Analýza mutací genu COL1A1 českých pacientů s diagnózou osteogenesis imperfecta, typ I-IV

cs30

Původní práce

Analýza mutací genu COL1A1 českých pacientů s diagnózou osteogenesis imperfecta, typ I-IV Lucie Šormová1 , Ivan Mazura1 , Ivo Mařík2 1 2

1. lékařská fakulta Univerzity Karlovy v Praze, ČR

Ambulantní centrum pro vady pohybového aparátu, Praha, ČR

Abstrakt Přehled: Osteogenesis imperfecta je celosvětově rozšířené onemocnění pojivové tkáně vyznačující se rozsáhlou klinickou heterogenitou. Hlavním klinickým příznakem je zvýšená fragilita kostí způsobená defektní produkcí kolagenu typu I, který je kódován geny COL1A1 a COL1A2. Z klinického, radiologického a genetického hlediska rozlišujeme 11 forem onemocnění, přičemž pouze první čtyři typy vznikají v důsledku mutací genů kolagenu typ I. Závažnost onemocnění se pohybuje od lehkých forem po letální typy onemocnění. Cíle a metody: Cílem studie je molekulárně-genetická analýza genu COL1A1 25 českých pacientů postižených onemocněním osteogenesis imperfecta, konkrétně I-IV typem, a následné porovnání klinického obrazu jedinců se shodnými změnami DNA.

Výsledky: Mutace genu COL1A1 byly identifikovány u 3 z 25 českých OI pacientů. Jedná se o nepříbuzné jedince s diagnózou osteogenesis imperfecta typ IA, III a IVB. Závěr: Identifikace mutačního spektra prostřednictvím molekulárně genetických analýz dalších pacientů a jejich příbuzných je nezbytná nejen pro stanovení vztahů mezi genotypem a fenotypem postižených jedinců, ale zároveň pro porovnání frekvence výskytu identifikovaných mutací české populace s dalšími populacemi.

Klíčová slova Osteogenesis imperfecta, kolagen typ I, COL1A1, COL1A2, MLBR, mutace

Kontakt: Lucie Šormová 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova v Praze Adresa: Kateřinská 32, 121 08 Praha 2, ČR E–mail: [email protected]

1

Úvod

Osteogenesis imperfecta je dědičné onemocnění pojivové tkáně, jehož charakteristickým klinickým znakem jsou křehké kosti s vysokým rizikem pro vznik zlomenin. Dalšími klinickými rysy této choroby jsou podprůměrný až malý vzrůst, kloubní hypermobilita, hyperlaxicita kůže, modré skléry, nