při smyslovém posouzení bylo ve 2. seči ve všech případech silážím započítáno 6 b za pach, 3 b za barvu a 3 b za strukturu a konzistenci. U skupiny siláží BIOS byla ve dvou případech makroskopicky zjištěna přítomnost plísně (cca 2 – 5 cm na povrchu). Plíseň se dále vyskytovala dvakrát ve skupině BIOS + B (cca 6 – 8 cm), jednou ve skupině B 100 (cca 3 cm) a jednou ve skupině B 500 (cca 5 cm). Tato vrstva byla odstraněna. Posouzení a analýzy byly provedeny ze zbylé kvalitní části. U hodnot pH byl splněn předpoklad homogenity rozptylů (F(6,

21)

= 16,5,

p = 0,000001). Hodnoty vykazují normální rozdělení. Výsledky jsou znázorněny na obr. 1. V provozním pokusu se silážovaným jetelem uvádějí Dewhurst a kol. (2003) hodnotu pH 4,24 při sušině 37,6 %. S hodnotou 4,26 je možno uvést skupinu siláží BIOS při obsahu sušiny 46,26 %. V ostatních případech byly námi zjištěné hodnoty vyšší. Siláže skupiny B 100 (pH 4,46) tak představovaly více než 5 % nárůst oproti uvedenému autorovi. V pokuse s plastovými sily Narasimhali a Sanderson (1993) prezentovali hodnotu pH dokonce 4,8.

111 | P a g e


May 24-25th 2012

Obrázek 1 Porovnání pH podle jednotlivých skupin ve 2. seči (Comparison of pH values in the different groups in the 2nd cut (F(6, 21) = 16.5, p = 0.000001)

Zároveň byly prokázány statisticky velmi vysoce významné rozdíly (P < 0,001) u siláží skupiny BIOS proti skupinám B 10, B 100, B 200 a B 500. Nižším pH se vyznačovala skupina BIOS. Na stejné hladině významnosti (P < 0,001) vykazovala nižší pH i skupina siláží BIOS + B v porovnání se skupinou B 500. Mezi hodnotami kyseliny mléčné byl splněn předpoklad homogenity rozptylů. Mezi skupinami siláží ovšem nebylo zjištěno statisticky významných rozdílů. Pro porovnání hodnot bylo užito neparametrické statistické hodnocení. Nejvyšší hodnoty vykazovala skupina BIOS (30,27 g . kg-1) a dále BIOS + B (29,90 g . kg-1), K (29,38 g . kg-1), B 200 (27,69 g . kg-1), B 500 (23,35 g . kg-1) a B 10 (23,13 g . kg-1). Nejnižšími hodnotami se prezentovaly siláže s označením B 100 (21,59 g . kg-1). Průměrná hodnota kyseliny mléčné byla v experimentu Narasimhali a Sanderson (1993) 24 g . kg-1. Námi naměřené hodnoty tak byly vyšší o více než 26 % (BIOS), na druhou stranu i nižší o 11 % (B 100). Dewhurst a kol. (2003) uvádějí koncentraci kyseliny mléčné 19,68 g . kg-1. Porovnáním s našimi průměrnými hodnotami

112 | P a g e


May 24-25th 2012

zjistíme, že všechny skupiny vykazovaly vyšší hodnoty. Obrázek 2 dokumentuje vývoj sušiny a kyseliny mléčné ve 2. seči. Obsah kyseliny mléčné roste s obsahem sušiny.

Obrázek 2 Vývoj obsahu sušiny a kyseliny mléčné ve 2. seči (Development of dry matter and lactic acid in the 2nd cut)

U hodnot kyseliny octové byl splněn předpoklad homogenity variancí. Při porovnání jednotlivých skupin však nebylo zjištěno statisticky významných rozdílů. Pro stanovení pořadí bylo využito neparametrické statistiké hodnocení. Pořadí jednotlivých skupin siláží podle klesající koncentrace bylo následující: K (12,31 g . kg-1), B 200 (11,96 g . kg-1), BIOS (11,24 g . kg-1), BIOS + B (10,91 g . kg-1), B 10 (9,78 g . kg-1), B 500 (9,06 g . kg-1) a B 100 (8,75 g . kg-1). Narasimhali a Sanderson (1993) uvádějí průměrnou hodnotu kyseliny octové 25 g . kg-1. Skupina siláží K tak tvoří téměř 50 % uvedené hodnoty. Hodnoty kyseliny propionové a máselné nevykazují normální rozdělení. Výskyt kyseliny propinové byl zaznamenán pouze jednou v siláži s označením B 10 (1,13 g . kg-1). Tentýž vzorek obsahoval 1,44 g . kg-1 kyseliny máselné. Vzorek nejevil žádné známky makroskopického poškození. V ostatních případech nebyl výskyt těchto kyselin zaznamenán. Dewhurst a kol. (2003) uvádějí ve svém experimentu průměrný obsah kyseliny máselné 1,36 g . kg-1. Mezi hodnotami NH3 byl splněn předpoklad homogenity rozptylů. Mezi skupinami siláží nebylo zjištěno statisticky významných rozdílů, proto bylo k porovnání hodnot užito 113 | P a g e


May 24-25th 2012

neparametrické statistiky. Nejnižší hodnoty vykazovala skupina BIOS + B (v průměru 0,046 %), následně B 500 (0,051 %), BIOS (0,055 %), B 10 (0,055 %), B 100 (0,056 %) a K (0,057 %). Nejvyšší průměrné hodnoty byly zaznamenány u skupiny siláží B 200 a to 0,060 %. Všechny námi zjištěné hodnoty amoniaku se nachází v bezpečné hladině, která je podle Doležala a kol. (2006) mezi 0,03 a 0,07 %.

Závěr Ve 2. seči bylo nejlepších výsledků dosaženo ve skupině BIOS. S ohledem na výskyt kyseliny máselné ve skupině B 10 je možné tuto skupinu označit jako nejméně příznivou.

Poděkování Příspěvek vznikl za finanční podpory projektu NAZV č. QH 92252 a výzkumného záměru č. MZe 0002701404.

Použitá literatura Dewhurst, R.J., Fischer, W.J., Tweed, J.K.S., Wilkins, R.J. Comparison of grass and legume silages for milk production. 1. Production responses with different levels of concentrate. J. Dairy Sci, 2003, 86, 2598-2611. Doležal, P., Doležal, J., Mikyska, F., Mrkvicová, E., Zeman, L. Konzervace, skladování a úprava objemných krmiv (Přednášky). MZLU, Brno, 2006, 247 s. Narasimhalu, P., Anderson, J.B. Composition and utilization in sheep of unwilted and wilted silages prepared from seeding year red clover (Triforium pratense L.) cut at two maturity stages. Canadian Journal of Plant Science, 1993, 87-91. Pozdíšek, J., Mikyska, F., Loučka, R., Bjelka M. Metodická příručka pro chovatele k výrobě konzervovaných krmiv (siláží) z víceletých pícnin a trvalých travních porostů. Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o., Rapotín, 2008, 38 s. StatSoft. STATISTICA (data analysis software system). 2010, Version 9.1. www.statsoft.com ÚKZÚZ. Metody laboratorního zkoušení krmiv. 2009, [online]. [cit. 10. 1. 2011]. Dostupný na WWW: . Vyhláška č. 415/2009 Sb. o stanovení požadavků na odběr vzorků a způsobu zveřejnění metod laboratorního zkoušení produktů ke krmení. [online]. [cit. 10. 1. 2011]. Dostupný na WWW: .

114 | P a g e


May 24-25th 2012

EFFECT OF RABBIT SPERMIOPHAGES ON SEMEN PARAMETERS Kuželová, L.1,2, Makarevich, A. V. 2, Chrenek, P.1,2 1

Slovak University of Agriculture, Faculty of Biotechnology and Food Science, Nitra, Slovak Republic,

2

Institute of Farm Animal Genetics and Reproduction, Animal Production Research Centre Nitra, Lužianky,

Slovak Republic

Abstract The aim of this study was analysis of spermiophages in rabbit ejaculate and effect of spermiophages on selected rabbit reproductive parameters. Activated macrophages, engaging in sperm phagocytosis (spermiophages), might represent a marker of innate immunosystem activation. Semen samples from rabbit males were collected using an artificial vagina and spermiophages were analysed with fluorescent dye Alexa-AcLDL (L-23380, Molecular Probes product). Semen samples were evaluated using the CASA system for concentration and motility. Our results show that the percentage concentration, total motility and progressive motility of the spermatozoa was lower in group with less than 20% contain of spermiophages within the sperm samples than in group with 40% contain of spermiophages within the sperm samples (0.886 x 109/ml vs. 2.023 x 109/ml of concentration, 74.78% vs. 86.64% of motile spermatozoa and 63.02% vs. 79.02% of progressive motile spermatozoa).

Key words: rabbit, spermatozoa, spermiophages, concentration, motility

Introduction Phagocytosis, the process by which cells engulf foreign particles, occurs in eukaryotes ranging from unicellular organisms, which use it for nutrition, to mammals, where it plays a key role in innate immunity (Gagnon et al., 2002). Leukocytes are present throughout the male reproductive tract, are found in most ejaculates, and are thought to play an important role in immunesurveillance and phagocytic clearance of abnormal sperm (Gallegos-Avila et al., 2010). Polymorphonuclear (PMN) granulocytes account for 50% to 60% of all white blood cells (WBC) in semen, macrophages (MF) account for 20% to 30% and T-lymphocytes for 5% (Smith et al., 1989; Wolff, 1995). Macrophages belong to the mononuclear phagocyte system and they represent a mechanism to remove senescent, malformed or degenerative sperm. They appear to be involved in immunologic surveillance, immunoregulation, and tissue remodeling. Concerning human testis, early morphological studies described the presence of macrophages in the interstitium and occasionally in the lamina propria of 115 | P a g e


May 24-25th 2012

seminiferous tubules (Hermo et al., 1978; Pollanen et al., 1987; Frungieri et al., 2002). Phagocytosis of sperm by epithelial cells has been descripted previously in ductal tubules testis of various species animals (Dym 1974; Goyal 1982; Holstein 1978; Hoffer and Hamilton 1974; Hoffer et al., 1975; Riva et al., 1981). Spermiophagy by macrophage has been described either in the male extragonadal ductal system (Holstein, 1978), in prostate and in boar ejaculate (Hrudka and Post, 1983) and male ejaculat (Riedel, 1980). Little informations are about occurrence spermiophages in rabbit ejaculate and effect of spermiophages on female reproduction. Aim of study was analysis of spermiophagy in rabbit ejaculate with fluorescent staining and evaluation of spermatozoa motility and concentration using CASA method.

Materials and methods Semen collection and analysis Semen samples were obtained from sexually mature (4 – 5 months old) and clinically healthy rabbit males of M91 and P91 lines from breeding in Institute of Small Farm Animals APRC (Animal Production Research Centre Nitra) and they were collected using an artificial vagina. Each semen collection was analyzed using a CASA (Computer Assisted Semen Analysis) system – SpermVision (Minitüb, Tiefenbach, Germany) combined with Olympus BX 51 microscope (Olympus, Japan) and following parameters were evaluated: concentration (x 109 cells per ml); percentage of motile spermatozoa (motility >5 µm/s) and percentage of progressively motile spermatozoa (motility >20 µm/s).

Analysis of spermiophagy Ejaculates of sperms were washed in saline solution. There was added 1% FCS and samples were centrifuged at 1000 g for 3 min from the rest of the seminal fluid. Pellets were resuspended in solution Alexa-AcLDL (L-23380, Molecular Probes product), 2 µg.ml-1 saline solution of FCS and incubated in the incubator for 2 – 4 hours. Cells were subsequently centrifuged at 1000 g for 3 min and resuspended in cold saline solution. The suspension was afterwards placed on a glass microscope slide, mixed in Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA) antifade medium containing DAPI fluorescent dye and the drop was covered with cover slid. Samples were evaluated in a Leica fluorescent microscope (Leica Microsystem, Germany). If the LDL (Low-Density Lipoprotein Complexes) has been acetylated, the LDL complex no longer binds to the LDL receptor, but rather is taken up by spermiophages 116 | P a g e

May 24-25th 2012


(macrophages) that possess “scavenger” receptors specific for modified LDL. The superior fluorescence output by Alexa Fluor AcLDL (L-23380) provides easier identification of spermiophages and endothelial cells in mixed cell population.

Statistical analysis Obtained data were statistically analyzed using Excel software and χ2 –test.

Results The semen samples were divided into two groups on the basis of contains spermiophages, which we found with fluorescent analysis. Ejaculates with the occurrence of spermiophages (SP) less 20% of all cells belong to the group R1 and ejaculates with the occurrence of spermiophages about 40% belong to the group R2. Computer assisted semen analysis showed that the average spermatozoa concentration in the group R1 was 0.886 x 10

9

per ml and in the group R2 was 2.023 x 10 per ml. Figure 1 shows the basic CASA 9

parameters of rabbit semen collected from rabbit males. The total motility and progressive motility of spermatozoa was lower in group with lower occurrence spermiophages (74.78% vs. 86.64% of motile spermatozoa and 63.02% vs. 79.02% of progressive motile spermatozoa).

Figure 1: Effect of spermiophages on female reproductive traits in vitro 90 80 70 60 50 40

R1 (<20% SP)

30

R2 (≈40% SP)

20 10

R2 (≈40% SP)

0

R1 (<20% SP) % of motile spermatozoa

% of progressive motile spermatozoa

Discussion Present work evaluates effect of rabbit spermiophages on selected sperm parameters. The possibility that macrophages may play a positive role in the control of semen quality was suggested by the interesting studies of Tomlinson et al. (1992). Specifically, the authors postulated that phagocytes might shape the quality of the human ejaculate by phagocytosing morphologically abnormal spermatozoa. These authors identified three types of seminal phagocytic cells: small PMN leukocytes, monocytes of similar size, and much larger 117 | P a g e


May 24-25th 2012

macrophages capable of engulfing multiple sperm heads. These authors suggested that the quality of sperm morphology is directly correlated with the size of the seminal leukocyte population (Gallegos-Avila et al., 2010). However, other authors reported a significant positive correlation between leukocyte counts in semen and sperm tail defects, acrosome damage and high sperm deformity index. The presence of spermiophages was associated with a lower total sperm count and sperm concentration, a lower forward motility and a high percentage of disrupted sperm compared to ejaculates without spermiophages (Pelliccione et al., 2008). Our results show that the concentration, percentage total motility and progressive motility of spermatozoa were increased in group with more occurrence spermiophages.

Conclusion Our data and those of others suggest that spermiophages might have a biological impact on some semen parameters. Clearly, more research is needed to evaluation effect of rabbit spermiophages on female reproduction.

Acknowledgement This work was supported from the grants of Slovak Research and Development Agency: LPP-0119-09.

References Dym, M. The fine structure of monkey Sertoli cells in the transitional zone at the junction of the seminiferous tubules with the tubuli recti. Am. J. Anat., 1974, 140, 1-26. Frungieri, M.B., Calandra, R.S., Lustig, L., Meineke, V., Kıhn, F.M., Vogt, H., Mayerhofer, A. Number, distribution pattern, and identification of macrophages in the testes of infertile men. Fertil. Steril., 2002, 78, 298-306. Gagnon, E., Duclos, S., Rondeau, Ch., Chevet, E., Cameron, P.H., Steele-Mortimer, O. Paiement, J., Bergeron, J.J.M., Desjardins, M. Endoplasmic Reticulum-Mediated Phagocytosis Is a Mechanism of Entry into Macrophages. Cell, 2002, 110, 119-131. Gallegos-Avila, G., Ancer-Rodríguez, J., Ortega-Martínez, M., Jaramillo-Rangel, G. Infection and phagocytosis: analysis in semen with transmission electron microscopy. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education, 2010, 3, 85-92. Goyal, H.O. Light microscopic and ultrastructural evidence of epithelial phagocytosis of sperm in the rete testis and ductuli efferentes in the bull. Am. J. Vet. Res., 1982, 43, 785790. Hermo, L., Lalli, M. Monocytes and mast cells in the limiting membrane of human seminiferous tubules. Biol. Reprod., 1978, 19, 92–100. Hoffer, A.P., HAMILTON, D.W. Phagocytosis of sperm by the epithelial cells in ductuli efferentes of experimental rats. Anat. Rec., 1974, 178, 376- 377. Hoffer, A.P., Hamilton, D.W., Fawcett, D.W. Phagocytosis of spermatozoa by the epithelial cells of the ductuli efferentes after epididymal obstruction in the rat. J. Reprod. Fertil., 1975, 44, 1-9. 118 | P a g e


May 24-25th 2012

Holstein, A.F. Spermiophagy in the seminiferous tubules and excurrent ducts of the testis in rhesus monkey and man. Andrologia, 1987, 10, 331-352. Hrudka, F., Post K. Leukophages in canine semen. Andrologia, 1983, 15, 26-33. Pelliccione, F., D’Angeli, A., Cordeschi, G., Mihalca, R., Bocchio, M., Ciociola, F., Mancini, M., Necozione, S., Francavilla, F., Francavilla, S. Seminal macrophages in ejaculates from men with couple Infertility. Int. J. Androl., 2008, 32, 623–628. Pollanen, P., Niemi, M. Immunohistochemical identification of macrophages, lymphoid cells and HLA antigens in the human testis. Int. J. Androl., 1987, 10, 37–42. Riedel, H.H. Uber den Nachweis einer speziellen Art von Spermophatogen in menschlichen Ejakulat. Andrologia, 1980, 12, 232-244. Riva, A.,Cossu, M., Esao, E., Testa-Riva, F. Spermiophagy by epithelial cells of the seminal vesicle and of the ampulla dustus deferentis in man: A scanning and transmission EM study. New York, Raven, 1981. Smith, D.C., Barratt, C.L., Williams, M.A. The characterisation of non-sperm cells in the ejaculates of fertile men using transmission electron microscopy. Andrologia, 1989, 2, 319–333. Tomlinson, M.J., White, A., Barratt, C.L.R., Bolton, A.E., Cooke, I.D. The removal of morphologically abnormal sperm forms by phagocytes: a positive role for seminal leukocytes? Hum. Reprod., 1992, 7, 517-522. Wolff, H. The biological significance of white blood cells in semen. Fertil. Steril., 1995, 63, 1143–1157.

119 | P a g e

May 24-25th 2012


EFFECT OF NONYLPHENOL AS ENDOCRINE DISRUPTOR ON THE MOTILITY OF BOVINE SPERMATOZOA IN VITRO Lukáčová, J., Kňažická, Z., Tvrdá, E., Lukáč, N. Department of Animal Physiology, Faculty of Biotechnology and Food Sciences, Slovak University of Agriculture in Nitra

Abstract Nonylphenol (NP) is a toxic environment contaminant that causes endocrine disruption. NP is widely used surfactants in domestic and industrial products. NP can affect male reproductive system and result a decline of spermatozoa count and motility. The target of this study was to determine the effect of NP as an endocrine disruptor on the motility of bovine spermatozoa. Specifically, we examined the dose- and time-dependent effect of nonylphenol (1, 10, 100 and 200 µg NP/ml) dissolved either in 0.1% dimethyl sulfoxide (DMSO) or 0.1% ethanol (ETOH) on the spermatozoa motility during several time periods (0 h, 2 h, 4 h and 6 h). The motility of spermatozoa was determined the Sperm VisionTM CASA (Computer Assisted Semen Analyzer) system. The results showed a decreased spermatozoa motility in all experimental groups with the addition of NP dissolved in 0.1% DMSO and 0.1% ETOH. Significant differences (P<0.001 and P<0.05) between the control group and all experimental groups were recorded. The lowest spermatozoa motility was found at doses > 100 µg NP/ml in comparison with the control group. The obtained data indicate that the negative effect of NP on spermatozoa motility must be seriously considered in the case of exposure to NP in animals and humans. Key words: nonylphenol, motility, spermatozoa, CASA, in vitro

Introduction The modern human life is dependent on a variety of man-made chemicals. Some of the chemicals and their degradation products in the environment can be hazardous to animal as well as human health (Miyaura and Iwata, 2002). Currently, risk to human health is represented by different consumer products of a wide and heterogenous group of compounds, namely endocrine disruptors chemicals (EDCs) that can act at several sites, mimicking the occurrence of natural hormones, blocking their production or by inhibiting/stimulating the endocrine system (White at al., 1994).

120 | P a g e


May 24-25th 2012

A well known class of environmental endocrine disruptors is the group of compounds known as alkylphenolpolyethoxylates (APEs), which are used in variety of products, including detergents, pesticides, cosmetics and plastic ware (White et al., 1994). Nonylphenol (NP) is one of the most abundant alkylphenolpolyethoxylates (APEs) derivates and is able to act as endocrine disruptor and cause adverse reproductive effects in mammals (Hughes et al., 2000). NP profoundly impairs testicular function as evidenced by reduced testis size, low circulating testosterone, disturbed testicular structure and suppressed spermatogenesis (Nagao et al., 2001; Tan et al., 2003; Cardinali et al., 2004). Gong et al. (2009) reported that NP induces apoptosis in rat testicular cells, particularly in Sertoli cells by inhibiting the Ca2+ pump in the endoplasmic reticulum. The target of this study was to analyze the effect of various concentrations of nonylphenol dissolved in either 0.1% ethanol (ETOH) or 0.1% dimethyl sulfoxide (DMSO) on the motility of bovine spermatozoa.

Materials and methods Semen samples and in vitro culture Bovine semen samples were obtained from 8 adult breeding bulls (Slovak Biological Services, Nitra, Slovak Republic). The samples had to accomplish the basic criteria given for the corresponding breed. The semen was obtained on a regular collection schedule using an artificial vagina. After collecting the samples were stored in the laboratory at room temperature (22-25°C). Each sample was diluted in physiological saline solution (PS) (sodium chloride 0.9% w/v, Bieffe Medital, Italia), using a dilution ratio of 1:40, depending on the original spermatozoa concentration. Spermatozoa were incubated with various concentrations of nonylphenol (4-n-NP; Fluka, Buchs, Switzerland) dissolved in 0.1% ethanol (ETOH, Sigma-Aldrich Co.) (group A – 1; B – 10; C – 100; D – 200 µg NP/ml) and in 0.1% dimethyl sulfoxide (DMSO, SigmaAldrich Co.) (group A – 1; B – 10; C – 100; D – 200 µg NP/ml). Spermatozoa were cultivated in the laboratory at room temperature (22-25°C). The control (Ctrl) group (medium without NP) was compared to the experimental groups (exposed to different concentrations of NP).

Computer-assisted semen analysis (CASA) The motility analysis was carried out using a CASA (Computer Assisted Semen Analyzer) system – SpermVisionTM program (MiniTőb, Tiefenbach, Germany) with the Olympus BX 51 microscope (Olympus, Japan) at cultivation Times 0 h, 2 h, 4 h and 6 h. Each 121 | P a g e


May 24-25th 2012

sample was placed into the Makler Counting Chamber (deph 10 µm, Sefi-Medical Instruments, Izrael) and the following parameters were evaluated: percentage of motile spermatozoa (motility > 5 µm/s; MOT) and percentage of progressive motile spermatozoa (motility > 20 µm/s; PROG). This study was performed in eight replicates at each concentration (n = 8). At least 1000 spermatozoa were analyzed in each sample (Slivkova et al., 2010; Lukac et al., 2011).

Statistical analysis Obtained data were statistically analyzed using PC program GraphPad Prism 3.02 (GraphPad Software Incorporated, San Diego, California, USA). Descriptive statistical characteristics (mean, minimum, maximum, standard deviation and coefficient of variation) were evaluated. One-way analysis of variance (ANOVA) and the Dunnett´s multiple comparison test were used for statistical evaluations. The level of significance was set at *** (P<0.001); ** (P<0.01) and * (P<0.05).

Results Evaluation of bovine spermatozoa motility exposed to NP dissolved in 0.1% DMSO Evaluation of the percentage of spermatozoa motility showed slightly decreased values in all doses of NP dissolved in 0.1% DMSO compared to the control group during Time 0 h of in vitro cultivation (Table 1). In this time, the lowest spermatozoa motility was recorded in the groups C (P<0.001) and D (P<0.001) using the highest doses of NP in comparison with the control group (95.58% and 92.69% versus 101.20%). After 2 h of cultivation the dose 1 µg NP/ml and 10 µg NP/ml caused a slightly increased spermatozoa motility in comparison with control at 0 h of in vitro cultivation (104.0% versus 100.20%; 101.5% versus 100.20%). Experimental administration of 100 µg NP/ml significantly decreased (P<0.05) the motility parameter. The lowest spermatozoa motility was detected in group D (P<0.001) with the highest dose of NP (81.82 ± 11.62%). After 4 h and 6 h of cultivation a decrease of motility was recorded in all experimental groups in comparison to the control group. An identical decrease of spermatozoa motility was detected also for the percentage of progressive motile spermatozoa in all time periods.

122 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab 1 Bovine spermatozoa motility (MOT; %) exposed to NP dissolved in 0.1% DMSO in various time periods.

Parameter

Time

Ctrl

A

B

(h)

C

D

µg NP/ml

x

101.20

99.83

97.51

95.58 A

92.69 A

minimum

90.56

90.56

83.35

80.07

74.43

105.70

106.80

105.30

105.90

104.50

S.D.

3.80

4.62

5.76

7.01

7.61

CV (%)

3.79

4.63

5.91

7.33

maximum

0

8.21 C

81.82 A

x

100.20

104.00

101.50

94.42

minimum

87.27

92.95

88,.30

84.59

63.20

111.70

114.30

112.60

100.00

96.10

S.D.

7.09

6.01

7.47

4.15

11.62

CV (%)

7.08

5.78

7.37

4.39

maximum

2

14.22 A

74.77A

x

97.60

97.21

94.83

88.68

minimum

82.76

90.49

82.23

76.04

62.73

110.40

102.70

106.50

100.00

93.86

S.D.

9.67

3.90

6.83

7.66

10.38

CV (%)

9.91

4.01

maximum

4

70.58

13.88 A

61.73 A

94.77

minimum

90.47

56.85

55.99

52.49

45.80

98.87

98.32

95.29

94.98

86.97

S.D.

2.33

10.36

12.58

14.59

14.68

CV (%)

2.46

12.01

15.22

6

82.64

8.64 A

x

maximum

86.27

7.20 C

20.68 A

B

23.78 C

Legend: x – mean, SD – standard deviation, CV (%) – coefficient of variation, P<0.001 ; P<0.01; P<0.05.

Evaluation of bovine spermatozoa motility exposed to NP dissolved in 0.1% ETOH The initial spermatozoa motility showed slightly decreased values in all groups of NP dissolved in 0.1% ETOH in comparison to NP dissolved in 0.1% DMSO. The average values of spermatozoa motility in all experimental groups were lower in comparison to the control group during time 0 h of in vitro cultivation (Table 2). Similarly, the lowest spermatozoa motility was also observed in the groups C (P<0.001) and D (P<0.001) with the highest doses of NP in comparison to the control group (95.38% and 91.55% versus 99.62%). High NP concentrations (100 µg/ml; 200 µg/ml) decreased the average motility values also after 2 h and significant differences (P<0.001) were found between these groups and the control group (90.62% versus 97.71%; 81.06% versus 97.71%). After 4 h of in vitro cultivation the spermatozoa motility was significantly decreased in group B, C and D (P<0.001). After 6 h of culture a decrease of motility in all experimental groups in comparison to the control group was found. A significant decrease of spermatozoa 123 | P a g e

May 24-25th 2012


motility (P<0.001) was found in groups B, C and D. An identical decrease of spermatozoa motility was detected also for the percentage of progressive motile spermatozoa in all time periods.

Tab 2 Bovine spermatozoa motility (MOT; %) exposed to NP dissolved in 0.1% ETOH in various time periods.

Parameter

Time

Ctrl

A

(h)

B

C

D

µg NP/ml 99.62

99.91

97.14

95.38 A

91.55A

93.46

89.98

61.66

80.96

89.07

105.90

104.40

106.00

102.00

98.95

S.D.

3.26

4.06

8.87

5.74

2.68

CV (%)

3.27

4.06

9.13

6.02

x minimum maximum

0

x

2.92 A

81.06 A

97.71

98.54

95.87

90.62

83.99

87.42

79.49

60.42

70.42

109.40

108.50

103.70

99.26

89.21

S.D.

6.64

6.07

5.23

6.78

5.28

CV (%)

6.79

6.16

5.45

minimum maximum

2

x

7.48 A

72.74 A

96.15

95.27

92.23

89.28

86.17

80.15

65.37

61.22

109.60

110.00

101.50

96.90

80.46

S.D.

4.27

5.10

5.76

8.10

5.13

CV (%)

4.44

5.34

6.24

minimum maximum

4

x

83.40

6.51 A

9.71 A

61.05A

90.30

87.35

81.33

81.54

74.00

58.66

56.12

47.27

98.37

99.48

94.91

86.56

80.72

S.D.

4.76

5.85

11.58

8.61

7.06

CV (%)

5.27

6.69

14.24

minimum maximum

6

69.66

7.05 A

12.36 A

B

11.56 C

Legend: x – mean, SD – standard deviation, CV (%) – coefficient of variation, P<0.001 ; P<0.01; P<0.05.

Discussion Nonylphenol (NP) is one of the most abundant alkylphenolpolyethoxylates (APE) derivates that can induce cell death in gonads and changes to other reproductive parameters (Cardinali et al., 2004). The data obtained from this study indicate that NP dissolved in ETOH has a higher inhibitory effect on spermatozoa motility than NP dissolved in DMSO. This indicates that a combination of NP and ETOH have a higher toxic effect than a combination of NP and DMSO. These findings are in accordance with the studies of Uguz et al. (2009).

124 | P a g e


May 24-25th 2012

Gong and Han (2006) investigated the effect of NP (10, 20, 30 and 40 µM) for 12 h and 24 h, they observed an increase of the oxidative stress in those doses of NP in rat Sertoli cells. Dakdoky and El-Helal (2007) found that a daily dose of 21.25 mg/kg of nonylphenol decreased significantly mouse spermatozoa motility for 35 days. Uguz et al. (2009) examined effect of NP (1, 10, 100, 250 and 500 µg/ml) on epididymal rat spermatozoa during different time periods (0 h, 1 h, 2 h, 3 h and 4 h) and recorded that exposure to a dose 250 µg NP/ml has detrimental effect on motility of rat spermatozoa. Our experiment indicates similar results at doses 200 µg NP/ml and a negative influence on spermatozoa motility.

Conclusion Recent researchers have hypothesized that environmental exposure to nonylphenol poses adverse effects on reproductive system of humans and wildlife species. The data obtained from this in vitro study describe the dose- and time-dependent effect of NP on the motility of bovine spermatozoa. Our results support the idea that higher doses of NP (>100 µg NP/ml) dissolved in 0.1% DMSO and in 0.1% ETOH negatively influence the spermatozoa motility.

Acknowledgments This work was supported by the Scientific Agency of the Slovak Republic VEGA No. 1/0532/11.

Refferences Cardinali M., Maradonna F., Olivotto I., Bortoluzzi G., Mosconi G., Polzonetti-Magni A.M., Carnevali O. Temporary impairment of reproduction in freshwater teleost exposed to nonylphenol. Reprod. Toxicol., 2004, 18, 597-604. El-Dakdoky, M.H. – Helal, M.A. Reproductive toxicity of male mice after exposure to nonyphenol. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 2007, 79, 188-191. Gong Y., Han X.D. Nonylphenol-induced oxidative stress and cytotoxicity in testicular Sertoli cells. Reprod. Toxicol., 2006, 22, 623-630. Gong, Y., Wu, J., Huang, Y., Shen, S., Han, X.D. Nonylphenol induces apoptosis in rat testicular Sertoli cells via endoplasmatic reticulum stress. Toxicol. Lett., 2009, 186, 84-95. Hughes P.J., McLellan H., Lowes D.A., Kahn S.Z., Bilmen J.G., Tovey S.C., Godfrey R.E., Michell R.H., Kirk C.J., Michelangeli F. Estrogenic alkylphenols induce cell death by inhibiting testis endoplasmic reticulum Ca(2+) pumps. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, 277, 568-574. Lukac, N., Massanyi, P., Roychoudhury, S., Capcarova, M., Tvrda, E., Knazicka, Z., Kolesarova, A., Danko J. In vitro effects of radiofrequency electromagnetic waves on bovine spermatozoa motility. J. Eenviron.l Sci. Heal. A, Toxic/hazardous substances & environmental engineering, 2011, 46, 1417-1423. 125 | P a g e


May 24-25th 2012

Miyaura, H., Iwata, M. Direct and indirect inhibition of Th1 development by progesterone and glucocorticoids. J. Immunol., 2002, 168, 1048-1094. Nagao, T., Wada, K., Marumo, H., Yoshimura, S., Ono, H. 2001. Reproductive effects of nonylphenol in rats after gavage administration: a two-generation study. Reprod. Toxicol., 2001, 15, 293-315. Slivkova, J., Massanyi, P., Pizzi, F., Trandzik, J,, Roychoudhury, S., Lukac, N., Dankova, M., Almasiova, V. In vitro toxicity of mercuric chloride on rabbit spermatozoa motility and cell membrane integrity. . Eenviron.l Sci. Heal. A, Toxic/hazardous substances & environmental engineering, 2010, 45, 767-774. Tan, B.L., Kassim, N.M., Mohd, M.A. Assessment of pubertal development in juvenile male rats after sub-acute exposure to bisphenol A and nonylphenol. Toxicol. Lett., 2003, 143, 261-270. Uguz, C., Varisli, O., Agca, C., Agca, Y. Effects of nonylphenol on motility and subcellular elements of epididymal rat sperm. Reprod. Toxicol., 2009, 28, 542-549. White, R., Jobling, S., Hoare, S.A., Sumpter, J.P., Parker, M.G. Environmentally persistent alkylphenolic compounds are estrogenic. Endocrin., 1994, 135, 175-182.

126 | P a g e


May 24-25th 2012

EXPOSURE OF GRANULOSA CELLS TO THE FUSARIUM TOXINS Medveďová, M.,1 Maruniaková, N.,1, Ciereszko, R.,2 Kolesárová, A.,1 1

Slovak University of Agriculture in Nitra, Faculty of Biotechnology & Food Sciences, Department of Animal

Physiology 2

Department of Animal Physiology, Faculty of Biology, University of Warmia and Mazury in Olsztyn

Abstract The aim of this in vitro study was to examine the secretory activity of a porcine ovarian granulosa cells (GCs) after deoxynivalenol (DON), T-2 toxin, HT-2 toxin and zearalenone (ZEA) addition. Ovarian granulosa cells were incubated with DON, T-2 toxin, HT-2 toxin and ZEA for 24h: 0, 10, 100 and 1000 ng/ml. The secretion of estradiol was determined by RIA. We found no significant differences between control group without mycotoxins addition and experimental groups, accordingly there is a continued need to elucidate detailed explanation of mechanisms of action these mycotoxins on steroidogenesis.

Key words: Deoxynivalenol, T-2 toxin, HT-2 toxin, zearalenone, estradiol, granulosa cells.

Úvod Mykotoxíny sú produkované rôznymi druhmi mikroskopických húb a môžu byť už v nízkych dávkach toxické pre stavovce a iné skupiny živočíchov. Medzi mykotoxíny produkované Fuzáriami zahŕňame nemakrocyklické trichotecény, ako je deoxynivalenol (DON), T2 toxín (T2), metabolit T2 toxínu HT-2 toxín (HT-2), ako aj zearalenon (ZEA), ktoré môžu ovplyvňovať reprodukčné parametre ošípaných (Caloni et al., 2009; Pestka, 2010). Trichotecény zahŕňajú skupinu viac ako 60 sesquiterpenoidných metabolitov produkovaných množstvom rodov mikroskopických húb, medzi ktoré patrí aj rod Fusarium spp. Všetky trochotecény majú spoločnú 12,13-epoxytrichoténovú kostru a olefínickú väzbu s početnými bočnými reťazcami. Sú obyčajne zastúpené ako krmivové a potravinové kontaminanty, a požitie týchto mykotoxínov môže mať za následok alimentárne krvácania a zvracanie; priamy kontakt spôsobil dermatitídu (Bennett a Klich, 2003). Deoxynivalenol, hovorovo známy ako „vomitoxín“ (spôsobujúci zvracanie), je z trichotecénov B-typu najčastejšie detekovaný v potravinách (Pestka, 2007). Rôzne dávky DON-u môžu mať, paradoxne, aj podporujúci aj tlmivý účinok na živočíšne bunky pri implementácii bunkových metabolických dráh. U ošípaných, ktoré sa zatiaľ zdajú byť najcitlivejším živočíšnym 127 | P a g e


May 24-25th 2012

druhom, sa prejavili účinky DON-u ako zápalové reakcie gastrointenstinálneho traktu, blokácie transportu živín a výsledné redukcie pri priberaní hmotnosti zvierat (Pestka, 2010). Všetky živočíšne druhy, ktoré boli zatiaľ preskúmané sú citlivé na DON v nasledovnom poradí: ošípané > myši > potkany > hydina ≈ prežúvavce (Prelusky et al., 1994). Bolo dokázané, že DON v granulóznych bunkách ošípaných podporoval produkciu progesterónu a expresiu proliferačných (cyklín B1, PCNA) peptidov (Medvedova et al., 2011). Aktivita enzýmu steroidogenézy (aromatáza) bola vysoko citlivá na vplyv DON-u v granulóznych bunkách, kým presný mechanizmus pôsobenia zatiaľ nebol popísaný (Ranzenigo et al., 2008). T-2 a HT-2 toxíny sú trichotecény typu-A. Základná cesta biotransformácie je deacetylácia C4 acetylovej skupiny T-2 toxínu, ktorá vedie k formovaniu metabolitu HT-2 (Bennett a Klich, 2003). V pokusoch na myšiach a potkanoch sa zistila ich cytotoxicita a zmeny v proliferácii buniek epitelu pažeráka a žalúdka. T-2 toxín indukoval hepatocelulárne a pľúcne adenómy u samcov myší. Početné bežné testy na genotoxicitu in vitro a in vivo, najmä pre klastogénny vplyv, boli pozitívne na T-2 a HT-2 toxín (Larsen et al., 2004). Z pokusov na granulóznych bunkách ošípaných bol zistený priamy vplyv T-2 toxínu na steroidogenézu a proliferáciu (Caloni et al., 2009), ako aj spomalenie dozrievania folikulov a ovuláciu (Huszenicza et al., 2000). Zearalenon (ZEA) je klasifikovaný ako nesteroidný estrogén alebo mykoestrogén, kvôli jeho štruktúre podobnej hormónu produkovanému vaječníkmi – 17β-estradiolu. Jeho špecifická štruktúra mu umožnila viazanie sa na receptory estrogénu v bunkách vaječníkov, maternice, mliečnej žľazy, hypofýzy a adenohypofýzy, čím spôsoboval výrazné klinické príznaky hyperestrogenizmu (Minervini et al., 2001). ZEA v luteinizovaných granulóznych bunkách redukoval aktivitu aromatázy, čo spôsobilo zníženie produkcie estradiolu z androsténdiolu (Whitehead a Lacey, 2003), kým v granulóznch bunkách bol zaznamenaný dávkovo-závislý efekt (Ranzenigo et al., 2008). Cieľom in vitro štúdii bolo skúmanie vplyvu vybraných fuzáriových mykotoxínov (DON-u, T-2 toxínu, HT-2 toxínu a ZEA-u) na sekréciu estradiolu granulóznymi bunkami vaječníkov ošípaných.

Materiál a metódy Príprava, Spracovanie A Kultivácia Granulóznych Buniek Vaječníky získané pri zabití zvierat (n=12) sme individuálne uskladnili v termoske s fyziologickým roztokom pri izbovej teplote a spracovali maximálne do 6 hodín od zabitia zvierat. ovariálne granulózne bunky sme izolovali metódou aspirácie zo stredne veľkých 128 | P a g e


May 24-25th 2012

folikulov (2–5 mm). suspenziu granulóznych buniek sme odstreďovali (1500 ot/min, 10 minút) za účelom oddelenia od folikulovej tekutiny s následným premývaním pomocou sterilného kultivačného média dmem/f12 1:1 (biowhittaker™, verviers, belgium) doplneného 10 % fetálnym teľacím sérom (biowhittaker™) a antibiotikom – antimykotikom (sigma, st. louis, mo, usa). pomocou hemocytometra sme počítali bunky a upravili koncentráciu buniek na potrebnú (106 buniek/ml média). Bunkovú suspenziu zriedenú kultivačným médiom sme kultivovali (37 oc, 5 % co2) na 24 jamkových kultivačných platničkách (1 ml/jamka). po 5-7 dňoch kultivácie, keď bunky vytvorili na 75 % súvislú monovrstvu, sme médium nahradili čerstvým, s rovnakými doplnkami média ako bolo pôvodné 1. bez pridania mykotoxínov (0 ng mykotoxínov) a 2. s pridaním rôznych koncentrácií mykotoxínov – don, t-2, ht-2 a zea (experimentálne skupiny): dávky 10 ng, 100 ng a 1000 NG. PO 24-HODINOVEJ kultivácii sme injekčnou striekačkou odobrali médium z kultivačných platničiek a uskladnili pri teplote –20 oc až do doby ria analýzy. Ria analýza Koncentrácie e2 boli stanovené metódou rádioimunoanalýzy (3h-RIA) V 150-200 µ L inkubačného média, podľa inštrukcií výrobcu (ciereszko et al., 1998). intra- a interkoeficienty variácie pre e2 boli 1,64 and 0,87%.

Štatistické analýzy Štatistické analýzy E2 v inkubačnom médiu bola vykonaná duplicitne. Štatistické rozdiely medzi skupinami boli hodnotené t-testom použitím štatistického programu Sigma Plot 11.0 (Jandel, Corte Madera, USA).

Výsledky a diskusia Po aplikácii mykotoxínov (DON, T-2 toxín, HT-2 toxín a ZEA) na granulózne bunky vaječníkov ošípaných neboli zaznamenané preukazné (P<0,05) rozdiely medzi kontrolnou skupinou bez pridania mykotoxínov a pokusnými skupinami (10, 100 a 1000 ng/ml) (Obrázok 1).

129 | P a g e

May 24-25th 2012


C

A 120

35

100

Estradiol release (pg/ml)


30

25

20

15

10

80

60

40

20

5 0

0 0 ng

10 ng

100 ng

0 ng

1000 ng

10 ng

100 ng

1000 ng

HT-2

DON

D 80

60

60



B 80

40

20

40

20

0

0 0 ng

10 ng

100 ng

0 ng

1000 ng

T-2

10 ng

100 ng

1000 ng

ZEA

Obrázok 1 Vplyv DON-u (A), T-2 toxínu (B), HT-2 toxínu (C) a ZEA-u (D) na uvoľňovanie estradiolu granulóznymi bunkami vaječníkov ošípaných (ng/ml). Kontrola bez prítomnosti mykotoxínov v médiu (0 ng) a pokusné skupiny: 10 ng, 100 ng, 1000 ng DON-u. RIA metóda. Figure 1: Effect of DON (A), T-2 toxin (B), HT-2 toxin (C) and ZEA (D) on estradiol release by porcine ovarian granulosa cells (ng/ml). Control group without mycotoxin addition (0 ng) and experimental groups: 10 ng, 100 ng, 1000 ng DON-u. RIA method.

Tento experiment bol vykonaný pre určenie účinku rôznych dávok DON-u, T-2 toxínu, HT-2 toxínu a ZEA-u na sekréciu estradiolu granulóznymi bunkami vaječníkov ošípaných. Pri všetkých dávkach podávaných mykotoxínov sme nezistili signifikantné rozdiely v uvoľnení estradiolu medzi pokusnými skupinami s prídavkom 10, 100 a 1000 ng/ml príslušného mykotoxínu a kontrolnou skupinou bez pridania mykotoxínov. Ranzenigo et al. (2008) zistili, že vysoké dávky DON-u (100 a 1000 ng/ml) inhibovali produkciu estradiolu, kým nižšie dávky (10 ng/ml) stimulovali produkciu estradiolu (P<0,05) indukovanú IGF-I a FSH. Dávkovo-závislý toxický efekt na steroidogenézu granulóznych buniek ošípaných zaznamenali predchádzajúci autori v prípade ťažkých kovov (Kolesarova et al, 2010). T-2 toxín a HT-2 toxín v našej štúdii nevykázali výrazné rozdiely pri uvoľňovaní

130 | P a g e


May 24-25th 2012

estradiolu medzi kontrolnou skupinou bez pridania mykotoxínov a pokusnými skupinami s prídavkami vybraných mykotoxínov: 10, 100 a 1000 ng/ml. V predchádzajúcej štúdii HT-2 toxín v dávkach 100 ng/ml a 1000 ng/ml signifikantne stimuloval (P<0,05) sekréciu progesterónu (Maruniaková et al., 2010). Caloni et al. (2009) zistili pri nižších dávkach T-2 toxínu (3, 30 a 300 ng/ml) výraznú inhibíciu uvoľňovania estradiolu granulóznymi bunkami (P<0,05) indukovanú IGF-I a FSH. Maruniaková et al. (2010) uvádzajú zvýšenú sekréciu progesterónu pri dávke 1000 ng/ml T-2 toxínu. V predchádzajúcich štúdiách bolo zaznamenané zvýšené uvoľňovanie estradiolu v granulóznych bunkách po podaní ZEA-u v dávkach 30 a 300 ng/ml (Ranzenigo et al., 2008). Vplyv rôznych dávok mykotoxínov (DON, T-2 toxín, HT-2 toxín a ZEA) na granulózne bunky je doposiaľ nedostatočne preskúmaný a nie sú dostatočne vysvetlené bunkové a molekulárne mechanizmy vstupu týchto mykotoxínov do živočíšnych tkanív. Na základe tejto skutočnosti je potrebné realizovať ďalšie experimenty v smere steroidogenézy v ovariálnych bunkách pre detailnejšie objasnenie mechanizmu účinkov vybraných mykotoxínov.

Záver Na záver, výsledky našej práce nenaznačujú priamy vplyv vybraných mykotoxínov (DON, T-2 toxín, HT-2 toxín a ZEA) v dávkach 10, 100 a 1000 ng/ml na uvoľňovanie estradiolu granulóznymi bunkami ošípaných. Z predchádzajúcich štúdií vyplýva, že purifikované mykotoxíny môžu byť menej toxické ako prírodne sa vyskytujúce v potravinách, čo naznačuje ich synergické pôsobenie. Otázne je, či príjem kombinácií mykotoxínov môže predstavovať podstatne vyššie riziko ako príjem každého z týchto mykotoxínov osobitne. Z tohto dôvodu by prítomnosť mykotoxínov mala byť prísne monitorovaná v krmivách a potravinách, lebo škodlivé účinky DON-u, T-2 toxínu, HT-2 toxínu a ZEA-u môžu ovplyvňovať reprodukčné procesy ovplyvňovaním folikulogenézy ošípaných.

Použitá literatúra Bennett, J.W., Klich, M. Mycotoxins. C. M. R., 2003, 16 (3), 497-516. Caloni, F., Ranzenigo, g., Cremonesi, F., Spicer, J.L. Effects of a trichothecene, T-2 toxin, on proliferation and steroid production by porcine granulosa cells. Toxicon, 2009, 54, 337344. Ciereszko, R.E., Petroff, B.K., Ottobre, A.C., Guan, Z., Stokes, B.T., Ottobre, J.S. Assesment of the mechanism by which prolactin stimulates progesterone production by early corpora lutea of pigs. J. Endocrinol., 1998, 159, 201-209.

131 | P a g e


May 24-25th 2012

Huszenicza, G., Fekete, S., Szigeti, G., Kulcsar, M., Febel, H., Kellems, R.O., Nagy, P., Cseh, S., Veresegyhazy, T., Huilar, I. Ovarian consequences of low dose peroral fusarium (T-2) toxin in a ewe and heifer model. Theriogenology, 2000, 53, 1631-1639. Kolesarova, A., Roychoudhury, S., Slivkova, J., Sirotkin, A.V., Capcarova, M., Massanyi, P. In vitro study on the effect of lead and mercury on porcine ovarian granulosa cells. J. Environ. Sci. Health B, 2010, 45, 320-331. Larsen, J.Ch., Hunt, J., Perrin, I., Ruckenbauer, P. Workshop on trichothecenes with a focus on DON: summary report. Toxicol. Lett., 2004,153, 1-22. Maruniaková, N., Medveďová, M., Kolesárová, A., Capcarová, M., Sirotkin, A.V., Bulla, J. The effect of T-2 toxin, HT-2 toxin and deoxynivalenol of the secretion activity of porcine ovarian granulosa cells. Proceedings of International Ph.D. Students Conference, November 24th, 2010, Brno. - Brno : Mendelova univerzita, 2010. - ISBN 978-80-7375453-2. - S. 917-924 Medvedova, M., Kolesarova, A., Capcarova, M., Labuda, R., Sirotkin A.V. Kovacik, J., Bulla, J. the effect of deoxynivalenol on the secretory activity, proliferation and apoptosis of porcine ovarian granulosa cells in vitro. J. Environ. Sci. Health B, 2011, 46 (3), 213219. Minervini, F., Dell’ Aquila, M.E., Maritato, F., Minoia, P. Visconti, A. Toxic effects of the mycotoxin zearalenone and its derivates on in vitro maturation of bovine oocytes and 17βestradiol levels in mural granulosa cell cultures. Toxicol. In Vitro, 2001, 15, 489-495. Pestka, J.J. Deoxynivalenol: mechanisms of action, human exposure, and toxicological relevance. Arch. Toxicol., 2010, 84, 664-679. Pestka, J.J. Deoxynivalenol: Toxicity, mechanisms and animal health risks. Anim. Feed Sci. Technol., 2007, 137, 283-298. Prelusky, D.B., Gerdes, R.G., Underhill, K.L. Rotter, B.A., Jui, P.Y., Trenholm, H.L. Effects of low-level dietary deoxynivalenol on haematological and clinical parameters of the pig. Nat. Toxins, 1994, 2, 97-104. Ranzenigo, G., Caloni, F., Cremonesi, F., Aad, Z.P., Spicer, J.L. Effects of Fusarium mycotoxins on steroid production by porcine granulosa cells. Anim. Reprod. Sci., 2008, 107, 115-130. Whitehead, S.A., Lacey, M. Phytoestrogens inhibit aromatase but not 17 β-hydroxisteroid dehydrogenase (HSD) type 1 in human granulosa-lutheal cells: evidence for FSH induction of 17 β-HSD. Hum. Reprod., 2003, 18 (3), 487-494.

132 | P a g e

May 24-25th 2012


HUMAN UMBILICAL VEIN ENDOTHELIAL CELLS IN PHYSIOLOGY RESEARCH Moravčík, R., Kováčová, E., Zeman, M. Department of Animal Physiology and Ethology, Faculty of Natural Sciences, Comenius University in Bratislava

Abstract The vascular system is a highly branched network of endothelium-lined tubes that provides all tissues with crucial nutrients and respiratory gasses. Most of the vasculature is formed by the process known as angiogensis. In adults, the process is stimulated mainly by tissue hypoxia via activation of hypoxia inducible factor 1α (HIF-1α). Peroxizome proliferator activated receptors (PPARs) are implicated in most molecular mechanisms that control angiogensis. PPARs belong to a group of three nuclear receptor isoforms consisting of PPARα, PPARβ/δ and PPARγ. These isoforms have important roles in the control of glucose and fatty acid metabolism and were found to be expressed in endothelial cells. In our experiments the selective PPARα agonist WY-14 643 inhibited migration and proliferaton of human endothelial cells in the wound healing assay. The inhibition was dose dependent, suggesting specificity of this substance. Molecular mechanisms of inhibition will be analysed in further experiments.

Úvod Vaskulárny systém je vysoko rozvetvená sieť endotelom potiahnutých tubulov, ktoré zabezpečujú rozvádzanie živín a respiračných plynov do všetkých tkanív a odvádzanie metabolitov z organizmu. Veľká časť vaskulatúry je tvorená procesom zvaným angiogenéza (Wacker a Gerhardt, 2011). Je to fyziologický proces zahŕňajúci rast nových ciev z preexistujúcej vaskulatúry (Carmeliet, 2005). U dospelých jedincov je angiogenéza stimulovaná najmä tkanivovou hypoxiou prostredníctvom hypoxiou indukovaného faktora 1 (HIF-1), ktorý slúži ako transkripčný faktor pre množstvo génov podieľajúcich sa na angiogenéze a prežívaní buniek. Medzi najvýznamnejšie patria gény pre vaskulárny endotelový faktor (VEGF), pre VEGF receptory 1 a 2 (VEGFR-1,-2) a angiopoetín 2 (Conway et al., 2001). V posledných rokoch stúpa množstvo poznatkov o zapojení peroxizómovým proliferátorom aktivovaných receptorov (PPAR) do molekulárnych mechanizmov, ktoré

133 | P a g e


May 24-25th 2012

regulujú angiogenézu prostredníctvom stimulácie rastových faktorov a cytokínov. Tie stimulujú migráciu, proliferáciu a prežívanie endotelových buniek (Biscetti et al., 2008; Goetze et al., 2002). Peroxizómovým proliferátorom aktivované receptory (PPAR) patria do superrodiny jadrových receptorov, ktoré pozostávajú z troch izoforiem PPARα, β/δ a γ (Kliewer et al., 2001). PPARα je prednostne exprimovaný v metabolicky aktívnych tkanivách ako je pečeň, srdce, obličky, kostrové svalstvo, ale vo veľkej miere sa nachádza aj vo vaskulárnom endotelovom tkanive a hladkej svalovine ciev. Zúčastňuje sa na β-oxidácii mastných kyselín (Biscetti et al., 2009). PPARβ/δ je všadeprítomný, ale vo väčšej miere sa tvorí v črevách, epidermis, placente, kostrovom svalstve a tukovom tkanive. Posledná izoforma PPARγ sa tvorí najmä v tukovom tkanive a podieľa sa na adipogenéze a glukózovej homeostáze (Wang et al., 2011). Všetky tri PPARα, PPARβ/δ aj PPARγ izoformy sú značne exprimované v endotelových bunkách, kde regulujú ich proliferáciu, angiogenézu, zápalové procesy či trombózu a koaguláciu (Bishop-Bailey, 2011). Všetky PPAR izoformy majú veľkú a flexibilnú ligand viažucu doménu, ktorá umožňuje ich aktiváciu veľkým množstvom mastných kyselín a eikosanoidov in vitro. Okrem nich sú PPAR aktivované aj množstvo synteticky pripravených ligandov. Medzi ne patria napríklad klinicky používané dislipidemické liečivá, fibráty (gemfibrozil, fenofibrát, bezafibrát a ciprofibrát), alebo thiazolidinediony (rosiglitazon, pioglitazón a troglitazon), používané ako inzulín senzitizujúce liečivá. Sú to vysoko selektívni PPARα, PPARγ agonisti (Bishop-Bailey, 2000). Fenofibrát ako klinicky používaný PPARα agonista spôsobuje inhibíciu angiogenézy v in vitro podmienkach. Inhibuje proliferáciu, migráciu a tvorbu kapiláram podobných štruktúr ľudských dermálnych endotelových buniek in vitro prostrednístvom disrupcie cytoskeletu a inhibície faktora Akt významného pre prežívanie endotelových buniek (Varet et al., 2003). Okrem fenofibrátu aj selektívny PPARα agonista WY 14 643 preukázal význam inhibície, proliferácie, migrácie a tvorbe kapiláram podobných štruktúr (Varet et al., 2003). Po aplikácii PPAR agonistov bola navyše pozorovaná inhibícia VEGF indukovanej aktivácie Akt u ľudských pupočníkových endotelových buniek (HUVEC) in vitro (Goetze et al., 2002). Predpokladá sa, že aktivácia PPARγ znižuje proangiogénnu odpoveď na pôsobenie VEGF prostredníctvom zníženie transkripcie receptoru VEGFR-2 (Sassa et al., 2004). Okrem toho agonisti PPARγ môžu inhibovať angiogenézu aj indukciou apoptózy endotelových buniek (Bishop-Bailey a Hla, 1999).

134 | P a g e

May 24-25th 2012


Niektoré štúdie naznačujú, že PPAR môžu mať okrem antiangiogénnych, aj proangiogénne vlastnosti. Obe izoformy PPARα aj PPARγ môžu byť zapojené do molekulárnych mechanizmov, ktoré regulujú angiogenézu prostredníctvom stimulácie rastových faktorov a cytokínov, ktoré stimulujú migráciu, proliferáciu a prežívanie endotelových buniek (Biscetti et al.,2008). Preto cieľom našej práce bolo študovať vplyv selektívneho PPARα agonistu WY 14 643 na migračnú a proliferačnú aktivitu ľudských endotelových buniek metódou obnovy poškodenej monovrstvy (wound healing).

Materiál a metódy V experimentoch

sme

používali

primárne

kultúry ľudských

pupočníkových

endotelových buniek (HUVEC), izolovaných z ciev ľudských pupočníkov, ktoré nám v rámci spolupráce poskytla firma Eurocord Bratislava. Bunky sme izolovali modifikovanou metódou podľa Jaffe et al., 1979 natrávením umbilikálnej vény pomocou kolagenázy NB 4 (7 mg/ml; Serva, Nemecko). Vyizolované bunky sme pestovali v kultivačných fľašiach v komerčne dostupnom médiu pre endotelové bunky (ECGM-Endothelial Cell Growth Medium; PromoCell, Nemecko) obsahujúcom suplementy (SupplementMix) a antibiotiká: gentamicín (5 µg/ml), penicilín (100 U/ml) a streptomycín (100 µg/ml). Kultivácia prebiehala v programovateľnom CO2 termostate Heareus B 5060 (Heraeus, Nemecko) so zvlhčenou atmosférou obsahujúcou 5% CO2 pri teplote 37°C. Migračnú a proliferačnú aktivitu HUVEC buniek sme testovali sledovaním obnovy poškodenej monovrstvy buniek podľa Martinez-Poveda et al., 2005. Suspenziu endotelových buniek v kompletnom ECGM (pasáž 2-7) sme nanášali na 24 jamkové platničky (TPP, Švajčiarsko) potiahnuté 1,5% želatínou v objeme 500 µl na jamku (100000 buniek/ml) a kultivovali v termostate do dosiahnutia 80% konfluencie. Po vyrastení monovrstvy sme na 17 hodín vymenili kompletné ECGM za hladovacie médiu, pozostávajúce z ECGM bez suplementov len s 2% obsahom inaktivovaného teľacieho séra (ITS; PAA Laboratories, Rakúsko), 5 IU/ml heparínu (Serva, Nemecko) a antibiotikami. Následne sme monovrstvu buniek poškodili sterilnou špičkou pipety, odstránili hladovacie médium a poškodenú monovrstvu premyli v PBS. K premytým bunkám sme pridávali v hladovacom médiu rozpustenú testovanú látku (WY 14 643) v koncentráciách 10-3, 10-4 a 10-5 mol.l-1 v prítomnosti alebo neprítomnosti VEGF (40 ng/ml). Kontrolu predstavovali bunky kultivované v hladovacom médiu s 0,08% dimetylsulfoxidom (rozpúšťadlo pre WY-14 643) 135 | P a g e


May 24-25th 2012

v prítomnosti alebo neprítomnosti VEGF (40 ng/ml). Sledované zmeny obnovy poškodenej monovrstvy s rastúcim časovým interevalom v závislosti od koncentrácie sledovanej látky sme pozorovali invertovaným optickým mikroskopom Olympus IMT 2 (Olympus, Japonsko) a fotografovali kamerovým systémom Moticam 1000 (Motic Incorporation, Hong Kong) v časovách intervaloch 0, 6, 9 a 24 hodín. Získané fotografie sme vyhodnocovali v programe Motic Images plus 2.0 ML (Motic Incorporation) a štatisticky spracovali pomocou t-testu.

Výsledky a diskusia Intenzita zarastania poškodenej monovrstvy endotelových buniek je znázornená na obr. 1. Selektívny agonista PPARα WY-14 643 najvýraznejšie inhibuje migráciu a proliferáciu HUVEC buniek v koncentrácii 10-3 mol.l-1 a to aj napriek stimulačnému účinku VEGF v koncentrácii 40 ng/ml. Koncentračnú závislosť inhibície WY-14 643 môžeme sledovať aj v bunkách, ktoré neboli stimulované pomocou VEGF.

Obrázok 1 The intensity of HUVEC migration and proliferation after 9 hours. Intenzita zarastania poškodenej monovrstvy HUVEC buniek v časovom intervale 9 hodín po poškodení. Bunky boli predkultivované v kompletnom ECGM a následne na 17 hodín hladované v ECGM bez suplementov s 2% obsahom ITS a 5 IU/ml heparínu. Do hladovacieho média bola pridaná aj testovaná látka WY-14 643 v koncentráciách 10-3, 10-4 a 10-5 mol.l-1 v prítomnosti alebo neprítomnosti VEGF (40 ng/ml). Kontrolu predstavovalo hladovacie médium s 0,08% obsahom dimetylulfoxidu v prítomnosti alebo neprítomnosti VEGF (40 ng/ml). (*, ◦ p‒ 0,05). Z obrázku taktiež vyplýva, že WY-14 643 v koncentráciách 10-4 a 10-5 mol.l-1 neinhibuje bunky stimulované pomocou VEGF (obr. 2). To môže byť spôsobené tým, že VEGF dokáže obísť signálne dráhy, ktoré sú inhibované pomocou WY-14 643.

136 | P a g e

May 24-25th 2012


300 µm

300 µm

A B Obrázok 2 Migration and proliferation of HUVEC in time 9 hours after scratching. Zarastanie poškodenej monovrstvy HUVEC buniek v čase 9 hodín od poškodenia po pôsobení WT-14 643 v koncentrácii (A) 10-3 mol.l-1, (B) 10-4 mol.l-1. Bunky boli stimulované 40 ng/ml VEGF. Vzorky boli pozorované optickým mikroskopom Olympus IMT 2 s fázovým kontrastom a kamerovým systémom Moticam 1000 pri zväčšení (40x). Záver Selektívny agonista PPARα WY-14 643 inhiboval migráciu a proliferáciu ľudských endotelových buniek na modeli zarastania poškodenej monovrstvy. Inhibícia bola závislá od dávky, čo naznačuje špecifickosť účinku tejto látky. Molekulové mechanizmy účinku budú podrobnejšie analyzované v ďalších experimentoch. Poďakovanie: Práca bola podporená grantom VEGA 1/0686/12.

Použitá literatúra Biscetti, F., Gaetani, E., Flex, A., Aprahamian, T., Hopkins, T., Straface, G., Pecorini, G., Stigliano, E., Smith, R.C., Angelini, F., Castellot, J.J. Jr., Pola, R. Selective activation of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)alpha and PPAR gamma induces neoangiogenesis through a vascular endothelial growth factor-dependent mechanism. Diabetes. 2008, 57, 1394-404. Biscetti, F., Straface, G., Pitocco, D., Zaccardi, F., Ghirlanda, G., Flex, A. Peroxisome proliferator-activated receptors and angiogenesis. Nutr. Meta. Cardiovasc. Dis. 2009, 19, 751-9. Bishop-Bailey, D. Peroxisome proliferator-activated receptors in the cardiovascular system. Br. J. Pharmacol. 2000, 129, 823-34. Bishop-Bailey, D. PPARs and angiogenesis. Biochem. Soc. Trans. 2011, 39, 1601-5. Bishop-Bailey, D., Hla, T. Endothelial cell apoptosis induced by the peroxisome proliferatoractivated receptor (PPAR) ligand 15-deoxy-Delta12, 14-prostaglandin J2. J. Biol. Chem. 1999, 274, 17042-8. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 2005, 38, 932-6. Conway, E.M., Collen, D., Carmeliet, P. Molecular mechanisms of blood vessel growth. Cardiovasc. Res. 2001, 49, 507-21. Goetze, S., Eilers, F., Bungenstock, A., Kintscher, U., Stawowy, P., Blaschke, F., Graf, K., Law, R.E., Fleck, E., Gräfe, M. PPAR activators inhibit endothelial cell migration by targeting Akt. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, 293, 1431-7.

137 | P a g e


May 24-25th 2012

Jaffe, E.A., Nachman, R.L., Becker, C.G., Minick, C.R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. The J. Clin. Invest. 1973, 52, 2745-2756. Kliwier, S.A., Xu, H.E., Lambert, M.H., Willson, T.M. Peroxisome proliferator-activated receptors: from genes to physiology. Recen.t Prog. Horm. Res. 2001, 56, 239-263. Martinez-Poveda, B. Quesada, A.R. Medina, M.A. Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro. Eur. J. Pharmacol. 516, 97-103. Sassa, Y., Hata, Y., Aiello, L.P., Taniguchi, Y., Kohno, K., Ishibashi, T. Bifunctional properties of peroxisome proliferator-activated receptor gamma1 in KDR gene regulation mediated via interaction with both Sp1 and Sp3. Diabetes. 2004, 53, 1222-9. Varet, J., Vincent, L., Mirshahi, P., Pille, J.V., Legrand, E., Opolon, P., Mishal, Z., Soria, J., Li, H., Soria, C. Fenofibrate inhibits angiogenesis in vitro and in vivo. Cell. Mol. Life Sci. 2003 Apr;60(4):810-9. Wacker, A., Gerhardt, H. Endothelial development taking shape. Curr. Opin. Cell Biol. 2011, 23, 676-85. Wang, N., Yin, R., Liu, Y., Mao, G., Xi, F. Role of peroxisome proliferator-activated receptor-γ in atherosclerosis: an update. Circ. J. 2011, 75, 528-35.

138 | P a g e


May 24-25th 2012

DIFFERENTIAL DEPOSITION OF YOLK TESTOSTERONE IN THE SECOND LAYING CYCLE DEPENDS ON FEMALE QUALITY IN JAPANESE QUAIL Okuliarová, M.,1 Škrobánek, P.,2 Zeman, M.1,2 1

Katedra živočíšnej fyziológie a etológie, Prírodovedecká fakulta UK, Bratislava

2

Ústav biochémie a genetiky živočíchov, SAV, Ivanka pri Dunaji, Slovenská republika

Abstract Egg yolk contains diverse maternally-derived signal compounds, among which yolk androgens have been shown to produce distinct inter- and intra- female variations. As most studies deal with maternal hormone deposition over one breeding season, limited data refer to inter-seasonal changes of yolk hormones. In the current study, we investigated the deposition of yolk testosterone (T) across two laying cycles in Japanese quail divergently selected low (LET line) and high (HET line) egg T concentrations. We measured yolk and plasma T levels and egg quality characteristics at the end of the first and at the beginning of the second laying cycle after the induced moult. Our results demonstrated consistent line differences in egg T in both cycles. The increase of yolk T deposition in the HET but not LET quail in the second laying cycle suggests that genetically-determined differences in maternal hormones can influence the responsiveness to rejuvenation processes and an ability of mothers to program development of their progeny over two reproductive seasons. Úvod Embryonálny vývin vtákov prebieha mimo tela matky v prostredí chránenom vajcovou škrupinou a s vopred definovaným zložením, ktoré zahŕňa nielen esenciálne živiny, ale aj početné signálne molekuly. Z tohto dôvodu predstavujú vtáky ideálny model na štúdium trans-generačných maternálnych účinkov sprostredkovaných depozíciou biologicky aktívnych látok do žĺtka, predovšetkým hormónov, vitamínov, antioxidantov a protilátok (Schwabl, 1993; Grindstaff et al., 2003). Podľa jednej z východiskových predikcií samica môže týmto spôsobom ovplyvňovať fenotypovú plasticitu svojho potomstva v zmysle adaptívneho prispôsobenia podmienkam prostredia očakávaným po vyliahnutí (Mousseau a Fox, 1998). Koncentrácie androgénov v žĺtku sa vyznačujú výraznou vnútrodruhovou variabilitou, ktorej zdrojom je pôsobenie viacerých environmentálnych a sociálnych faktorov prostredia (Gil, 2008), ako aj samotný genotyp samice (Okuliarova et al., 2009; Tschirren et al., 2009). Divergentná selekcia prepelice japonskej (Coturnix japonica) na obsah testosterónu vo vajci

139 | P a g e


May 24-25th 2012

experimentálne dokázala na základe vysokej heritability, že gény vysvetľujú najmenej polovicu celkovej fenotypovej variability v hladinách žĺtkových androgénov (Okuliarova et al., 2011). Popri vysokých inter-individuálnych rozdieloch však existuje aj nezanedbateľná intra-individuálna variabilita v depozícii maternálnych androgénov do vajca, ktorá bola popísaná najmä u altriciálnych vtákov v súvislosti s pozíciou vajca v násade (Schwabl, 1993) a s poradím násady v rámci hniezdnej sezóny (Tobler et al., 2007). U prekociálnej prepelice japonskej koncentrácie testosterónu v žĺtku klesajú s narastajúcim vekom samice, respektíve počas prvého znáškového cyklu (Okuliarova et al., 2009), čo pravdepodobne súvisí s poklesom hladín luteinizačného hormónu a citlivosti adenohypofýzy na gonádotropín uvoľňujúci hormón (Ciccone et al., 2005). V doposiaľ publikovanej literatúre sú iba okrajové údaje týkajúce sa variability maternálnych hormónov vo vajci medzi dvoma reprodukčnými sezónami, aj keď tieto poznatky môžu byť dôležité nielen z ekologického hľadiska pre dlho žijúce vtáky, ale aj z hľadiska praxe v komerčných chovoch hydiny. Preto cieľom našej štúdie bolo analyzovať zmeny v depozícii maternálneho testosterónu do žĺtka medzi dvoma znáškovými cyklami prepelice japonskej. Túto medzisezónnu variabilitu sme hodnotili aj v závislosti od geneticky podmienených rozdielov v depozícii maternálnych hormónov do vajca s využitím dvoch línií prepelíc selektovaných na nízke (LET) a vysoké (HET) koncentrácie testosterónu v žĺtku. Okrem žĺtkového testosterónu sme merali hladiny testosterónu v plazme samíc, ako aj základné charakteristiky kvality vajec (hmotnosti, vajca, žĺtka a škrupiny) na konci prvého a na začiatku druhého znáškového cyklu.

Materiál a metodika Zvieratá a priebeh experimentu Použili sme dospelé prepelice japonské zo štvrtej filiálnej generácie LET a HET línií selektovaných na obsah testosterónu vo vajcovom žĺtku (Okuliarova et al., 2011). Do pokusu bolo zaradených 8 LET a 8 HET samíc, ktoré boli umiestnené v individuálnych klietkach so samcom z rovnakej línie. Prepelice boli chované pri svetelnom režime 14 hodín svetlo (L) a 10 hodín tma (D), s voľným prístupom k vode a krmivu. Na konci prvého znáškového cyklu (vek 46 týždňov) vykazovali prepelice pravidelnú znášku vajec, pričom od každej samice sme použili 2 vajcia na analýzy. Druhý znáškový cyklus sme indukovali núteným pŕchnutím prepelíc. Samice boli vystavené inhibičnej fotoperióde 8L:16D po dobu 2 týždňov. Zároveň sme zvieratám odobrali krmivo na prvých 24 hodín. Táto procedúra prerušila znášku vajec u 6 LET a 7 HET samíc. 140 | P a g e


May 24-25th 2012

Následne boli prepelice opätovne vystavené režimu 14L:10D. Šesť samíc z každej línie obnovilo pravidelnú znášku vajec po 4 týždňoch od vystavenia stimulačnej fotoperióde. Vajcia znesené počas nasledovných 6 dní druhého znáškového cyklu sme použili na analýzy. Najskôr sme odmerali základné parametre kvality vajec (hmotnosti vajca, žĺtka a škrupiny). Žĺtka sme po odvážení zhomogenizovali a uskladnili pri -20°C do analýzy testosterónu. Krv na analýzu testosterónu sme odoberali z podkrídlovej žily počas prvého znáškového cyklu (vek 38 týždňov), 11 deň vystavenia prepelíc inhibičnej fotoperióde a počas druhého znáškového cyklu (5 týždňov po obnovení stimulačnej fotoperiódy).

Stanovenie koncentrácií testosterónu Testosterón sme najskôr extrahovali zo žĺtka zmesou rozpúšťadiel dietyléter/petroléter (7:3) na kolónkach vyplnených absorpčným materiálom Extrelut® NT (Merck, Darmstadt, Nemecko) podľa postupu Okuliarova et al., (2009). Koncentrácie T v extraktoch a plazme sme stanovili rádioimunologickou metódou validovanou v našom laboratóriu (Zeman et al., 1986). Použili sme [1,2,6,7-3H]-testosterón (3,52 TBq/mmol, 95,0 Ci/mmol, Amersham Biosciences, Veľká Británia) a špecifickú protilátku pripravenú imunizáciou králika testosterónom naviazaným v pozícii 3 cez karboxymetyloxím na hovädzí sérový albumín. Všetky vzorky boli odmerané v 4 stanoveniach s priemerným variačným koeficientom v rámci stanovenia 4,0 % a variačným koeficientom medzi stanoveniami 5,2%. Citlivosť merania predstavovala 2,16 pg na skúmavku.

Štatistická analýza Získané údaje o parametroch kvality vajec a hladinách testosterónu v žĺtku sme spriemerovali pre jednotlivé samice samostatne pre prvý a druhý znáškový cyklus. Dáta pre koncentráciu a obsah testosterónu v žĺtku sme upravili logaritmickou transformáciou, aby spĺňali podmienku normálneho rozdelenia a homogenity rozptylov. Dáta sme štatisticky vyhodnotili analýzou rozptylu s opakovaním, v ktorej sme použili medziskupinový faktor línia (LET/ HET), vnútroskupinový faktor znáškový cyklus (prvý/druhý) a ich vzájomnú interakciu. Rozdiely medzi skupinami sme analyzovali pomocou LSD post hoc testov.

Výsledky Koncentrácie testosterónu v plazme samíc neboli ovplyvnené líniou (F(1,10)=0.14; p=0.713), znáškovým cyklom (F(1,10)=1.09; p=0.322) ani interakciou medzi faktormi (F(1,10)=0.70; p=0.422). Priemerné hodnoty plazmatických hladín testosterónu sa pre LET 141 | P a g e

May 24-25th 2012


a HET samice pohybovali na úrovni 523 ± 61 a 754 ± 178 pg/ml v prvom znáškovom cykle a 497 ± 48 a 582 ± 175 pg/ml v druhom znáškovom cykle. Koncentrácie testosterónu v žĺtku boli podľa očakávania vyššie v HET ako v LET línii (F(1,10)=29.14; p<0.001). Ďalej sme zistili signifikantnú interakciu medzi líniou a znáškovým cyklom (F(1,10)=14.64; p<0.01). Post hoc analýza ukázala, že koncentrácie testosterónu v žĺtku sa zvýšili medzi prvým a druhým znáškovým cyklom v HET línii (p<0.01), zatiaľ čo skôr opačný trend sme zaznamenali v LET línii (Tab. 1). Rovnaký výsledok ako pre koncentrácie žĺtkového testosterónu sme zistili aj analýzou celkového obsahu testosterónu v žĺtku (línia: F(1,10)=36.21, p<0.001; znáškový cyklus: F(1,10)=1.21, p=0.298 a interakcia: F(1,10)=12.99, p<0.01) (Tab. 1). Tab 1 Koncentrácie a obsah testosterónu v žĺtku (priemer ± SEM) počas prvého a druhého znáškového cyklu 2 línií prepelíc japonských selektovaných na nízke (LET, n=6) a vysoké (HET, n=6) koncentrácie testosterónu v žĺtku. Vertikálne p-hodnoty vyjadrujú post hoc porovnanie medzi cyklami, horizontálne p-hodnoty porovnanie medzi líniami. (Yolk testosterone concentrations and content (mean ± SEM) during the first and second laying cycle in 2 lines of Japanese quail selected for low (LET, n=6) and high (HET, n=6) yolk testosterone concentrations. Differences between laying cycles and lines are expressed by vertical and horizontal p-values, respectively.) Koncentrácie testosterónu [pg/ mg žĺtka]

Obsah testosterónu [ng/ žĺtok]

Prvý cyklus

Druhý cyklus

p-hodnota

Prvý cyklus

Druhý cyklus

p-hodnota

LET línia

8,1 ± 0,5

7,2 ± 0,7

ns

22,1 ± 1,7

18,7 ± 2,1

ns

HET línia

15,1 ± 2,0

21,7 ± 3,9

p < 0.01

41,1 ± 3,7

60,8 ± 10,2

p < 0.01

p-hodnota

p < 0.05

p < 0.001

p < 0.05

p < 0.001

Hmotnosť vajca aj hmotnosť žĺtka sa nezmenili v druhom znáškovom cykle v oboch líniách (F(1,10)=0.01; p=0.935; F(1,10)=0.11; p=0.752) (Tab. 2) a rovnako sme v týchto parametroch nezaznamenali ani rozdiely medzi líniami (F(1,10)=2.01; p=0.186; F(1,10)=1.25; p=0.290) (Tab. 2). Hmotnosť škrupiny sa znížila medzi prvým a druhým znáškovým cyklom v oboch líniách (F(1,9)=9.01; p<0.05; Tab. 2), pričom HET prepelice znášali vajcia s ťažšou škrupinou v porovnaní s LET samicami (F(1,9)=7.90; p<0.05) bez interakcie so znáškovým cyklom. Tabuľka 2 Parametre kvality vajec (priemer ± SEM) počas prvého a druhého znáškového cyklu 2 línií prepelíc japonských selektovaných na nízke (LET, n=6) a vysoké (HET, n=6)

142 | P a g e

May 24-25th 2012


koncentrácie testosterónu v žĺtku. (Table 2 Egg quality parameters (mean ± SEM) during the first and second laying cycle in 2 lines of Japanese quail selected for low (LET, n=6) and high (HET, n=6) yolk testosterone concentrations.) Hmotnosť vajca [g]

Hmotnosť žĺtka [g]

Hmotnosť škrupiny [g]

Prvý cyklus

Druhý cyklus

Prvý cyklus

Druhý cyklus

Prvý cyklus

Druhý cyklus

LET línia

8,92 ± 0,30

8,91 ± 0,24

2,72 ± 0,13

2,59 ± 0,06

0,774 ± 0,020 0,734 ± 0,017

HET línia

9,50 ± 0,34

9,47 ± 0,40

2,80 ± 0,17

2,85 ± 0,15

0,874 ± 0,028 0,821 ± 0,029

Záver Prezentované výsledky demonštrujú vysoko konzistentné rozdiely v hladinách žĺtkového testosterónu medzi LET a HET líniami prepelíc pretrvávajúce v druhom znáškovom cykle. Obdobie reprodukčnej inaktivity počas vystavenia inhibičnej fotoperióde je spojené s rejuvenáciou hypotalamo-hypofýzo-gonadálnej (HPG) osi, ktorá vedie po opätovnom vystavení stimulačnej fotoperióde k zvýšeniu gonádotropínov v plazme a obnoveniu produkcie vajec v druhom znáškovom cykle (Sharp et al., 1992). Preto zvýšenie koncentrácií žĺtkového testosterónu v druhom cykle HET samíc môže odrážať ich vyššiu odpovedateľnosť HPG osi v porovnaní s LET samicami. Navyše, geneticky determinovaná variabilita v depozícii maternálnych hormónov do vajca môže ovplyvňovať reprodukčnú úspešnosť samice a jej schopnosť prispôsobiť vývin potomstva medzi dvoma reprodukčnými sezónami. Poďakovanie Práca bola podporená grantmi APVV 0047-10 a VEGA 1/0686/12. Použitá literatúra Ciccone, N.A., Sharp, P.J., Wilson, P.W., Dunn, I.C. Changes in reproductive neuroendocrine mRNAs with decreasing ovarian function in ageing hens. Gen. Comp. Endocr., 2005, 144, 20-27. Gil, D. Hormones in avian eggs: Physiology, ecology and behavior. Adv. Stud. Behav., 2008, 38, 337-398. Grindstaff, J.L., Brodie, E.D., Ketterson, E.D. Immune function across generations: integrating mechanism and evolutionary process in maternal antibody transmission. P. Roy. Soc. Lond. B Bio., 2003, 270, 2309-2319. Mousseau, T.A., Fox, C.W. The adaptive significance of maternal effects. Trends Ecol. Evol., 1998, 13, 403-407. Okuliarova, M., Groothuis, T.G.G., Skrobanek, P., Zeman, M. Experimental evidence for genetic heritability of maternal hormone transfer to offspring. Am. Nat., 2011, 177, 824834. Okuliarova, M., Skrobanek, P., Zeman, M. Variability of yolk testosterone concentrations during the reproductive cycle of Japanese quail. Comp. Biochem. Physiol. A, 2009, 154, 530-534.

143 | P a g e


May 24-25th 2012

Sharp, P.J., Dunn, I.C., Cerolini, S. Neuroendocrine control of reduced persistence of egg laying in domestic hens: evidence for the development of photorefractoriness. J. Reprod. Fertil., 1992, 94, 221-235. Schwabl, H. Yolk is a source of maternal testosterone for developing birds. P. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 11446-11450. Tobler, M., Granbom, M., Sandell, M. Maternal androgens in the pied flycatcher: timing of breeding and within female consistency. Oecologia, 2007, 151, 731-740. Tschirren, B., Sendecka, J., Groothuis, T.G.G., Gustafsson, L., Doligez, B. Heritable variation in maternal yolk hormone transfer in a wild bird population. Am. Nat., 2009, 174, 557-564. Zeman, M., Kosutzky, J., Bobakova, E. Testosterone concentration in the seminal plasma of cocks. Brit. Poultry Sci., 1986, 27, 261-266.

144 | P a g e

May 24-25th 2012


THE EFFECT OF SUPPLEMENTATION OF DIFFERENT FORMS OF COPPER ON THE GROWTH INTENSITY AND THE CONCENTRATION OF COPPER AND ZINC IN THE BODY OF KIDS

Pechová, A., Pavlata, L., Hauptmanová, K., Zvonareva, E., Husáková, T., Dvořák, R. Ruminant and Swine Clinic, Faculty of Veterinary Medicine, University of Veterinary and Pharmaceutical Scinces Brno

Abstract The aim of this trial was to compare the effect

of supplementation of kids with

different forms of copper on growth intensity and body reserves of copper and zinc in the body after 2 month of supplementation. In this trial we used 26 kids that were divided into 3 groups. Group C (n=10) was control, group Cu-I (n=10) was given inorganic form (copper sulfate CuSO4.5H2O) and group Cu-O (n=6) was given organic form (Bioplex Cu, Alltech). Different number of the kids in individual groups was due to different count of kids from goats. Mothers were supplemented during pregnancy till the time of weaning with the same form of copper. After weaning the kids from groups Cu-I and Cu-O were supplemented with copper for 2 month with daily dose 7.5 – 10.5 mg per day. The amounts of Cu was increased during the experiment according the body weight; in average kids received 0.4 mg/kg BW daily. The natural content of the copper in the feed mixture was 5 mg/kg and supplemented Cu in different forms was 30 mg/kg of feed mixture. After 2 month of supplementation kids were slaughtered and the samples of liver, pancreas, spleen, myocardium, lungs, kidney, thigh muscle and tongue were taken for the assessment of Cu and Zn, which was measured by AAS after microwave digestion of samples. Concentration of Cu and Zn was determined in mg/kg of fresh tissue. The supplementation of kids with organic and inorganic form of Cu influenced significantly Cu concentration only in the liver, where were the concentrations in both experimental groups significantly higher than in control group (p ≤ 0.0001): group C: 45.73 ± 12.31 mg/kg; group Cu-I: 109.17 ± 27.13 mg/kg and group Cu-O: 110.16 ± 7.08 mg/kg. Similar concentrations of Zn was significantly influenced only in the liver, where were in experimental groups lower in comparison with control (p ≤ 0.01): group C: 42.20 ± 7.03

145 | P a g e


May 24-25th 2012

mg/kg; group Cu-I: 33.71 ± 3.13 mg/kg and group Cu-O: 32.25 ± 5.24 mg/kg. The Cu supplementation influenced significantly growth of kids. The average daily gain of kids from the time of weaning was highest in the group Cu-I (143 ± 21 g/day) in comparison with group C (105 ± 33 g/day, p ≤ 0.01) and group Cu-O (111 ± 38 g/day, p ≤ 0.05). Significant differences between supplementation of organic and inorganic forms of copper were found only in daily growth which was higher in group supplemented with inorganic form.

Úvod Měď je jedním ze stopových prvků, které jsou nezbytné pro zdraví, produkci a reprodukční funkce zvířat. Významnou roli má měď jako součást molekul s regulační funkcí jako je cytochromoxidáza C, lyziloxidáza, dopaminoxidáza, tyrozináza, monoaminooxidáza, superoxidizmutáza apod. Vedle dalších funkcí je měď významná pro embryogenezi, růst a vývoj savců. V průběhu březosti je měď přenášena přes placentu z mateřského organismu do plodu (McArdle a Erlich 1989). V plodu jsou ukládány zásoby mědi především v jaterní tkáni, odkud se později uvolňují a jsou využívány při růstu plodu a dále v první fázi postpartálního vývoje (Linder a kol. 1999). V posledních letech je výzkum věnován vlivu mědi na denní přírůstky, konverzi krmiv a ovlivnění tukového metabolismu u přežvýkavců. Solaiman a kol. (2007) zjistili při suplementaci Cu 100 mg/den po dobu několika týdnů zvýšení přírůstků a zlepšení konverze krmiv. Naopak Engle a Spears (2000) zjistili při suplementaci Cu snížení přírůstků i konverze krmiva u výkrmových býků. K suplementaci mědi do krmné dávky jsou v současné době využívány dvě základní skupiny preparátů, které obsahují měď anorganicky vázanou (CuSO4, CuO, CuCO3) a nebo měď organicky vázanou ve formě chelátů (proteinát, glycinát apod.). Výsledky výzkumů porovnávající organické a anorganické formy mědi nejsou jednotné. Významným faktorem, který ovlivňuje využitelnost mědi je složení krmné dávky. U organických preparátů mědi je popisována lepší využitelnost, protože Cu je chráněna chelátovou vazbou před ionizací a následnou reakcí s dalšími látkami (železo, molybden, síra, fytáty) v trávicím traktu (Spears 2003). Cílem pokusu bylo vyhodnocení vlivu suplementace anorganické a organické formy mědi od embryonálního vývoje až do 4 měsíců stáří kůzlat na intenzitu růstu a koncentraci mědi a zinku v těle kůzlat.

Materiál a metodika Do pokusu bylo zařazeno 26 kůzlat, která byla rozdělena do 3 skupin. Skupina C (n = 10) byla kontrolní, skupina Cu-I (n = 10) byla suplementována anorganickou formou Cu 146 | P a g e


May 24-25th 2012

(síran měďnatý CuSO4.H2O) a skupina Cu-O (n = 6) byla suplementována organickou formou mědi (Bioplex Cu, Alltech). Různé počty kůzlat v jednotlivých experimentálních skupinách byly z důvodu různého počtu mláďat. Matky byly suplementovány od druhého měsíce březosti až do odstavu mláďat stejnými formami mědi jako mláďata po odstavu. Po odstavu kůzlata pokusných skupin Cu-I a Cu-O dostávala po dobu 2 měsíců denní dávku 7,5 – 10,8 mg Cu v příslušné formě. Množství mědi se v průběhu pokusu postupně zvyšovalo podle tělesné hmotnosti kůzlat; v průměru kůzlata přijímala 0,4 mg/kg tělesné hmotnosti. Přirozený obsah mědi v krmné směsi byl 5 mg/kg a přídavek Cu v odpovídající formě byl ve výši 30 mg/kg směsi. Po 2 měsících suplementace byla kůzlata odporažena a byly odebrány vzorky jater, pankreatu, sleziny, myokardu, plic a stehenní svaloviny na stanovení Cu a Zn. Laboratorní analýzy byly realizovány v klinicko-biochemické laboratoři na Klinice chorob přežvýkavců FVL VFU Brno. Koncentrace Zn a Cu byla stanovena po mikrovlnné mineralizaci vzorků plamenovou atomovou absorpční spektrofotometrií na přístroji SOLAAR 939 (Unicam, Great Britain). Koncentrace Cu a Zn je uváděna v mg/kg čerstvé tkáně.

Výsledky a diskuse Suplementace mědi signifikantně ovlivnila růst kůzlat (tabulka 1). Vyšší intenzita růstu byla zjištěna ve skupině Cu-I, dotované anorganickou formou mědi ve srovnání s kontrolou i se skupinou Cu-O, dostávají měď v organické formě. Pozitivní vliv suplementace mědi na přírůstek u kůzlat zjistili rovněž Solaiman a kol. (2006) při dávce 100 mg/kus/den, což je však několikanásobně vyšší než námi použité množství Cu. Tito autoři však při zvýšení Cu na 200 mg/kus/den již zjistili depresi růstu. Suplementace mědi se odrazila rovněž v koncentraci mědi a zinku v jednotlivých orgánech a tkáních (tabulka 2 a 3). Signifikantně vyšší koncentrace Cu byly zjištěny v játrech u obou pokusných skupin ve srovnání s kontrolou, ale mezi použitými formami nebyly zjištěny rozdíly v žádné ze sledovaných tkání. Ve skupině Cu-I došlo ke zvýšení koncentrace Cu v játrech na 239 % a ve skupině Cu-O na 241 % ve srovnání s kontrolou. Zvýšená suplementace mědi negativně ovlivnila koncentraci zinku v jaterní tkáni. U skupiny Cu-I se průměrná koncentrace Zn snížila o 20,1 % a ve skupině Cu-O o 23,6 % ve srovnání s kontrolní skupinou. Tyto výsledky potvrzují negativní interakci mezi Cu a Zn bez ohledu na formu ve které je měď podávána.

147 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab. 1 Průměrné hmotnosti a přírůstky u kůzlat z jednotlivých pokusných skupin (Ckontrola; Cu-I suplementace CuSO4; Cu-O suplementace bioplexu Cu) od narození do konce experimentu (The average daily gain and weight of kids form individual experimental groups from the day of birth till the end of experiment (C- control; Cu-I supplementation of CuSO4; Cu-O supplementation of bioplex Cu)) Hmotnost narození C

Cu-I

Cu-O a

p<0,05

aa

odstav

Přírůstek

věk při konec

odstavu

od porodu

pokusu

od odstavu

x

3,67

17,19

23,18 a

68,20

0,105 aa

0,127 aa

s

0,59

3,78

4,34

11,22

0,033

0,025

x

3,99

19,17

27,33 a

64,70 aa

0,143 aa,b

0,156 aa,b

s

0,53

1,48

2,25

1,77

0,021

0,013

x

3,53

18,37

24,67

69,00 aa

0,111 b

0,137 b

s

0,44

1,76

2,72

3,16

0,038

0,017

p<0,01 (signifikantní rozdíl mezi skupinami označenými stejnými písmeny

v jednom sloupci)

Tab. 2 Koncentrace mědi (mg/kg) a zinku (mg/kg) ve vybraných orgánech kůzlat jednotlivých pokusných skupin (C- kontrola; Cu-I suplementace CuSO4; Cu-O suplementace bioplexu Cu) (The concentration of copper (mg/kg) and zinc in organs of kids from individual groups (C- control; Cu-I supplementation of CuSO4; Cu-O supplementation of bioplex Cu) ) plíce

C

Cu-I

Cu-O

pankreas

myokard

slezina

Zn

Cu

Zn

Cu

Zn

Cu

Zn

Cu

x

16,98

2,16

17,04

0,96

15,36

3,19

21,27

0,89

s

1,12

0,20

3,60

0,09

1,03

0,21

1,90

0,04

x

16,53

2,16

17,11

1,02

15,16

3,20

22,12

0,89

s

0,88

0,18

1,51

0,07

0,99

0,18

0,79

0,06

x

16,28

2,05

18,37

1,04

15,04

3,25

21,82

0,89

s

1,01

0,10

2,65

0,07

0,88

0,19

0,93

0,05

148 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab. 3 Koncentrace mědi (mg/kg) a zinku (mg/kg) ve vybraných orgánech a tkáních kůzlat jednotlivých pokusných skupin (C- kontrola; Cu-I suplementace CuSO4; Cu-O suplementace bioplexu Cu) (The concentration of copper (mg/kg) and zinc in organs of kids from individual groups (C- control; Cu-I supplementation of CuSO4; Cu-O supplementation of bioplex Cu)) stehenní sval Zn Cu C

jazyk Zn

Cu

x 24,97

0,60

28,03

0,74

4,45

0,11

4,95

0,14

s

játra

ledviny

Zn

Cu

Zn

42,20 aa,bb

45,73 A,B

16,94

2,30

1,19

0,13

16,39

2,39aa

7,03

12,31 aa

Cu-I x 30,68

0,67

27,42

0,75

33,71

s 14,78

0,15

3,19

0,09

3,13

27,13

0,60

0,08

Cu-O x 26,16

0,68

26,92

0,69

32,25 bb

110,16 B

15,94

2,22aa

5,67

0,17

5,86

0,15

5,24

7,08

0,75

0,09

s aa

p<0,01

A

109,17

A

Cu

p<0,001 (signifikantní rozdíl mezi skupinami označenými stejnými písmeny

v jednom sloupci)

V naší studii jsme nezjistili rozdíly ve tkáňových koncentracích při suplementaci organické nebo anorganické mědi. Obdobně Ward a kol. (1996) u skotu nepotvrdili vyšší využitelnost mědi z organických zdrojů u skotu při srovnání s anorganickými zdroji. Tito autoři testovali rovněž různé formy Cu při zvýšeném obsahu molybdenu v krmné dávce a v tomto pokuse již zvýšenou dostupnost Cu proteinátu oproti CuSO4 zjistili. Vyšší koncentraci mědi v játrech kůzlat o 26 % zjistili při suplementaci síranu měďnatého ve srovnání s proteinátem Mondal a kol. (2007). Tito autoři sledovali rovněž koncentraci zinku v játrech při různých dávkách CuSO4. Při zvýšení suplementace z 10 mg/kg na 20 mg/kg došlo ke snížení koncentrace Zn v játrech, ale při zvýšení suplementace na 30 mg/kg byla zjištěna naopak nejvyšší koncentrace Zn v játrech. V našem pokuse jsme potvrdili negativní vliv suplementace Cu bez ohledu na formu na koncentraci Zn v játrech.

Závěr Suplementace mědi od období březosti matek až do 2 měsíců po odstavu u kůzlat zvýšila koncentraci mědi v játrech, ale v ostatních orgánech a tkáních nebyla koncentrace mědi signifikantně ovlivněna. Suplementace Cu se negativně projevila na koncentraci zinku v

149 | P a g e


May 24-25th 2012

játrech. Mezi organickou a anorganickou formou nebyly zjištěny signifikantní rozdíly v koncentraci Cu a Zn v těle kůzlat. Suplementace anorganické formy mědi měla pozitivní vliv na intenzitu růstu, která byla signifikantně zvýšena ve srovnání jak s kontrolou tak i se skupinou dotovanou Cu-glycinátem (Cu-O).

Poděkování Práce byla realizována s podporou Výzkumného záměru MŠMT č. MSM 6215712402 a č. MSM 6215712403.

References Engle, T. E., Spears, J.W. Performance, carcass characteristics, and lipid metabolism in growing and finishing Simmental steers fed varying concentrations of copper. J. Anim. Sci., 2001, 79, 2920–2925. Linder, M. C., Donley, S., Dominiguez, D., Woooten, L., Mehrbod, F., Cerevza, P. a kol.: Copper transport and ceruloplasmin during lactation and pregnancy. In: Metals and genetics (Sarkar, B., ed.), Kluwer Academic/ Plenum, New York, pp 117–129 McArdle, H. J., Erlich, R. 1989: Copper uptake and transfer to the mouse fetus during pregnancy. J. Nutr., 1989, 121, 208–214. Mondal, M. K., Biswas, P., Roy, B., Mazumdar, D., Effect of copper sources and levels on serum lipid profiles in Black Bengal (Capra hircus) kids. Small Rum. Res., 2007, 67, 2835. Solaiman, S. G., Craig Jr., T. J., Reddy, G., Shoemaker, C. E. Effect of high levels of Cu supplement on growth performance, rumen fermentation, and immune responses in goat kids. Small Rum. Res., 2007, 69, 115-123. Solaiman, S. G., Shoemaker, C. E., D´Andrea G. H. The effect of high dietary Cu on health, growth performance, and Cu status in young goats. Small Rum. Res., 2006, 66, 85-91. Spears, J. W. Trace mineral bioavailability in ruminants, J. Nutr., 2003, 133, 1506-1509. Ward, J. D., Spears, J. W., Kegley, E. B. Bioavailability of Copper Proteinate and Copper Carbonate Relative to Copper Sulfate in Cattle. J. Dairy Sci., 1996, 97, 127-132.

150 | P a g e

May 24-25th 2012


MORPHOMETRIC PARAMETERS OF OVINE THYROID GLAND WITH DIFFERENT IODINE FOODBORNE INTAKE Peksa Z.1, Trávníček J.1 , Konečný R.1 , Jelínek F.2 , Dušová H. 1

1

University of South Bohemia, Faculty of Agriculture, Department of Veterinary Sciences and Quality of

Products, Studentská 13, 370 05 České Budějovice, Czech Republic 2

Veterinary Histopathological Laboratory, Sojovická 16, 197 00 Prague 19, Czech Republic

Abstract In years 2010 and 2011 were performed two experiments on young sheep of breed Šumavská ovce. Experimental feed mixtures with different iodine concentration (3, 5 and 10 mg I*kg DM) were fed for 11 months. The group with intake 10 mg I*kg DM received goiter causing substance too. The animals were slaughtered at the slaughterhouse after experiment and the thyroid gland was sampled. Samples were adjusted with classic method (in paraffin), colored with hematoxylin and eosin and histometric analysis was performed. Significant differents in thyroid weight were found. In group with the lowest iodine intake (3 mg) was found the lowest thyroid weight (3.74±0.37 g). The biggest thyroid weight (5.10±1.12 g) was found in group with iodine intake 5 mg. Between groups with intake 10 mg I (res. 10 mg and goiter causing substance) weren´t detected different in thyroid weight. The thyroid weight (4.89±0.79 g res. 4.60±1.10 g) was similar as in group with iodine intake 5 mg. Correlations between percentage behalf of follicular size categories and iodine foodborne intake were very hard.

Key words: histometry, follicle, epithelium, tyreocytes

Úvod Základními funkcemi štítné žlázy je tvorba, zadržování a následné uvolňování hormonů (tyroxinu a trijodtyroninu) do vnitřního prostředí. Tyto hormony zásadním způsobem ovlivňují prakticky veškerý metabolismus organismu. Pro správnou funkci štítné žlázy je důležitý optimální příjem jódu z prostředí. Dlouhodobý nedostatečný nebo nadbytečný příjem se může odrazit jak na zdravotním stavu zvířat (či jejich mláďat), tak i na produkci.

151 | P a g e


May 24-25th 2012

Při dlouhodobě vysokém příjmu dochází k snížení tvorby TSH. Následkem čehož dochází v počátku ke změnám v morfologii tyreocytů (snižování výšky epitelu), posléze dochází k hromadění koloidu v luminu folikulů, zvětšování jejich rozměrů, a následně ke zvyšování hmotnosti celé štítné žlázy (Cunningham, 2002). V posledních letech byl zjištěn enormní vzestup obsahu jódu v mléce dojnic (Trávníček et al, 2006; Hejtmánková et al., 2006), který byl způsoben zvýšením koncentrace jódu v minerálních krmných doplňcích. Tento stav může přinášet pro některé konzumenty určitá riziky, byla zjištěna souvislost mezi nadměrným příjmem jódu a rizikem vzniku některých onemocnění štítné žlázy u lidí (Burgi, 2010; Guan et al., 2009; Dal Maso et al., 2009; Knobel et Medeiros-Neto, 2007). Naším cílem bylo experimentálně ověřit dopad diferencovaného alimentárního příjmu jódu na morfometrické parametry štítné žlázy ovcí.

Materiál a metodika V roce 2010 a 2011 byly uskutečněny dva pokusy na jehnicích plemene Šumavská ovce. V obou pokusech byla zvířatům podávána pokusná krmná směs a ad libitum seno. V roce 2010 byla odebrána štítná žláza celkem od deseti jalových jehnic. Tato zvířata byla po dobu 11 měsíců experimentálně zatížena vysokou dávkou jódu. Pokusná skupina přijímala dávku 5 mg I na kg sušiny krmné dávky a kontrolní 3 mg I na kg sušiny krmné dávky. Průměrná hmotnost jehnic byla 74-88 kg a průměrný věk při porážce byl 24 měsíců. Do pokusu v roce 2011 bylo celkem zařazeno12 zvířat. Kontrolní skupina přijímala v krmné dávce 10 mg I/kg sušiny KD, pokusné skupině byla podávána krmná směs se stejným obsahem jódu, mimo to ještě obsahovala řepkový extrahovaný šrot a dusičnan sodný (v dávce 1g/ks a den). Cílem experimentu bylo zjištění dopad příjmu strumigenních látek (glykosinolátů a dusičnanu sodného) při současně vysokém příjmu jódu na strukturu štítné žlázy jehnic. Po ukončení obou pokusů byla zvířata poražena, byla zjištěna hmotnost štítné žlázy a byl odebrán vzorek ze středu laloku štítné žlázy pro histologické zpracování, které bylo provedeno klasickou parafínovou metodou a následným barvením hematoxylinem a vodným eosinem. Histometrické měření bylo uskutečněno v programu pro obrazovou analýzu Leica IM 500 Version 4.0., kamera Leica DC 320 v kombinaci s mikroskopem Leica DM 2500. Ve třech zorných polích z různých částí řezu bylo změřeno celkem 60 folikulů (délka, šířka, plocha). Současně byla změřena výška 20 tyreocytů. Následně byly změřené folikuly dle 152 | P a g e


May 24-25th 2012

Jelínka et al. (2003) rozděleny do tří kategorií podle velikosti na velké (175,1– 615,0 µm), střední (80,1–175,0 µm) a malé (15,0–80,0 µm) a vyhodnoceno jejich zastoupení. Výsledky byly zpracovány v programu STATISTICA 7.0. (StatSoft, Inc.) pomocí Anova a regresní a korelační analýzy.

Výsledky a diskuze Zřetelně nejnižší hmotnost štítné žlázy byla zjištěna u skupiny jehnic přijímajících v krmné dávce 3 mg jódu (3,74±0,37 g) (obr. 1). Naopak nejvyšší hmotnosti (5,10±1,12g) dosáhly štítné žlázy jehnic přijímajících 5 mg jódu. Skupiny jehnic, které přijímaly 10 mg jódu (res. 10 mg a řepkový extrahovaný šrot) se vzájemně nelišily (4,89±0,79 g res. 4,60±1,10 g). Byly zjištěny signifikantní rozdíly mezi skupinami jehnic přijímajících 10 mg a skupinou, která přijímaly 3 mg I (p<0,05). Hmotnost štítné žlázy u všech skupin odpovídala údajům Sovy (1981) či Kratochvíla (1998).

Obrázek 1 Průměrná hmotnost štítné žlázy u jednotlivých skupin. (Average thyroid weight in experimental groups.)

a:b

p<0,05

Nejnižší zastoupení velkých folikulů bylo zjištěno u skupiny jehnic přijímajících 3 mg I a to v porovnání se skupinami jehnic přijímajících 5 mg i 10 mg jódu (res. 10 mg a strumigeny) (obr 2). V zastoupení středních folikulů nebyly zjištěny mezi skupinami

153 | P a g e


May 24-25th 2012

výraznější rozdíly. Jen mezi skupinami s příjmem jódu 3 a 5 mg byl zjištěn statisticky významný rozdíl (p<0,01). Nejnižší zastoupení malých folikulů bylo zjištěno u skupin, které přijímaly 10 mg jódu (res. 10 mg a strumigeny). Mezi těmito skupinami nebyl zjištěn rozdíl. Vyšší hodnoty byly prokázány u skupin s příjmem 3 a 5 mg. Byly zjištěny statisticky významné rozdíly (p<0,01) a to jak mezi těmito dvěma skupinami, tak i v porovnání s jehnicemi přijímajícími 10 mg (10 mg a strumigeny). Jelínek et al. (2003) uvádí, že zvýšená metabolická aktivita je histologicky manifestována přítomností malých folikulů a zvýšením rozměrů tyreocytů. V tabulce 1 jsou uvedeny korelační koeficienty mezi procentickým zastoupením jednotlivých kategorií folikulů a alimentárním příjmem jódu. Kóňová et al. (1999) zjistila u jehňat přijímajících dlouhodobě chloridy v napájecí vodě výrazné zvýšení počtu malých folikulů, v našem případě se alimentární příjem strumigeních látek na tomto zvýšení neodrazil, naopak se projevilo statisticky nevýznamné snížení počtu malých folikulů.

Obrázek 2 Procentické zastoupení jednotlivých velikostních kategorií folikulů. (Percentages representation of follicular size categories.)

a:b,c

p<0,01; b:c; d:e p<0,05

154 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab. 1 Korelační koeficienty mezi procentickým zastoupením jednotlivých velikostních kategorií folikulů a alimentárním příjmem jódu. (Correlation between follicular size categories percentages representation and foodborne iodine intake.) Nezávisle proměnná R2 Závisle proměnná Procento velkých folikulů (%)

Příjem jódu (mg I*kg-1 DM)

0,98

Procento středních folikulů (%)


0,43

Procento malých folikulů (%)


-0,64

U skupiny jehnic přijímající 3 mg jódu byly zjištěny menší rozměry folikulů ve všech velikostních kategorií folikulů. Rozdíl oproti ostatním skupinám zvířat byly statisticky významné (p<0,05). Největší folikuly v jednotlivých velikostních kategoriích folikulů byly u skupin přijímající 10 mg I (res. 10 mg a strumigeny) (mezi skupinami nebyl zjištěn žádný rozdíl). Největší rozdíly se projevily u skupin v rozměrech velkých a malých folikulů v porovnání s dalšími skupinami.

Závěr Byly zjištěny rozdíly v průměrné hmotnosti štítné žlázy zvířat mezi jednotlivými skupinami. Nejnižší hmotnost byla zjištěna u zvířat přijímající 3 mg jódu na kg sušiny krmné dávky. Naopak nejvyšší hmotnosti dosáhly štítné žlázy u zvířat, která přijímala 5 mg. U obou skupin, které přijímaly 10 mg I (res. 10 mg I a strumigeny) dosáhla hmotnost štítné nižších hodnot oproti skupině přijímající 5 mg, nebyl však zjištěn signifikantní rozdíl. Byly zjištěny významné rozdíly v zastoupení jednotlivých velikostních kategorií folikulů mezi pokusnými skupinami, které silně korelovali s alimentárním příjmem jódu. Nebyl zjištěn dopad strumigenních látek na procentické zastoupení jednotlivých velikostních kategorií u zvířat, které přijímaly 10 mg I.

Poděkování Tento příspěvek byl podpořen granty NAZV QH 81 105 a GAJU 022/2010/Z.

Použitá literatura Burgi, H. Iodine exess. Best. Pract. Res. Cl. En., 2010, 24(1), 107-115. Cunningham, J. G. Textbook of Veterinary physiology, 3rd edition, Saunders, 575 s, 2002. Dal Maso, L., Bosetti, C., La Vecchia, C., Franceschi, S. Risk factors for thyroid cancer: an epidemiological review focused on nutritional factors. Cancer Cause Control, 2009, 20(1), 75-86.

155 | P a g e


May 24-25th 2012

Guan, H.X., Ji M., Bao R., Yu, H.Y., Wang, Y.G., Hou, P., Zhang, Y., Shan, Z.Y., Teng, W.P., Xing, M. Z. Association of High Iodine Intake With the T1799A BRAF Mutation in Papilary Thyroid Cancer. J. Clin. Endocr. Metab., 2009, 94(5), 1612-1617. Hejtmánková, A., Kuklík, L., Trnková, E., Dragounová, H. Iodine concetrations in cow´s milk in Central and Northern Bohemia. Czech J. Anim. Sci., 2006, 51(5), 189-195. Jelínek, F., Krabačová, I., Kroupová, V. Assessment of functional activity of the bovine thyroid gland using morphometry and two markers of cellular proliferation. Acta Vet. Brno, 2003, 72(1), 11-16. Koňová, M., Békeová, E., Levkut, M. The effects of chlorine intake on some morphometric parameters of the thyroid gland in lambs. Acta Vet. Brno, 1999, 68, 191-195. Knobel, M., Medeiros-Neto, G. Relevance of Iodine Inatake as a Reputed Predisposing Factor for Thyroid Cancer. Arq. Bras. Endocrinol. Metab., 2007, 51(5), 701-712. Kratochvíl, P. Morfological changes in the thyroid gland of livestock under different breeding conditions. (In Czech). Disertation, South Bohemia University, Faculty of Agriculture, České Budějovice, 175, 1998. Sova, Z. a kol. Fyziologie hospodářských zvířat, 1. vyd., Praha, SZN, 511 s, 1981. Trávníček, J., Herzig, I., Kurza, V., Kroupová, V., Navrátilová, M. Iodine content in raw milk, Vet. Med. Czech, 2006, 51(9), 448-453.

156 | P a g e

May 24-25th 2012


EFFECT OF T-2 TOXIN ON SOME PARAMETERS OF ANTIOXIDANT STATUS OF PORCINE BLOOD IN VITRO Petruška, P.,Capcarová, M. Department of Animal Physiology, Faculty of Biotechnology and Food Sciences, Slovak University of Agriculture in Nitra

Abstract T-2 toxin, a trichothecene mycotoxin, is considered to be a one of the most toxic compounds that is produced by molds, particularly the Fusarium species. Mycotoxins can contaminate a large variety of feed mixtures, and could cause serious health problems to domestic livestock and humans when consumed. The aim of the present study was to investigate the effect of T-2 toxin on some antioxidants parameters (superoxide dismutase - SOD, glutathione peroxidase - GPx, bilirubin - BIL, albumins - ALB) in whole blood of porcine in vitro.Application of different dosage of T-2 toxin (10, 100 and 1000 mg.ml-1) has caused no significantdifference (P>0.05)inall following parameters compared with the control group.

Key words: T-2 toxin, antioxidants, SOD, GPx, albumins, bilirubin, porcine, blood.

Introduction Mycotoxins are natural and very stable toxins, with relatively low-molecular weight secondary metabolites of fungal origin, which can contaminate a large variety of feed mixtures (Labuda et al., 2009; Tančinová and Labuda, 2009) grains and foodstuffs worldwide, a variety of foods and beverages, including both plant-based products and animal products (Schollenberger et al., 2007; Ranzenigo et al., 2008). Trichotecenemycotoxins are very large family of chemically related toxins produced by

various

species

of

Fusarium,

Myrotecium,

Trichoderma,

Cephalosporiu,

etc.(Wannemacher and Neufeld, 1991). T-2 toxin is some of the most important and toxic trichothecenemycotoxinoccurring in various agriculture products (Iwahashi et al. 2008). Lipophilic nature of T-2 toxin suggests that they are easily absorbed through skin, gut, and pulmonary mucosa (Bunner and Morris, 1988). Trichotecene causes multiorgan effect including emesis, and diarrhea, weight loss, nervous disorders, cardiovascular alterations,

157 | P a g e

May 24-25th 2012


immunodepression, hemostaticderangements, skin toxicity, and bone marrow damage (Ueno, 1984; Wannemacher and Neufeld, 1991). The aim of the present study was to investigate the effect of T-2 toxin on antioxidants parameters (superoxide dismutase - SOD, glutathione peroxidase - GPx, bilirubin - BIL, albumins - ALB) in whole blood of porcine in vitro.

Materials and methods The blood was obtained from sexually mature porcineLarge white (APRC, Nitra). T-2 toxin (RomerLabsDivision Holding GmbH, Tulln, Austria) was added to blood samples at doses10, 100 and 1000 ng.ml-1(Table 1). The blood samples without addition of T-2 toxin served as control group (C).

Tab. 1 Application ofT-2 toxin in tobloodin vitro

The

blood

was

Group

T-2 toxin (ng.ml-1)

C E1 E2 E3

0 10 100 1000

incubated

for

5

hours

at

37oC.Enzyme

activity

(SOD – superoxide dismutase and GPx – glutathione peroxidase) was assayed by spectrophotometric analysis (Genesys 10, ThermoFisherScientificInc., USA), using commercial assay kit (Randox, Bratislava). Blood plasma was separated from whole blood by centrifugation at 3000 g for 10 min. Concentration of bilirubin (BIL) and albumins (ALB) were determined by automatic analyzer Microlab 300 (Merck®, Germany) and spectrophotometric analysis (Genesys 10, Thermo Fisher Scientific Inc., USA). SAS software and Sigma Plot 11.0 (Jandel, Corte Madera, USA) were used to conduct statistical analyses. One-way ANOVA was used to calculate basic statistic characteristics and to determine significant differences among experimental and control groups. Data presented were given as mean and standard deviation (SD). Differences were compared for statistical significance at the level P<0,05.

158 | P a g e

May 24-25th 2012


Results and Discussion It is know that in general mycotoxins causeoxidative stress (Sehata et al., 2005) and this leads to peroxidation of membrane lipids and β-oxidation of fatty acids(Jaeschke et al., 2002).It has been shown that the administration of T-2 toxin caused a significant increase in respiratory burst of macrophages, which lead to the release of reactive oxygen species into the blood stream (Cooray and Johnsson, 1990). In this study we found no significant (P>0.05) differences in all observed parameters (SOD, GPx, BIL and ALB) in comparison with control group. The activity of SOD was slightly higher in all experimental groups (E1,E2 and E3) in comparison with control group (C), however without statistical significance (P>0.05). GPx was slightly higher in E1 and E3 group in comparison with control group, in E2 was activity of GPx lower when compared with control group (C) and experimental groups (E1 and E3) but this differences was not significantly. Content of BIL was higher in all experimental groups (E1, E2, E3). The highest content of BIL was observed in E3 group in comparison with control group (C) and experimental groups (E1, E2) but without statistical significance (P>0.05).The content of ALB was slightly higher in all experimental groups (E1, E2 and E3) in comparison with control group (C), however without statistical significance (P>0.05). In our previous research (Petruška et al., 2012)with T-2 toxin in a combination withresveratrol we found significantly(P<0.05)higher activity of SOD in experimental groups with

compared

to

control

group.

Concentration

of

ALB

and

BILwere

also

significantly(P<0.05) higher in experimental groups. Damianaky et al.(2000) andHiroyuki et al. (2001)found that low concentrations of resveratrol showedhigh biological activity, hindering platelet aggregation and it has antioxidant activity.In this paper the application of T-2 toxin has not caused the significants differences in observed parameters in contrast with the previous study. Natural antioxidant like resveratrol has probably supportive effect and is able to maintain the antioxidant status of animal cells.In another in vitro study Medvedova et al. (2011) found that DON () has direct effect on secretion of growth factor IGF-I and steroid hormone progesterone in porcine granulosa cells. In different study Vilà et al.(2002)found that α-tocopherol was significantly lower for the T-2 toxin treated mice. The interaction between T-2 toxin and vitamin E suggests that toxin affects plasma vitamin E levels to a greater degree at low concentration compared with high dietary concentrations of the vitamin.These different results could be affected by different animals, concentration of doses and conditions of research.

159 | P a g e

May 24-25th 2012


Figure 1The activity of SOD of porcine blood after/without T-2 toxin exposure in Activity of SOD vitro

Figure 2The activity of GPx of porcine Activity GPx exposure in blood after/without T-2of toxin vitro 1400

10

1200 8

6

GPx in U/l

SOD in U/ml

1000

4

800

600

400 2

200

0

0 C

E1

E2

C

E3

E1

E2

E3

Groups

Groups

C – control group E1 - 10 ng.ml-1, E2 – 100 ng.ml-1, E3 – 1000 ng.ml-1, Values are means ± SD

C – control group E1 - 10 ng.ml-1, E2 – 100 ng.ml-1, E3 – 1000 ng.ml-1, Values are means ± SD

Figure 3The content of BILof porcine blood after/without T-2 toxin Concentration of BIL exposure in vitro

Figure 4The content of ALBof porcine blood after/without T-2 toxin Concantration of ALB exposure in vitro

140

60

120

50

100

ALB in g/l

BIL in µmol/l

40 80

60

30

20 40 10

20

0

0 C

E1

E2

E3

C – control group Groups E1 - 10 ng.ml-1, E2 – 100 ng.ml-1, E3 – 1000 ng.ml-1, Values are means ± SD

C

E1

E2

E3

C – control group Groups E1 - 10 ng.ml-1, E2 – 100 ng.ml-1, E3 – 1000 ng.ml-1, Values are means ± SD

Conclusion In this paper the additions of T-2 toxin in different doses tothe porcine blood in in vitro caused no significantly differences in observed parameters of antioxidant status. To our knowledge there are not a lot of similar studies on effect of T-2 toxin in various doses given to the blood in vivoand its effect on antioxidant profile. Further investigation with different doses of T-2 toxinand combination with other substances will be worthy of further investigation.

Acknowledgments This work is financially supported by VEGA scientific grant 1/0790/11 and Vega 1/0084/12.

160 | P a g e


May 24-25th 2012

References Cooray, R., Johnsson, P. Modulation of resistence to mastitis pathogens by pretreatment of mice with T-2 toxin. Food Chem. Toxic. 28, 1990, 687-692. Damianaki, A., Bakogeorgou, E., Kampa, M., Notas, G., Hatzoglou, A., Panagiotou, S., Gemetzi, C., Kouroumalis, E., Martin, P.M., Castanas, E. Potent inhibitory action of red wine polyphenols on human breast cancer cells. J. Cell. Biochem. 78, 2000, 429–441. Hiroyuki, N., Yasuhiko, K., Yoshiko, U., Hideto, S., Nobuaki, S., Koshiro, H., Airo, T. Resveratrol inhibits human breast cancer cell growthand may mitigate the effect of linoleic acid, a potent breast cancer cell stimulator. J. Can. Res.and Clin. Oncol. 127,2001, 258-264. Jaeschke, H., Gores, G.J., Cederbaum, A.I., Hinson, J.A., Pessayre, D., Lemasters, J.J. Mechanisms of Hepatotoxicity. Toxicol. Sci. 2002, 65, 166-176. Labuda, R., Parich, A., Vekiru, E., Tančinová, D. Incident of fuminosis, moniliformin and Fusarium species in poultry feed mixtures from Slovakia. Ann. Agric. Environ. Med. 2009, 12, 81-86. Medvedova, M., Kolesarova, A., Capcarova, M., Labuda, R., Sirotkin, V.A., Kovacik, J., Bulla, J. The effect of deoxynivalenol on the secretion activity, proliferation and apoptosis of porcine ovarian granulosa cells in vitro. J. of Environ. Sci. Health, Part B. 46, 2011, 213-219. Petruška, P., Tušimová, E., Capcarová, M. Effect of resveratrol and T-2 toxin on antioxidant parameters of porcine blood. VI. Vedecká konferencia doktorandov s medzinárodnou účasťou. Nitra : SPU v Nitre, 2012, 66-70. Ranzenigo, G., Caloni, F., Cremonesi, F., Aad, P.Y., Spicer, L.J. Effect of Fusarium mycotoxins on steroid production by porcine granulose cells. Anim. Reprod. Sci. 2008, 107, 115-130. Sehata, S., Kiyosawa, N., Atsumi, F., Ito, K., Yamoto, T., Teranishi, M., Uetsuka, K., Nakayama, H., Doi, K. MicroarrayAnalysisof T-2 Toxin-induced Liver, Placenta and Fetal Liver Lesions in Pregnant Rats. Exp.Toxic. Path. 57, 2005, 15-28. Schollenberger, M., Muller, H.M., Rufle, M., Terry-jara, H., Suchy, S., Plank, S., Drochner, W. Natural occurrence of Fusarium toxins in soy food marketed in Germany. Int. J. Food Microbiol. 2007, 113, 142-146. Tančinová, D., Labuda, R. Fungi on wheat bran and their toxinogenity. Ann. Agric. Environ. Med. 2009, 16, 325-331. Vila, B., Jaradat, Z.W., Marquard, R.R., Frohlich, A.A. Effect of T-2 toxin on in vivo lipid peroxidation and vitamin E status in mice. Food Chem. Tox. 40, 2002, 479-486.

161 | P a g e


May 24-25th 2012

THE EFFECT OF LOW DOSES OF 2,3,7,8-TETRACHLORODIBENZO-P-DIOXIN (TCDD) AND GENISTEIN ON EXPRESSION OF ARYL HYDROCARBON RECEPTOR PROTEIN IN PORCINE GRANULOSA CELLS Piasecka J.,1 Kolomycka A.,1 Maruniakova N.,2 Bakova Z.,2 Ciereszko R.1 1

Department of Animal Physiology, University of Warmia and Mazury in Olsztyn, Poland

2

Department of Animal Physiology, Slovak University of Agriculture in Nitra, Slovak Republic

Abstract Introduction: Endocrine disrupting chemicals (EDCs; e.g. dioxins, phytoestrogens) are present in the environment and influence reproduction by interfering with steroid hormone biosynthesis/secretion and/or receptor signaling and gene regulation. Dioxins and phytoestrogens are known to activate aryl hydrocarbon receptor (AhR) and estrogen receptor β (ERβ), respectively. However, our preliminary data indicate that both dioxins and phytoestrogens may influence AhR mRNA expression. Additionally, a cross-talk between intracellular pathways activated by dioxins and phytoestrogens may occur in cells expressing both AhR and ERβ. Therefore, the aim of the study was to examine the effect of low, environmentally relevant doses of dioxin (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin; TCDD) and/or phytoestrogen (genistein; GEN) on dynamic changes in AhR protein expression in porcine GCs isolated from medium (3-6 mm) and large, preovulatory (≥8 mm) follicles. Methods: To determine changes in AhR protein expression, the cells (2×105/ 0.3 ml Eagle’s medium, 5% calf serum, 0.05 mg/ml gentamycin, 60 U/ml nystatin) were first precultured for 40 hours, and then cultured with TCDD (100 pM) and/or GEN (500 nM) for additional 1, 3 or 24 hours. Following culture, cells were fixed in 4% paraformaldehyde and AhR protein expression was determined by fluorescence immunocytochemistry. Cells were analyzed by fluorescence microscopy and the intensity of the fluorescence was measured using NIS-Elements 3.0. One-way ANOVA followed by the least significant difference (LSD) post hoc test was used to compare the AhR protein expression among treatment groups. Results: TCDD and GEN alone did not affect AhR protein expression in granulosa cells from medium follicles. However, the combined treatment of TCDD and GEN decreased (p≤0.05) the intensity of AhR immunostaining in the cells after one hour of culture. In cells isolated from large follicles only GEN alone increased (p≤0.05) AhR immunostaining after

162 | P a g e


May 24-25th 2012

one hour of culture. CONCLUSIONS: Changes in AhR protein expression appeared to be rapid and occurred shortly after cells exposition to TCDD and GEN. The Ah receptor pathway may be involved in the intracellular action of TCDD and GEN in porcine granulosa cells. Supported by grants No. N N311 542040; N N303 815240; UWM 528.0206.0805.

163 | P a g e


May 24-25th 2012

THE LENGTH OF PREGNANCY IN WARMBLOOD MARES Pospíšilová, D., Julínková, E., Sláma, P., Řezáč P. Department of Animal Morphology, Physiology and Genetics, Agronomy Faculty, Mendel University in Brno

Abstract The study was aimed on the duration of pregnancy in mares in Czech Republic. The main part of this work was focused on the effect of mare age, the month of conceiving and the gender of the foal on the length of pregnancy. The age of mares and the month of conceiving had an effect on the length of pregnancy.

Key words: Pregnancy, Horse

Úvod Délka březosti klisen je významná z celé řady důvodů. Jedním z nejdůležitějších je, že znalost variability trvání březosti je klíčová z hlediska předvídání nástupu porodu. U koní je proměnlivost délky březosti větší v porovnání s dalšími druhy hospodářských zvířat (Bos a Van Der May, 1980). Jedním z důvodů může být, že délka březosti je pravděpodobně ovlivněna faktory, které neovlivňují délku březosti u dalších druhů. Značná variabilita délky březosti byla pozorována i u různých plemen koní (Pérez et al., 2003). Faktorů, které ovlivňují délku březosti u koní, je celá řada. Bylo zjištěno, že může být ovlivněna věkem klisen, počtem ohřebení, výživou a pohlavím narozeného hříběte (Panchal, 1995; DaviesMorel et al., 2002; Vassilev et al., 2002). Cílem práce bylo zjištění vlivu věku klisen, měsíce zabřeznutí a pohlaví narozeného hříběte na délku březosti. Materiál a metodika Práce byla prováděna v letech 2007 až 2010. Bylo sledováno 430 klisen plemene český teplokrevník. Klisny pocházely od různých majitelů z ČR. Klisny měly průměrný věk 11 roků, s rozmezím od 3 let do 23 let. Většina sledovaných klisen již v minulosti měla hříbě, některé klisny však dosud nebyly březí. Počet ohřebení u pokusných klisen se pohyboval v rozmezí 1 – 12. Diagnostika říje byla prováděna u všech klisen za použití pohlavně dospělého hřebce. Klisny byly inseminovány veterinárním lékařem nebo inseminačním

164 | P a g e


May 24-25th 2012

technikem. Po inseminaci byla prováděna raná diagnostika gravidity. U klisen, které se ohřebily, byla diagnostika říje prováděna od 9. dne po porodu.

Výsledky Klisny, které měly 3 - 6 let, byly březí v průměru 337 dní, s rozmezím od 320 do 358 dní. S věkem klisen se průměrná délka březosti lineárně prodlužovala. Klisny ve věkovém rozmezí 16 - 23 let byly březí v průměru 343 dní, s rozmezím od 316 do 381 dní. U klisen, které měly 3 - 6 let, byla zjištěna průkazně kratší délka březosti oproti klisnám, které měly 16 - 23 let (P < 0,05). Byla zjištěna kladná korelace mezi věkem klisen dobou březosti (r = 0,16; P < 0,05). U klisen, které zabřezly v únoru, byla průměrná délka březosti 346 dní, s rozmezím od 335 do 376 dní. Klisny, které zabřezly v březnu, byly březí v průměrná 342 dní, s rozmezím od 316 do 365 dní. S přibývajícími dalšími měsíci se délka březosti postupně zkracovala. Nejkratší průměrná délka březosti byla zaznamenána v červenci a to 333 dní, s rozmezím od 305 do 359 dní. V srpnu byla průměrná délka březosti rovněž 333 dní, s rozmezím od 309 do 348 dní. U klisen, které zabřezly v únoru, byla průměrná délka březosti průkazně větší oproti klisnám, které zabřezly v červenci a srpnu (P < 0,05). V případě narození hřebečků byla průměrná délka březosti 340 dní, s rozmezím od 309 do 392 dní. V případě narození klisniček činila průměrná délka gravidity 339 dní, s rozmezím od 305 do 381 dní.

Závěr Na délku březosti teplokrevných klisen měl významný vliv měsíc zabřeznutí a věk klisen. S věkem klisen se prodlužovala délka březosti a s pokračujícími měsíci od února do července až srpna se byla zaznamenána tendence k lineárnímu zkracování délky březosti.

Poděkování Práce byla zpracována za podpory výzkumného záměru č. MSM 6215648905.

Použitá literatura Bos, H., Van Der Mey, G.J.W., 1980. Length of gestation periods of horses and ponies belonging to different breeds. Livest. Prod. Sci. 7, 181–187. Davies-Morel, D.M.C., Newcombe, J.R., Holland, S.J., 2002. Factors affecting gestation length in the thoroughbred mare. Anim. Reprod. Sci. 74, 175–185.

165 | P a g e


May 24-25th 2012

Panchal, M.T., Gujarati, M.L., Kavani, F.S., 1995. Some of the reproductive traits in Kathimares in Gujarat State. Indian J. Anim. Reprod. 16, 1. Pérez, C., Rodrýguez, J., Mota, J., Dorado, M., Hidalgo, M., Felipe, J., Sanz, G., 2003. Gestation length in Carthusian Spanish bred mares. Livest. Prod. Sci. 82, 181–187. Vassilev, D., Dimov, G., Tsankov, T., 2002. Direct, maternal and uncorrelated (co)variances for gestation length in Pleven Warmblood mares. In: 7th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production, Montpellier, France.

166 | P a g e

May 24-25th 2012


CANINE BEHAVIOR IN OPEN SPACES Řezáč, P., Šedivá, M., Sláma, P, Havlíček, Z., Pospíšilová, D. Deparment of Animal Morphology, Physiology and Genetics, Mendel University, Zemedelska 1, 61300 Brno, Czech Republic

Abstract The aim of the study was to analyze the dog behavior in public places. It was observed 412 dogs. Interactions were more frequently observed between puppies than between adult dogs. Male dogs more often interested in the interaction with female dogs than vice versa. Interactions were more frequently found between dogs which were led by women than men. Further research is needed to understand the behavior of dogs on walks.

Úvod Nedostatek pohybu je jednou z hlavních příčin nárůstu civilizačních chorob spojených s obezitou (Bauman, 2004). Procházky jsou nenáročnou fyzickou aktivitou, která může kladně ovlivnit lidské zdraví. Bylo zjištěno, že vlastníci psů v porovnání s ostatními lidmi tráví více času formou mírné fyzické aktivity (Brown and Rhodes, 2006). Existuje řada faktorů, které stimulují majitele k procházkám se svými psy. Současně je však i celá řada faktorů, které na ně působí zcela opačně. Psi na procházkách se svými majiteli totiž přicházejí do kontaktu s cizími psy. S tím souvisí fakt, že řada majitelů se bojí útoku cizích psů na jejich psa (Cutt et al., 2007). Poznatky o tom, jak se chovají psi při vzájemných setkáních na procházkách v parcích a dalších veřejně přístupných místech, jsou dosud útržkovité (Westgarth et al., 2008). Práce je zaměřena na nejčastější interakce mezi psy na veřejných prostranstvích.

Materiál a metody Pozorování bylo uskutečněno na 412 psech různých plemen. Sledování psů probíhalo v průběhu roku 2011. Pozorování bylo prováděno v Brně v oblastech s vyšší frekvencí výskytu psů. Místem pozorování byly parky, které jsou často využívány k procházkám se psy. Dále bylo sledování uskutečněno v dalších vhodných lokalitách pro vycházky se psy. Chování psů bylo pozorováno od okamžiku, kdy si jeden pes všimnul druhého psa, a probíhalo až do okamžiku, kdy psi nebo majitelé setkání ukončili nebo si psi začali hrát. Bylo sledováno vzájemné očichávání a rovněž reakce psů na očichávání. Pozorován byl také zájem 167 | P a g e


May 24-25th 2012

o hru. Zaznamenáno bylo také značení močí, které proběhlo v souvislosti se vzájemným setkáním. Všechna pozorování byla prováděna pozorovatelem, který žádným způsobem neovlivňoval chování sledovaných psů a ani jejich majitelů. Informace byly shromažďovány písemně a následně přepsány do Excelu. Při analýze faktorů ovlivňujících chování pozorovaných dvojic psů byly vyhodnoceny následující vlivy: způsob vedení psa, věk a pohlaví psa a pohlaví majitele. Vliv jednotlivých faktorů byl testován chí-kvadrát testem.

Výsledky Při setkání dvou psů vedených na vodítku bylo vzájemné očichávání častěji pozorováno mezi psy opačného než stejného pohlaví (P < 0,05). Tento rozdíl však nebyl zaznamenám mezi jedinci vedenými na volno. Věk psů neměl průkazný vliv na očichávání psů vedených na vodítku ani na volno. Při setkání dvou psů vedených na volno dvěma ženami bylo očichávání pozorováno častěji než při setkání dvou psů vedených muži (P < 0,05). Při setkání dvou psů vedených na vodítku častěji značil pes, když potkal fenu (P < 0,01), než naopak. Věk psů neměl průkazný vliv na značení psů vedených na vodítku ani na volno. Při setkání dvou psů vedených na volno nebyl zjištěn vliv pohlaví majitele na značení psů. Podobné zjištění bylo dosaženo i u psů vedených na vodítku. Při setkání dvou psů vedených na vodítku si jedinci různého pohlaví hráli častěji než jedinci stejného pohlaví (P < 0,001). Štěňata vedená na vodítku i na volno si hrála častěji než dospělí a staří psi (P < 0,01). Při setkání dvou psů vedených na volno dvěma ženami byla hra pozorována častěji než při setkání dvou psů vedených muži (P < 0,01).

Závěr Interakcím mezi psy v parcích a dalších veřejných prostranstvích byla dosud věnována malá pozornost. Znalost přirozených projevů psů při vzájemných komunikujících na veřejných prostranstvích může kladně ovlivnit rozhodovací proces majitelů psů, zda chodit či nechodit se psem na procházky.

Poděkování Práce byla zpracována za podpory výzkumného záměru č. MSM 6215648905.

168 | P a g e


May 24-25th 2012

Použitá literatura Bauman, A.E. Updating the evidence that physical activity is good for health: an epidemiological review 2000-2003. J. Sci. Med. Sport, 2004, 7, 6-19. Brown, S.G., Rhodes, R.E. Relationships among dog ownership and leisure-time walking in Western Canadian adults. Am. J. Prev. Med., 2006, 30, 131-136. Cutt, H., Giles-Corti, B., Knuiman, M., Burke, V. Dog ownership, health and physical activity: a critical review of the literature. Health Place, 2007, 13, 261-272. Westgarth, C., Pinchbeck, G.L., Bradshaw, J.W., Dawson, S., Gaskell, R.M., Christley, R.M. Dog-human and dog-dog interactions of 260 dog-owning households in a community in Cheshire. Vet. Rec., 2008, 162, 436-442.

169 | P a g e

May 24-25th 2012


INFLUENCE OF THE SPECIES AND CONSERVATION ADDITIVES ON THE QUALITY AND SAFETY OF SILAGES Skládanka, J.1, Nedělník, J.2, Doležal, P.1, Lindušková, H.2, Nawrath, A.1. 1

Ústav výživy zvířat a pícninářství. Mendelova univerzita v Brně,

2

Výzkumný ústav pícninářský , s. r. o. Troubsko

Abstract The work evaluate occurrence of ergosterol and mycotoxins in green matter of grasses and their silages. A higher occurrence of mycotoxins in the feed may be expected and the related damage to animal metabolism may affect the number of diseased animals and/or diagnostics of animal diseases with consequent impact on animal production efficiency, health of animals and breeding economics. Mycotoxins were detected in all evaluated samples. Deoxynivalenol, zeralenone and T2 toxin were detected in green matter and silages. Increase of ergosterol content (P<0.05) over the year is indicative growing contamination of matter with mold. However between of ergosterol content and mycotoxins content was not correlation. Lower content of ergosterol (P<0.05) was at Festulolium pabulare. Use of silage additives did not decrease content of mycotoxins.

Úvod Zimní krmná dávka může být založena na konzervované píci z travních porostů. Ve srovnání s výrobou sena je výroba siláží spojena s nižšími ztrátami a není tak závislá na povětrnostních podmínkách (Achilles et al., 2002). Využití biologických inkulantů může přispět ke zvýšení kvality fermentačního procesu (Jatkauskas et al., 2010). Silážní aditiva ovšem neřeší všechny problémy. Předpokladem výroby zdravotně bezpečných siláží je čistá a zdravá fytomasa (Holubek et al., 2007). Rozvoj mikrokopických hub může souviset s tvorbou mykotoxinů (Opitz von Boberfeld et al., 2006). Sekundární metabolity hub jsou příčinou ekonomických ztrát a poklesu kvality živočišných produktů, v neposlední řadě negativně ovlivňují zdravotní stav zvířat (Opitz von Boberfeld, 1996). V zelené píci z travních porostů může být detekován zearalenon nebo deoxynivalenol (Skládanka et al., 2011). Z pole přechází tyto mykotoxiny do siláží. Zvýšená tvorba nastává za chladnějšího a vlhčího počasí ve vegetačním období (Thalmann, 1986). Vedle přímého působení na přežvýkavce ovlivňuje kontaminovaná píce také mikroorganismy v bachoru (Wolf, 2002). Přítomnost plísní je možné detekovat prostřednictvím ergosterolu. Ergosterol patří mezi hlavní steroly 170 | P a g e


May 24-25th 2012

produkované nižšími i vyššími houbami. Jeho výskyt v jiných organismech je velmi omezený, pouze v některých bakteriích a kvasinkách byly nalezeny zanedbatelné koncentrace ergosterolu v sušině. Díky tomuto specifickému výskytu je prakticky možné spojit nález tohoto sterolu s přítomností plísní ve zkoumaném vzorku (Marin et al., 2007). Cílem práce je posoudit obsah ergosterolu a mykotoxinů v zelené píci a silážích ošetřených různými silážními aditivy.

Materiál a metody Prvním hodnoceným faktorem byl travní druh (TD): Lolium perenne (cv. Kentaur), Festulolium pabulare (cv. Felina), Festulolium braunii (cv. Perseus) a směsi těchto druhů s Festuca rubra (cv. Gondolin) nebo Poa pratensis (Slezanka). Travní porosty byly využívány jako třísečné, termíny odběru (TA) byly počátkem června, počátkem července a koncem vegetačního období (postupné odběry v říjnu, listopadu a prosinci). Píce z první seče byla využita pro výrobu siláží. Trávy zavadaly po dobu 20 – 30 hodin. V této souvislosti bylo dalším hodnoceným faktorem použité silážní aditivum (SA): kontrolní neošetřené siláže, chemický konzervant (kyselina mravenčí, kyselina propionová) a probioenzymatický inokulant (Enterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Pediococcus acidilactici, Lactobacillus salivarius, celuláza. Hemiceluláza a amyláza), (1x1011 CFU; 10 g.t-1). Dávka chemického aditiva byla 4 l.t-1 a dávka biologického aditiva byla 10 g.t-1. Biomasa byla konzervována v kontejnerech o průměru 0,15 m a výšce 0,64 m. Mykotoxiny byly stanoveny metodou ELISA, hodnocen byl obsah deoxynivalenolu (DON), zearalenonu (ZEA), fumonisinu (FUM), aflatoxinu (AFL) a T2 toxinu (T2), (Nedělník a Moravcová, 2006). Ergosterol byl stanoven na HPLC podle Dohnala et al. (2007). Data byla vyhodnocena statistickým softwarem STATISTICA.CZ, verze 8.0. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměrné hodnoty (x). Rozdíl mezi průměry byl hodnocen metodou ANOVA a následným testováním Tukeyovým testem.

Výsledky a diskuse Festulolium pabulare mělo ve srovnání s ostatními druhy nižší obsah ZEA (Tab. 1). Odolnost tohoto druhu vůči houbovým chorobám dokazuje obsah ergosterolu. Jeho obsah byl u Festulolium pabulare nižší (P<0,05) než u Festulolium braunii. Obsah ergosterolu se postupně zvyšoval (P<0,05) od června až do prosince. Naproti tomu v případě mykotoxinů je zřejmý vysoký (P<0,05) obsah DON v červenci a vysoký (P<0,05) obsah ZEA v červenci a 171 | P a g e


May 24-25th 2012

říjnu. I přes vysoký (P<0,05) obsah ergosterolu v listopadu a prosinci byl v těchto měsících zaznamenán nízký (P<0,05) obsah ZEA. Tato skutečnost může souviset s poklesem teplot, kdy se u plísní snižuje produkce mykotoxinů, které jsou obecně reakcí na stres související s vyššími teplotami. V zelené píci z první seče (Tab. 2) byly detekovány mykotoxiny deoxynivalenol a T2 toxin. Ostatní hodnocené mykotoxiny fumonisiny, aflatoxiny a zearalenon byly pod hranicí detekce (
172 | P a g e


May 24-25th 2012

Tab. 2 Obsah deoxynivalenolu (DON), fumonisinu (FUM), aflatoxinu (AFL), zearalenonu (ZEA), T-2 toxinu (T2) a ergosterolu (ERGO) v zelené píci trav (Contents of deoxynivalenol (DON), fumonisin (FUM), aflatoxin (AFL), zearalenone (ZEA) and ergosterol (ERGO) in green matters of grasses) Faktor DON FUM AFL ZEA T2 ERGO (ppb) (ppb) (ppb) (ppb) (ppb) (mg.kg-1 suš.) Druh (TD) Lolium perenne 19,80
Tab. 3 Obsah deoxynivalenolu (DON), fumonisinu (FUM), aflatoxinu (AFL), zearalenonu (ZEA), T-2 toxinu (T2) a ergosterolu (ERGO) v silážích (Content of deoxynivalenol (DON), fumonisin (FUM), aflatoxin (AFL), zearalenon (ZEA), T-2 toxin (T2) and ergosterol (ERGO) in grass silages) Faktor DM DON FUM AFL ZEA T2 ERGO (%) (ppb) (ppb) (ppb) (ppb) (ppb) (mg.kg-1 suš.) Druh (TD) Lolium perenne 30,17 141,39
173 | P a g e


May 24-25th 2012

Závěr Již při hodnocení zelené píce byl na poli zaznamenán výskyt mykotoxinů. Jednalo se zejména o deoxynivalenol a T2 toxin. Obsah zearalenonu byl v období sklizně počátkem června pod hranicí detekce (
Poděkování Práce byla zpracována s podporou grantu Národní agentury pro zemědělský výzkum č. QH71041 „Vliv patogenních mikroorganismů a jejich sekundárních metabolitů na kvalitu a hygienickou nezávadnost objemných krmiv“.

Použitá literatura Achilles, W., M. Golze, H. J. Herrmann, W. Opitz von Boberfeld, R. Wassmuth a K. Zeeb. Ganzjährige Freilandhaltung von Fleischrindern, Darmstadt, KTBL, 2002. Dohnal, V., Kaderová, I., Ježková, A., Skládanka, J. Obsah ergosterolu u vybraných druhů trav na konci vegetačního období. Acta univ. Agric. et silvic. Mendel. Brun., 2007, 55, 9 14. Holúbek, R, J. Jančovič, H. Gregorová, J. Novák, E. Ďurková a L. Vozár. Forages management of forage growing and utilization, Nitra, SPU Nitra, 2007. (In Slovak) JATKAUSKAS, J., Vrotniakiene, V., Aragón, Y.A. Fermentation quality and nutritive value of grass-legume silage treated with inoculant BioStabil Plus. In 14th International Symposium Forage Conservation, Brno, Mendel University in Brno, 2010, 45–47. Marin, S., Vinaixa, M., Brezmes, J., Llobet, E., Vilanova, X., Correig, X., Ramos, A. J., Sanchis, V. Use of a MS-electronic nose for prediction of early fungal spoilage of bakery products. Int. J. Food Microbiol., 2007, 114, 10-16.

174 | P a g e


May 24-25th 2012

Nedělník, J., Moravcová, H. Mycotoxins and forage crops . Problems of the occurrence of mycotoxins in animal feeds. In 12th International Symposium Forage Conservation, Brno, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 2006, 15–25. Opitz von Boberfeld, W., K. Banzhaf, F. Hrabě, J. Skládanka, S. Kozlowski, P. Golinsky, L. Szeman a J. Tasi. Effect of different agronomical measures on yield and quality of autumn saved herbage during winter grazing – 2nd communication: Crude protein, energy and ergosterol concentration. Czech J. Anim. Sci., 2006, 51, 271–277 Opitz von Boberfeld, W. Changes of the quality including mycotoxin problems of the primary growth of a hay meadow – Arrhenatherion elatioris. Agribiol. Res., 1996, 49, 52–62. Skládanka, J., Nedělník, J., Adam, V., Doležal, P., Moravcová, H., Dohanl, V. Forage as a primary source of mycotoxins in animal diets. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2011, 8, 37-50. Thalmann, A. Fusarientoxine in Futtermitteln und Lebensmittelrohstoffen. Agrar- und Umweltforschung in Baden-Württemberg. Stuttgart, Verl. Eugen Ulmer Stuttgart, Bd. 14, 1986. Wolf, D. On the effect of stand, pre-utilization and date of winter harvest on quality and yield of winter pasture. PhD. Thesis, Justus Liebig University, Giessen, 2002.

175 | P a g e


May 24-25th 2012

EXPRESSION OF CD14 SURFACE RECEPTOR ON APOPTOTIC RESIDENT AND INFLAMMATORY MACROPHAGES FROM BOVINE MAMMARY GLAND Sladek Z.1, Rysanek D.2 1

Department of Animal Morphology, Physiology and Genetics, Mendel University in Brno

2

Department of Immunology, Veterinary Research Institute in Brno

Abstract This paper investigates the association between expression of CD14 and occurrence of apoptosis in resident (RESMAC) and inflammatory (INFMAC) macrophages (MAC) from heifer mammary glands. Our experiments confirmed that the expression of CD14 in bovine mammary gland macrophages is strongly associated with cell vitality. The higher CD14 expression is equal to the higher proportion of dead cells. Further studies will be needed in order to establish a cause and exact effect of CD14 expression on apoptosis, particularly in situ during inflammatory response.

Introduction In the healthy mammary gland of heifers, macrophages are the predominant cell type (Wardley et al., 1976). These cells are generally known to be critical mediators both of innate and adaptive immunity against bacterial infections. CD14, a glycosylphosphatidylinositollinked receptor, serves as a key receptor for Gram-negative and Gram-positive bacteria. In blood mononuclear cells, the expression of CD14 is strongly associated with cell vitality. It was observed that the activating stimuli (IL-1, TNF-α, LPS) which are able to enhance CD14 expression, rescue blood monocytes from programmed cell death - apoptosis (Haidenreich et al., 1997). However, the question is whether we can expect anti-apoptotic effects of CD14 also in mammary gland macrophages in situ in comparison to blood monocytes in vitro. Therefore, the aim of the presented study was to evaluate a possible relationship between the apoptosis and CD14 expression in different types of macrophages obtained before and after the inflammatory response induced by CD14 dependent and independent agents.

Materials and methods The experiments were carried out on eight virgin, clinically healthy, Holstein x Bohemian Red Pied crossbred heifers, aged 15 to 18 months. Three samples of mammary 176 | P a g e

May 24-25th 2012


gland macrophages were obtained. The first sample was obtained from untreated mammary glands of heifers (resident -

RESMAC),

the second sample from mammary gland following

PBS infusion, and the third sample following LPS infusion (inflammatory - INFMAC). A modified urethral catheter (AC5306CH06, Porges S.A., France) was inserted into the teat canal of each quarter after thorough disinfection of the teat orifice with 70% ethanol. Each mammary quarter was infused with 20 mL of PBS, massaged and containing resident cell population was retrieved through the catheter. Immediately after harvesting resident cells, the mammary glands were infused as before with 20 mL of PBS or 10 µg of LPS (LPS of Escherichia coli serotype O128:B12, Sigma, St. Louis, Mo., USA) diluted in 20 mL of PBS. Samples of the mammary gland inflammatory cell populations were obtained by lavage 24 h after treatment. Immediately after harvesting, macrophages were divided into two parts. The first one was immediately analyzed as a fresh population. The reminder samples were incubated in vitro. The blood and mammary gland cells adjusted suspensions were inserted into Corning microplates (Costar Ultraplates, Myriad Industries, CA, USA) and were incubated at 37°C in thermostat with a 5% CO2 atmosphere for up to 6 h in accordance with Newman et al. (1982). Flow cytometry (FCM) analysis was used for determination of the differential counts, for detection of apoptosis and necrosis in cells, and for detection of CD14 expression in apoptotic and necrotic cells. Instrument setting for FCM was set to analyze 20,000 cells per sample. Final dot plots were evaluated qualitatively and quantitatively using the CellQuest software analysis (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Apoptotic and necrotic macrophages were analyzed after being simultaneously stained with Annexin-V labeled with FITC and propidium iodide (PI) as described by Vermes et al. (1995). Moreover, we used tricolor labeling for detection of CD14 expression in apoptotic and necrotic monocytes and macrophages. The FCM analysis strategy for identifying one color positive - living cells (CD14+/AnnexinV-/PI-), two color positive - apoptotic (CD14+/AnnexinV+/PI-), and three color positive - necrotic cells (CD14+/AnnexinV+/PI+) is illustrated in Figure 1.

177 | P a g e

May 24-25th 2012


Figure 1.

Results The proportions of macrophages, CD14+, apoptotic and necrotic cells in all fresh macrophage populations (Tab. 1). Tabl. 1 The differential count and proportion of CD14+, apoptotic and necrotic cells in fresh population of RESMAC and INFMAC Fresh cell populations

Differential cells counta 27.3 ± 7.6

CD14+ cellsb 57.9 ± 12.1

Apoptotic cellsb 6.2 ± 2.2

Necrotic cellsb 2.3 ± 1.2

Monocytelike cells RESMAC Vacuolized 29.7 ± 5.5 77.4 ± 17.1 22.9 ± 5.1 16.5 ± 7.3 cells Monocyte15.5 ± 4.2 59.6 ± 14.1 3.2 ± 1.2 3.8 ± 1.2 INFMAC like cells after PBS Vacuolized 5.5 ± 2.2 56.3 ± 9.6 3.1 ± 1.1 11.1 ± 4.6 cells Monocyte3.1 ± 1.1 39.2 ± 8.1 5.3 ± 2.1 10.3 ± 4.4 INFMAC like cells after LPS Vacuolized 2.7 ± 1.7 44.3 ± 6.3 5.5 ± 1.7 15.3 ± 3.8 cells a The differential cell count was set from all cell types presented in mammary gland (macrophages, neutrophils and lymphocytes). b The proportions of CD14+, apoptotic and necrotic cells were determined from macrophage populations only.

178 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab. 2 In vitro time-dependent proportion of live, apoptotic and necrotic cells in population of CD14+ macrophages measured by tricolor immunofluorescence in flow cytometry.

CD14+ RESMAC

CD14+ INFMAC - PBS

CD14+ MAC - LPS INF

Live cells

Apoptotic cells

Necrotic cells

Monocyte-like cells

85.1 → 77.4*

11.2 → 18.1*

3.7 → 4.5

Vacuolized cells

80.5 → 74.6

13.2 → 13.3

6.3 → 12.1*

Monocyte-like cells

86.4 → 71.8*

10.5 → 15.5*

3.1 → 12.7 *

Vacuolized cells

57.9 → 43.7

28.5 → 37.9

13.6 - 18.4

Monocyte-like cells

54.3 → 38.4

23.3 → 26.1

22.4 → 35.5

Vacuolized cells

25.2 → 14.2*

12.5 → 14.3

62.3 → 71.5

Data are mean in percentages and significant differences are marked by asterisks (*P < 0.05, **P < 0.01, Scheffé´s method). The comparisons were made among 0 hour samples relative to 6 hour samples during cultivation in vitro.

As is evident from the results of tricolor labeling (Tab. 2), in population of CD14+ macrophages were observed differing proportions of living, apoptotic and necrotic cells. While in population of CD14- macrophages we were observed mostly living cells. In CD14+ macrophages, the highest proportion of living cells was observed in monocyte-like after PBS and the smallest in vacuolizated

INFMAC

INFMAC

after LPS. In vitro cultivation leads to

decrease the proportion of living cells in all categories of macrophages. However, significant differences were observed only in monocyte like RESMAC (P < 0.05), monocyte like INFMAC after PBS (P < 0.01) and finally in vacuolized

INFMAC

after LPS (P < 0.05). In CD14+

macrophages, the highest proportion of apoptotic cells was observed in vacuolized

INFMAC

after PBS. In contrast to living cells, in vitro cultivation leads to increase the proportion of apoptotic cells in all categories of macrophages. Interestingly, this increase was significant only in monocyte like RESMAC (P < 0.05). In CD14+ macrophages, the highest proportion of necrotic cells was observed in vacuolized

INFMAC

after LPS. Similarly to apoptotic cells, in

vitro cultivation leads to leads to increase the proportion of necrotic cells in all categories of

179 | P a g e

May 24-25th 2012


macrophages, except vacuolized

INFMAC

after PBS. However, the increase was significant

only in vacuolized RESMAC (P < 0.05) and in monocyte like INFMAC after PBS (P < 0.05).

Conclusion The analysis of CD14+ macrophages revealed that almost all apoptotic and necrotic macrophages were CD14+ cells. In all categories of CD14+ macrophages, proportion of live cells decreased, and proportion of apoptotic and necrotic cells was increased during cultivation. This is very interesting situation, because it suggests that the increase of CD14 expression is due to the increase of apoptotic and necrotic cells. Thus, our experiments confirmed that the expression of CD14 in bovine mammary gland macrophages is strongly associated with cell vitality. The higher CD14 expression is equal to the higher proportion of dead cells. Further studies will be needed in order to establish a cause and exact effect of CD14 expression on apoptosis, particularly in situ during inflammatory response.

Acknowledgements This study was supported by the Ministry of Agriculture of the Czech Republic (MZE 0002716201).

References Heidenreich, S. M., Schmidt, C., August, P,. Cullen, A., Rademaekers, Pauels, H. P. Regulation of human monocyte apoptosis by the CD14 molecule. J. Immunol., 1997, 159, 3178-3188. Wardley R.C., Rouse B.T., Babiuk L.A. The mammary gland of the ox: a convenient source for the repeated collection of neutrophils and macrophages. J. Reticuloendothel. Soc. 19, 29-36.

180 | P a g e

May 24-25th 2012


THE EFFECT OF DIOSMECTITE SUPPLEMENTATION ON IMMUNE RESPONSE IN WEANED PIGLETS Slámová, R.,1 Sláma, P.,2 Přikrylová-Vondrušková, H.,1 Trčková, M.,1 Zralý, Z.,1 Pavlík, 2 A., Pavlík, I.1 1

Department of Food and Feed Safety, Veterinary Research Institute, Brno, Czech Republic

2

Department of Animal Morphology, Physiology and Genetics, Mendel University in Brno, Czech Republic

Abstract The aim of this study was to assess the effect of diosmectite supplementation on the course of post-weaning diarrhoeal infection in piglets. Twenty four weaned piglets at the age of 28 days were divided into two dietary treatments: control (C) and smectite (S). Piglets were fed a basal starter diet without (C) or with (S) 2% of diosmectite for 20 days. At the end of the trial, 2 piglets from each group were slaughtered and samples of blood and small intestine were taken. In our trial diosmectite was not effective in alleviation or shortening of diarrhoea in weaned piglets. However, diosmectite supplementation had a positive effect on intensity and course of intestinal inflammation. There were no observations of enteritis or only light chronic form of enteritis in the smectite group contrary to the control group with sub-acute or chronic enteritis. The influence of diosmectite supplementation on the inflammatory response (production of TNF-α and TGF-β1) was recorded.

Introduction The weaning period is one of the most important and crucial period in pig breeding. The transition from mother’s milk to dry feed and stress factors of weaning result in development of diarrhoeal diseases. In weaning pigs diarrhoeal diseases are mainly caused by enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) and they are by far the most common diseases in weaning period and considered as a major economic problem (Melin et al., 2004; Vondruskova et al., 2010). Dioctahedral smectite (diosmectite) is a natural aluminomagnesium silicate clay effectively used in the treatment of infectious diarrhoea (Gonzalez et al., 2004; Slamova et al., 2011). Its anti-diarrhoeal properties involve the adhesion to digestive mucus and absorption of toxins. Diosmectite has the capacity to absorb endotoxins, exotoxins, bacteria and rotaviruses (Szajewska et al., 2006). A multifactorial effect of this mineral is supposed, however, the mechanism of action of diosmectite has not been fully explained yet (Dupont

181 | P a g e


May 24-25th 2012

and Vernisse, 2009). Clinical studies demonstrated that diosmectite alleviated the symptoms of acute diarrhoea and shortened its duration (Szajewska et al., 2006), reduced the frequency of liquid stools and long-lasting diarrhoeal episodes (Gonzalez et al., 2004). Smectite also alters the activity of bile salts and physical properties of gastric mucus, which prevents mucolysis induced by bacteria (Szajewska et al., 2006). Pathogenic bacteria that penetrate the intestinal epithelial barrier stimulate an inflammatory response in the intestinal mucosa. A number of different cell types produce cytokines that play an essential role in intercellular communication (Jung et al., 1995). This coordinate regulation of specific groups of cytokines has important consequences for the host response to microbial pathogens since resistance or susceptibility can correlate closely with the specific group of cytokines expressed. The levels of inflammatory cytokines may suggest the course of inflammation. Cytokines can be categorized based on their major activities. For example, the cytokines TNF-α, IL-1 and GM-CSF can activate a spectrum of proinflammatory effects, whereas cytokines such as TGF-β1 and IL-10 can mediate effects that down-regulate inflammatory responses (Wahl, 1992; Slama et al., 2011). Gonzalez et al. (2004) presented that diosmectite was effective in controlling hapten-induced colonic inflammation, through a mechanism that may involve adsorption of proteins, mucus protection and possibly a direct modulation of the production of proinflammatory mediators by the colonic mucosa. Therefore the present study deals with immune response after diosmectite supplementation during the diarrhoeal infection caused by ETEC.

Material and Methods The effect of diosmectite and diarrhoeal infection on immune response was evaluated by the estimation of cytokines TNF-α as the pro-inflammatory cytokine, and TGF-β1 cytokine that represents anti-inflammatory cytokine group. Twenty four weaned piglets of the breed Pietrain x (Large White x Landrace) were bought from a conventional herd with animals often affected by diarrhoea. Piglets weaned on day 28 of life were allocated according to their body weight into two dietary treatments: control (C) and smectite (S), with 12 animals in each group. Piglets with the initial average live body weight of 9.4 kg (C) and 9.22 kg (S), respectively, were fed a basal starter diet without (C) or with (S) 2% of diosmectite (Beaufour Ipsen Pharma, France) for 20 days. Piglets were fed twice a day ad libitum, water was provided by automatic waterers. At the end of the trial, blood samples from each piglet were taken and two piglets from each group were slaughtered for the histopathological examination and gut samples. 182 | P a g e


May 24-25th 2012

For the TNFα and TGF-β1 assay, samples of duodenum, jejunum, ileum and blood were taken. Blood samples were drawn from vena cava cranialis and cytokine concentrations were measured in the blood serum. The samples of duodenum, jejunum and ileum (10 cm fragments) were removed after abdominal dissection of the slaughtered pigs (aged 48 days). The intestinal fragments were staple fixed to prevent chyme evacuation. Then they were placed into the tubes with 20 ml cold PBS. The fragments were longitudinally opened and together with the chyme, they were incubated for 10 min in shaking bath. The samples were centrifuged at 3000 x g for 5 min and the supernatants were kept at -80°C until assay. Cytokines concentrations were quantified by ELISA (eBioscience, San Diego, CA, USA).

Results TNF-α production corresponded with immune responses on bacterial colonization and inflammation in the guts but no significant differences among groups were determined. The TNF-α contents differed in the individual segments of the small intestines and there was measured no concentration of TNF-α in the blood (Table 1).

Tab. 1 Concentration levels of TNF-α and TGF-ß1 in small intestines and blood serum TNF-α (pg/ml) C S duodenum 3069.15 3339.11 jejunum 146.44 below detection limit ileum 646.24 664.67 blood serum 0 0 TGF-ß1(pg/ml) duodenum 204.96 0 jejunum 142.45 0 ileum 0 0 blood serum 1737.05 4692.1

The highest concentration of TNF-α was measured in duodenum whereas the lowest content of TNF-α was in jejunum and ileal concentration of TNF-α was similar for both groups. Concentrations of TGF-β1 in intestinal samples were low opposite to blood values and they did not show such variability in individual segments as TNF-α (Table 1). There were measured no concentrations of TGF-β1 in duodenum (S), jejunum (S) and ileum (C). Intestinal TNF-α concentration were similar for both groups and were not affected by the diet. There was measured no TNF-α in the blood. TGF-β1 concentration was low or not detected in intestinal samples whereas its values were high in the blood. It seems that concentration of TGF-β1 tented to be higher in blood samples of smectite group.

183 | P a g e


May 24-25th 2012

Discussion Clinical studies demonstrated that diosmectite alleviated the symptoms of acute diarrhoea and shortened its duration (Szajewska et al., 2006), and reduced the frequency of liquid stools and long-lasting diarrhoeal episodes (Gonzalez et al., 2004). Despite results noted above, we did not observe any effect on duration of diarrhoea and/or reduction of liquid stools in our experiment. These discrepancies could be explained by poor feed intake by piglets during the infection that resulted in the insufficient diosmectite ingestion. The insufficient intake of diosmectite pointed on the dose-dependent effect of this clay mineral. There is an ability of clay minerals to bind bacteria and some studies documented that some clay minerals may have an antibacterial effect on various microorganisms (Haydel et al., 2008). As the shedding of ETEC in piglet faeces was not affected by the diet, it seems that diosmectite did not show any bactericide effect on ETEC in piglets. However this could be also associated with poor feed intake of piglets. There was a sooner start and sooner relief of ETEC infection in smectite group contrary to control group. The differences between smectite and control group could be caused by different infectious pressure in the pens. Despite the lack of diosmectite impact on the clinical course of diarrhoea in piglets, diosmectite improved the morphological structure of the intestines and had a positive effect on the reparation of intestinal mucosa. Also Gonzalez et al. (2004) proved the positive effect of diosmectite on the morphological structure of the intestines such as intestinal weight, macroscopic damage, necrotic area and histology administered as a post-treatment in rats with induced chronic colitis. There are some mechanisms of action of diosmectite that were presented to explain the diosmectite effects. There has been demonstrated that diosmectite protects intestinal mucosa by interactions with digestive mucus. Mucoprotective properties and increased production of mucus were observed. The study of Szajewska et al. (2006) presented that smectite alters the activity of bile salts and physical properties of gastric mucus, which prevents mucolysis induced by bacteria. Some authors point out potential of diosmectite play a role in the modulation of immune response. Cytokine concentration is widely used to assess the response to pathogens and antigens, both in experimental animal models and in human. Cytokines play an important role in the mucosal immune response. They are involved in regulation of metabolism and nutrient absorption (Zhao et al., 2008). Cytokines are also important agents that modulate inflammation. In our experiments, we focused on analysis of one pro-inflammatory cytokine (TNF-α) and one anti-inflammatory cytokine (TGFβ1) in blood serum and small intestine. Course of inflammation depends on balance between pro-inflammatory and anti184 | P a g e


May 24-25th 2012

inflammatory cytokines. In our trial, TNF-α concentration did not differ in the smectite and control group however the histological examination showed better intestinal structure in smectite group which is in agreement with the information above. The intestinal barrier is weakened by the release of proinflammatory cytokines in many digestive diseases. It has been demonstrated that TNF-α weakens the intestinal barrier through the tight junctions and increases its permeability, and diosmectite counteracts this disruption (Gonzalez et al., 2004). Also Szajewska et al. (2006) observed that smectite enhances the absorption of water and electrolytes and restores the barrier of human intestinal cell monolayers after exposure to TNF-α. We measured these cytokines in three different parts of small intestine (duodenum, jejunum and ileum). TNF-α was not found in blood serum, but it was measured in small intestine. There were significant differences between concentration of TNF-α in different part of small intestine with no significant differences between control and smectite group of weaned piglets. On the other hand, TGFβ1 was measured in blood serum, but not in small intestine. The concentration of TGFβ1 in control group was significant differ from pigs fed with diosmectite. Gonzalez et al., (2004) demonstrated that diosmectite restored the epithelial barrier defect induced by the TNF in the intestinal cell line FT29-19A. These were demonstrated by the significant decrease in ionic conductance and the decreases in mannitol and horseradish peroxidase permeabilities. The mechanism of that is unknown, but those authors suggest that diosmectite may reduce the consequences of intestinal inflammation by acting from luminal side of the epithelium.

Acknowledgements This study was supported by grants of the Ministry of Agriculture of the Czech Republic (Grants No. MZe 0002716202 and MZE QJ 1210112) and the Ministry of Education, Youth and Sports (AdmireVet; Grant No. CZ 1.05/2.1.00/01.0006-ED006/01/01).

References Dupont, C., Vernisse, B. Anti-diarrheal effects of diosmectite in the treatment of acute diarrhea in children: a review. Paediatr. Drugs, 2009, 11, 89–99. Gonzalez, R., Sanchez de Medina, F., Martinez-Augustin, O., Nieto, A., Gálvez, J., Risco, S., Zarzuelo, A. Anti-inflammatory effect of diosmectite in hapten-induced colitis in the rat. Br. J. Pharmacol., 2004, 141, 951–960.

185 | P a g e


May 24-25th 2012

Haydel, S.E., Remenih, C.M., Williams, L.B. Broad-spectrum in vitro antibacterial activities of clay minerals against antibiotic-susceptible and antibiotic-resistant bacterial pathogens. J. Antimicrob. Chemother., 2008, 61, 353–361. Melin, L., Mattsson, S., Katouli, M., Wallgren, P. Development of post-weaning diarrhoea in piglets. Relation to presence of Escherichia coli strains and rotavirus. J. Vet. Med. B – Infect. Dis. Vet. Pub. Health, 2004, 51, 12–22. Slama, P., Sladek, Z., Slamova, R., Pavlik, A. Production of bovine IL-10 following stimulation with lipopolysaccharide and muramyl dipeptide. FEBS J., 2011, 278, 304304. Slamova, R., Trckova, M., Vondruskova, H., Zraly, Z., Pavlik, I. Clay minerals in animal nutrition. Appl. Clay Sci., 2011, 51, 395-398. Szajewska, H., Dziechciarz, P., Mrukowicz, J. Meta-analysis: Smectite in the treatment of acute infectious diarrhoea in children. Aliment. Pharmacol. Ther., 2006, 23, 217–227. Vondruskova, H, Slamova, R., Trckova, M., Zraly, Z., Pavlik, I. Alternatives to antibiotic growth promoters in prevention of diarrhoea in weaned piglets: a review. Vet. Med., 2010, 55, 199-224. Wahl, S.M. Transforming growth factor beta (TGF-beta) in inflammation: a cause and a cure. J. Clin. Immunol., 1992, 12, 61–74. Zhao, J., Harper, A.F., Webb, K.E., Jr., Kuehn, L.A., Gilbert, E., Xiao, X., Wong, E.A. Cytokine mRNA expression in the small intestine of weanling pigs fed diets supplemented with specialized protein or peptide sources. Asian-Aust. J. Anim. Sci., 2008, 21, 1800–1806.

186 | P a g e


May 24-25th 2012

THE EFFECT OF GLYCEROL ON RABBIT SPERMATOZOA MOTILITY Slanina, T., Bíziková, K., Massányi, P. Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitra, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Katedra fyziológie živočíchov, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovenská Republika, email: [email protected]

Abstract The target of our study was to evaluate the effect of crude and pure glycerol on rabbit spermatozoa motility parameters in vitro. Semen samples of New Zealand White rabbit breed were used in the experiment. After processing, the semen samples were stored in the laboratory at 37˚C in thermostat. For in vitro culture, crude (GC) and pure (PG) glycerol (2, 5, 10%) diluted in physiological saline were used. Each of prepared samples was evaluated using Computer Assisted Semen Analyzer (CASA) system. The total spermatozoa motility ranged in experimental groups in range 18.70 – 52.60% (CG group) and 22.82 – 57.09% (PG group), and these values were significantly lower compared to control group (74.51 – 84.94%). This decrease was dependent on glycerol concentration used in the study as well as on the period of culture. The percentage of progressive motile spermatozoa was significantly lower in group CG (minimum 5.46%) and exactly in group of addition of 10% of crude glycerol. The values in groups with pure glycerol showed time and dose dependent decrease mainly after 3 hours of culture. The percentage of progressive spermatozoa was lower in group CG compared to PG. Results of our study clearly demonstrate negative effect of glycerol in higher concentrations on spermatozoa motility parameters. Key words: rabbit, spermatozoa motility, CASA, glycerol Úvod Glycerol (glycerín, propán–1,2,3–triol) je hygroskopická bezfarebná viskózna kvapalina bez zápachu, sladkej chuti. Je dôležitou biogénnou organickou zlúčeninou, keďže je vo forme svojich esterov súčasťou tukov. Glycerol je slabo jedovatý. V menších dávkach spôsobuje bolesti hlavy, žalúdočné problémy a zvracanie. Vo väčších dávkach môže spôsobiť poškodenie pečene. Najnižšia toxická dávka podaná orálne u človeka činí približne 1,5 g.kg-1 živej hmotnosti, čo znamená, že priemerný človek by ho musel požiť najmenej 90 až 120 g, aby sa u neho prejavili symptómy otravy. V nízkych koncentráciách je prakticky neškodný (Qoja et al., 2011).

187 | P a g e


May 24-25th 2012

Glycerol je využívaný ako kryoprotektant pre rôzne bunky, vrátane cicavčích spermií a embryí vďaka svojím kryopretektívnym vlastnostiam. Hoci glycerol bol úspešne použitý pri kryokonzervácii spermií mnohých druhov, nebol efektívny pri zmrazovaní králičích spermií. Z výsledkov novších výskumov vyplýva, že použitie glycerolu pri zmrazovaní spermií králikov malo za následok extrémne nízku fertilitu (Kashiwazaki at al., 2006). Cieľom tejto práce bolo analyzovať účinok surového a čistého glycerolu na pohybové parametre spermií králikov počas kultivácie in vitro pri teplote 37˚C.

Materiál a metodika V experimente sme hodnotili ejakulát získaný od pohlavne dospelých samcov králikov plemena biely Novozélandský. Po prenose do laboratória boli vzorky riedené pomerom 1 diel ejakulátu a 5 dielov roztoku (glycerol, fyziologický roztok). Ejakuláty boli riedené dvoma formami glycerolu: čistý – PG a surový glycerol – CG, v troch koncentráciách zriedených fyziologickým roztokom: 10, 5 a 2%. Kontrolnú vzorku – K predstavoval ejakulát zriedený čistým fyziologickým roztokom. Pohyblivosť sa hodnotila a porovnávala pri teplote 37°C (termostat) v štyroch časových intervaloch 0, 1, 2 a 3 hodín. Charakteristika použitých glycerolov: Surový glycerol (crude glycerol – CG) o

hmotnostný podiel glycerolu 80,06%; obsah NaCl 7,15%; obsah vody 8,0%; obsah metanolu 0,001%; Cd < 0,01 mg.l-1; Pb < 0,1 mg.l-1; Cu < 0,04 mg.l-1; Mn < 0,03 mg.l-1; Zn – 2,5 mg.l-1; Fe – 15 mg.l-1; Ni – 2,5 mg.l-1; Co – 12,5 mg.l-1; Cr – 7,5 mg.l-1.

Čistý glycerol (pure glycerol – PG) o

obsah minimálne 99,5%; síranový popol maximálne 0,01%; chloridy maximálne 0,001%; ťažké kovy (Pb) maximálne 0,0005%; voda maximálne 0,5%; index lomu 1,470 – 1,474. Na hodnotenie pohyblivosti spermií sme použili CASA systém SpermVision

(Minitub, Tiefenbach, SRN) s mikroskopom Olympus BX 51 (Olympus, Japonsko). Každá vzorka sa umiestni do počítacej komôrky Makler Counting Chamber s hĺbkou 10µm (Sefi – Medical Instrumenst, SRN) a následne umiestnili do zorného poľa mikroskopu. V každej vzorke sa sledovalo percento pohyblivých spermií (%) a percento progresívne pohyblivých spermií (%). V rámci každého merania systém CASA vyhodnotil parametre pohyblivosti z minimálne 7 polí komôrky Makler Counting Chamber.

188 | P a g e

May 24-25th 2012


Na porovnanie výsledkov CASA analýzy v jednotlivých časových obdobiach pri sledovaní vplyvu riedidiel bol použitý štatistický Scheffeho test a štandardný štatistický Studentov t–test. Preukaznosť rozdielov bola hodnotená na hladine preukaznosti p<0,05.

Výsledky a diskusia Po zriedení ejakulátu surovým glycerolom boli pri sledovaní pohyblivosti spermií zaznamenané preukazne nižšie hodnoty oproti kontrolnej vzorke vo všetkých sledovaných vzorkách (CG10, CG5 a CG2) počas celej doby in vitro kultivácie (Graf 1). Motilita spermií sa výrazne znížila v skupinách s prídavkom surového glycerolu (CG10 – 22,98; CG5 – 36,82 a CG2 – 52,60%) v porovnaní s kontrolou skupinou (K – 84,94%) už v čase 0. Tento trend sa zachoval aj počas 1, 2 a 3 hodinovej kultivácii. Rovnaké tendencie boli zistené aj pri meraní percenta progresívne pohyblivých spermií, kde taktiež kontrolná vzorka vykazovala preukazne vyššie hodnoty oproti sledovaným vzorkám (Graf 2).

Graf 1 a 2 Pohyblivosť spermií a progresívna pohyblivosť (%) v testovaných skupinách s prídavkom surového glycerolu (Figure 1 and 2 – Spermatozoa motility and progressive motility (%) in experimental groups with addition of crude glycerol – CG) Motility [%] 100 80 60

Progressive motility [%]

40 20

100

0

80

0

1 K

CG2

2 CG5

3 h.

60 40

CG10

20 0

Už v čase 0 bol rozdiel v progresívnej pohyblivosti

medzi

kontrolou

(77,70%)

0

1 K

CG2

2 CG5

3 h. CG10

a najvyššou hodnotou nameranou u vzorky CG2 (38,77%) až 38,93%, čo poukazuje na negatívny vplyv surového glycerolu na pohyblivosť i progresívnu pohyblivosť spermií králikov. Výsledky našej práce sú veľmi podobné ako predošlé popisované autormi Qoja a kol. (2011). V tejto práci popisujú negatívny efekt surového glycerolu riedeného citrátom sodným (v koncentráciách 5 – 20%) na pohyblivosť spermií králikov. Už hneď po pridaní glycerolu

189 | P a g e

May 24-25th 2012


došlo k preukaznému poklesu pohyblivosti a podobné tendencie boli sledované aj po 60, 120 a 180 minútach kultivácie. Podobne aj ostatné parametre pohyblivosti spermií boli nižšie, čo potvrdzuje negatívny účinok glycerolu vo vyšších koncentráciách na pohyblivosť spermií (Qoja a kol., 2011). V rámci hodnotenia vplyvu čistého glycerolu (PG) na pohyblivosť spermií bola taktiež najvyššia hodnota 84,94 % nameraná u kontrolnej vzorky v čase 0 (Graf 3). Počas celej doby kultivácie boli zaznamenané preukazne vyššie hodnoty u kontrolnej vzorky v porovnaní so všetkými sledovanými vzorkami (PG2, PG5, PG10). Najvyššia pohyblivosť 57,09% v rámci sledovaných skupín bola nameraná vo vzorke PG5. Obdobné tendencie boli zistené taktiež pri progresívnej pohyblivosti, kde taktiež u všetkých sledovaných vzorkách boli zaznamenané preukazne nižšie hodnoty (Graf 4).

Graf 3 a 4 Pohyblivosť spermií a progresívna pohyblivosť (%) v testovaných skupinách s prídavkom čistého glycerolu – PG (Figure 3 and 4 – Spermatozoa motility and progressive motility (%) in experimental groups with addition of pure glycerol – PG) Motility [%]

Dosiahnuté

100

výsledky

naznačujú

negatívny účinok glycerolu na pohybové

80 60

Progressive motility [%]

40 20

100

0

80 0

1 K

PG2

2 PG5

60

3 h.

40

PG10

20

parametre spermií in vitro. Toxický účinok glycerolu na spermiách zaznamenali už Fahy a kol. (1990). Hammerstedt a Graham (1992) informovali

o účinkoch

glycerolu,

0 0

1 K

PG2

2 PG5

3 h. PG10

ktorý

zahŕňal zmeny v cytoplazmatických bunkách, kvôli zvýšenej viskozite a zmenenej polymerizácii tubulínu. Mocé a kol. (2003) porovnávali čerstvé a zmrazené spermie králika z hľadiska ich fertilizačnej schopnosti. Výsledky poukazujú na fakt, že inseminácia samíc čerstvými spermiami sa preukázali lepšie výsledky ako pri inseminácii samíc zmrazenými spermiami. Po oplodnení čerstvými spermiami 79% samíc ostalo oplodnených a po inseminácii

190 | P a g e


May 24-25th 2012

zmrazenými spermiami ostalo oplodnených 61%. Tieto výsledky sú zaujímavé, nakoľko sa glycerol používa pri riedení spermií určených na kryokonzerváciu. Záver Namerané hodnoty pohyblivosti i progresívnej pohyblivosti boli u oboch sledovaných skupinách (CG, PG) preukazne nižšie ako u kontrolnej vzorky. Môžeme teda zhodnotiť, že pridaním glycerolu do ejakulátov došlo k značnému poklesu pohyblivosti i progresívnej pohyblivosti spermií. V rámci porovnania jednotlivých rozdielnych koncentrácií glycerolu, preukazne najnižšie hodnoty voči kontrolnej vzorke boli namerané u vzoriek CG10 a PG10, teda u vzoriek s najvyššou koncentráciou glycerolu (10%). Oproti kontrolnej skupine bol dosiahnutý významne klesajúci charakter s postupným časom in vitro kultivácii. Na záver môžeme skonštatovať, že aj keď je glycerol využívaný v rôznych odvetviach priemyslu, výsledky nášho experimentu naznačujú, že jeho vyššie koncentrácie majú na živočíšne bunky, akými sú spermie, negatívny účinok, ktorý má za následok zníženie pohyblivosti spermií.

Poďakovanie Táto práca bola podporená projektom VEGA č. 1/0532/11.

Použitá literatúra Fahy, G.M., Lilley, T.H., Linsdell, H., Douglas, M.S.J., Meryman, H.T. Cryoprotectant toxicity and cryoprotectant toxicity reduction: Search of molecular mechanisms. Cryobiol., 1990, 27, 247– 268. Hammerstedt, R.H., Graham, J.K. Cryopreservation of poultry sperm: the enigma of glycerol. Cryobiol., 1992, 29, 26–38. Kashiwazaki, N., Okuda, Y., Seita, Y., Hisamatsu, S., Sonoki, S., Shino, M., Masaoka, T., Inomata, T. Comparison of glycerol, lactamide, acetamide and dimethylsulfoxide as cryoprotectants of Japanese white rabbit spermatozoa. J. Reprod. Develop., 2006, 52, 511–516. Mocé, E., Lavara, R., Vicente, J.S. Effect of an asynchrony between ovulation and insemination on the results obtained after insemination with fresh of frozen sperm in rabbits. Anim. Reprod. Sci., 2003, 75, 107–118. Qoja, A.O., Rafajová, M., Massányi, P. The effect of crude glycerol on rabbit spermatozoa motility in vitro. Animal Physiology 2011 : proceedings of scientific publication, Nitra 2011, 457–462.

191 | P a g e


May 24-25th 2012

DIFFERENCES IN CHARACTERISTICS OF CALCIUM METABOLISM AND EGGSHELL QUALITY IN CZECH HEN AND HYBRID LOHMANN WHITE Svobodová J., Tůmová E. Katedra speciální zootechniky, Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů, Česká zemědělská univerzita v Praze

Abstract The aim of the study was to determine differences in eggshell quality, calcium concentration in serum, tibia and eggshell of two white shelled genotypes. In this experiment were included 66 hens Lohmann white and 66 Czech hen housed on litter. Significantly higher eggshell strength (P ≤ 0.002), shell thickness (P ≤ 0.001), calcium content in the shell (P ≤ 0.005) and the serum (P ≤ 0.02) were in Lohmann white. In Czech hen was significantly higher tibia weight (P ≤ 0.02) and tibia strength (P ≤ 0.001). There were no significantly differences in calcium content in tibia. Úvod Vápník patří mezi základní prvky uplatňující se při mnoha metabolických procesech v organismu. Velký význam je u drůbeže přikládán zejména metabolismu vápníku, a to především ve spojitosti s tvorbou vaječné skořápky. Metabolismus vápníku je úzce propojen s fosforem a jejich vzájemný chybný poměr může negativně ovlivnit retenci vápníku (Kebreab a Vitti, 2005). Vápník je přijímán společně s potravou, přes tenké střevo se dostává do krve a odtud je využit pro tvorbu vaječné skořápky. Dalším zdrojem vápníku jsou medulární kosti, které fungují jako dočasný zdroj vápníku v době, kdy není zajištěné dostatečné zásobování vápníku krmivem (Etches, 1987). Informace o metabolismu vápníku lze získat z koncentrace Ca v krvi, ale je třeba brát v úvahu genotypové rozdíly. Suchý et al. (2004) zjistili významně nižší koncentraci Ca v krvi u masných slepic v porovnání s nosnými. Podobně může být ovlivněn i obsah Ca v tibii. Cílem práce bylo zjistit rozdíly v kvalitě skořápky, koncentrace Ca v krevním séru, tibii a ve skořápce dvou bělovaječných genotypů.

Materiál a metodika Pokus byl realizován se slepicemi Lohmann bílý (66 ks) a Česká slepice (66 ks) ustájených na podestýlce (7 ks/m2). Snáška byla hodnocena během celého snáškového cyklu

192 | P a g e


May 24-25th 2012

mezi 20. a 50. týdnem věku ve dvoutýdenním intervalu. Vejce se vážila pravidelně ve čtyřtýdenním intervalu. Rozbory vajec pro stanovení charakteristik kvality skořápky byly prováděny rovněž v intervalu 28 dnů, celkem bylo analyzováno 300 vajec od slepic Lohmann bílý a 150 vajec od České slepice. Stanovoval se podíl skořápky z vejce, tloušťka skořápky (mikrometr QCT, TSS England), pevnost skořápky (přístroj QC-SPA, TSS England). Ve druhé polovině snášky, v 50 týdnech věku bylo analyzováno 10 vajec od každého genotypu na obsah popelovin a vápníku ve skořápce. V tomto věku bylo 24 slepic od každého genotypu zabito, při porážce byla odebírána krev pro stanovení koncentrace Ca v krevním séru. Pro analýzu v krevním séru byly využity komerční standardní kity (Randox Laboratories Ltd., Crumlin, UK) a spektrofotometr Libra S 22 (Biochrom Ltd., UK).

Po zabití byla

vypreparována tibie, zvážena, a stanovena pevnost na přístroji QC-SPA (TSS England). Dále v tibii byly stanoveny popeloviny a obsah Ca. Obsah vápníku ve skořápce a v tibii byl stanoven po spálení v 550 °C, za použití vanado-molybdenového reagentu (metoda AOAC 965.17). Obsah Ca byl analyzován atomovou absorpční spektrometrií při využití zařízení Solaar M6 (TJA Solutions, Cambridge, UK). Výsledky byly zpracovány analýzou variance, metodou Anova, programem SAS. Průkaznost rozdílů byla hodnocena t-testem.

Výsledky a diskuze Dle očekávání byly užitkovost slepic a hmotnost vajec signifikantně (P ≤0,001) vyšší u hybrida Lohman ve srovnání s Českou slepicí, což souviselo s prošlechtěností.

Také

kvalitativní ukazatele skořápky jako je pevnost, tloušťka a podíl skořápky z vejce byly u Lohmanna bílého signifikantně vyšší. To koresponduje například s výsledky Tůmové et al. (2009), kteří uvádějí rozdíly v kvalitě skořápky v závislosti na genotypu s horšími hodnotami u genotypů s nižší prošlechtěností.

193 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab. 1 Ukazatelé kvality skořápky a metabolismu vápníku (Parameters of eggshell quality and calcium metabolism)

Lohmann bílý a

Česká slepice b

Průkaznost 0,001

Snáška (ks)

255

Hmotnost vejce (g)

60

49,2

b

0,001

4541

4347

0,002

0,36

0,34

0,001

Podíl skořápky (%)

12,3

11,8

0,001

Obsah Ca ve skořápce (g/kg)

344

321

0,005

Obsah Ca v krvi (mmol/l)

10,45

5,59

0,02

Hmotnost tibie (g)

4,9

6,1

0,02

Pevnost tibie (N)

429

499

0,001

Obsah Ca v tibii (%)

33,8

35,7

NS

Pevnost skořápky 2

(g/cm ) Tloušťka skořápky (mm)

a

96

Horší kvalitativní ukazatele skořápky mohly souviset s vápníkem ve skořápce, který u hybrida Lohmann bílý dosahoval hodnot 344 g/kg oproti 321 g/kg u České slepice. Tyto výsledky nejsou porovnatelné, protože rozdíly v obsahu Ca ve skořápce podle genotypu v literatuře chybějí. Z dalších sledovaných ukazatelů byl hodnocen obsah vápníku v krvi. Až dvojnásobně vyšší (P ≤ 0,02) byl u nosnic Lohmanna bílého (10,45 mmol/l) ve srovnání s Českou slepicí (5,59 mmol/l). Tyto rozdíly jsou v souladu s údaji Suchého et al. (2004), kteří zjistili nižší koncentraci Ca v séru masných slepic než u nosných. Lze se domnívat, že koncentrace Ca v krvi je závislá na úrovni metabolismu Ca. Ve srovnání s nosnicemi genotypu Lohmann bílý měla Česká slepice signifikantně vyšší hodnoty hmotnosti (6,1 g vs. 4,9 g u Lohmana) a pevnosti (499 N vs 429 N u Lohmana) tibie. Rovněž Vits et al (2005) zjistili průkazné rozdíly v pevnosti tibie u Lohmana LSL a 194 | P a g e


May 24-25th 2012

Lohmana hnědého. Je možné, že pevnost tibie mohla souviset i s obsahem Ca v tibii, který dosahoval neprůkazně vyšších hodnot u České slepice (35,7 %) proti Lohmanovi (33,8 %). Závěr Mezi Českou slepicí a hybridem Lohmann bílý byly nalezeny prokazatelné rozdíly v ukazatelích metabolismu vápníku a kvality skořápky. Na základě získaných výsledků můžeme konstatovat, že ukazatele kvality skořápky, obsah vápníku ve skořápce a obsah vápníku v krvi vykazovaly průkazně vyšší hodnoty u hybrida Lohman bílý. Naproti tomu vyšší hodnoty hmotnosti, pevnosti a obsahu vápníku v tibii byly zaznamenány u nosnic České slepice.

Poděkování Příspěvek byl zpracován při řešení grantu NAZV QI101A164. Použitá literatura AOAC. Official Methods of Analysis. 18th ed., AOAC International, Gaithersburg, MD, USA, 2005. Etches, R. J. Calcium logistics in the laying hen. J. Nutr., 1987, 117: 619 – 628. Kebreab, E., Vitti, D. M. S. S. Mineral metabolism. Pages 469 – 486 in Quantitative Aspects of Ruminant Digestion and Metabolism. Ed. CAB Int., Walingford, UK, 2005. Suchý, P., Straková, E., Jarka, B., Thiemel, J., Večerek, V. Differences between metabolic profiles of egg-type and meat-type hybrid hens. Czech J. Anim. Sci., 2004, 49: 323-328. Tůmová, E., Skřivan, M., Englmaierová, M., Zita, L. The effect of genotype, housing system and egg collection time on egg quality in egg type hens. Czech J. Anim. Sci., 2009, 54 (1): 17 – 23. Vits A., Weitzenburger D., Hamann H., Distl O. Production, egg quality, bone strength, claw length, and keel bone deformities of laying hens housed in furnished cages with different group sizes. Poultry Sci., 2005, 84, 1511–1519.

195 | P a g e

May 24-25th 2012


FUNCTIONAL PARAMETERS OF BULL SEMEN IN RELATION TO THE BODY CONDITION SCORE. Špaleková, E., 1, 2 Makarevich, V.A., 1Kubovičová, E., 1 Stadnik, L., 3 Louda, F. 3 1

Institute of Animal Genetics and Reproduction, Animal Production Research Centre Nitra, Slovak Republic

2


Agriculture in Nitra, Slovak Republic 3

Czech University of Agriculture in Prague, Czech Republic

Abstract The goal of this study was to examine the effect of body condition score (BCS) of breeding bulls on functional parameters of sperm in particular effect of BSC on sperm total motility and progressive movement (PM) and on viability parameters of sperm. Motility parameters of thawed semen were analyzed using CASA system at the time intervals of 0, 0.5h or 2h. Viability parameters of sperm were analyzed using fluorescent microscopy. The spermatozoa were stained for a plasma membrane integrity (peanut agglutinin, PNA-FITC), occurrence dead/necrotic sperm (PI) and apoptosis (Yo-Pro-1). Our results point out on a minor difference between adjoins groups of BCS 2 and 3. However significant difference in sperm viability between bulls with BCS 2 and 4 were noted. Bulls with BCS 4 had significantly (P<0,05) lower total motility and progressive movement than bulls with BCS 2. Similarly significantly higher (P<0,05) proportion of sperm with disturbed plasma membrane and increased proportion of dead/necrotic sperm was recorded in BCS 4 compared to bulls with BCS 2. These results indicate that higher level of BCS may have negative effect on quality of ejaculates of breeding bulls.

Key words: bull, BCS, sperm, viability, motility Introduction The evaluation of body condition score (BCS) is used mainly to gain economic profit through improved reproductive parameters and more cost-effective feeding. Body condition scoring is an assessment of proportion of muscle and of body fat which the male has and is determined on a scale of 1 to 5 (1 being very thin and 5 being overweight). Previous studies showed that many factors affect semen quality, including abnormal scrotal thermoregulation

196 | P a g e


May 24-25th 2012

(Coulter et al., 1997), stress, age, testicle size and body condition (Barth, 1995). BCS, or degree of fatness, seems to be the most reliable indicator of well-being of an animal, and, when coupled with changes in body weight, provides a useful method to assess reproductive potential (Dunn - Moss, 1992). If the animal is too thin or overweight, breeding stamina and quality of ejaculate may be affected (Neary, M. - Yager, A., 2002). The quality of bull semen may be positively affected by quality of livestock feed. In particular, feeding moldy or poorquality feed or silage may elicit loss of sperm motility and could have caused temporary or permanent infertility of bulls (Louda et al., 2007). Production of quality ejaculate requires a diet which ensures adequate nutrition levels and the corresponding amount of essential vitamins and mineral substances. Bulls in poor body condition have lower fertilizing ability (Louda et al., 2007). It is only few reports about effect of BCS on sperm characteristics and fertility ability of beef bulls (Addass, 2011; Barth – Waldner, 2002; Dunn - Moss, 1992). But there are no reports about effect of BCS on the sperm viability in regards to cell death, membrane status and motility. The aim of this study was to evaluate effect of body condition score of breeding bulls on several functional parameters of spermatozoa.

Material and methods Semen collection The semen was collected once weekly from 8 Holstein and 8 Czech Fleckvieh bulls. The BCS of selected bulls was evaluated by a five point scale with an accuracy of 0.25 points at the time of ejaculate collecting according to methodology of body condition scoring. Only fresh semen with required quality (min PM 70% and concentration 0,7x106 ml-1) was used for producing artificial insemination doses. The samples of semen were frozen in a programmable freezing device (IMV-Digitcool, L’Aigle, France) then plunged into liquid nitrogen for storage. Analysis of sperm motility Straws were thawed in a water bath at 37 ± 1°C for 1min. Motility parameters of semen were analyzed immediately after thaw at time intervals of 0, 0.5h or 2h, using computer assisted semen analysis (CASA) – Sperm VisionTM 3.5. Between these time points the samples were incubated at 37 ˚C. Fluorescent assays Sperm membrane integrity was evaluated using fluorescently labelled lectin PNAFITC ((Arachis hypogaea peanut agglutinin; Molecular Probes, Lucerne, Switzerland) in combination with propidium iodide (PI) which detected dead/necrotic sperm in samples (red 197 | P a g e


May 24-25th 2012

signal) and DAPI (blue signal). Sperm samples were unfixed; therefore, PNA marked only the sperm with disturbed plasma membrane (green signal) while the sperm with intact membranes remained unstained. Staining was done in a solution containing 2.5 µl PNA and 10 µl PI in 250 µl saline-FCS solutions for 20 minutes at room temperature. After the incubation, 4 µl of sperm samples were mixed with 4 µl of Vectashield mounting medium with DAPI (H-1200, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA). Samples were observed under a Leica fluorescent microscope (MIKRO spol. s r.o., Bratislava, Slovak Republic) with respective filters for green, red and blue fluorescence. Apoptotic cells were detected using specific nuclear green fluorochrome, Yo-Pro-1 in combination with PI. The staining solution contained 1 µl of Yo-Pro-1 and 10 µl of PI in 200 µl of saline-FCS solution. Sperm cells with bright green fluorescent signal were regarded as apoptotic. The cells colored red were considered as dead or necrotic. Statistical analysis The experiments have been done in two replications. For sperm motility analysis (CASA), 7 view fields per each group were evaluated (at least 750 sperm cells per one experiment were counted). Average values were calculated from three measurements during the day. For fluorescent markers, more than 800 sperm cells per each group were evaluated. The results were statistically evaluated by repeated measure ANOVA test and t-test.

Results Average motility of all tested bulls (n=16) after thawing was 42,47±2,08%, progressive movement (PM) was 39,62±2,08%. The bulls were divided into the 3 groups according to their body condition score (BCS). The high average motility and progressive movement was observed in the group of bulls with BCS 2, where motility and progressive movement were significantly higher (P<0,05), when compared with the group of bulls with BCS 4. In the group of BCS 3 bulls average whole motility was 42,21±2,06% and PM was 39,31±2,02%. The lowest sperm total motility and progressive movement was determined in the BCS 4 group (Tab 1). Similar trends were observed in evaluation of viability characteristics of sperm. The proportion of sperm with disturbed plasma membrane (PNA positive) was significantly lower in the BCS 2 than in the group with BCS 4 (P<0,05). Similarly, presence of dead/necrotic sperm cells was the lowest in the BCS 2. The highest proportion of apoptotic sperm was detected in the group with BCS 3. In group BCS 3, proportion of sperm with disturbed plasma membrane, dead/necrotic and apoptotic sperm was higher that in the group with BCS 198 | P a g e

May 24-25th 2012


2. The highest proportion of dead/necrotic sperm and PNA positive sperm was detected in the group with BCS 4 (Tab 2). Tab. 1 Average values of motility parameters of bull sperm. BCS category Motility Progressive movement –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bulls together 42,47±2,08 39,62±2,08 a BCS 2 56,26±2,21 52,93±2,37 a BCS 3 42,21±2,06 39,31±2,02 BCS 4 28,94±1,98 b 26,61±1,86 b a,b

P<0,05 – significant difference between BCS groups (t-test)

Tab. 2 Average values of selected viability parameters of bull sperm according to bull’s body condition score BCS category PNA Yo-Pro-1 PI –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– BCS 2 24,03±2,30 a 15,62±1,83 12,63±1,49 BCS 3 27,07±2,08 18,85±1,66 15,22±1,62 BCS 4 35,06±2,72 b 15,37±1,56 20,25±1,85 a, b

P<0,05 – significant difference between groups (t-test)

High significant positive (P<0,0001) correlation was observed between total motility and progressive movement in a whole population of bulls (irrespective to BCS). Medium negative correlation was observed between motility and sperm viability parameters (PNA, PI, Yo-Pro1 positive sperm) (Tab 3). Tab. 3 Correlation coefficients of a whole group of bulls and correlation between total motility and selected sperm parameters according to BCS of bulls M/PM

M/PNA

M/Yo-Pro-1 M/PI r r r r ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bulls together 0,998* - 0,634 - 0,491 - 0,584 BCS 2 0,996* - 0,358 - 0,746 - 0,213 BCS 3 0,997* - 0,626 - 0,530 - 0,702 BCS 4 N/D N/D N/D N/D r – Pearson correlation coefficient (t-test); no correlation 0,111 ± 0,333; moderate correlation 0,334 ± 0,666; high correlation 0,667±0,999; * P<0,0001; N/D – not determined

When BCS was taken into consideration, highly significant positive (P<0,0001) correlation was noted between total motility and progressive motility in the BCS 2 and the BCS 3 bulls. High negative correlation between total motility and apoptotic sperm cells was observed in the BCS 2 (r = -0,7458). In the group with BCS 3, high negative correlation was observed between total motility and dead/necrotic sperm (r = - 0,7019) (Tab 3). In the group

199 | P a g e


May 24-25th 2012

with BCS 4 correlation was not determined due to low numbers of animals available in this group.

Discussion This study investigated the impact of BCS of breeding bulls on motility and viability of spermatozoa. Motility of sperm is a most important indicator of ejaculate quality. The results of this study demonstrated possible negative effect of high body condition score of bulls on sperm total motility as well as progressive movement. Bulls with BCS 4 have considerably lower motility and progressive movement than bulls with BCS 2 and 3. Similarly, the others authors indicate that bulls fed high-energy diet (high BCS) had decreased proportion of progressively motile sperm and very poor progressive movement than bulls fed moderate-energy diet (lower BCS) (Coulter et al., 1997). Except good motility parameters, low content of apoptotic and dead/necrotic sperm in ejaculate is also important for good fertilizing ability. Presence of apoptotic spermatozoa in the sperm dose could be one of the reasons for poor fertility of breeding bulls (Anzar et al., 2002).

High negative correlation was found between total motility and proportion of

apoptotic sperm in the BCS 2. Similarly, Hao-Bo Zhang (2008) confirmed negative correlations between motility and rate of apoptotic sperm in human. No large difference in proportion of apoptotic sperm was recorded between tested groups. Proportion of apoptotic sperm was the highest in the BCS 3. For successful fertilization, high proportion of sperm with intact membrane is necessary, because intact plasma membrane is an essential requirement for sperm cell function (Makarevich et al., 2011). Significantly higher proportion of sperm with damaged membrane was detected in the BCS 4 compared with the BCS 2 group. Spermatozoa with damaged or inactive membranes will have limited viability and fertilization potential (Correa - Zavos, 1994). Only moderate negative correlations were confirmed between PNA positive sperm and motility in the BCS 2 and the BCS 3 groups. Alm et al. (2001) found low but significant correlation between proportion of viable cells and fertility, suggesting that the plasma membrane integrity evaluation can serve as a quality control method for frozen-thawed spermatozoa in breeding bulls. These results imply that overfeeding could adversely affect ejaculate, because overfed bulls have lower semen quality than underfed bulls. Bulls with BCS 4 has higher occurrence of dead/necrotic sperm than bulls with BCS 2 and 3. Similarly studies other on beef bulls confirm, that significantly fewer bulls with a BCS 2 and BCS of 4 or greater had satisfactory semen quality than bulls with a BCS of 3.0 (where satisfactory semen quality comprise 70% 200 | P a g e


May 24-25th 2012

of morphological normal sperm and PM of spermatozoa is at minimum 60%) (Barth Waldner, 2002). Bulls fed high-energy diet (high BCS) had decreased proportion of morphologically normal and progressively motile sperm (Coulter et al. 1997) and also greater proportion of sperm with defects (Swanepoel et al., 2008) than bulls fed moderate-energy diet (lower BCS). Body condition, or degree of fatness, seems to be the most reliable indicator of wellbeing of an animal, and, when coupled with changes in body weight provides a useful method to assess reproductive potential (Dunn et al., 1992). Our results support an idea, that high BCS has negative effect on quality from ejaculates from breeding bulls.

Acknowledgement The study was supported from the grants APVV-0137-10 (Slovak Republic) and QI91A061 (Czech Republic).

References Addass, P. A. Effect of age and body condition score on sperm production potential among some indegenous bull cattle in Mubi Adamawa State, Nigeria. Agric. Biol. J. N. Am., 2011, 2, 203-206. Alm, K., Taponen, J., Dahlbom, M., Tuunainen, E., et al. A novel automated fluorometric assay to evaluate sperm viability and fertility in dairy bulls. Theriogenology, 2001, 56, 677-684. Anzar, M., He, L., Buhr, M. M., Kroetsch, T. G., Pauls, K. P. Sperm apoptosis in fresh and cryopreserved bull semen detected by flow cytometry and its relationship with fertility. Biol. Reprod., 2002, 66, 354-360. Barth, A. D. - Waldner, Ch. L. Factors affecting breeding soundness classification of beef bulls examined at the Western College of Veterinary Medicine. Can. Vet. J., 2002, 43, 274-284. Barth, A.D., Cates, W. F, Harland, R. J. The effect of amount of body fat and loss of fat on breeding soundness classification of bulls. Can. Vet. J., 1995, 36, 758–763. Correa, J. R. - Zavos, P. M. The hypoosmotic swelling test: Its employment as an assay to evaluate the functional integrity of the frozen-thawed bovine sperm membrane. Theriogenology, 1994, 42, 351-360. Coulter, G. H, Cook, R. B., Kastelic, J. P. Effects of dietary energy on scrotal surface temperature seminal quality, and sperm production in young beef bulls. J. Anim. Sci., 1997, 75, 1048–1052. Dunn, T. G. - Moss, G. E. Effects of nutrient deficiencies and excesses on reproductive efficiency of livestock. J. Anim. Sci., 1992, 70, 1580-1593. Hao-Bo Zhang, Shao-Ming Lu, Chun-Ya Ma, Li Wang, Xiao Li, Zi-Jiang Chen. Early apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation. Asian J. Androl., 2008, 10, 227-235. Louda, F. et al. Zásady využívaní plemenných býků v podmínkách přirozené plemenitby. 2007. Vydal: Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o., Šumperk: KartoTISK, s.r.o., ISBN: 978-80-87144-01-5.

201 | P a g e


May 24-25th 2012

Makarevich, A., Špaleková, E., Olexíková, L., Lukáč, N., Kubovičová, E., Hegedušová, Z. Functional characteristics of ram cooling-stored spermatozoa under the influence of epidermal growth factor. General Physiology and Biophysics, 2011, 30, 36-43. Neary, M., - Yager, A. Body Condition Scoring in Farm Animals. Farm Animals Management and Purdue, 2002, 9, 1-8. Swanepoel, F. J. C., Taylor, G. J., Webb, E. C., Stroebel, A. Effect of nutrition on testicular traits of tropically adapted yearling beef bulls. Aust. J. Exp. Agric., 2008, 48, 950-953.

202 | P a g e

May 24-25th 2012


THE PRENATAL APPLICATION OF RETINOIC ACID AND EMOTIONAL BEHAVIOUR Tomášová, L.,1 Hvizdošová, N.,1 Špakovská, T.,1 Kokošová, N.,2 Boleková, A.,1 Kluchová, D.1 1

Ústav anatómie, Lekárska fakulta Univerzity P. J. Šafárika v Košiciach

2

Katedra fyziológie živočíchov, Ústav biologických a ekologických vied, Prírodovedecká fakulta Univerzity P.

J. Šafárika v Košiciach

Abstract Vitamin A plays an important role in embryonal development of central nervous system (CNS). Its insufficiency, but also the excess intake during pregnancy can lead to the various defects of CNS, from various malformations, which are sometimes incompatible with life, to the less intensive damages, that can express behavioral disorders. The aim of our work was to study changes of emotional behaviour after prenatal application of all-trans retinoic acid (a metabolit of vitamin A). We found out a significant increase of anxiety in 3-weeks old rats prenatally exposed to RA. This result indicates, that application of retinoids during pregnancy can produce changes of emotional behavior in the offspring.

Key words: retinoic acid, prenatal development, emotional behavior Úvod Vyvíjajúci sa centrálny nervový systém (CNS) je veľmi zraniteľný, pričom táto jeho zraniteľnosť závisí od viacerých faktorov. Kľúčovú úlohu tu zohráva stupeň maturácie CNS (Rice a Barone, 2000). Čím sú nervové bunky viac diferencované, tým sú odolnejšie voči pôsobeniu rôznych faktorov. Obzvlášť citlivou fázou vývinu CNS je prenatálne obdobie, kedy dochádza k proliferácií, diferenciácií, myelinizácií a migrácií nervových buniek a k tvorbe nervových spojení. Dôležitú úlohu v týchto procesoch zohráva vitamín A (retinoidy). Ovplyvňuje diferenciáciu buniek a formovanie neurálnej trubice (Maden, 2007). Nadmerný prísun retinoidov počas embryonálneho vývinu môže viesť k rôznym vrodeným defektom nervovej rúry (NTD´s - neural tube defects, napr. anencefália, spina bifida atď.) (Frey a Hauser, 2003), malformáciam predného a zadného mozgu (Holson a kol., 1997), resp. môže poškodiť proces proliferácie a diferenciácie nervových buniek, čo sa môže prejaviť poruchami pamäťových funkcií, ale aj iných foriem správania (Adams, 1993). Cieľom našej

203 | P a g e


May 24-25th 2012

práce bolo zistiť aký vplyv má zvýšený prísun vitamínu A počas prenatálneho vývinu na emočné správanie.

Materiál a metodika Zvieratá. V experimente boli použité laboratórne potkany kmeňa Wistar, ktoré boli chované za štandardných podmienok s použitím umelého svetelného režimu LD 12/12. Zvieratá mali prístup k štandardizovanej potrave a vodovodnej vode. Trojmesačné samice boli pripustené k samcom toho istého veku. Gravidným samiciam bola na 14. – 16. deň gravidity podaná i. p. kyselina all-trans retinová (RA), metabolit vitamínu A, o dávke 1mg/kg hmotnosti. Narodené mláďatá boli chované za štandardných podmienok a veku 3 týždňov boli testované vo vyvýšenom krížovom labyrinte. Vyvýšený krížový labyrint. V tomto teste bola použitá aparatúra pozostávajúca z dvoch otvorených a dvoch uzavretých ramien o dĺžke 50 cm, veľkosť centrálneho štvorca bola 15x15 cm. Ramená aparatúry boli vo výške 75 cm nad zemou. Zvieratá boli vložené do stredu aparatúry a počas 5 min sa zaznamenávalo ich správanie. Získané výsledky boli spracované nepárovým T-testom.

Výsledky Výsledky testu vo vyvýšenom krížovom labyrinte ukázali, že prenatálne aplikované retinoidy výrazne ovplyvnili emocionálne správanie potkanov. Mláďatá vystavené pôsobeniu RA zriedkavejšie vstupovali do otvorených ramien aparatúry a trávili tu kratší čas v porovnaní s kontrolami (Obr. 1). Tento rozdiel sme pozorovali u obidvoch pohlaví, pričom u samcov bol štatisticky významný.

Obrázek 1 Emocionálne správanie zvierat v teste vo vyvýšenom krížovom labyrinte vyjadrené ako priemerný čas strávený v otvorených ramenách labyrintu +/- SEM; * P < 0,05. (The emotional behavior of rats in elevated plus maze test expressed as average time spent in the open arms of maze +/- SEM; * P < 0,05)

204 | P a g e


May 24-25th 2012

Záver Výsledky našej práce naznačujú, že zvýšený prísun vitamín A počas gravidity môže viesť k zmenám emočného správania. Jedinci vystavený pôsobeniu retinoidov majú zvýšenú mieru úzkosti a strachu a častejšie sa u nich vyskytujú depresívne stavy. Behaviourálne zmeny, ktoré sme zistili môžu predstavovať doposiaľ neznámy syndróm vyskytujúci sa po vysokých dávkach vitamínu A počas embryonálneho vývinu, ktorý bol zaznamenaný v klinickej literatúre, ale doposiaľ nebol dôkladne popísaný. Aj z toho dôvodu je potrebné sa danej problematike i naďalej venovať a dôkladne ju preskúmať.

Použitá literatúra Frey, L., Hauser, W.A. Epidemiology of neural tube defects. Epilepsia, 2003, 44, 4-13 Holson, R.R., Gazzara, R.A., Ferguson, S.A., Adams, J. Behavioral effects of low-dose gestational day 11-13 retinoic acid exposure. Neurotoxicol. Teratol., 1997, 19, 355-362 Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Neuroscience, 2007, 8, 755-765 Rice, D., Barone, S. Jr. Critical periods of vulnerability for the developing nervous system: evidence from humans and animal models. Environ. Health. Perspect, 2000,108, 511–33

205 | P a g e

May 24-25th 2012


THE EFFECT OF INCREASED IODINE INTAKE ON THYROID ACTIVITY IN SHEEP Trávníček, J., Kroupová, V., Dušová, H., Peksa, Z., Cimbůrková, P. Department of Veterinary Disciplines and Quality of Products, Agriculture Faculty, JU in České Budějovice

Abstract The paper is focused on the contemporary issue of excess iodine in farm animals. The monitoring was performed in ewes. The feed ration in control group (K) of ewes (n = 6) contained for 8 months 3.1 mg iodine per kg of dietary dry matter (DM) and for experimental group (P) of ewes (n = 6) 5.1 mg iodine per kg of dietary DM. Simultaneously with different iodine supplementation the level of Total Triiodothyronine (TT3), Total Thyroxine (TT4), Free Triiodothyronine (fT3), Free Thyroxine (fT4) in blood plasma was examined in ewes before and until 60 days after parturition. The significant decrease of fT3 in group K before parturition was observed. The significant increase of TT3 and TT4 from day 1 to 10 after parturition was found in group K. The significant lower level (P<0.05) of fT3 on the day 30 after parturition was found in the group with iodine intake of 5.1 mg/kg dry matter of diet compared with the group K. In group P was observed lower values (not significantly) of thyroid hormons, especially fT3 and fT4. The above results call for the need of more profound research and revision of thyroid activity connected with the permitted upper limit of iodine supplementation in ruminants 5 mg per kg of 88% DM defined by Commission Regulation /EC/ No. 1459/2005.

Úvod Suplementace

jódu

u

hospodářských

zvířat

představuje

významný

prvek

v celosvětovém řešení jeho nedostatku u obyvatel Světovou zdravotnickou organizací v rámci činnosti International Council for the Control of Iodine Deficiency Disorders. V oblastech s úspěšnou živočišnou produkcí podmíněnou vysokou úrovní suplementace stopových prvků včetně jodu se pozornost soustřeďuje i na rizika jeho případného nadbytku na která upozorňují Huszenica et al., (2002), Pavlata et al., (2005), Mühlberg a Paschke (2009) a Nobukuni (2009). Koncentrace thyroidních hormonů (T3 a T4) jsou obvykle využívány jako indikátory funkce štítné žlázy u lidí a experimentálních zvířat (Kelly, 2000). Podle NRC

206 | P a g e


May 24-25th 2012

(2001) je doporučený denní příjem jodu pro masný skot jen 0,3-0,6 mg/kg sušiny krmné dávky (KD), ale horní povolená hranice příjmu jodu podle směrnice EU je 5 mg/kg 88% sušiny krmné dávky (Nařízení komise ES č. 1459/2005).

Materiál a metodika Vliv nadbytečného příjmu jódu 3,1 mg/kg sušiny u skupiny kontrolní -K (n = 6) a 5,1 mg/kg sušiny u skupiny pokusné - P (n = 6) byl sledován od 1-2 měsíce gravidity do 120-140 dnů po porodu na úroveň hormonů štítné žlázy (celkový trijodthyronin - TT3, celkový thyroxin - TT4, volný trijodthyronin - fT3, volný thyroxin - fT4) v krevní plazmě. Do pokusu byly vybrány ovce plemene ovce šumavská na 5. laktaci. Základní složky krmné dávky pro skupinu K a P: 1,5 kg luční seno, 0,24 kg vojtěška granule, 0,27 kg ovesná krupice, 9 g minerální doplněk. Obsah jodu na 1 kg sušiny krmné dávky v době experimentu byl: skupina K 3,1 mg, skupina P 5,1 mg. Jód byl podáván jako jodičnan vápenatý. Krev bahnic pro stanovení sledovaných parametrů byla odebrána z hrdelní žíly. Koncentrace TT3, TT4, fT3 a fT4 byla stanovena v krevní plazmě metodou radioimunoanalýzy s využitím komerčních kitů firmy IMMUNOTECH a.s. (Praha). Před experimentem byly krevní vzorky odebrány u bahnic 2 krát v intervalu 30 a 60 dní před jeho zahájením, v průběhu pokusu ve 100-120 dnech gravidity a 1, 10, 30 a 60 den po porodu. Pro statistické vyhodnocení byl použit program Statistica 6.0 Cz software (ANOVA test, Tukey test). Hodnoty P<0,05 byly považovány za významné.

Výsledky a diskuse V předložené studii byl sledován vliv nadbytečného příjmu jodu na hormony štítné žlázy bahnic přijímajících 3 a 5 mg jodu na kg sušiny krmné dávky (KD). Příjem 5 mg na kg sušiny KD představuje dle Nařízení komise ES č. 1459/2005 horní hranici povolené normy. V poslední době se věnuje dopadu vysoké koncentrace jodu v krmných dávkách zvýšená pozornost zaměřená na zdravotní stav mláďat (Boland et al., 2008; Rose et al., 2007). Z tabulky 1 je patrné, že úroveň TT3 se mezi skupinou K a P nezměnila ani po 60 dnech suplementace jodu ve třech měsících březosti. Na úrovni TT4 došlo po 60-ti denní suplementaci jodu k jeho poklesu u obou skupin. Tento pokles byl méně výrazný u skupiny P. Z tabulky 1 je patrné, že po 60-ti denním podávání 5 mg jodu na kg sušiny KD byly hodnoty fT3 a fT4 u pokusné skupiny nižší. Ve skupině K došlo k významnému snížení fT3 v období před porodem. Zjištěné koncentrace TT3 u bahnic v průběhu celého pokusu jsou obdobné jako uvádí Nazifi et al. (2008) u ovcí. Postupné snížení hormonů štítné žlázy bahnic (tabulka 207 | P a g e

May 24-25th 2012


1) s postupující graviditou udává i Yildiz et al., (2005). Manalu et al., (1997) vysvětluje toto snížení zvýšenou spotřebou jodu plodem, který ho využívá pro syntézu hormonů štítné žlázy.

Tab. 1 Dopad suplementace jodu na koncentraci hormonů štítné žlázy v krevní plazmě v peripartálním období bahnic (The impact of iodine supplementation on the concentration of thyroid hormones in blood plasma in peripartum period of ewes)

Parametr

TT3 (nmol/l)

Před pokusem 30-60 dnů gravidity bez suplementace I K P 2.4 ± 0.3 2.4 ± 0.2

Během pokusu 100-120 dní gravidity suplementace I – 60-90 dní K P 2.2 ± 0.3 2.3 ± 0.4

TT4 (nmol/l)

75.6 ± 14.6

69.2 ± 9.2

56.6 ± 11.8

62.1 ± 12.1

fT3 (pmol/l) fT4 (pmol/l) a:b P<0,05

4.7 ± 0.7 a 13.6 ± 3.3

4.2 ± 0.6 12.5 ± 3.1

3.8 ± 0.4 b 13.4 ± 3.5

3.5 ± 0.4 12.2 ± 2.9

Skupina K – suplementace jodu 3 mg/kg sušiny krmné dávky Skupina P – suplementace jodu 5 mg/kg sušiny krmné dávky

V porovnání s obdobím před porodem (tabulka 1) se 1. den po porodu stav TT3 významně mezi skupinami nelišil (tabulka 2). Z 1. na 10. den po porodu došlo ve skupině K k významnému zvýšení úrovně TT3. Naproti tomu úroveň TT4 byla již 1. den po porodu (tabulka 2) u skupiny P významně vyšší (P<0,01) zatímco 10. den se hodnoty TT4 významně od sebe nelišily a pohybovaly se u obou skupin na stejné úrovni. V porovnání mezi skupinami se především hodnoty fT4 v průběhu laktace snížily u obou skupin a obdobně jako u fT3 byly nejnižší hodnoty zaznamenány 10. den po porodu v pokusné skupině přijímající 5 mg jodu na kg sušiny KD. Pokles fT4 u skupiny P z 1. na 10. den byl významný (tabulka 2).

208 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab. 2 Dopad suplementace I na koncentraci hormonů štítné žlázy v krevní plazmě bahnic 1. a 10. den po porodu (The impact of iodine supplementation on the concentration of thyroid hormones in blood plasma of ewes in the 1st and the 10th day after parturition)

Dny po porodu Parametr TT3 (nmol/l)

1 K 2.0 ± 0.1c

10 P 2.8 ± 1.2

TT4 (nmol/l) 47.8 ± 6.8 a 78.2 ± 11.7 b fT3 (pmol/l) 4.4 ± 0.3 4.2 ± 1.1 fT4 (pmol/l) 12.0 ± 1.8 13.1 ± 1.6f a:b; c:d; f:g a:e

K 2.5 ± 0.3d

P 2,4 ± 0.7

61.7 ± 7.4e 64,7 ± 13,7 4.0 ± 0.5 3,6 ± 0.3 10.9 ± 2.8 9.9 ± 0.7g

P<0,01

P<0,05 V porovnání s bezprostředním obdobím po porodu (tabulka 2) v následujícím

laktačním období (tabulka 3) zůstávaly hodnoty TT3 bez rozdílu mezi skupinami na nižší úrovni (tabulka 3). Ve skupině P a K v 60. dnu laktace došlo v porovnání s 30. dnem k statisticky významnému poklesu TT4. Koncentrace TT4 u bahnic v průběhu celého pokusu byly kromě 30. dne po porodu u obou skupin bahnic nižší než udává Nazifi et al. (2008) u ovcí (91. 60 ± 2.95 nmol/l). Volný trijodthyronin byl významně nižší (P<0,05) 30. den ve skupině P. Zatímco hodnoty fT4 se 30. den po porodu v obou skupinách nelišily mezi sebou a nelišily se od hodnot fT4 do 10. dne po porodu (tabulka 2). Pokles fT4 u skupiny P z 30. na 60. den byl významný. Výrazný vliv na koncentraci thyreoidálních hormonů po porodu má laktace. V našem pokusu koncentrace TT3 a TT4 u bahnic byla nejnižší 1. den po porodu u skupiny K a poté se postupně zvyšovala až na hodnoty před porodem, což odpovídá nálezům Huszenica et al. (2001). Tento poporodní pokles má klíčové postavení v homeostatické a metabolické adaptaci organizmu na zvýšenou energetickou spotřebu (Huszenica et al. 2001).

209 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab. 3 Dopad suplementace jodu na koncentraci hormonů štítné žlázy v krevní plazmě bahnic po porodu (The impact of iodine supplementation on the concentration of thyroid hormones in blood plasma of ewes in the 30th and the 60th day after parturition) Dny po porodu Parametr TT3 (nmol/l) TT4 (nmol/l) fT3 (pmol/l) fT4 (pmol/l) a:b; e:g; f:h P<0,01 c:d; e:f; ch:i

30 K 2.3 ± 0.3 94.7 ± 20.4a 4.2 ± 0.3e 13.8 ± 1.8

P 2.3 ± 0.2 91.0 ± 17.5c 3.6 ± 0.3f 13.6 ± 1.3ch

60 K P 2.2 ± 0.1 2.0 ± 0.4 b 54.1 ± 7.6 62.0 ± 9.6 d 3.0 ± 0.1g 2.7 ± 0.3h 12.3 ± 1.5 11.9 ± 0.4i

P<0,05

Ze souhrnného sledování změn úrovně hormonů štítné žlázy v průběhu laktace při vysoké zátěži jodem vyplývá tendence k nižší koncentraci hormonů štítné žlázy (především fT3 a fT4) při suplementaci 5 mg jodu na kg sušiny KD.

Poděkování Tato studie byla podporována z grantu QH 81 105 Ministerstva zemědělství a z projektu 022/2010/Z Grantové agentury Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích.

Použitá literatura Boland, T.M., Hayes, L., Sweeney, T., Callan, J.J., Baird, A.W., Keely, S., Crosby, T.F. T.effects of cobalt and iodine supplementation of the pregnant ewe diet on immunoglobulin G, vitamin E, T3 and T4 levels in the progeny. Animal, 2008, 2, 197206. Huszenica, G.Y., Kulcsar, M., Nikoli, J.A., Schmidt, J., Korodi, P., Katai, L. Plasma leptin concentration and its interrelation with some blood metabolites, metabolic hormones and the resumption of cyclic ovarian function in postpartum dairy cows supplemented with monensin or inert fat in feed, In: Diskin, M.G., editor, Fertility in the High-producing Dairy Cow, Br. Soc. Anim. Sci., 2001, 2, 405-409. Huszenica, G.Y., Kulcsar, M., Rudas, P. Clinical endocrinology of thyroid gland function in ruminants. Vet. Med.-Czech., 2002, 47, 199-210. Kelly, G. Peripheral metabolism of thyroid hormones: a review. Altern. Med. Rev., 2000, 5, 306–333. Manalu, W., Sumaryadi, M.Y., Kusumorini, N. Maternal serum concentrations of total triiodothyronine, tetraiodothyronine and cortisol indifferent status of pregnancy during late pregnancy in Ettawah-cross does. A. Aust. J. Anim. Sci., 1997, 10, 385–390. Mühlberg, K.S., Paschke, R. Frequency, Pathogenesis, Prevention and Treatment of IodineInduced Hyperthyroidism. In: Preedy, V.R., Burrow, G.N., Watson, R.R. Comprehensive

210 | P a g e


May 24-25th 2012

Handbook of Iodine: Nutritional, Biochemical, Pathological and Therapeutic Aspects, Academic Press, 2009, 887-896. Nařízení Komise (ES) č. 1459/2005 ze dne 8. září 2005, kterým se mění podmínky pro povolení některých doplňkových látek v krmivech, které patří do skupiny stopových prvků. OJEU., 2005. Nazifi, S., Saeb, M., Abangah, E., Karimi, T. Studies on the relationship between thyroid hormones and some trace elements in the blood serum of Iranian fat-tailed sheep. Vet. Archiv., 2008, 78, 159-165. NRC (National Research Council). Nutrient Requirements of Dairy Cattle. National Academies Press, 174 Washington, DC, USA, 2001. Nobukuni, K. Influence of Iodine-Containing Pharmaceuticals on Iodine Status and Thyroid Function: Iodine Induced Hyperthyroidism and Hypothyroidism. In: Preedy, V.R., Burrow, G.N., Watson, R.R. Comprehensive Handbook of Iodine: Nutritional, Biochemical, Pathological and Therapeutic Aspects, Academic Press, 2009, 927-936. Pavlata, I., Šlosárková, S., Fleischer, P., Pechová, A. Effects of increased iodine supply on the selenium status of kids. Vet. Med.-Czech., 2005, 186-194. Rose, M.T., Wolf, B.T., Haresign, W. Effect of the level of iodine in the diet of pregnant ewes on the concentration of immunoglobulin G in the plasma of neonatal lambs following the consumption of colostrum. Br. J. Nutr., 2007, 97, 315-320. Yildiz, A., Balikci, E., Gurdogan, F. Changes in some serum hormonal profiles during pregnancy in single- and twin-foetus-bearing Akkaraman sheep. Med. Wet.-Pl., 2005, 61, 1138- 1141.

211 | P a g e

May 24-25th 2012


THE RELATIONSHIP OF FAT CONTENT IN CARCASS, THIGH MEAT AND BLOOD BIOCHEMICAL PARAMETERS IN CZECH RABBIT GENETIC RESOURCES Tůmová, E.1, Härtlová, H.2, Chodová, D.1 1

Katedra speciální zootechniky FAPPZ, ČZU v Praze,

2

Katedra veterinárních disciplín FAPPZ, ČZU v Praze

Abstract In the experiment, correlations between growth, renal fat content, fat, cholesterol content in thigh meat and blood biochemical fat characteristics in rabbit genetic resources were evaluated. There were used giant breed Moravian Blue (Mm), medium breeds Czech Spotted (CS), Czech Solver (CL), Czech White (CA), Moravian White of brown eye (Mbh) and small breeds Czech Black Guard Hair (Ccp) and Czech Gold (Cc). There were significant medium correlations (P ≤ 0.01) between daily weight gain and serum cholesterol concentration (0.40) and (P ≤ 0.01) between renal fat and serum NEFA (0.39).

Úvod Genové zdroje králíků jsou významnou součástí biodiverzity zvířat, protože většina produkce se uskutečňuje využíváním hybridních zvířat, která mají velmi úzký genetický základ. Genové zdroje mohou být nositeli znaků, které mohou být využity při šlechtění nových populací. U genových zdrojů králíků jsou známé hmotnosti dospělých zvířat, zbarvení a kvalita srsti, ale minimum informací o užitkovosti a genetickém polymorfismu (Bolet et al. 2000). V ČR je v programu ochrany genových zdrojů registrováno sedm plemen, u kterých se teprve získávají první údaje o populacích a užitkovosti (Tůmová et al., 2011). Biochemické parametry krve charakterizují homeostázu vnitřního prostředí organismu zvířat, která se odráží v produkčních ukazatelích. V definovaných podmínkách biochemické ukazatele krevního séra mají úzký vztah k metabolismu tuků, což je důležité především z hlediska produkce masa králíků. Cílem

práce

bylo

zjištění

korelací

mezi

koncentrací

triacylglycerolů,

neesterifikovaných mastných kyselin a cholesterolu k obsahu ledvinového tuku, obsahu tuku a cholesterolu ve stehenním svalstvu sedmi plemen genových zdrojů králíků.

212 | P a g e


May 24-25th 2012

Materiál a metodika Do sledování bylo zařazeno celkem 49 králíků sedmi čistokrevných plemen, velké plemeno moravský modrý (Mm), střední plemena český luštič (ČL), český strakáč (ČS), český albín (ČA), moravský bílý hnědooký (Mbh) a malá plemena český červený (Čč) a český černopesíkatý (Ččp). Ve skupině bylo sedm králíků od každého genotypu vykrmovaných od 42 do 91 dnů věku v identických podmínkách. Králíčata byla ustájena v individuálních klecích (0,2 m2/ks), dostávala komerční typ krmné směsi s 18,8 % N-látek, 16,3 % vlákniny a 3,7 % tuku. Používal se 12 hodinový světelný režim. Růst králíčat byl sledován individuálním vážením v týdenním intervalu. V 91 dnech věku bylo 6 králíků od každého plemene poraženo pro zjištění obsahu ledvinového tuku. Současně byly odebrány vzorky stehenního svalstva pro stanovení obsahu tuku a cholesterolu v mase. Obsah intramuskulárního tuku byl zjišťován ze sušiny extrakcí petroéterem, obsah cholesterolu byl stanoven fotometrickou metodou. Biochemické parametry krevního séra králíků byly analyzovány při porážce králíků v 91 dnech věku. Triacylglyceroly (TAG), neesterifikované mastné kyseliny (NEFA) a cholesterol byly stanoveny fotometricky na spektrofotometru Libra S 22 (Biochrom Ltd., UK) za použití komerčních setů (Randox Laboratories Ltd., Crumlin, UK). Výsledky pokusu byly zpracovány jednoduchou analýzou variance programem SAS (SAS Institute Inc., 2003), metoda ANOVA. Statisticky průkazné rozdíly byly hodnoceny Duncanovým testem. Průkaznost rozdílů je značena různými písmeny na hladině významnosti P≤0,05. Korelace mezi sledovanými parametry byly hodnoceny Pearsnovým korelačním koeficientem.

Výsledky a diskuse V živé hmotnosti králíků v 91 dnech věku, stejně jako v průměrném denním přírůstku byly zjištěny vysoce průkazné rozdíly (P≤ 0,001) mezi plemeny. Nejvyšší živá hmotnost i přírůstek byly u velkého plemene Mm a dále u středního plemene ČA. Naopak nejnižší hodnoty byly u malých plemen Čč a Ččp. Tyto výsledky odpovídají i předpokladům o růstu králíků ve vztahu k tělesnému rámci a korespondují s našimi předchozími údaji (Tůmová et al., 2011). Obsah ledvinového tuku byl signifikantně (P≤ 0,001) nejvyšší u plemene ČS. Toto plemeno mělo i průkazně nejvyšší obsah tuku ve stehenním svalstvu (P≤ 0,017) a nevýznamně nejvyšší obsah cholesterolu ve stehenním svalstvu.

213 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab. 1 Výsledky růstu, obsahu tuku v jatečném trupu a stehnech, obsahu cholesterolu ve stehnech (Results of growth, renal fat, fat and cholesterol content in thigh meat)

Plemeno

Živá Průměrný Obsah Obsah tuku Obsah hmotnost denní ledvinového ve stehenním cholesterolu v 91 dnech přírůstek (g) tuku (%) svalstvu (%) ve stehenním (g) svalstvu (%) a

42,6

2190

dc

30,7

ČA

2804

ab

39,6

ČL

2024

cd

29,9

Čč

1933

d

26,6

Mbh

2520

bc

Ččp

cd

Mm

3217

ČS

a

abc

2,55

a

3,59

bc

2,84

abc

2,27

ab

2,26

abc

2,20

1,25 0,84

c

2,33 0,01

0,11

0,001

0,017

0,641

1,86

bc

2,98

ab

1,48

bc

1,90

bc

2,69

25,9

c

1,90

23,9 1,2

c

SEM

2000 325

Průkaznost

0,001

0,001

a,b,c,d

b

0,93

a

1,01

ab

0,92

b

0,95

b

0,89

b

0,91

b

0,93

P ≤ 0,05

Koncentrace TAG a NEFA v krevním séru nebyla genotypem králíků ovlivněna, nejvyšší koncentrace TAG byla u ČA a NEFA u Mm, v obou případech u plemen s nejvyšší intenzitou růstu. Vliv genotypu na koncentraci TAG a NEFA v krevním séru není v literatuře uváděn. Koncentrace cholesterolu byly signifikantně nejvyšší (P≤ 0,041) u velkého plemene Mm a dále u ČA, u kterého se koncentrace cholesterolu významně nelišila od Mm a ostatních plemen, která měla průkazně nižší koncentrace. Tyto výsledky jsou v souladu s údaji Atkinsona et al. (1989), kteří zjistili vliv genotypu na koncentraci cholesterolu v krvi.

214 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab. 2 Biochemické parametry tukového metabolismu v krevním séru (Biochemical parameters of fat metabolism in blood serum)

Plemeno

Cholesterol (mmol/l)

Mm

Triacylglyceroly (mmol/l) 0,91

NEFA (mmol/l)

3,16

a

1

ČS

0,89

1,81

b

0,83

ČA

1,3

2,36

ab

0,79

ČL

1,19

2,00

b

0,73

Čč

1,08

1,46

b

0,84

Mbh

0,75

1,87

b

0,81

Ččp

1,12

b

0,69

SEM Průkaznost

0,42 0,652

1,90 1,47 0,041

0,41 0,645

Korelace mezi přírůstkem živé hmotnosti a parametry krevního séra byly průkazné pouze u cholesterolu ((P≤ 0,01) a dosahovaly středních hodnot. Výsledky jsou v souladu s Hernandez et al. (2008), kteří zjistili, že koncentrace cholesterolu je ovlivněna genotypem, zejména však velikostí tělesného rámce. Významná korelace byla (P≤ 0,02) mezi podílem ledvinového tuku a NEFA. Také u těchto parametrů byly zjištěny střední hodnoty korelací. Korelace mezi obsahem tuku ve stehenním svalstvu a charakteristikami krevního séra nebyly významné a pohybovaly se v nízkých negativních hodnotách. Podobné vztahy byly zaznamenány i u obsahu cholesterolu v mase a hodnotami krevního séra.

Tab 3 Korelace mezi sledovanými parametry (Correlations between evaluated parameters).

Ukazatel Přírůstek TAG živé Chol. hmotnosti NEFA Podíl TAG ledvinového Chol. tuku NEFA

r 0,16

Průkaznost 0,31

0,4 0,12 -0,06 -0,18 0,39

0,01 0,43 0,71 0,32 0,02

Ukazatel Obsah tuku TAG ve stehenním Chol. svalstvu NEFA Obsah TAG cholesterolu Chol. ve stehenním NEFA svalstvu

r -0,08

Průkaznost 0,68

-0,22 -0,06 -0,03 -0,08 -0,22

0,71 0,71 0,98 0,65 0,23

215 | P a g e


May 24-25th 2012

Závěr Z výsledků je zřejmý vliv genotypu na růst králíků i obsah ledvinového tuku. Méně genotyp ovlivnil obsah tuku ve stehenním svalstvu, vliv na obsah cholesterolu ve stehenním svalstvu byl nevýznamný. Z biochemických ukazatelů byla signifikantně ovlivněna koncentrace cholesterolu. U korelací je zřejmé, že k růstu králíků měla vztah koncentrace cholesterolu a k podílu ledvinového tuku koncentrace neesterifikovaných mastných kyselin. Vztah mezi parametry krve a obsahem tuku či cholesterolu ve stehenním svalstvu nebyl zjištěn, korelace byly velmi nízké a negativní.

Poděkování Příspěvek byl zpracován při řešení projektu NAZV QI101A164.

Použitá literatura Atkinson, J.B., Hoover, R.L., Berry, K.K., Swift, L.L. Cholesterol-fed heterozygous Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits: a new model for atherosclerosis. Atherosclerosis, 1989, 78, 123-136. Bolet, G., Brun, J. M., Monnerot, M., Abeni, F., Arnal, C., Arnold, J., Bell, D., Bergoglio, G., Besenfelder, U., Bosze, S., Boucher, S., Chanteloup, N., Ducourouble, M. C., DurandTardif, M., Esteves, P. J., Ferrand, N., Haas, C., Hewitt, G., Jehl, N., Joly, T., Koehl, P. F., Laube, T., Lechestrier, S., Lopez, M., Masoero, G., Menigoz, J. J., Piccinin, R., Querney, G., Vincente, J. S., Saleil, G., Surrdge, A., Van Der Loo, W., Virag, J. S., Viudes de Castro, M. P., Zimmermann, J. M.: Evaluation and utilisation of European rabbit (Oryctolagus cuniculus) genetic resources. In: Proc. 7th World Rabbit Congr., Valencia, Spain, 4-7 July 2000, pp. 1-32. Hernandez P, Cesari V, Blasco A Effect of genetic rabbit lines on lipid content, lypolytic activities and fatty acid composition of hind leg meat and perirenal fat. Meat Sci., 2008, 78, 485-491 Tůmová, E., Martinec, M., Chodová, D. Analysis of Czech rabbit genetic resources. Scientia Agric. Bohemica, 2011, 42, s. 113 – 118.

216 | P a g e


May 24-25th 2012

SELECTED SPERMATOZOA MOTILITY PARAMETERS VERSUS CATALASE AND GLUTATHIONE CONTENT IN BOVINE SEMINAL PLASMA Tvrdá, E.,1 Kňažická, Z.,1 Lukáčová, J.,1 Massányi, P.,1 Goc, Z.,2 Kilian, K.,2 Formicki, G.,2 Stawarz, R.,2 Lukáč, N.1 1


Agriculture, Nitra, Slovakia, 2Institute of Biology, Faculty of Geography and Biology, Pedagogical University, Krakow, Poland

Abstract To investigate the relationships between basic motility characteristics (motility, progressive motility) and selected antioxidant parameters (catalase-CAT, glutathione-GLH) in the bovine seminal plasma semen samples were collected from breeding bulls and used in the study. Motility analysis was carried out using the Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) system. Subsequently, the samples were centrifuged and fractions of seminal plasma were collected. Antioxidant parameters were analyzed by UV/VIS spectrophotometry. The correlation analysis revealed that both antioxidants were positively correlated with motility (r = 0.521; p < 0.05 for CAT and r = 0.525; p < 0.05 for GLH), progressive motility (r = 0.521; p < 0.05 for CAT and r = 0.520; p < 0.05 for GLH). Moreover the samples were categorized in three quality groups (Excellent, Good, Medium) according to their motility values. The the best antioxidant characteristics were found in samples of excellent quality, medium quality samples were described by the worst antioxidant power. Our findings suggest a protective role of seminal plasma catalase and glutathione against oxidative stress development in bovine semen.

Key words: bulls, CASA, catalase, glutathione, oxidative stress, semen.

Introduction Oxygen is essential to sustain life as physiological levels of reactive oxygen species (ROS) are necessary to maintain normal cell functions. Conversely, ROS can prove to be detrimental to cell function and survival (Makker et al., 2009). Excessive ROS production in farm animal diseases has been mainly associated with infectious

217 | P a g e


May 24-25th 2012

diseases, such as pneumonia, enteritis, mastitis, endometritis, arthritis, intestinal strangulation and sepsis (Lykkesfeldt and Svendsen, 2007). Regarding male fertility, increased levels of ROS have been correlated with decreased sperm motility, increased sperm DNA damage, sperm cellular membrane lipid peroxidation and decreased efficacy of oocyte–sperm fusion (Aitken, 1995; Eskenazi et al., 2003; Agarwal et al., 2007). Antioxidants, in general, are compounds or enzymes that dispose, scavenge and inhibit the formation of ROS, or oppose their actions (Sikka et al., 1995). They can be divided into two main categories: • Enzymatic (e.g. superoxide dismutases, catalase and glutathione peroxidases), • Non-enzymatic (e.g. vitamin C, vitamin E, vitamin A, carotenoids, albumin, glutathione, uric acid, pyruvate, etc.; Agarwal and Prabakaran, 2005). Due to the size and small volume of cytoplasm, as well as the low concentrations of scavenging enzymes, spermatozoa have limited antioxidant defence properties. Mammalian sperm mainly contain enzymatic antioxidants, which are mainly present in the midpiece. A few nonenzymatic antioxidants are present in the plasma membrane of spermatozoa and act as preventive antioxidants. Under normal conditions, the seminal plasma is an important protectant of sperm cells against possible free radical formation and distribution. It contains both enzymatic antioxidants, as well as an array of non-enzymatic antioxidants (e.g. ascorbate, urate, vitamin E, vitamin A, pyruvate, glutathione, albumin, taurine and hypotaurine; Agarwal et al., 2004; Tvrda et al., 2011). This study was carried out to: determine selected basic motility characteristics and antioxidant parameters of bovine semen, test whether any correlation exists between these markers in bovine seminal plasma. The motility and antioxidant parameters were as follows: • Motility (MOT): percentage of motile spermatozoa (motility > 5µm/s), • Progressive motility (PROG): percentage of progressive motile spermatozoa (motility > 20µm/s), • Catalase (CAT): a major antioxidant enzyme produced by the organism, which catalyzes the decomposition of hydrogen peroxide to water and oxygen, • Glutathione (GLH): an important non-enzymatic protein with antioxidant properties preventing damage to important cellular components caused by ROS.

Material and Methods 20 bovine semen samples were obtained from adult breeding bulls (Slovak Biological

218 | P a g e


May 24-25th 2012

Services, Nitra, Slovakia) on a regular collection schedule using an artificial vagina. After collecting the samples were stored in the laboratory at room temperature (22-25°C) for further analysis. Spermatozoa motility and progressive motility analysis was carried out using the Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) system – SpermVision (MiniTüb, Tiefenbach, Germany) with Olympus BX 51 phase contrast microscope (Olympus, Japan). Each sample was placed into Makler Counting Chamber (depth 10 µm, 37±1°C; Sefi–Medical Instruments, Haifa, Israel), motility and progressive motility parameters were evaluated. 1000 cells were examined for each sample (Massanyi et al., 2008). The samples were centrifuged (15 min, 12 718 x g, 4°C) to obtain the cell sediment and seminal plasma fraction. The fractions were separated, seminal plasma was transferred into 1.5 mL tubes and kept frozen (-80°C) until analysis (Tvrda et al., 2012). All of the measurements were based on a colorimetric reaction of the target substance and a subsequent UV/VIS spectrophotometric detection at a specific wavelength. TAS, SOD and ALB were measured using the Genesys 10 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc, USA). Reduced glutathione was determined by the Ellman method (1959). 1 mL of supernatant was treated with 0,5 mL of Ellmans reagent (19.8 mg of 5,5´dithiobisnitro benzoic acid in 100 mL of 0.1 % sodium citrate) and 3.0 ml of phosphate buffer (0.2 M, pH 8.0). The absorbance was read at 412 nm. Activity measurements of catalase were performed by the Beers and Sizer method (1952) monitoring the decrease of H2O2 at 240 nm. The reaction mixture contained 1.7 mL of 50 mmol/L of potassium phosphate buffer solution (pH 7.0), 30 uL of the sample and 0.5 mL of 54 mmol/L H2O2 solution. The activity was calculated based on the rate of decomposition of H2O2, which is proportional to the reduction of the absorbance at λ = 240 nm during 1 min. Statistical analysis was carried out using the statistical program GraphPad Prism 3.02 (Graphpad Software incorporated, San Diego, California, USA). Results are quoted as arithmetic mean±standard deviation (SD). Additionally, the samples were categorized in three quality groups according to their motility rates. The comparison of semen parameters in the quality groups was carried out by the Tukey's Multiple Comparison Test. Pearson’s correlation coefficient (two tailed) test was used to examine correlations between all the analyzed parameters. The level of significance for the comparison test as well as for the correlation analysis was set at *** (p < 0.001); ** (p < 0.01); * (p < 0.05). 219 | P a g e

May 24-25th 2012


Results and Discussion Tab. 1 Semen characteristics of bovine semen and seminal plasma (n=15). PARAMETER

MEAN

MIN

MAX

SD

CV

VOLUME (mL)

5.55

3.00

9.00

1.64

19.51

pH

6.57

6.25

7.04

0.21

3.22

CONCENTRATION (109)

2.69

1.48

4.12

0.80

19.78

MOTILITY (%)

81.61

14.93

95.96

9.86

14.33

PROGRESSIVE MOTILITY (%)

78.48

14.07

93.68

10.15

15.67

CATALASE (U/mg proteins)

2.39

0.42

6.13

1.91

13.61

GLUTATHIONE (mg/100mL)

26.52

6.59

81.92

6.87

19.95

SD – standard deviation; CV – coefficient of variation

The total catalase content of the bovine seminal plasma was recorded as 2.39±1.91 U/mg (Table 1) which was positively correlated with sperm motility (p<0.05) and progressive motility (p<0.05; Table 2). Alavi-Shoushtari et al. (2009) observed that the catalase activity of water buffalo bulls was 32.00±0.42 U/mL and was highly associated with sperm motility, viability and sperm gross motility. Additionally, we recorded a significant decrease of the catalase activity in the good quality group (p < 0.05) and moderate quality group (p < 0.001) when compared to the excellent group (Table 3). The findings of other authors are however controversial. Sanocka et al. (1996) showed a decrase of catalase activity in infertile samples. Lapointe et al. (2000) reported that catalase had a significant positive effect on the maintenance of bovine sperm motility. Verberckmoes et al. (2005) observed that addition of catalase to the semen diluents had no effect on sperm quality in bulls. Marti et al. (2007) suggested that catalase activity was higher in the first ejaculate of rams during all months of the year and higher in non-breeding season and finally, DeGraaf et al. (2007) found that in vitro addition of catalase had no effect on the post-thawn sperm motility in rams.

220 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab. 2 Correlations between selected spermatozoa motility and antioxidant parameters of bovine seminal plasma evaluated by the Pearson’s correlation coefficient test (n=15). MOT

PROG

CAT

GLH

VOL

pH

MOT

1

PROG

0.996***

1

CAT

0.521*

0.521*

1

GLH

0.525*

0.520*

0.312

1

VOL

-0.034

-0.046

-0.261

-0.304

1

pH

-0.346

-0.311

-0.290

-0.039

-0.013

1

-0.0301

-0.053

-0.113

-0.226

0.153

-0.362

9

[10 ]

[109]

1

The correlation analysis was correlation based on the value of the correlation coefficient: ±0.667 - ±0.999: high correlation; ±0.334 – ±0.666: moderate correlation; ±0.111 - ±0.333: low correlation; - p < 0.05; -p< 0.01; - p < 0.001.

The total GLH content of bovine seminal plasma detected in our experiment was 26.52±6.87 mg/100mL. The total GLH content of bovine spermatozoa detected by Stradaioli et al. (2007) in the raw semen was 566.9±75.0 pmoles/mg protein and it was very close to that reported by Bilodeau et al. (2000). Sperm GLH levels vary widely between species, from 0.1 nmol/109 spermatozoa in rabbit to 90 nmol/108 spermatozoa in mouse Ochsendorf (1998). Agarwal and Vanha-Perttula (1988) state that the total content of GLH in the bovine semen is 1.3 mM. In our case, the GLH concentration was positively correlated with both motility (p<0.05) and progressive motility (p<0.05). Additionally we observed a similar decrease in its content according to a decreased quality of semen, as we did in the case of catalase (p<0.05; p<0.001). According to Ochsendorf et al. (1998) no association between sperm GLH concentration to any parameter of the routine ejaculate analysis was found. Also, only a small but still significant association was found between the intracellular glutathione concentration and the fertilization ability of human spermatozoa was found. Furthermore, there was no statistical difference (p>0.05) between the GLH concentrations in the samples of fertile or infertile patients or associations to parameters of the spermiogram. However, in a doubleblind study of Lenzi et al. (1993) GLH therapy improved spermatozoa motility. Moreover, supplementation of GLH in the extender has been shown to provide a protective role in maintaining the quality of bovine (Bilodeau et al., 2000) and buck semen (Sinha et al., 1996).

221 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab. 3 Average values of observed motility and antioxidant parameters in the quality groups (mean±SD) and the Tukey’s Multiple Comparisson Test (n=15). MOT

PROG

CAT

GLH

Ex

93.87±1.79

91.02±1.80

2.73± 1.86

33.79±12.02

Go

85.95±2.13*a

83.33±3.31*a

2.39± 2.39*a

24.35±12.60*a

Mo

59.62±14.92***b,***c

55.63±14.40***b,***c

1.74±1.56***b,***c

21.70±5.61***b

Quality groups are based on the motility values: Excellent quality (Ex): > 90% motile (n=9); Good quality (Go): 80-90 % motile (n=5); Moderate quality (Mo): < 80% motile (n=6). Mean ± SD. MOT – motility, PROG – progressive motility, CAT – catalase (U/mg proteins), GLH – glutathione (mg/100 mL). *** (p < 0.001); ** (p < 0.01); * (p < 0.05). a – Ex vs. Go; b – Ex vs. Mo; c – Go vs. Mo.

Despite our expectations to find a significant relationship between catalase and glutathione, a positive, nut no significant correlation (p>0.05) was found. This observation may suggest that each of these antioxidants protects semen on a different level. CAT catalyzes the reduction of H2O2 and protects the tissues from highly reactive hydroxyle radicals (Chance et al., 1952), meanwhile GLH functions as free radical scavenger and in the repair of radical cause biological damage (Meister, 1984). Both of these antioxidants participate in the elimination of toxic H2O2, however actions of GLH are not limited on hydrogen peroxide only. Therefore we may assume that even though there is collaboration between all of the antioxidant mechanisms in order to protect spermatozoa against oxidative stress, the pathways and exact mechanisms are specific for enzymatic and non-enzymatic antioxidants.

Conclusions In conclusion, our findings indicate a protective role of seminal plasma catalase and glutathione against oxidative stress development in bovine semen. Both antioxidants are positively correlated with basic parameters of spermatozoa viability and their decrease is associated with a lower quality of ejaculates. As both are part of a crucial defence mechanism to protect sperm cells from oxidative damage, further studies on both proteins and their possible therapeutic assessment in male infertility are requested.

222 | P a g e


May 24-25th 2012

Acknowledgment This study was supported by the Scientific Grand of the Slovak republic VEGA no. 1/0532/11 and by the Cultural and Educational Grant of the Slovak Republic KEGA no. 101001SPU-4/2010.

References Agarwal, Y.P., Vanha-Perttula, T. Glutathione, L-glutamic acid and γ-glutamyl transpeptidase in the bull reproductive tissues. Int. J. Androl., 1988, 11 (2), 123–131. Agarwal, A., Nallella, K. P., Allamaneni, S. S., Said, T. M. Role of antioxidants in treatment of male infertility: an overview of the literature. Reprod. Biomed. Online, 2004, 8, 616– 627. Agarwal, A., Prabakaran, S. A. Mechanism, measurement, and prevention of oxidative stress in male reproductive physiology. Indian J. Exp. Biol., 2005, 43, 963–974. Agarwal, A., Prabakaran, S. A., Sikka, S. C. Clinical relevance of oxidative stress in patients with male factor infertility: evidence-based analysis. AUA Update Series, 2007, 26, 1–12. Aitken, R. J. Free radicals, lipid peroxidation, sperm function. Reprod. Fertil. Dev., 1995, 7, 659–668. Alavi-Shoushtari, S.M., Asri Rezai, S., Ansari, M.H.Kh., Khaki, A. Effects of the seminal plasma zinc content and catalase activity on the semen quality of water buffalo (Bubalus bubalis) bulls. Pak. J. Biol. Sci., 2009, 12 (2), 134-139. Beers, R.F. Jr., Sizer, I.W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J. Biol. Chem., 1952, 195, 133-140. Bilodeau, J.F., Chatterjee, S., Sirard, M.A., Gagnon, C. Levels of antioxidant defenses are decreased in bovine spermatozoa after a cycle of freezing and thawing. Mol. Reprod. Dev., 2000, 55, 282–288. Chance, B. Effect of pH upon the reaction kinetics of the enzyme-substrate compounds of catalase. J. Biol. Chem., 1952, 194, 471-481. De Graaf, S.P., Evans, G., Gillan, L., Guerra, M.M., Maxwell, W.M., O'Brien, J.K. The influence of antioxidant, cholesterol and seminal plasma on the in vitro quality of sorted and non-sorted ram spermatozoa. Theriogenology, 2007, 67 (2), 217-27. Ellman, G.L. Tissue sulfhydrl groups. Arch. Biochem. Biophys., 1959, 82, 70–77. Eskenazi, B., Wyrobek, A. J., Sloter, E., Kidd, S. A., Moore, L., Young, S., Moore, D. The association of age and semen quality in healthy men. Hum. Reprod., 2003, 18, 447–454. Lapointe, S., Bilodeau, J.F., Lemieux, D., Asselin, E., Sirard, M.A. Epithelial and stromal uterine cells cultured in vitro protect bovine sperm from hydrogen peroxide. Theriogenology, 2000, 54 (3), 355-369. Lenzi, A., Cualosso, F., Gandini, L., Lombardo, F., Dondero, F. Placebo controlled, doubleblind, cross-over trial of glutathione therapy, in male infertility. Hum. Reprod., 1993, 9, 2044-2050. Lykkesfeldt, J., Svendsen, O. Oxidants and antioxidants in disease: Oxidative stress in farm animals. Vet. J., 2007, 173, 502–511. Makker, K., Agarwal, A., Sharma, R. Oxidative stress & male infertility. Ind. J. Med. Res., 2009, 129, 357–367. Marti, E., Mara, L., Marti, J.I., Muiño-Blanco, T., Cebrián-Pérez , J.A. Seasonal variations in antioxidant enzyme activity in ram seminal plasma. Theriogenology, 2007, 67 (9), 14461454.

223 | P a g e


May 24-25th 2012

Massanyi, P., Chrenek, P., Lukac, N., Makarevich, A.V., Ostro, A., Zivcak, J., Bulla, J. Comparison of different evaluation chambers for analysis of rabbit spermatozoa moility using CASA system. Slovak J. Anim. Sci. 2008, 41(2), 60-66. Meister A. New aspects of glutathione biochemistry and transport--selective alteration of glutathione metabolism. Nutr. Rev., 1984, 42 (12), 397-410. Ochsendorf, F.R., Buhl, R., Bastlein, A., Beschmann, H. Glutathione in spermatozoa and seminal plasma of infertile men. Hum. Reprod., 1998, 13, 353–359. Sanocka, D., Miesel, R., Jedrzejczak, P., Kurpisz, M.K. Oxidative stress and male infertility. J. Androl., 1996, 17 (4), 449-454. Sikka, S. C., Rajasekaran, M., Hellstrom, W. J. Role of oxidative stress and antioxidants in male infertility. J. Androl., 1995, 16, 464–468. Sinha, M.P., Sinha, A.K., Singh, B.K., Prasad, R.L. The effect of glutathione on the motility, enzyme leakage and fertility of frozen goat semen. Anim. Reprod. Sci., 1996, 41 (3-4), 237-243. Stradaioli, G., Noro, T., Sylla, L., Monaci, M. Decrease in glutathione (GSH) content in bovine sperm after cryopreservation: Comparison between two extenders. Theriogenology, 2007, 67, 1249–1255. Tvrda, E., Knazicka, Z., Bardos, L., Massanyi, P., Lukac, N. Impact of oxidative stress on male fertility – a review. Acta Vet. Hung., 2011, 59 (4), 465–484. Tvrda, E., Knazicka, Z., Lukac, N. Selected heavy metals versus antioxidant parameters in bull seminal plasma – a comparative study. J. Env. Sci. Health A, 2012, 47 (9), 12611266. Verberckmoes, S., Van Soom, A., Dewulf, J., de Kruif A. Comparison of three diluents for the storage of fresh bovine semen. Theriogenology, 2005, 63 (3), 912-922.

224 | P a g e

May 24-25th 2012


INFLUENCE OF FACTORS INVOLVED IN THE REGULATION OF PROLACTIN SECRETION ON THE EXPRESSION OF GENES – CODING FOR OPIOID PRECURSORS – IN ANTERIOR PITUITARY CELLS OF THE LATE FOLLICULAR - PHASE GILTS IN VITRO Tworus, K., Tworus, D., Okrasa, S. Department of Animal Physiology, University of Warmia and Mazury in Olsztyn; Oczapowski Street 1A, 10719 Olsztyn-Kortowo

Abstract Endogenous

opioid

peptides

deriving

from

proopiomelanocortin

(POMC),

proenkephalin (PENK) and prodynorphin (PDYN) are, among others, involved in the modulation of prolactin secretion in females. However, data concerning factors modulating the activity of pituitary opioid systems are scarce. The aim of the study was to test whether pituitary opioid systems are affected by factors engaged in the regulation of prolactin secretion, such as: dopamine, tyreoliberin, salsolinol, kisspeptin, corticotropin and oxytocin. Anterior pituitaries were collected from gilts on days 20-21 of the estrous cycle. Isolated cells were incubated (N=7) with dopamine (10-7 and 10-6M), tyreoliberin (10-8 and 10-7M), kisspeptin (10-8 and 10-7M), oxytocin (10-8 and 10-7M), salsolinol (10-8 and 10-7M), prostaglandin E (10-8 and

10-7M) and corticotrophin (10-8 and 10-7M). The expression of

endogenous opioid genes was determined by a Real-Time RT-PCR technique. The expression of POMC, PENK and PDYN genes significantly increased in response to treatments with kisspeptin, corticotropin and dopamine. In addition, the expression of PENK and PDYN genes was significantly elevated by oxytocin and prostaglandin E, but that of PDYN gene was increased by salsolinol. These results indicate that factors potentially involved in the regulation/modulation of prolactin secretion, tested herein, may influence the pituitary expression of genes coding for opioid precursors in gilts during follicular late phase of the estrous cycle. Thereby, it is suggested that EOP may be incorporated in the network of factors regulating prolactin secretion at the pituitary level.

225 | P a g e

May 24-25th 2012


THE EVALUATION OF SEMEN COLLECTION AND EJACULATE QUALITY OF HUNTING DOGS Vágenknechtová, M., Hošek, M., Filipčík, R., Máchal, L. Department of Animal Breeding, Agronomy Faculty, Mendel University in Brno

Abstract Hunting dogs works with men for thousands years. Game law proceses without well trained dogs are not possible. To take well hunting dog is long term proces, for it is need long term progeny, breeding and kennel rights, training and ability for succesfull reproduction. The aim of this work was evaluate semen quality of ten hunting dogs of six different breeds dividend in FCI group. We evaluate time of semen collection, semen quality and sperm morphology. Highest semen volume, motility and sperm concentration was found in group FCI 3 – Terriers, neverthles worst semen parameters had dogs from group FCI 7 – Setters. Best results in evaluation of pathomorphological changes on sperms was observed in FCI group 4 – Dachshund.

Key words: dog semen collection, ejaculate quality, sperm morphology, FCI groups Introduction In Czech Republic is hold approximately 1 million dogs of many breeds. Most important prerequisite of breeding work is successful dog reproduction. The important part of reproduction is dog ejaculate collection and evaluation. This is reason of great interest from breeders for qualitative dog semen evaluation, because lots of male dogs can to be sub fertile (Věžník et al., 2004). Gunay et al., (2003) collected 5 weeks spermatic fraction of ejaculate from 7 German shepherds, weekly two time in 60 minutes frequency. Between first and second ejaculate was found significant difference in volume and semen concentration, sperm motility, number of live sperm and morphological changes was not affected. Similar results found England (1999), but he found breed effect, when German shepherds have greater volume of ejaculate and total sperm number then other breeds. England (1999) evaluated effect of short frequency between collections too. Conclude, that two ejaculates collected in 60 minutes frequency can result in gain more 70% sperm than from one semen collection. Schafer et al., (1997) collected Beagle dogs two time a week for six month. In evaluated period was not affected libido and qualitative ejaculate parameters, but only spermatic

226 | P a g e

May 24-25th 2012


fraction volume decreased from 1,2 (January) on 0,5 ml (June). Gamčík et al., (1992) presents, that minimal motility dog semen for insemination can not decreased under 70% and number of morphologicaly normal sperms must to be 80%. Věžník et al., (2004) presents like sufficient number of morphologicaly normal sperms in ejaculate for insemination 70 %. Material and methods The ejaculates was collected from 10 dogs of six different breeds (3 Dachshunds rough, Jagdterrier, Bulterrier, Foxterrier, 2 German shorthaired setter and 2 Irish setter). Dogs was in evaluation divided on FCI groups (FCI 3 – Terriers, FCI 4 – Dachshunds, FCI 7 – Setters). The whole ejaculates (all three fractions) was collected in three month period and 30 day frequency by manual stimulation in presence of bitch in estrus. Measurements of prepare time for collection and time of ejaculate collection was done. Immediately after semen collection was done macroscopical and microscopical evaluations of semen quality – semen volume, motility and concentration. Semen volume was measured in calibration container (ml), motility subjectively in native preparate on microscope (%) and concentration hemocytometricaly in Bürker cells (103 x mm-3). For morphological evaluation of semen was used colouring method by Farelly (in Věžník et. al. 2004). Was count percent of morphologicaly normal, abnormal and immature sperms.

Results and discussion Start, course and time of collection Tab. 1 Čas přípravy a doba odběru ejakulátu dle skupin FCI (Prepare time and time of semen collection by FCI group) FFactor

Time of collection (s)

x

±

sx

x

±

sx

30

157,0

±

316,3

282,0

±

192,2

FCI 3

9

63,3A

±

22,5

120,0AB

±

57,6

FCI 4

9

370,0AB

±

523,2

313,3A

±

254,2

FCI 7

12

67,5B

±

25,2

380,0B

±

112,0

Total

FCI group

Prepare time (s)

n

A,B – between numbers in columns was found statistical differences (P≤ 0,01) Group FCI 3 Terriers, group FCI 4Dachshunds, group FCI 7 Setters.

227 | P a g e

May 24-25th 2012


How shows table 1, prepare time of collection was longest in dogs of FCI 4 – 370s. Dogs of FCI groups 3 and 7 had prepare time distinct shorter (63,3s in FCI 3 and 67,5s in FCI 7), than FCI 4 dogs. Between groups FCI 4 and FCI 3 was find out significant difference (P≤ 0,01), between groups FCI 4 and FCI 7 was find too. How present Vagenknechtova (2010), average preparation time for dog collection is 3,7 minutes and time ranged from 0,5 to 23,7 minutes. Our measurements range in similar values. Time of collection was longest in dogs of FCI 7 group - 380s, when dogs of group FCI 4 had time of semen collection slightly shorter (313,3s). Shortest collection time was measured in dogs of FCI 3, only 120s. High statistical difference (P≤ 0,01) was find between FCI group 3 and FCI group 4 and between FCI group 3 and FCI group 7

too.

Vagenknechtova (2010) present, that average time of dog semen collection is 6,4 minutes. In our evaluation results range from 2,0 to 6.3 minutes, average time of collection was only 4,7 minutes, what is slightly shorter time of dog semen collection and reason of this difference is home place of semen collection in comparison with Vagenknechtova (2010), which collect semen in different environments (home vs. laboratory). Semen volume, motility and concentration Tab. 2 Hodnocení objemu, aktivity a koncentrace spermií (Volume, motility and concentration) Factor

n

Motility (%)

Concentration (in ths)

x

±

sx

x

±

sx

x

±

sx

30

6,0

±

2,3

68,3

±

20,1

168,1

±

97,3

FCI 3

9

7,0A

±

0,6

76,7 A

±

11,8

186,7

±

19,2

FCI 4

9

6,4a

±

3,0

74,4 B

±

8,5

177,4

±

75,1

FCI 7

12

±

25,8

147,1

±

137,3

Total

FCI group

Semen volume (ml)

4,9

Aa

±

2,1

57,5

AB

A,B -– between numbers in columns was found statistical differences (P≤ 0,01) a,b - – between numbers in columns was found statistical differences (P≤ 0,05) Group FCI 3 Terriers, group FCI4 Dachshunds, group FCI 7 Setters.

The highest volume of whole collected ejaculate was find in dogs of group FCI 3, which volume was 7,0 ml. Relatively higher semen volume was in dogs of FCI group 4 (6,4 ml). Lowest volume of whole ejaculate was find in dogs of group FCI 7 - 4,9 ml. Between groups FCI 3 and FCI 7 was find significant difference (P≤ 0,01), between group FCI 4 and FCI 7 significant difference (P≤ 0,05). Gamčík, et al. (1992) present average dog semen

228 | P a g e

May 24-25th 2012


volume 7,0 ml, Jelínek et al. (2003) 6,0 ml and Věžník et al. (2004)) volume of dog semen only 2,0 ml. In our measurements we have average whole dog ejaculate volume, depend on FCI group, 6,0 ml in range 2,3 ml. Best results in motility we find out in dog semen of group FCI 3 and FCI 4 (76,7 % in FCI 3 and 74,4 % in FCI 4 respectively). Worst motility was find out in dogs group FCI 7 (57,5 %). High significant difference (P≤ 0,01) was between dogs of group FCI 3 and FCI 7 and between groups FCI 4 and FCI 7 too. Svoboda, Senior et al. (2001) and Věžník et al. (2004) present as minimal dog sperm motility for normal health dog 70%. On this percent in our evaluation reach dogs from group FCI 3 (Terriers) and FCI 4 (Dachshunds). The dogs of FCI group 7 (Setters) had only 57,5% motility and in next evaluations is necessary target attention on this group of dogs. Table 2 present, that highest sperm concentration had dogs from group FCI 3 (186,7 x 103 x mm-3). In dogs of group FCI 4 was concentration very similar to group FCI 3 (177,4 x 103 x mm-3). Lowest sperm concentration had dogs of FCI 7 (147,1 x 103 x mm-3). Between groups for sperm concentration was not find out significant differences. The average sperm concentration for all dogs of FCI groups was (168,1 x 103 mm-3). Jelínek et al. (2003) present as average sperm concentration for all dog population 120,1 x 103 mm-3. Opposite Věžník et. al. (2004) present as average dog sperm concentration 200,1 x 103 mm-3, our concentrations are between cited authors. Evaluation of morphologicaly normal, immature and abnormal sperms. Tab. 3 Hodnocení morfologických změn na spermiích (Morphologicaly normal, immature and abnormal sperms) Factor

n

Immature sperms (%)

Morphologicaly abnormal (%)

x

±

sx

x

±

sx

30

58,6

±

15,9

7,9

±

8,5

FCI 3

9

58,4

±

9,3

10,0

±

13,2

41,6

±

9,3

FCI 4

9

±

8,0 6,4

6,4 4,3

35,5a 45,6a

±

12

5,9 22,5

±

FCI 7

64,4 54,4

5,9 22,5

Total

FCI group

Morphologicaly normal (%)

±

±

x 41,3

± ±

±

sx

15,9

a,b - between numbers in columns was found statistical differences (P≤ 0,05) Group FCI 3 Terriers, group FCI4 Dachshunds, group FCI 7 Setters.

Table 3 present, that best percent of morphologicaly normal sperms (64,4 %) in ejaculate had group FCI 4, following by group FCI 3 with 58,4 % morphologicaly normal

229 | P a g e


May 24-25th 2012

sperms. Lowest percent of morphologicaly normal sperms had dogs of group FCI 7 (54,4%). Because low differences between all groups in morphologicaly normal sperms, was not found significant difference between groups. For dogs is 70% morphologicaly normal sperms standard value (Věžník et. al., 2004). Vagenknechtova et al. (2011) in previous study find out normal sperm morphology in average 64,3%. In our study was find out average morphologicaly normal sperms 58,6%, immature sperms was 7,9% and morphologicaly abnormal sperms 41,3%. Any of evaluated FCI groups have percent of morphologicaly normal sperm, which are present for example in Věžník et. al. (2004).

Conclusion The aim of this study was collection and evaluation of ejaculates three groups of hunting dogs (FCI 3 – Terriers, FCI 4 – Dachshunds, FCI 7 – Setters). The ejaculates was collected from ten dogs of six breeds (3 Dachshund rough, Jagdterrier, Bulterrier, Foxterrier, 2 German shorthaired setters and 2 Irish setters). The dogs of group FCI 3 (Terriers) had shortest time of preparetion for collection (63,3s) and time of collection - ejaculation (120s), but greatest whole semen volume (7,0 ml), highest sperm motility (76,7%) and sperm concentration (186,7 x 103 x mm-3) too. Only in percent of morphologicaly normal sperms was Terriers on second position (58,4%). Highest percent immature sperms in ejaculate was find out in this group (10,0 %). The dogs of group FCI 4 (Dachshunds) needs for preparation on semen collection (start of sexual reflexes) longest time (370s), time of ejaculation was in average 313,3s. Volume of whole ejaculate was 6,4ml, motility and sperm concentration was very good (74,4 %, 177,4 x 103 x mm-3). In morphological sperm evaluation had this group of dogs best result - 64,4% morphologicaly normal sperms. The group of dogs FCI 7 (Setters) had longest time of semen collection (380s), whole semen volume only (4,9 ml), sperm motility 57,7 % and concentration 147,1 x 103 x mm-3. Dogs of this group had higher percent morphological abnormal sperms too. Dog breeders can increase their efforts and can more evaluate dogs reproduction functions. We can recommend to breeders before breeding of each dog complete screening of ejaculate qualitative parameters.

Acknowledgements Work was supported by IGA AF MENDELU TP 1/2012.

230 | P a g e


May 24-25th 2012

References England, G. C. W. Semen quality in dogs and the influence of short-interval second ejaculation. Theriogenology, 1999, 52, 6, 981-986. Gamčík, P., Kozumplík, J.: Andrológia a umelá inseminícia hospodářských zvierat, Príroda, 1992, s290 Gunay, U., Polat, U., Gunes, N., Soylu, M., K., Kil, F. The effects of short-interval ejaculation on semen quality and some biochemical parameters in dogs. Revue de Medicine Vetrinaire, 2003, 154, 7, 459-462 Jelínek, P., Koudela, K., et al. Fyziologie hospodářských zvířat, MZLU v Brně, 2003, 351s, Schafer, S., Holzmann, A., Arbiter, K. The influence of frequent semen collection on the semen quality of beagle-dogs. Deutsche tierarztliche wochenschrift, 1997, 104, 1, 26-29 Svoboda, M., Senior, D. Nemoci psa a kočky II. díl, Brno, Noviko, 2001. Vagenknechtová, M. Vliv vybraných faktorů na odběr semene a kvalitu ejakulátu psů. In Animal Physiology 2010: Proceedings of International Conference. Brno: Mendelova univerzita, 2010. Vagenknechtová, M., Hošek, M., Máchal, L. Vliv věku na kvalitu spermatu u psů. In Animal Bredeeding, Brno Mendelova univerzita, 2011 Věžník, Z., Švecová, D., et al. Repetitorium spermatologie a andrologie a metodiky spermatoanalýzy, Brno, 2004

231 | P a g e

May 24-25th 2012


FLOW-CYTOMETRIC DETECTION OF THE RABBIT HEMATOPOIETIC STEM CELLS Vašíček, J.,1,2 Shehata, M.,3 Chrenek, P.1,2 1

Animal Production Research Centre Nitra, Lužianky, Slovak Republic,

2

Department of Biochemistry and Biotechnology, Faculty of Biotechnology and Food Science, Slovak

University of Agriculture, Nitra, Slovak Republic, 3

Division of Hematology and Hemostaseology, Department of Internal Medicine I, Medical University of

Vienna, Vienna, Austria

Abstract The aim of this preliminary study was to detect the CD133+ and CD34+ cells within human and rabbit peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using flow cytometry and different clones of CD133 and CD34 antibodies. Young (3 – 8 month old) and clinically health rabbits of New Zealand White (NZW) line (n = 3) were used in the experiment. PBMCs from the blood samples of human volunteer and humanely sacrificed rabbits were isolated using Ficoll centrifugation and stained with different clones of anti-human monoclonal antibodies: PE-conjugated CD133 (AC133 and 293 C3), FITC-conjugated CD34 (AC136 and 581), Alexa Fluor 488-conjugated rabbit polyclonal CD34 and unconjugated mouse anti-rabbit CD45 according to the producer’s manual. We observed the highest percentage of CD34+ rabbit cells using the clone AC136 (0.43 ± 0.13%). The highest percentage of CD133+ rabbit cells was noticed using clone 293 C3 (0.50 ± 0.06%). We assumed that these clones of the anti-human antibodies could be efficient for rabbit HSCs flow-cytometric detection, but other experiments are required to prove this hypothesis.

Introduction The hematopoietic system is resourced by stem cells that are capable of both selfrenewal and differentiation into progenitor and mature blood cells of all hematopoietic lineages. Thus, it contains cells at various stages of maturation, including primitive hematopoietic stem cells (HSCs) that give rise to identical daughter cells as well as possessing mulitlineage differentiation capacity. Human CD34 was the first differentiation marker recognized on hematopoietic stem and progenitor cells from hematopoietic sources, such as fetal liver, cord blood, peripheral blood, and bone marrow. It is therefore the classical marker used to obtain enriched

232 | P a g e


May 24-25th 2012

populations of human hematopoietic stem and progenitor cells (HSCs/HPCs) for research and clinical use. CD34 is expressed on approximately 1 – 3% of the nucleated cells in normal human bone marrow (BM) and on 0.1 – 0.5% of the nucleated cells in human peripheral blood. The majority of human cells capable of producing multilineage hematopoietic engraftment in myeloablated recipients express CD34. The engraftment potential of enriched populations of human CD34+ cells has also been demonstrated clinically in numerous autologous and allogeneic transplantation trials. The CD34+ subset also includes hematopoietic stem cells and more committed progenitor cells, such as lymphocyte progenitor cells, but is not expressed on the majority of terminally differentiated cells (Bosio et al., 2009). The usefulness of CD34 as a hematopoietic stem and progenitor cell marker for human cells is well established. There is evidence, however, of the existence of a very primitive population of CD34+ cells with HSC and lymphopoietic potential in human cord blood and adult hematopoietic sources. Thus far, the phenotype of primitive CD34+ HSCs has been characterized by the concurrent absence of CD38 and the positive expression of CD133 (Buhring et al., 1999). CD133 has been described as a marker of more primitive hematopoietic stem and progenitor cells. It was originally found on HSCs and HPCs deriving from human fetal liver, bone marrow, and peripheral blood (Yin et al., 1997). Phenotypical analysis of CD133-expressing cells (CD133+ cells) revealed a high expression on primitive hematopoietic and myeloid progenitor cells (Freund et al., 2006). The presence of CD133+ cells in different hematopoietic sources is similarly low as in case of CD34+ cells. For example de Wynter et al. (1998) observed these values of CD133+ cells: 1.75 ± 0.7% in cord blood, 0.98 ± 0.2% mobilized peripheral blood and 2.3 ± 0.9% in bone marrow. Till now many studies about human HSCs have been published, but there are really rare information about the presence of HSCs in the rabbit hematopoietic system (peripheral blood or bone marrow) and about the identification of rabbit HSCs on the basis of the hematopoietic stem cell markers, such as CD133 (Garbade et al. 2009; Martınez-Lorenzo et al., 2009) and CD34 (Gómez-Ochoa et al. 2005; Shi et al. 2010; Gao et al., 2011; Zhao et al., 2011) using mainly anti-human CD133 and CD34 antibodies, since there is any specific antirabbit CD133 or CD34 antibody available on the market. Therefore the aim of our preliminary study was to detect the CD133+ and CD34+ cells within human and rabbit peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using flow cytometry and different clones of CD133 and CD34 antibodies.

233 | P a g e


May 24-25th 2012

Materials and Methods Animals Young (3 – 8 month old) and clinically health rabbits of New Zealand White (NZW) line (n = 3) reared in a partially air-conditioned hall of a local rabbit farm at APRC Nitra were used in the experiment. The animals were housed in individual cages, under a constant photoperiod of 14 h of light day. Temperature and humidity in the building were recorded continuously by means of a thermograph positioned at the same level as the cages (average relative humidity and temperature during the year was maintained at 60 ± 5% and 17 ± 3°C). The rabbits were fed ad libitum with a commercial diet (KV; TEKRO Nitra, s.r.o.) and water was provided ad libitum with nipple drinkers. PBMCs isolation and phenotyping PBMCs from the blood samples of human volunteer and humanely sacrificed rabbits were isolated using Ficoll centrifugation according to the original protocol: Isolation of mononuclear cells from human peripheral blood by density gradient centrifugation (Miltenyi Biotec, 2008). Fresh human blood and three frozen rabbit samples were used for the experiment. Cell count was evaluated using the Z1 Automated Cell Counter (BeckmanCoulter, Germany). The cells were then divided into prepared tubes and stained with different clones of anti-human monoclonal antibodies: PE-conjugated CD133 (AC133 and 293 C3; both Miltenyi Biotec, Germany), FITC-conjugated CD34 (AC136, Miltenyi Biotec, Germany; and 581, BD Pharmingen, USA), Alexa Fluor 488-conjugated rabbit polyclonal CD34 (Bioss, USA) and unconjugated mouse anti-rabbit CD45 (VMRD, USA) according to the producer’s manual. As a secondary antibody APC-conjugated goat anti mouse Ig (BD Pharmingen, USA) was used. Besides double staining (CD34/CD45 or CD133/CD45), also triple staining (different antibody combinations CD34/CD45/CD133) was performed. Labelled cells were evaluated using the flow cytometer FACSCalibur (BD Biosciences, USA). Statistics The data obtained using flow cytometry from three different rabbit blood samples were evaluated statistically using a one-way ANOVA (Duncan's multiple range test) in SigmaPlot software (Systat Software Inc., Germany) and expressed as means ± SE. P-values at P<0.05 were considered as statistically significant.

Results and discussion Table 1 shows the percentage of CD133+ and CD34+ cells within the human and rabbit PBMCs. Insignificant antibody interference was observed between double and triple staining 234 | P a g e

May 24-25th 2012


of human cells using monoclonal CD34 (clones 581 and AC136), polyclonal CD34 (KLH) (0.18% vs. 0.22%, 0.23% vs. 0.24% and 0.15% vs. 0.09%, respectively) and monoclonal CD133 clones (293 C3 and AC133) (0.25% vs. 0.24% and 0.21% vs. 0.15%, respectively). Similarly, insignificant antibody interference was observed between double and triple staining of rabbit cells using monoclonal CD34 (clones 581 and AC136), polyclonal CD34 (KLH) (0.22 ± 0.14% vs. 0.19 ± 0.11%, 0.47 ± 0.14% vs. 0.43 ± 0.13% and 0.04 ± 0.01% vs. 0.05 ± 0.01%, respectively) and monoclonal CD133 clones (293 C3 and AC133) (0.55 ± 0.04% vs. 0.50 ± 0.06% and 0.53 ± 0.12% vs. 0.44 ± 0.08%, respectively). CD45+ cells proved the origin of rabbit cells in comparison to human cells (94.66% vs. 0.34%; Fig. 1). Tab. 1 CD133+ and CD34+ cells within the human and rabbit PBMCs PBMCs

Double staining CD45/CD133

Double staining CD45/CD34 CD45 (rabbit)

Sample Neg % of # Control CD45+ Human 0 0.34 (fresh) Rabbit 1 0.08 94.90 (frozen) Rabbit 2 0.07 95.62 (frozen) Rabbit 3 0.20 93.45 (frozen) 0.12 94.66 Average ± ± values 0.04 0.64

CD34 (581) % of CD34+ in Neg double Control staining

Triple staining CD45/CD34/CD133

CD34 (AC136)

CD34 (KLH)

CD133/2 CD133/1 (293 C3) (AC133)

CD34 (581)

CD34 (AC136)

CD34 (KLH)

% of CD34+ in double staining

% of CD34+ in double Neg staining Control



% of CD34+ in triple staining



CD133/2 (293 C3)

CD133/1 (AC133)



0.01

0.18

0.23

0.15

0.01

0.25

0.21

0.22

0.24

0.09

0.24

0.15

0

0.01

0.25

0.02

0.01

0.57

0.37

0.03

0.27

0.03

0.55

0.29

0

0.49

0.72

0.05

0

0.61

0.77

0.40

0.69

0.07

0.58

0.58

0

0.48

0.45

0.14

0.33

0.04

0.38

0.44

0d

0.55 ± 0.04

0.53 ± 0.12

0.19 ± 0.11

0.43 ± 0.13a

0.05 ± 0.01b

0.50 ± 0.06c

0.44 ± 0.08

0.01

0.17

0.44

0.05

0b

0.22 ± 0.14

0.47 ± 0.14

0.04 ± 0.01

Average values from rabbit samples are expressed as means ± SE; a vs. b and c vs. d were statistically significant at P<0.05.

We noticed slightly higher percentage of CD34+ human cells labelled by clone AC136 (0.24%) in comparison to clone 581 (0.22%), but evidently higher percentage of CD34+ cells in comparison to those labelled by polyclonal CD34 (KLH; 0.09%) used in triple staining with CD133 and CD45, or in comparison to negative control (0.01%) without staining. We also observed higher percentage of CD133+ human cells labelled by clone 293 C3 (0.24%) in comparison to clone AC133 (0.15%) used in triple staining with CD34 and CD45, or in comparison to negative control (0.01%) without staining. Uniformly, there was insignificantly higher percentage of CD34+ rabbit cells labelled by clone AC136 (0.43 ± 0.13%) in comparison to clone 581 (0.19 ± 0.11%), but significantly higher (P<0.050) percentage of CD34+ cells in comparison to those labelled by polyclonal CD34 (KLH; 0.05 ± 0.01%) used in triple staining with CD133 and CD45, or in comparison to negative control (0%). The

235 | P a g e


May 24-25th 2012

percentage of CD133+ rabbit cells labelled by clone 293 C3 (0.50 ± 0.06%) was insignificantly higher in comparison to clone AC133 (0.44 ± 0.08%) used in triple staining with CD34 and CD45, but on the other hand in comparison to negative control (0%) without staining the percentage of the CD133+ cells labelled by clone 293 C3 was significantly higher (P<0.050). Figure 1 The illustrative comparison of CD34+, CD45+ and CD133+ cells within the human and rabbit PBMCs

Although we obtained low percentage of CD34+ (AC136) and CD133+ (293 C3) cells within the rabbit PBMCs (0.43 ± 0.13% and 0.50 ± 0.06%, respectively), these results are similar to values mentioned in the literature: 0.1 – 0.5% of CD34+ cells in human peripheral blood (Bosio et al., 2009) and 0.98 ± 0.2% of CD133+ cells in mobilized peripheral blood (de Wynter et al., 1998).

Conclusion Anti-human CD34 (clone AC136) and CD133 (clone 293 C3) antibodies seems to be more suitable for detection HSCs within human peripheral blood than the other mentioned antibody clones. Since similar observations were achieved within the rabbit peripheral blood, we assumed that these clones of anti-human antibodies could be efficient for rabbit HSCs flow-cytometric detection, but other experiments are required to prove this hypothesis.

Acknowledgement This work was supported from the grants of Slovak Research and Development Agency: LPP-0119-09 and also by the supervision of Dr. Medhat Shehata from the Medical University of Vienna, who provides facilities and expert advices for our experiment.

236 | P a g e


May 24-25th 2012

References Bosio, A., Huppert, V., Donath, S., Hennemann, P., Malchow, M., Heinlein, U.A.O. Isolation and Enrichment of Stem Cells. Adv. Biochem. Engin/Biotechnol., 2009, 114, 23 – 72. Buhring, H.J., Seiffert, M., Bock, T.A., Scheding, S., Thiel, A., Scheffold, A., Kanz, L., Brugger, W. Expression of novel surface antigens on early hematopoietic cells. Ann. NY Acad. Sci., 1999, 872, 25 – 38. Yin, A.H., Miraglia, S., Zanjani, E.D., Almeida-Porada, G., Ogawa, M., Leary, A.G., Olweus, J., Kearney, J., Buck, D.W. AC133, a Novel Marker for Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Blood, 1997, 90, 5002 – 5012. Freund, D., Oswald, J., Feldmann, S., Ehninger, G., Corbeil, D., Bornhauser, M. Comparative analysis of proliferative potential and clonogenicity of MACS-immunomagnetic isolated CD34+ and CD133+ blood stem cells derived from a single donor. Cell. Prolif., 2006, 39, 325 – 332. de Wynter, E.A., Buck, D., Hart, C., Heywood, R., Coutinho, L.H., Clayton, A., Rafferty, J.A., Burt, D., Guenechea, G., Bueren, J.A., Gagen, D., Fairbairn, L.J., Lord, B.I., Testa, N.G. CD34+AC133+ Cells Isolated from Cord Blood are Highly Enriched in Long-Term Culture-Initiating Cells, NOD/SCID-Repopulating Cells and Dendritic Cell Progenitors. Stem Cells, 1998, 16, 387 – 396. Garbade, J., Dhein, S., Lipinski, C., Aupperle, H., Arsalan, M., Borger, M.A., Barten, M.J., Lehmann, S., Walther, T., Mohr, F.W. Bone Marrow-Derived Stem Cells Attenuate Impaired Contractility and Enhance Capillary Density in a Rabbit Model of DoxorubicinInduced Failing Hearts, J. Card. Surg, 2009, 24, 591 – 599. Martínez-Lorenz, M.J., Royo-Cañas, M., Alegre-Aguarón, E., Desportes, P., Castiella, T., García-Alvarez, F., Larrad, L. J. Orthop. Res., 2009, 27, 1499 – 1508. Gómez-Ochoa, P., Miana-Mena, F.J., Muñoz, M.J., Cativiela, E., Gómez, F. An in vitro study of hematopoietic progenitor cells from peripheral blood of rabbits. Can J. Vet. Res., 2005, 69, 309 – 312. Zhao, Q., Sun, C., Xu, X., Zhou, J., Wu, Y., Tian, Y., Yuan, Z., Liu, Z. CD34+ cell mobilization and upregulation of myocardial cytokines in a rabbit model of myocardial ischemia, Int. J. Cardiol., 2011, 152, 18 – 23. Gao, X., Chen, W., Liang, Z., Chen, L. Autotransplantation of circulating endothelial progenitor cells protects against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rabbit. Int. Immunopharmacol., 2011, 11, 1584 – 1590. Shi, Z.B., Wang, K.Z. Effects of recombinant adeno-associated viral vectors on angiopoiesis and osteogenesis in cultured rabbit bone marrow stem cells via co-expressing hVEGF and hBMP genes. Tissue and Cell, 2010, 42, 314 – 321.

237 | P a g e

May 24-25th 2012


EFFECT OF CATTLE PRODUCTION TYPE ON BLOOD PLASMA BIOCHEMICAL PARAMETERS Vošterová, I.,1 Pavlík, A.,1 Matějíček, M.,2 Sláma, P.1 1

Department of Animal Morphology, Physiology and Genetics, Mendel University in Brno, Czech Republic

2

Vetlabfarm s.r.o., Dolní Dobrouč, Czech Republic

Abstract The aim of this work was to evaluate effect of cattle production type on biochemical parameters of blood plasma. In experiment two breed of cattle was used, beef cattle Aberdeen Angus (10 animals) and dual purpose breed type that in our conditions, however, mainly used for milkproduction – Czech Pied cattle (10 animals). Blood was collected from calving cows during lactation, specifically 94th day, 133rd day, 164th day, 194th day and 235th day of lactation. Blood was drawn from vena coccygea media at regular intervals by sampling system HEMOS. The result is a marked difference between the levels of blood plasma of the parameters studied breeds. Statistically significant difference in total protein concentration was detected 164th day, the 204th day and 235th day of the experiment, the growing tendency of this parameter was observed in beef breeds, which also reached higher values. The difference in urea concentration was found to 94th day, 133rd day and 164th day of the experiment. Dairy breed showed generally higher values of urea in blood plasma. The maximum value was achieved 133rd day (8.36 ± 1.32 mmol·l-1) on the contrary cholesterol concentration was higher in individuals belonging to a beef cattle. Statistically significant difference was observed 94th day, 164th day and 204th day. Glucose levels were examined in both breeds similar trend. Significantly different concentrations were measured up to the end of the experiment when values reached higher meat breed. Statistically significant difference was found 133rd day and 235 day of the experiment. Statistically significant difference was found even in one of the enzymes studied. Alanine aminotransferase levels are monitored at different type of animal, commercial 94th day, 164th day and 204th day. Higher values of his parameter reached Aberdeen Angus breed. Statistically significant difference in concentration of aspartate aminotransferase in blood plasma was not found.

Key words: milk production, beef, blood plasma, production type

238 | P a g e


May 24-25th 2012

Úvod Chovatelé v české republice se zaměřují především na chov skotu s mléčnou užitkovostí, ale disponují i stády zvířat se zaměřením masným. Mezi plemena chovaná v ČR můžeme zařadit 5, resp. 3 mléčná plemena a 21 masných plemen. Jednotlivá plemena a užitkové typy mají odlišné nároky na výživu a podmínky prostředí. Zároveň však můžeme v rámci jednoho užitkového typu, který je tvořen více různými plemeny, sledovat do určité míry podobné nároky, ať už na výživu či podmínky prostředí. Tyto optimální podmínky je potřeba zajistit, protože správná výživa a zvolená technologie ovlivňuje produkci a tím pádem i zisky podniku. Parametry vnitřního prostředí jsou ukazatele, které poukazují na úroveň výživy, chovu a na celkový stav zvířete. Dle koncentrace jednotlivých látek v krvi můžeme zjistit, které komponenty v krmné dávce chybí, kterých je přebytek a ze získaných údajů můžeme zvířeti krmnou dávku přizpůsobit dle potřeby. Hladina těchto látek v krvi samozřejmě závisí také na pohlaví, věku, na fázi reprodukčního cyklu, ve kterém se jedinec nachází, či výše zmíněném užitkovém zaměření zvířat. Úroveň jednotlivých parametrů v krevní plazmě rovněž hraje důležitou roli při hodnocení zdravotního stavu zvířat. Proto by neměla být opomíjena důležitost provádění metabolických testů. V této práci je poukázáno na problematiku udávaných referenčních rozmezí, která jsou v literatuře většinou uváděna obecně pro skot. Bylo by však vhodné zaměřit se právě i na plemeno, resp. užitkové zaměření zvířat, protože jejich produkční využití ovlivňuje metabolismus a jeho hospodaření s živinami.

Materiál a metodika Dojnice Českého strakatého plemene byly chovány v produkční stáji s volným boxovým ustájení. Dojení probíhalo pravidelně dvakrát denně, ve dvanáctihodinových intervalech. Živinové složení krmné dávky je popsáno v tabulce 1. Zvířat plemene Aberdeen Angus byla chována v systému bez tržní produkce mléka. Převážnou část roku (od jara do podzimu) byla tato zvířata na pastvě. Do zimoviště byla přesunuta v průběhu roku několikrát z důvodů odčervení, úpravy paznehtů a také odběru vzorků krve. Také na zimní období byla tato zvířata přesunuta do zimoviště. V období po porodu byli sledovaní jedinci v zimovišti krmeni travní senáží a senem ad-libitum a jadrnou směsí. Po přechodu na pastvu tvořil majoritní podíl krmné dávky pastevní porost, příkrm sena a minerální směsi (vše ad-libitum). Průměrné živinové složení krmné dávky uvádí tabulka 1.

239 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab. 1 Průměrné živinové složení krmných dávek sledovaných zvířat Český strakatý skot Parametr

Jednotka

Abrdeen Angus

Obsah

Obsah

vehmotě

v sušině

ve hmotě

v sušině

sušina N-látky tuk vláknina NEL PDIN PDIE Ca P

% % % % MJ/kg g/kg g/kg g/kg g/kg

40,10 7,25 1,23 6,54 6,70 38,60 45,60 3,50 1,90

100,00 18,05 3,06 16,28 16,67 96,11 113,54 8,72 4,73

43,31 8,93 0,98 11,96 4,42 46,21 53,78 3,14 2,16

100 20,63 2,26 27,62 10,20 106,69 124,75 7,25 4,99

Mg

g/kg

1,20

2,99

1,12

2,60

U obou plemen byly vybrány krávy v přibližně stejném termínu telení, v tomto případě krávy otelené v průběhu února (± 13 dní). Sledováno bylo 10 zvířat od každého plemene. Z podocasní žíly byl, pomocí odběrového sytému HEMOS® (Gama Group a.s), v daných intervalech (94, 133, 164, 204 a 235 dní po porodu) odebírán vzorek krve, který byl ošetřen antikoagulačním prostředkem (heparin) a uchován v chladícím boxu do dalšího zpracování. Bezprostředně po odběrech byla separována krevní plazma, a uchována do analýzy při 4 ºC. V laboratoři bylo provedeno stanovení koncentrací vybraných parametrů vnitřního

prostředí

(celkový

protein,

glukóza,

močovina,

celkový

cholesterol,

alaninaminotransferáza a aspartátaminotransferáza), spektrometricky na automatickém analyzátoru XT 20 I (Siemens), za použití běžně dostupných komerčních setů od firmy Biovendor-Laboratorní medicína, a.s. Data získána v průběhu sledovaného období byla setříděna pomocí editoru MS Office Excel a byly sestaveny soubory pro statistické testování. Data byla analyzována v programu Statistica 8.0 (StatSoft®). Normalita souboru byla testována pomocí Shapiro-Wilkova testu a na základě jeho výsledku byla vybrána pro hodnocení dvoufaktorová analýza rozptylu (ANOVA) při opakovaném měření, s následným testováním dle Fishera na hladinách významnosti p < 0,05 a p < 0,01.

Výsledky Koncentrace celkových bílkovin v krevní plazmě se pohybovala mezi hodnotami 64,57 ± 9,41 a 86,4 ± 4,94 g·l-1 (Graf 1). Kolísavější tendence parametru byla v průběhu experimentu zaznamenána u plemene České strakaté. Statisticky průkazný rozdíl na hladině p

240 | P a g e


May 24-25th 2012

< 0,01 byl u mléčného plemene ve srovnání s masným plemenem zaznamenán ve 164. a 235. dnu, na hladině p < 0,05 to bylo ve 204. dnu. Na počátku sledovaného období byla koncentrace celkových proteinů v krevní plazmě u obou plemen obdobná, ovšem v průběhu experimentu byly zaznamenány vyšší koncentrace tohoto parametru u masného plemene.

Hladina močoviny se pohybovala v rozmezí od 4,55 ± 0,46 mmol·l-1 do 8,36 ± 1,32 mmol·l-1. Tendence parametru byla u sledovaných plemen rozdílná. U mléčného plemene převažovala spíše tendence klesající s občasným mírným nárůstem, kdežto u masného plemene byla tendence převážně rostoucí s jednorázovým poklesem. Mezi sledovanými plemeny byl zaznamenán statisticky průkazný rozdíl na hladině p < 0,01, a to v 94. a 133. dnu. Statisticky průkazný rozdíl na hladině p < 0,05 byl zjištěn ve 164. dnu. Vyšší hodnoty močoviny v krevní plazmě byly naměřeny u plemene České strakaté. Množství glukózy v průběhu sledovaného období kolísalo mezi 3,36 ± 0,3 mmol·l-1 a 4,96 ± 1,04 mmol·l-1. U obou plemen bylo zaznamenáno mírné kolísání průměrných hodnot, 241 | P a g e

May 24-25th 2012


značný rozdíl se projevil až v na konci sledovaného období, kdy u mléčného plemene došlo k náhlému poklesu hladiny glukózy a naopak u plemene masného ke zvýšení úrovně glukózy v krevní plazmě. I u tohoto parametru byl zaznamenán statisticky průkazný rozdíl mezi sledovanými plemeny, a to na hladině p < 0,01 ve 235. dnu a na hladině p < 0,05 ve 133. dnu. Hladina glukózy v krevní plazmě měla u obou zkoumaných plemen podobnou tendenci, ovšem mírně vyšší hodnoty byly zaznamenány u masného plemene. Koncentrace cholesterolu v krevní plazmě sledovaných zvířat se pohybovala mezi 3,19 ± 0,76 mmol·l-1 a 5,75 ± 1,27 mmol·l-1. Zároveň byl zřejmý značný rozdíl ve vývoji úrovně parametru v průběhu experimentálního období. Statisticky průkazný rozdíl byl mezi sledovanými plemeny zjištěn v 94. dnu (p < 0,01), 164. dnu (p < 0,01) a 204. dnu (p < 0,01). Koncentrace plazmatického cholesterolu dosahovala během experimentálního období výrazně vyšších hodnot u plemene Aberdeen Argus. Průměrné hodnoty katalytické koncentrace alaninaminotransferázy kolísaly mezi 0,246 ± 0,09 µkat·l-1 a 0,635 ± 0,14 µkat·l-1. Nejnižší i nejvyšší hodnota a zároveň největší kolísání bylo zaznamenáno u plemene s masnou užitkovostí. Vliv užitkového zaměření na množství ALT v krevní plazmě byl statisticky prokázán. Konkrétně na hladině p < 0,01 v 94. dnu, 164. dnu a 204. dnu. V počátku experimentu byla zaznamenána vyšší katalytická koncentrace ALT u plemene mléčného, ovšem v průběhu testu se koncentrace ALT výrazně zvýšila u masného plemene, které nakonec dosáhlo vyšších hodnot, než České strakaté. Katalytická

aktivita

v průběhu

sledovaného

období

dosáhla

hodnot

mezi

1,163 ± 0,46 µkat·l-1 a 1,566 ± 0,31 µkat·l-1. Mezi jednotlivými užitkovými typy zvířat se neprojevily výrazné rozdíly v aktivitě AST. V průběhu experimentálního období nebyl dokázán statisticky průkazný rozdíl mezi katalytickou aktivitou aspartátaminotransferázy u pozorovaných plemen s rozdílným užitkovým zaměřením.

Diskuse Jagoš et Bouda (1980) uvádějí u dojnic tradičního českého kombinovaného plemene hodnotu 76,4 g·l-1 před porodem a hodnotu 73,1 g·l-1 po porodu, což poukazuje na skutečnost, kterou publikovali i Klebaniuk et al. (2009), a to, že hladina celkových proteinů klesá v průběhu prvních týdnů laktace. Tato skutečnost zřejmě souvisí s produkcí mléka a tudíž se zvýšenou potřebou bílkovin. Uvádějí, že ke snížení hladiny celkových bílkovin na fyziologickou úroveň dochází v pozdní fázi březosti a v prvních týdnech laktace. V pozdějším období byl u dojených plemen zaznamenán nárůst hladiny celkových bílkovin Šamanc et al. (2011). 242 | P a g e


May 24-25th 2012

Taylor et al. (2003) zjistili jednoznačně jednorázový propad koncentrace močoviny těsně po porodu, a poté na pozvolný nárůst koncentrace parametru v krevní plazmě. Bojkovski et al. (2011) zaznamenali u dojeného skotu hladinu glukózy mezi 3,54 a 4,52 mmol·l-1, což koresponduje s našimi výsledky, ovšem autoři ve své publikaci také konstatují, že hladina glukózy má v průběhu laktace klesající tendenci, což se v našem testu nepotvrdilo. Zaznamenali jsme spíše kolísavý charakter parametru. K zajímavým závěrům dospěli Klebaniuk et al. (2009), kteří ve své práci zmínili fakt, že po porodu dochází k nárůstu aktivity ALT, a to až o 30 %. V jejich konkrétním případě to byl nárůst z průměrných hodnot před porodem 0,69 až 0,82 µkat·l-1 až na hodnotu 1,12 µkat·l1

po porodu. Ovšem v publikaci Ruginosu et al. (2011) se autoři zmiňují o opačné tendenci

parametru. U dojnic v období 0 až 2 měsíce po porodu zjistili katalytickou aktivitu 0,59 µkat·l-1 a v období 3 až 6 měsíců po porodu aktivitu 0,44 µkat·l-1, tudíž zaznamenali jednoznačný pokles úrovně ALT v krevní plazmě. V našem případě došlo u dojeného plemene primárně k nárůstu katalytické koncentrace enzymu, ovšem následně k pozvolnému poklesu. Klebaniuk et al. (2009) ve své práci také konstatovali, že katalytická aktivita AST má značně nejednoznačný průběh, tedy kolísá, což je možné z výsledků našeho experimentu potvrdit.

Závěr Z výsledků experimentu je patrné, že v některých parametrech metabolického profilu krevní plazmy se daná plemena, ve stejném věku a přibližně ve stejném období laktace, lišila. Předpokládám, že tyto rozdíly do jisté míry odráží odchylky ve složení krmné dávky masného a dojeného skotu, ale také rozdíly v metabolickém založení daných jedinců, v závislosti na požadavcích na produkci. Na základě těchto zjištění se domnívám, že by hodnocení metabolického profilu krve masných plemen skotu nemělo vycházet čistě z referenčních rozmezí biochemických parametrů, která zahrnují, jak je v literárním přehledu patrné, většinou hodnoty stanovené u skotu dojeného. Poděkování Tato práce vznikla v rámci projektu NAZV č. QH 71156 Použitá literatura Taylor, V.J., Beever, D.E., Bryant, M.J., a Wathes D. Metabolic profiles and progesterone cycles in first lactation dairy cows. Theriogenology, 2003, 59, 1661-1677. Šamanc, H., Kirovski, D. Stojić, V., Stojanović, D., Vujanac, I., Prodanović, R. Bojković-Kovačević, S. Application of the metabolic profile test in the prediction and diagnosis of fatty liver in Holstein cows. Acta Vet. Beograd, 2011, 5-6, 543-553.

243 | P a g e


May 24-25th 2012

Ruginosu, E., Creanga, S., Sofronie M., Malancus R., Boghian, V. Solcan, G. The biochemical profile in cows with reproductive disorders. Cercetari Agronomice in Moldova. 2011, 44. Klebaniuk, R., et al. Blood metabolic profile parameters of cows fed diet with glucogenic additive. Medycyna weterynaryjna. 2009, 65, 765–770. Jagoš, P., Bouda, J. Protein metabolism in cows and their calves fed from buckets. Acta Vet. Brno. 1980, 49, 59–66. Bojkovski, J., Relić, R., Savić, B., Petrujkić, T. Metabolic parameters and welfare of dairy cows. Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine ClujNapoca Veterinary medicíně, 2011, 68.

244 | P a g e

May 24-25th 2012


THE EFFECT OF NUMBER OF LACTATION ON INCIDENCE OF CALF TWIN’S PARTURITION AND STILLBIRTH OF CZECH FLECKVIEH – SIMENTAL DAIRY COWS Zejdová, P.; Falta, D.; Večeřa, M.; Polák, O.; Kopec, T.; Chládek, G. Ústav chovu a šlechtění zvířat, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita Zemědělská 1, 613 00 Brno, Czech Republic

Abstract The effect of number of lactation on incidence of calf twin‘s parturition and stillbirth was evaluated in this experiment. The database of 62,237 parturitions observed between years 2005 – 2008 was used. All cows were Czech Fleckvieh – Simental breed (pure breed) originated in Czech Republic. Dairy cows were divided into three groups according to number of lactation (1st, 2nd, 3rd). Records of the occurence of live calve’s parturition, stillbirth calves and twin calves (dead or alive) were used for evaluation. Statistical data evaluation was performed by X2 test. It was found statistically high significant effect (p < 0,01) of number of lactation on incidence of calf twin‘s parturition and stillbirth (single calves and twin calves). The live twining rate was the lowest in cases of primiparous (0,73 %), higher for dairy cows on 2nd lactation (2,72 %) and the highest on 3rd lactation (3,41 %). Conversely, incidence of single calve stillbirth had an opposite trend (8,23 % vs. 4,23 % vs. 3,51 % 1st vs. 2nd vs. 3rd lactation, resp.). The rates of twin calves (one calve as dead) were 0,11 % vs. 0,30 % vs. 0,37 % (1st vs. 2nd vs. 3rd lactation, resp.). The same trend was in cases of twin calves (both calves as dead) - 0,10 % vs. 0,22 % vs. 0,29 % (1st vs. 2nd vs. 3rd lactation, resp.).

Key words: dairy cows, number of lactation, calf twin, abort.

Úvod Porody mrtvých telat – ať už jedináčků, či dvojčat – jsou nepříjemnou událostí se kterou se setkal téměř každý chovatel skotu. Bos taurus je uniparní druh, což znamená, že samicím se ve většině případů narodí jedno mládě. Na druhou stranu, přirozený výskyt vícenásobných porodů je vysoký a pohybuje se na úrovni 1 – 5 % - v závislosti na plemeni, paritě a environmentálních podmínkách (Gregory et al., 1990). Mezi možná rizika, doprovázející narození více mláďat patří pokles přežitelnosti telat, zhoršení ukazatelů 245 | P a g e


May 24-25th 2012

reprodukce dojnic (Bicalho et al., 2007), menší porodní hmotnost telat (Hossein-Zadeh, N. G., 2010a), větší riziko retence placenty, horší poporodní kondice, vyšší výskyt obtížných porodů a abortů, větší počet dní od otelení do nástupu první pozorovatelné říje a delší mezibřezost (Bell, Roberts, 2007). Krávy po dvojčatech mají také 3,2 krát větší šanci na vyřazení ze stáda, než krávy po jednom teleti (Bell, Robertse, 2007) a vyskytuje se u nich horší energetická rovnováha (del Río et al., 2010). Porod dvojčat ovlivňuje i výši mléčné užitkovosti během nastalé laktace (Hossein–Zadeh, 2010a; Hossein–Zadeh et al., 2008) a množství tuku v mléce (Hossein–Zadeh, 2010b). Podle Zejdové et al. (2012) se dokonce projeví rozdíl ve výši mléčné užitkovosti v závislosti na pohlaví narozených telat U dojnic je s porody dvojčat spojeno více negativních efektů. Na druhou stranu,

ve

stádech masného skotu mohou dvojčata zlepšit produkční výkonnost – pokud je zajištěna adekvátní výživa a management (Çobanoğlu, 2010). Problematika dvojčat a abortů je tedy nepochybně aktuální a proto jsme se na ní také zaměřili v naší studii. Stanovili jsme následující hypotézy: H1 – výskyt porodů mrtvých telat bude vyšší u krav na 1. laktaci., než u krav

na

vyšších laktacích. H2 – výskyt porodů živých dvojčat bude vyšší u krav na 2. a 3. laktaci, než u krav na 1. laktaci. H3 – výskyt abortů při porodech dvojčat bude vyšší u krav na 1. laktaci, než

u

krav na vyšších laktacích. Materiál a metodika Pro účely experimentu byla využita databáze (poskytnuta Svazem chovatelů českého strakatého skotu) 62 237 porodů z období 2005 – 2008. Všechny dojnice byly plemene české strakaté (C 90 – C 100) a pouze s kodexem CZ (tzn. žádná zvířata nebyla z dovozu). Dojnice byly rozděleny do tří skupin podle pořadí laktace (1., 2., 3.). Hodnocena byla incidence porodů živých a mrtvých jedináčků, živých dvojčat a abortů dvojčat (jak v případě jednoho z narozených telat, tak i pokud se narodila obě telata mrtvá). Statistické zpracování dat bylo provedeno pomocí Chí kvadrát – testu (X2). Výsledky a diskuze Celkem bylo hodnoceno 62 237 porodů. Z toho bylo 37 064 porodů na 1. laktaci, 18 652 porodů na 2. laktaci a 6 521 záznamů o otelení u krav na třetí laktaci (viz. Tab 1). Ve výskytu porodů živých jedináčků nebyl mezi hodnocenými laktacemi statisticky průkazný

246 | P a g e


May 24-25th 2012

rozdíl (při p > 0,05). V počtech abortů jedináčků je však patrný statisticky vysoce průkazný rozdíl (při p < 0,01) mezi laktacemi. Výskyt těchto potratů byl nejvyšší u prvotelek a s přibývajícím pořadím laktace měl klesavou tendenci (viz. Tab. 2). H1 – výskyt porodů mrtvých telat bude vyšší u krav na 1. laktaci., než u krav na vyšších laktacích – byla potvrzena.

Tab. 1 Incidence porodů a abortů na jednotlivých laktacích (ks telat) (Incidence of parturitions and stillbirths on individual lactations (heads of calves)) pořadí porody jedináčci jedináčci dvojčata dvojčata 1 dvojčata laktace celkem živí mrtví živá mrtvé obě mrtvá 1. 37 064 33 637 3 074 274 41 38 2. 18 652 17 246 796 511 57 42 3. 6 521 6023 231 224 24 19 celkem 62 237 56 906 4 101 1 009 122 99 průkaznost N.S. ** ** ** ** N.S. = statisticky neprůkazné (při p > 0,05) rozdíly mezi jednotlivými laktacemi ** = statisticky vysoce průkazné (při p < 0,01) rozdíly mezi jednotlivými laktacemi Zjištěná frekvence abortů je o něco vyšší než popisuje Hossein-Zadeh et al. (2008). Autor udává 2,9 % porodů mrtvých telat u holštýnských dojnic - multipar a 6,6 % u primipar. Ovšem del Río et al. (2007) prováděl sledování na tomtéž plemeni a popisuje úmrtnost telat u prvorodiček 10,4 % a u dojnic na vyšších laktacích 7,2 %. Co se týká výskytu porodů mrtvých telat, zdá se, že nesouvisí pouze s paritou, ale významným faktorem je i věk při 1. otelení (Ettema, Santos, 2004). Porody živých dvojčat se nejvíce vyskytovaly u dojnic na 3. laktaci a nejméně

u

primipar (viz. Tab. 1., Tab. 2.). H2 – výskyt porodů živých dvojčat bude vyšší u krav na 2. a 3. laktaci, než u krav na 1. laktaci – byla potvrzena. Námi zjištěná zvyšující se tendence výskytu vícečetných porodů zároveň se stoupajícím pořadím laktace souhlasí s výsledky ostatních autorů (Hossein-Zaddeh

et

al.,

2008; Fricke, 2000; del Río et al., 2007). Autoři se téměř shodují i ve zjištěné frekvenci, s jakou se vyskytují. Hossein-Zaddeh et al. (2008) popisuje celkový podíl dvojčat u holštýnských krav 3,9 % a tento poměr se zvyšoval s paritou (1,1 % pro primipary vs. 5,7 % u krav na čtvrté nebo vyšší laktaci). Del Río et al. (2007) uvádí u stejného plemene celkový podíl dvojčat 4,2 % a tento poměr se zvyšoval s paritou (1,2 % pro prvorodičky vs. 5,8 pro multiparní krávy). Podle Frickeho (2000) kolísá incidence dvojčat od 1 % u primipar do téměř 10 % u vyšších parit (5. laktace). V našem sledování jsme zjistili nižší frekvenci

247 | P a g e


May 24-25th 2012

výskytu porodu živých dvojčat, než je popsáno v uvedených studiích – to nejspíše souvisí s plemennou příslušností sledovaných krav – zatímco naše sledování probíhalo u českého strakatého skotu, tak zmiňovaní autoři sledovali holštýnské dojnice. Právě plemeno je dle Gregoryho et al. (1990) a Frickeho (2000) významným faktorem působícím na četnost výskytu dvojčat. Tab. 2 Incidence porodů a abortů na jednotlivých laktacích (v %) (Incidence of parturitions and stillbirths on individual lactations (in %)) pořadí porody jedináčci jedináčci dvojčata dvojčata 1 dvojčata laktace celkem živí mrtví živá mrtvé obě mrtvá 1. 100,00 90,09 8,23 0,73 0,11 0,10 2. 100,00 91,68 4,23 2,72 0,30 0,22 3. 100,00 91,63 3,51 3,41 0,37 0,29 celkem 100,00 90,73 6,54 1,61 0,19 0,16 průkaznost N.S. ** ** ** ** N.S. = statisticky neprůkazné (při p > 0,05) rozdíly mezi jednotlivými laktacemi ** = statisticky vysoce průkazné (při p < 0,01) rozdíly mezi jednotlivými laktacemi Při hodnocení abortů u porodů dvojčat se - navzdory předpokladu – projevila rostoucí tendence zároveň s narůstajícím pořadím laktace (viz. Tab. 1, Tab. 2). H3 – výskyt abortů při porodech dvojčat bude vyšší u krav na 1. laktaci, než

u krav na

vyšších laktacích – byla vyvrácena. Nárůst počtu těchto potratů zároveň se stoupajícím pořadím laktace bude s největší pravděpodobností souviset s celkově vyšším počtem porodů dvojčat u krav na vyšších laktacích. Vliv parity na výskyt vícečetných porodů není plně objasněn, ale může souviset se zvýšenou schopností starších krav vyživovat dva plody po celou březost, s vyšším výskytem dvojnásobné ovulace nebo interakcí mezi těmito faktory (Fricke, 2000). Závěr Náš experiment prokázal, že existuje statisticky vysoce průkazný rozdíl (při p < 0,01) ve výskytu porodů dvojčat a abortů (jedináčků i dvojčat) v závislosti na pořadí laktace krav. Porody živých dvojčat se nejméně vyskytovaly u prvotelek, více u krav na 2. laktaci a nejvíce u dojnic na 3. laktaci. Naopak, incidence abortů jedináčků měla opačný trend (nejvíce u krav na 1. laktaci, nejméně na 3. laktaci). Při sledování porodů dvojčat, kdy se jedno z telat narodilo mrtvé a druhé živé, bylo nejméně takových případů u prvotelek, více u krav na 2. laktaci a nejvíce u dojnic na třetí laktaci. Naprosto stejný trend se projevil i v případě hodnocení abortů dvojčat (obě telata mrtvá).

248 | P a g e


May 24-25th 2012

Poděkování Příspěvek byl zpracován s podporou interního grantového projektu AF MENDELU, TP 1/2012 a s podporou Výzkumného záměru č. MSM6215648905 „Biologické a technologické aspekty udržitelnosti řízených ekosystémů a jejich adaptace na změnu klimatu“ uděleného Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy České republiky.

Použitá literatura Bell, M. J., Roberts, D. J. Effect of twinning on the feed intake, performance and health of dairy cows. Liv. Sci., 2 – 3, 2007, 107, 274–281 Bicalho, R. C., Cheong, S. H., Galvao, K. N., Warnick, L.D., Guard, C. L. Effect of twin birth calvings on milk production, reproductive performance, and survival of lactating cows. Jav.-j. Am. Vet. Med. Assoc., 9, 2007, 231, 1390 – 1397. Çobanoğlu, Ö. Twinning in Cattle: Desirable or Undesirable? J. Biol. Environ. Sci., 2010, 4, 2010, 10, 1-8. Ettema, J.F., Santos, J. E. P. Impact of Age at Calving on Lactation, Reproduction, Health, and Income in First-Parity Holsteins on Commercial Farms. J. Dairy Sci.,87, 2004, 8, 2703-2742. Fricke, P.M. Review: Twinning in Dairy Cattle. Prof. Anim. Sci., 2000, 17, 61-67. Gregory, K. E., Echternkamp, S.E., Dickerson, G. E., Cundiff, L.V., Koch, R.M., Van Vleck, L. D. Twinning in cattle: I. Foundation animals and genetic and environmental effects on twinning rate. J. Anim. Sci., 1990, 68, 1867– 876. Hossein-Zadeh, N. G., Nejati-Javaremi, A., Miraei-Ashtiani, S. R., Kohram, H. n Observational Analysis of Twin Births, Calf Stillbirth, Calf Sex Ratio, and Abortion in Iranian Holsteins. J. Dairy Sci., 11, 2008, 91, 4198-4205. Hossein-Zadeh, N. G. The effect of twinning on milk yield, dystocia, calf birth weight and open days in Holstein dairy cows of Iran. J. Anim. Phys. Anim. Nut., 6, 2010a, 94, 780– 787. Hossein-Zadeh, N. G. Evaluation of the effect of twin births on the perinatal calf mortality and productive performance of Holstein dairy cows. Archiv fur tierzucht-archives of animal breeding, 3, 2010b, 53, 256-265. del Río, N. S., Fricke, P.M., Grummer, R.R.Effects of twin pregnancy and dry period feeding strategy on milk production, energy balance, and metabolic profiles in dairy cows. J. Dairy Sci., 3, 2010, 88. del Río, N. S., Stewart, S., Rapnicky, P., Chang, Y. M., Fricke, P.M. Observational Analysis of Twin Births, Calf Sex Ratio, and Calf Mortality in Holstein Dairy Cattle. J. Dairy Sci., American Dairy Science Association, 2007, 90, 1255–1264. Zejdová, P., Falta, D., Večeřa, M.; Polák, O.; Kopec, T., Chládek, G. Vliv pohlaví u telat dvojčat na mléčnou užitkovost jejich matek. Animal Breeding 2012, 2012, 72-78.

249 | P a g e

May 24-25th 2012


SELECTION APPROACH TO EVALUATION OF EFFECTS OF MATERNAL HORMONES ON PROGENY IN PRECOCIAL BIRDS Zeman, M.,1,2 Kaňková, Z.,1 Košťál, Ľ.,2 Okuliarová, M,1 1

Katedra živočíšnej fyziológie a etológie, Prírodovedecká fakulta UK, Bratislava

2

Ústav biochémie a genetiky živočíchov, SAV, Ivanka pri Dunaji, Slovenská republika

Abstract Testosterone (T) transfer into the egg yolk can mediate epigenetic maternal effects on the phenotype of offspring in many avian species. Lines of Japanese quail divergently selected for low (LET) and high (HET) yolk T concentrations represent our unique approach to study physiological mechanisms, by which maternal hormones exert their action. Using this model, we can address mechanisms, how maternal steroids are deposited into the yolk and which environmental and socio-ecological variables determine their deposition. Moreover, we can quantify consequences of different egg steroid content on growth and development of progeny as well as its immune and behavioural phenotype.

Úvod Fenotyp jedinca je výsledkom spolupôsobenia genotypu a prostredia, pričom ich vzájomná interakcia prebieha na rôznych stupňoch ontogenézy. Z tohto hľadiska je dôležité embryonálne a skoré postnatálne obdobie, počas ktorého sa formujú základné fyziologické a neurobehaviorálne epigenetických

systémy,

maternálnych

ktoré

sú

signálov.

v tomto Faktory

čase

najcitlivejšie

prostredia

sa

môžu

na

pôsobenie

manifestovať

prostredníctvom maternálnych vplyvov, kedy matka „programuje“ svoje potomstvo na podmienky prostredia, do ktorých sa majú mláďatá narodiť (Mousseau a Fox, 1998). Schopnosť samice ovplyvňovať potomstvo popri genetickej výbave aj epigeneticky je všeobecne známa, no iba v posledných desaťročiach sa začal rozsiahly výskum mechanizmov, ktorými môže matka modifikovať expresiu génov nasledovnej generácie. Motivácia takéhoto výskumu vyplýva najmä zo skutočnosti, že epigenetické zmeny sú podstatne rýchlejšie ako genetické a umožňujú organizmom efektívnejšie reagovať a prispôsobiť sa na rýchlo sa meniace podmienky prostredia. Matka má viacero možností, prostredníctvom ktorých môže modifikovať fyziologický a behaviorálny fenotyp svojho potomstva, aby zvýšila jeho reprodukčnú úspešnosť v neustále

250 | P a g e

May 24-25th 2012


sa meniacich podmienkach prostredia. Okrem behaviorálnych prejavov matky sa v venuje veľká

pozornosť

maternálnym

hormónom,

ktoré

môžu

prostredníctvom

svojich

organizačných účinkov permanentne zmeniť fenotyp jedinca (Groothuis et al., 2005). Tento mechanizmus je významný z evolučného hľadiska v rámci rýchlej reakcie na nepredvídateľné zmeny v prostredí, ale aj z hľadiska bezprostredných negatívnych dôsledkov takýchto adaptácií pre vývin mláďaťa a jeho nesprávne naprogramovanie. Napriek tomu, že vplyvy matky na sociálne správanie najmä u cicavcov a človeka sú známe už dlho (napríklad negatívne dôsledky separovania mláďat od matky počas skorých vývinových období po narodení), mechanizmy, akými sa tieto dôsledky manifestujú, sa začínajú spoznávať až v súčasnosti. V tomto smere hrajú dominantnú úlohu maternálne steroidné hormóny, ktoré môžu prechádzať cez placentárnu alebo chorioalantoickú bariéru a svojimi organizačnými účinkami permanentne modifikovať fyziologické a behaviorálne charakteristiky potomstva (Groothuis a Schwabl, 2008). Tento problém sa v súčasnosti stáva aktuálnejším

aj

z hľadiska

zvyšujúcej

sa

kontaminácie

prostredia

endokrinnými

disruptantami, ktoré okrem priamych a ľahko viditeľných negatívnych účinkov môžu pôsobiť aj nepriamo, modifikáciou epigenetických adaptačných mechanizmov.

Divergentná selekcia prepelíc japonských na obsah testosterónu vo vajci Selekcia bola založená na znáškovej línii prepelíc japonských chovaných na Ústave biochémie a genetiky živočíchov SAV v Ivanke pri Dunaji. Významnú heritabilitu tohto znaku sme očakávali na základe vysokej opakovateľnosti hodnôt koncentrácie a obsahu testosterónu v žĺtku jednotlivých samíc počas reprodukčného cyklu (Okuliarova et al., 2009). Signifikantné rozdiely v obsahu i koncentráciách testosterónu v žĺtku sme pozorovali už v F1 generácii a maximálnu odpoveď na selekciu sme zaznamenali v F2 generácii (Tab. 1). Koeficient heritability predstavoval h2 = 0,42, čo znamená, že až polovicu individuálnej variability obsahu testosterónu je možné vysvetliť geneticky, kým druhá polovica je spôsobená akútnymi socio-environmentálnymi podmienkami. Okrem výrazných a očakávaných rozdielov v koncentráciách a obsahu testosterónu sme zistili odpoveď aj v ostatných steroidných hormónov prítomných v žĺtku. Vo vajciach HET línie sme pozorovali výrazný vzostup v koncentráciách a obsahu androstendiónu v porovnaní v LET líniou a opačné zmeny pri estradiole (Okuliarova et al., 2011a). Androstendión je prekurzorom testosterónu, ale má aj slabé androgénové účinky demonštrované po jeho injekčnom podaní (Hegyi a Schwabl, 2010). Naopak, estradiol predstavuje dominantný estrogén a vo vajci sa nachádza v nízkych koncentráciách, pretože vo vysokých 251 | P a g e

May 24-25th 2012


koncentráciách má výrazné feminizačné a demaskulinizačné účinky (Adkins-Regan et al., 1995). V koncentráciách progesterónu, ako univerzálneho prekurzora pre androgény a estrogény sme medzi líniami rozdiely nepozorovali. Naše výsledky teda naznačujú, že selekcia na obsah testosterónu vo vajci zasahuje selektívne do biosyntézy steroidov pravdepodobne na viacerých, minimálne na dvoch stupňoch. Paralelnosť zmien v koncentrácii a obsahu testosterónu počas 4 generácii dokazuje, že tento zásah je špecifický, uskutočňuje sa pravdepodobne na úrovni enzýmov zapojených do biosyntézy steroidov a neodráža iba nešpecifický transport lipidických komponentov z pečeni do žĺtka.

Tab. 1 Dynamika zmien koncentrácií a obsahu testosterónu v žĺtku prepelíc japonských divergentne selektovaných na vysoký (HET) a nízky (LET) testosterón vo vajci v priebehu selekcie (Changes in concentrations and content of egg testosterone in Japanese quail selected divergently on high (HET) and low (LET) egg testosterone during the selection process)

F1 generácia

F2 generácia

F3 generácia

F4 generácia

F5 generácia

priemer ± SE N rozsah priemer ± SE N rozsah priemer ± SE N rozsah priemer ± SE N rozsah priemer ± SE N rozsah

Testosterón [pg/mg žĺtka] LET línia HET línia 6,15 ± 0,41 8,69 ± 0,77 33 24 3.03 – 13,63 3.66 – 18,25 5,60 ± 0,27 11,95 ± 1,17 35 33 3.11 – 9,68 5.35 – 43,33 6,95 ± 0,23 15,58 ± 0,86 25 29 4.50 – 8,93 8.38 – 25,63 8,95 ± 0,42 14,39 ± 0,89 29 29 4.63 – 13,15 6.41 – 25,68 9,26 ± 0,50 19,39 ± 0,86 29 33 4.70 – 16,17 9.74 – 34,06

Testosterón [ng/mg žĺtok] LET línia HET línia 17,55 ± 1,19 24,63 ± 2,13 33 24 7.20 – 34,47 11.15 – 47,76 14,49 ± 0,75 31,21 ± 3,28 35 33 7.62 – 24,49 11.08 – 114,48 19,00 ± 0,76 42,51 ± 2,84 25 29 11.84 – 24,27 22.33 – 75,59 22,36 ± 1,10 38,84 ± 2,35 29 29 11.98 – 31,98 16.27 – 65,58 23,66 ± 1,33 51,38 ± 2,60 29 33 11.76 – 44,44 25.79 – 97,67

Významným výstupom nášho selekčného experimentu je zistenie, že veľmi výrazný vzostup obsahu testosterónu vo vajci nemal za následok vzostup hladín v organizme matky, ktorý by mohol negatívne ovplyvňovať jej fyziologické procesy a správanie. Bola tým vyvrátená jedna z hypotéz, ako môže byť obsah maternálneho testosterónu limitovaný z evolučného hľadiska. Na druhej strane, tento nález otvára ďalšie otázky o mechanizmoch, ktoré umožňujú selektívne zvýšenie obsahu testosterónu pre mláďa bez negatívnych efektov na materský organizmus. Naše doterajšie výsledky demonštrujú, že zvýšené maternálne androgény vo vajci majú pozitívny vplyv na intenzitu rastu, pričom finálna hmotnosť sa

252 | P a g e


May 24-25th 2012

medzi líniami nelíši (Okuliarova et al., 2011b). Predpokladáme, že vyššia intenzita rastu môže byť významná z evolučného hľadiska, pretože môže predstavovať výhodu v kompetícii o potravné zdroje. Nepotvrdili sme očakávanú supresiu imunitných odpovedí u HET v porovnaní s LET líniou, minimálne na úrovni bunkovej imunity v reakcii na podanie phytohemaglutinínu, ani v skorej reakcii na podanie lipopolysacharidu (Kankova et al., 2012). Tejto problematike budeme preto venovať ďalšiu pozornosť.

Záver Prezentované výsledky demonštrujú, že divergentne selektované línie

prepelíc

japonských na obsah testosterónu vo vajcovom žĺtku sa líšia v intenzite rastu, ktorá je vyššia v HET ako LET línii vo všetkých študovaných generáciách. Na druhej strane, niektoré parametre, ktoré boli pripisované vplyvu maternálnych androgénov sa medzi generáciami konzistentne nelíšia, čo naznačuje absenciu kauzálnych vzťahov. Z tohto hľadiska je zaujímavý najmä vzťah k aktivite imunitného systému, ktorému venujeme významnú pozornosť. Genetické línie predstavujú efektívny model, ktorý môže prispieť k objasneniu mechanizmov diferenciálneho transportu maternálneho testosterónu do žĺtka a jeho dôsledkov pre potomstvo.

Poďakovanie Práca bola podporená grantmi APVV 0047-10 a VEGA 1/0686/12. Použitá literatúra Adkins-Regan, E., Ottinger, M.A., Park, J. Maternal transfer of estradiol to egg yolks alters sexual differentiation of avian offspring. J. Exp. Zool., 1995, 271, 466-470. Groothuis, T.G.G., Muller, W., von Engelhardt, N., Carere, C., Eising, C. Maternal hormones as a tool to adjust offspring phenotype in avian species. Neurosci. Biobehav. Rev., 2005, 29, 329-352. Groothuis, T.G.G., Schwabl, H. Hormone-mediated maternal effects in birds: mechanisms matter but what do we know of them? Philos. Trans. R. Soc. B, 2008, 363, 1647-1661. Hegyi, G., Schwabl, H. Do different yolk androgens exert similar effects on the morphology or behaviour of Japanese quail hatchlings Coturnix japonica? J. Avian Biol., 2010, 41, 258-265. Kankova, Z., Zeman, M., Okuliarova, M. Growth and innate immunity are not limited by selection for high egg testosterone content in Japanese quail. J. Exp. Biol., 2012, 215, 617622. Mousseau, T.A., Fox, C.W. The adaptive significance of maternal effects. Trends Ecol. Evol., 1998, 13, 403-407. Okuliarova, M., Groothuis, T.G.G., Skrobanek, P., Zeman, M. Experimental evidence for genetic heritability of maternal hormone transfer to offspring. Am. Nat., 2011a, 177, 824834.

253 | P a g e


May 24-25th 2012

Okuliarova, M., Kostal, L., Zeman, M. Effects of divergent selection for yolk testosterone content on growth characteristics of Japanese quail. Comp. Biochem. Physiol. A, 2011b, 160, 81-86. Okuliarova, M., Skrobanek, P., Zeman, M. Variability of yolk testosterone concentrations during the reproductive cycle of Japanese quail. Comp. Biochem. Physiol. A, 2009, 154, 530-534.

254 | P a g e


May 24-25th 2012

THE MONITORING OF MANGANESSE CONCENTRATION IN GOAT COLOSTRUM AND MILK BY SUPPLEMENTATION OF DIFFERENT FORMS Zvonareva E., Pechová A. , Mišurová L. , Hauptmanová K. , Pavlata L. Ruminant and Swine Clinic, Faculty of Veterinary Medicine, University of Veterinary and Pharmaceutical Scinces Brno.

Abstract The objective of the study was to monitor manganese concentration in goat colostrum and milk during a long-term oral supplementation in different forms. The study was performed in the Ruminant’s clinic of VFU FVL. The experiment involved 31 goats divided into 4 groups. The first group (A; n = 9) served as a control group, the second group (B; n = 8) received inorganic manganese (MnSO4), the other groups received Mn in organic forms – group C (n = 6) Bioplex Mn, group D (n = 8) B-Traxim 2C Mn. The supplementation of Mn was performed by feed mixture which was fed to goats before parturition in the doses 0.5 kg/day and after parturition 1 kg/day. The concentration of Mn in the mixture was 20 mg/kg for control and 160 mg/kg for experimental groups. Colostrum was taken after parturition before first milk feeding of kids. Next samples were taken in 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 15, 30, 60 days post partum. The samples were mineralized, Mn content were measured via electrothermic atomic absorption spectrophotometry. The long-term manganese supplementation of goats influenced the concentration of manganese in colostrum/milk only in some samplings, but in general we did not find longlasting influence on the manganese concentration after supplementation of different forms of Mn. The concentration of Mn in colostrum and milk show high individual variability within individual experimental groups. The highest Mn concentration were found in first colostrum (A: 20,78 µg/l; B: 32,3 µg/l; C: 23,47 µg/l ; D: 38,31 µg/l), significant difference (p ≤ 0.05) was between A and D. During colostral period Mn concentration in colostrum decreased, but from the second week of lactation Mn concentration in milk increased till the end of the experiment.

Key words: manganese, Mn proteinate, Mn chelate, MnSO4, goat colostrum and milk Mangan je jedním z nejméně zastoupených stopových prvků v mléce, jeho koncentrace většinou není vyšší než 0,1 mg/l u různých druhů zvířat, s výjimkou mleziva (Grace a

255 | P a g e


May 24-25th 2012

kol.,1973). Koncentrace Mn v mléce a mlezivu je popisována pouze v malém počtu vědeckých prací. Publikovaná data se však liší s ohledem na sledovaný druh zvířat a fázi laktace. Hladina manganu v mléce je podle výsledků některých autorů (Merian a kol., 2004; Underwood a Suttle, 1999) ovlivňována množstvím Mn v krmné dávce. Cílem této práce bylo sledování koncentrace manganu v mlezivu a mléce koz při perorální suplementaci různými formami manganu.

Materiál a metodika Experiment byl realizován na Klinice chorob přežvýkavců FVL VFU Brno v roce 2009 - 2010. Do pokusu bylo zařazeno 31 březích krátkosrstých bílých koz, které byly rozděleny do 4 samostatně ustájených skupin. Všechny kozy byly krmeny shodnou krmnou dávkou, která sestávala z doplňkové krmné směsi (DKS) 0,5 kg/kus/den před porodem, a 1,0 kg/kus/den po porodu. Dále měly všechny kozy ad libitní přístup k lučnímu senu, vodě a minerálním lizům bez obsahu manganu. Průměrný příjem sena se pohyboval kolem 2,5 kg na kus a den. Koncentrace Mn v senu byla v průměru 87,53 mg/kg. Kontrolní skupina A (n = 9) dostávala doplňkovou směs bez přídavku Mn (přirozený obsah Mn byl 20 mg/kg). Kozy pokusných skupin dostávaly doplňkovou směs, která byla obohacena Mn v různých formách v koncentraci 140 mg/kg (celkem DKS obsahovalo 160 mg/kg Mn). Suplementace pokusných skupin byla zahájena ve druhém měsíci gravidity. Skupina B (n = 8) dostávala krmnou směs obohacenou anorganickým Mn ve formě MnSO4, v dalších pokusných skupinách byly použity organické formy manganu: skupina C (n = 6) dostávala DKS supplementovanou 15 % Mn proteinátu (BioplexMn, Alltech), skupina D (n = 8) dostávala DKS suplementovanou 21 % Mn chelát glycinu (B-Traxim 2C Mn, Pancosma). V den porodu bylo odebráno mlezivo před prvním napitím kůzlat a dále byly odebírány vzorky 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7., 15., 30. a 60. den po porodu. Mlezivo/mléko bylo po odběru zamraženo až do zpracování v laboratoři. Analýzy vzorků byly realizovány v biochemické laboratoři Kliniky chorob přežvýkavců. Koncentrace Mn v mléce byla stanovena po mikrovlnné mineralizaci v uzavřeném systému s přídavkem peroxidu vodíku a kyseliny dusičné (2 ml mleziva/mléka +1 ml H2O2 + 2 ml HNO3) na přístroji MLS-1200 (Milestone, Itálie). Vlastní stanovení Mn bylo provedeno elektrotermickou atomovou absorpční spektrofotometrií na přístroji Solaar 939 (Unicam, Velká Británie). Výsledky byly statisticky zpracovány za použití F-testu pro zhodnocení variability jednotlivých souborů a na základě jeho výsledku byl použit Studentův t-test pro soubory se shodnými/různými rozptyly. Výsledky jsou uvedeny jako průměry se směrodatnými 256 | P a g e

May 24-25th 2012


odchylkami. Statistické zpracování bylo provedeno v programu Excel (Microsoft Windows 97). Výsledky a diskuse Koncentrace manganu v kolostru koz vykazovala poměrně vysokou variabilitu v rámci jednotlivých pokusných skupin. Největší rozdíly mezi jednotlivými zvířaty byly zjištěny v den porodu (tabulka 1). Tab. 1 Koncentrace Mn (µg/l) v mlezivu u jednotlivých pokusných skupin koz (A – kontrola, B – MnSO4, C – Mn proteinát, D – Mn glycinát) v den porodu.

a

Skupiny

x

s

MAX

MIN

A

20,78a

8,53

34,65

9,87

B

32,30

19,85

70,73

10,04

C

23,47

10,56

44,53

12,31

D

38,31a

17,47

80,50

24,04

p ≤ 0,05(signifikantní rozdíl mezi skupinami označenými stejnými písmeny)

V kontrolní skupině byla v den porodu zjištěna nejnižší koncentrace Mn, ale signifikantní rozdíl byl pouze ve srovnání se skupinou D, která dostávala Mn-glycinát. U koz kontrolní skupiny koncentrace manganu v kolostru mírně stoupala do 4. dne po porodu. Naopak u pokusných skupin koncentrace manganu od porodu mírně klesala. Koncentrace Mn v kolostru u jednotlivých skupin v prvních 5 dnech po porodu je uvedena v tabulce 2. Na rozdíl od výsledků Weisse a kol. (2005) jsme zjistili signifikantní rozdíly v kolostrální koncentraci manganu mezi jednotlivými pokusnými skupinami. V den porodu byly zjištěny signifikantně nižší koncentrace Mn v mlezivu koz u skupiny A ve srovnání se skupinou D (p<0,05) suplementovanou Mn- glycinátem a naopak signifikantně vyšší koncentrace byly zjištěny 3. den po porodu u skupiny A ve srovnání se skupinou C (p<0,05) suplementovanou Mn-proteinátem. Tab. 2 Průměrná koncentrace Mn (µg/l) v mlezivu u jednotlivých pokusných skupin koz (A – kontrola, B – MnSO4, C – Mnproteinát, D – Mnglycinát) Dny laktace A B C D a a 32,30 ± 19,85 23,47 ± 10,56 Porod 20,78 ± 8,53 38,31 ± 17,47 20,44 ± 8,67 28,33 ± 17,61 20,68 ± 9,44 28,15 ± 10,24 1 17,55 ± 7,04 17,75 ± 6,87 20,50 ± 7,40 14,77 ± 3,40* 2 a a, 15,22 ± 8,63 12,81 ± 4,69 3 17,75 ± 5,20 11,65 ± 5,98 * * 21,54 ± 7,37 15,33 ± 6,95 11,39 ± 3,45 16,51 ± 10,09 4 19,06± 9,75 15,28± 7,10 15,07± 5,19 14,65± 7,82 5 a

p ≤ 0,05(signifikantní rozdíl mezi skupinami označenými stejnými písmeny v jednom řádku) *p ≤ 0,05(signifikantní rozdíl ve srovnání s předchozím odběrem v jednom sloupci)

257 | P a g e


May 24-25th 2012

V dostupné literatuře jsme nenašli informace o koncentraci Mn v kolostru a mléce koz. Námi zjištěné koncentrace Mn v mlezivu jsou nižší, než uvádí Weiss a kol. (2005) u krav. Tito autoři sledovali koncentrace Mn v mlezivu dojnic při suplementaci MnSO4 a Mn-Met (200 mg Mn/kus/den). Průměrná koncentrace Mn v mlezivu dojnic kontrolní skupiny byla 34,7 µg/l, u dojnic suplementovaných MnSO4 - 33,1 Mn µg/l, a ve skupině suplementovaných Mn-Met - 35,8 Mn µg/l. Výrazně vyšší koncentrace Mn mlezivu dojnic (130-160 µg/l) však uvádí Underwood a Suttle (1999). Průměrné koncentrace manganu v kolostru koz bez ohledu na suplementaci jsou uvedeny v grafu 1. Graf 1 Koncentrace manganu (µg/l) v mlezivu koz bez ohledu na suplementaci

Koncentrace manganu v mléce koz od 6. dne po porodu do konce 2. měsíce v jednotlivých pokusných skupinách jsou uvedeny v tabulce 3. Nejnižší koncentrace manganu u koz skupiny A, B i C byly 6. den laktace, pouze u skupiny D až 15. den po porodu. U všech skupin koz byla zjíštěna tendence zvyšování koncentrace manganu v mléce ke konci druhého měsíce laktace, přičemž se průměrné koncentrace pohybovaly od 21,52 až do 29,40 µg/l, což jsou hodnoty blížící se koncentraci v prvním mlezivu. Signifikantní rozdíly mezi jednotlivými pokusnými skupinami byly vzhledem k poměrně vysoké variabilitě v rámci jednotlivých skupin zjištěny pouze na konci prvního týdne laktace. Signifikantně vyšší hodnoty byly 6. den laktace u skupiny D, suplementované Mn-glycinátem ve srovnání se skupinami B a C. Dále byl signifikantní rozdíl zjištěn 7. den laktace mezi skupinami D a C. Přestože určité rozdíly mezi pokusnými skupinami byly v průběhu našeho experimentu zjištěny, nelze jednoznačně říci, že suplementace některé z použitých forem manganu dlouhodobě zvýšila koncentraci Mn v mléce dané skupiny koz. Vliv suplementace Mn-glycinátu a Mn oxidu u dojnic sledovali Hall a kol. (2007). Tito autoři zjistili signifikantně vyšší hodnoty Mn v mléce u dojnic suplementovaných Mn-glycinátem ve srovnání s kontrolní skupinou. 258 | P a g e

May 24-25th 2012


Tab. 3 Průměrná koncentrace Mn (µg/l) v mléce u jednotlivých pokusných skupin koz (A – kontrola, B – MnSO4, C – Mn proteinát, D – Mn glycinát) v prvních dvou měsících laktace. Dny laktace

A

B

C a

D b

6

16,76 ± 8,96

9,68 ± 3,49

7

13,30 ± 5,76

10,95 ± 4,86

9,53 ± 2,07

15

17,34 ± 6,05

21,10 ± 12,17

21,75 ± 12,27

14,00 ± 5,82

30

28,14 ± 10,53

21,70 ± 3,25

22,28 ± 3,32

24,57 ± 7,62

60

29,40 ± 6,75

21,52 ± 12,29

22,37 ± 6,78

26,29 ± 6,65

* *

10,03 ± 3,12 a

20,16 ± 9,40 15,16 ± 5,32

ab a

*

a

p ≤ 0,05(signifikantní rozdíl mezi skupinami označenými stejnými písmeny v jednom řádku) *p ≤ 0,05(signifikantní rozdíl ve srovnání s předchozím odběrem v jednom sloupci)

Průměrná koncentrace Mn v mléce koz bez ohledu na pokusné skupiny se pohybovala od 15 do 25 µg/l, přičemž s postupující laktací se zvyšovala (graf 2). Naše výsledky jsou obdobné jako údaje uváděné v literatuře pro kravské mléko: 20- 40 µg/l (Underwood a Suttle, 1999); 20,07 ± 8,26 µg/l (Pechová a kol., 2008); 20 – 50 µg/l (Knowles a kol., 2006); 32 – 52 µg/l (McLeod a Robinson, 1972). Nicméně naše výsledky jsou výrazně nižší, než uvádí Anke a kol. (1999) – 620 a 120 µg/l v kravském a v lidském mléce jednotlivě (citováno z Merian a kol., 2004). Domníváme se, že tyto velké rozdíly mohou být způsobeny rozdíly v metodice stanovení a především pak přístrojovém vybavení. Graf 2 Koncentrace manganu (µg/l) v mléce koz od 6. do 60. dne laktace bez ohledu na suplementaci

Z grafu 2 je patrné postupné zvyšování koncentrace Mn v mléce s postupující laktací. Nejvyšší hodnoty byly zjištěny 60. den laktace, kdy byla průměrná koncentrace Mn v mléce 25,20 ± 9,11µg/l. Naopak minimální koncentrace Mn 12,44 ± 5,31µg/l byla stanovena 7. den

259 | P a g e


May 24-25th 2012

laktace. Obdobně zjistili tendenci zvýšení koncentrace Mn v mléce s postupující laktací Pechová a kol. (2008) Závěr Suplementace březích koz různými formami Mn ovlivnila koncentraci Mn v kolostru/mléce pouze při některých odběrech, ale při celkovém zhodnocení nebyl zjištěn dlouhodobý vliv suplementace některé z použitých forem Mn na koncentraci tohoto prvku v kolostru ani v mléce. Koncentrace manganu v kolostru i v mléce koz vykazovala vysokou individuální variabilitu v rámci jednotlivých pokusných skupin. V prvních dnech po porodu docházelo k poklesu koncentrace Mn v mlezivu, ale s postupující laktací se koncentrace Mn u většiny koz zvyšovala.

Poděkování Práce byla realizována s podporou Výzkumného záměru MŠMT č. 6215714203.

Použitá literatury Grace, N.D. Effect of high dietary Mn levels on the growth rate and the level of mineral elements in the plasma and soft tissues of sheep. New Zealand Journal of agricultural research, 1973, 16, 177–180 Hall, J., Winger, H., Hole, P., Samord, R. Investigation of the bioavailability of manganese from organic vs. inorganic supplements. 2007, 58, 358–363. Knowles, S.O., Grace, N.D., Knight, T.W., Mcnabb, W.C., Lee, J. Reasons and means for manipulating the micronutrient composition of milk from grazing dairy cattle. Anim. Feed Sci. Technol., 2006, 131, 154–167 Mcleod, B., Robinson, M. Dietary intake of manganese by New Zealand infants during the first six months of life. Br. J. Nutr. 1972, 27, 229–232 Merian, E., Anke M., Ihnat, M., Stoeppler, M. Elements and their Compounds in the Environment. 2nd Edition, Wienheim: Copyright WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2004, 1245 Pechová, A., Pavlata, L., Dvožák, R., Lokajová, E. Contents of Zn, Cu and Se in milk in relation to their concentrations in blood, milk yield and stage of lactation in dairy cattle. Acta Vet. Brno, 2008, 77, 523–531 Underwood, E.J., Suttle, N.F. The mineral nutrition of Livestock, 3rd ed. 3.vyd. Oxon: CABI Publishing, 1999, 614 Weiss, W., Socha, T. Dietary manganese for dry and lactating Holstein cows. J. Dairy Sci., 2005, 88, 2517–2523

260 | P a g e

May 24-25th 2012


VYTVOŘENÍ PARTNERSKÉ SÍTĚ VZDĚLÁVÁNÍ A VÝZKUMU V OBLASTI MASTITID CZ.1.07/2.4.00/17.0026 Dotační titul: OP Vzdělávání pro konkurenceschopnost Prioritní osa: 7.2 Terciární vzdělávání, výzkum a vývoj Oblast podpory: 7.2.4 Partnerství a sítě Doba řešení: 1.1.2012 – 31.12.2014 Přidělené finanční prostředky: 6 918 878 Kč Koordinátor projektu: Ing. Petr Sláma, Ph.D. Partneři projetu: Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích Společnost mladých agrárníků České republiky Bentley Czech s.r.o. Anotace projektu: Hlavním cílem projektu je vytvoření partnerské sítě mezi institucemi terciárního vzdělávání, výzkumnými organizacemi a subjekty soukromého sektoru, které se zabývají vzděláváním a výzkumem v oblasti mastitid. Dalším cílem je prohloubit vzájemnou spolupráci mezi jednotlivými subjekty a přispět tak k lepšímu přenosu poznatků. Do projektu budou zapojeny také zahraniční univerzity a výzkumné instituce, které jsou předpokladem zkvalitnění vzdělávání cílové skupiny. Tyto cíle budou naplňovány prostřednictvím následujících klíčových aktivit: 1. Komunikační a interaktivní platformy 2. Vzdělávací a tréninkové moduly 3. Stáže a odborné praxe 4. Odborná stáž na Kasetsart University, Thajsko 5. Odborná stáž na National Institute of Animal Health, Japonsko 6. Odborná stáž na Slovenskej poľnohospodárskej univerzite v Nitre, Slovensko 7. Odborná stáž v Centru výskumu živočíšnej výroby Nitra, Slovensko Tento projekt je spolufinancován z Evropského sociálního fondu a státního rozpočtu České republiky

261 | P a g e


May 24-25th 2012

Partnerství a sítě Mendelu Zdeněk Havlíček, Jiří Skládanka – Mendelu v Brně Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat je spolu s Ústavem výživy zvířat a pícninářství koordinátorem projektu CZ 1.07./2.4.01/12.0045 „Posílení spolupráce mezi MZLU v Brně a dalšími institucemi v terciárním vzdělávání a výzkumu“, jehož hlavní podstatou je cílené seskupování univerzit a vědeckých institucí do celků, které jsou označovány jako partnerství. Projekt spolufinancovaný z Evropského sociálního lidí fondu umožní výměnu informací mezi jednotlivými subjekty. Primárně bude kladen důraz na výměnu informací a prohlubování spolupráce mezi jednotlivými partnery vytvořené sítě. Na projektu se kromě zmiňované Agronomické fakulty Mendelu v Brně podílejí také další čtyři instituce – Zemědělská fakulta Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích, AgroKonzulta – poradenství s.r.o. Žamberk, Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i Praha a Zemědělský výzkum, spol. s r.o. v Troubsko. Co je možné očekávat? V následujících 36 měsících budou pro jednotlivé cílové skupiny, které jsou představovány akademickými i neakademickými pracovníky univerzit, stejně jako vědeckými i nevědeckými pracovníky jednotlivých partnerských pracovišť organizovány workshopy s praktickými ukázkami jednotlivých laboratorních, experimentálních a modelových postupů, u kterých bude nedílnou součástí i aktivita spojená s interpretací výsledků. Důraz bude kladen na interdisciplinární využitelnost. V současné době probíhají semináře s názvem Interaktivní informační platformy, kde se presentují jednotlivá pracoviště partnerských organizací. Co s toho budou mít studenti? Výsadní postavení a důraz v aktivitách projektu je kladen především na vysokoškolské studenty, kteří svou znalostí fungujících činností a mechanismů od výzkumné až po aplikaci jednotlivých poznatků získají výhodnější postavení na trhu práce. Pro studenty je cíleně určena aktivita Podpora pracovních a studijních pobytů, kdy budou mít studenty u partnerů projektu možnost poznat specifické vybavení institucí partnerů, budou mít možnost praktického vyzkoušení některých experimentů s vyjasněním jejich podstaty a přínosu tak, aby je studenti mohli v budoucnu využít nejen pro své Jaké to bude mít důsledky pro budoucnost? Projekt přispěje ke zvýšení vzájemné spolupráce a přispěje k lepšímu přenosu poznatků z univerzitní do aplikační sféry. Tato část zahajovaného projektu je určena pro akademické a neakademické vědecké pracovníky. Projekt svými klíčovými aktivitami napomůže budoucímu efektivnějšímu a společnému využívání výzkumných a vývojových kapacit, včetně konzultační činnosti při vyústění do společně řešených, komplexně pojatých projektů na úrovni základního i aplikačního výzkumu. Navázaná spolupráce bude finalizována vytvořením kontaktního místa na Mendelově univerzitě v Brně, které bude též zaměřeno na poskytnutí relevantních informací vůči aplikační sféře a zaměstnavatelskému sektoru.

262 | P a g e

May 24-25th 2012


Inovace studijních programů AF MENDELU směrem k internacionalizaci studia CZ.1.07/2.2.00/28.0020 Doba řešení: 1.6.2012 – 31.5.2015 Koordinátor projektu: Jiří Skládanka Žadatel projektu: Mendelova univerzita v Brně Partner projektu: AgroKonzulta – poradenství, s.r.o. Obsah projektu: Projekt přispívá k tvorbě studijních materiálů oboru Všeobecné zemědělství, který je na AF MENDELU akreditován v češtině a angličtině. Pro anglickou výuky nejsou k dispozici didaktické pomůcky nutné pro dosažení požadovaných znalostí a dovedností absolventů. Učební texty v angličtině jsou také nutné pro další akreditace. Projekt je dále zaměřen na inovaci oborů fytotechnických a zootechnických, jejichž předměty se prolínají v mezioborovém Všeobecném zemědělství. Vytvořené studijní texty budou reagovat na aktuální měnící se ekonomické podmínky a na environmentální problematiku, zejména změny klimatu. Pro vyšší uplatnění absolventů na trhu práce budou realizovány stáže u budoucích zaměstnavatelů. Projekt je určen pro učitele VŠ a studenty AF MENDELU. Cílů projektu bude dosaženo tvorbou e-learningových prezentací, skript, posterů, DVD nahrávek, atlasů a dalším jazykovým vzděláváním učitelů. Plánované aktivity bude realizovat tým VŠ učitelů z AF MENDELU a odborníků z firmy AgroKonzulta – poradenství, s.r.o. Klíčové aktivity: KA1 Inovace fytotechnických programů směrem k modernizaci didaktických metod KA2 Inovace zootechnických programů směrem k modernizaci didaktických metod KA3 Inovace studijních programů s možností mezioborových studií směrem k výuce v AJ KA4 Zvyšování jazykových kompetencí akademických pracovníků KA5 Zapojení odborníků ze zahraničí do přípravy studijních programů v anglickém jazyce KA6 Podpora stáží studentů u budoucích zaměstnavatelů KA7 Inovace předmětů v cizích jazycích napříč obory AF Rozpočet projektu: celkové náklady 20 092 755,20 Kč

Tento projekt je spolufinancován z Evropského sociálního fondu a státního rozpočtu České

263 | P a g e

May 24-25th 2012


Name of publication: Author: Editors: Number of pages: Number of copies: Publisher:

ISBN:

Animal Physiology 2012 – Proceedings of International Conference Collective of Authors Ing. Aleš Pavlík, Ph.D., Ing. Petr. Sláma, Ph.D., Ing. Petr Škarpa, Ph.D. 264 90 Mendel University in Brno, Zemědělská 1, 613 00, Czech Republic

978-80-7375-616-1

Contributions are published in original version, without any language correction

264 | P a g e

ANIMAL PHYSIOLOGY 2012

Recommend Documents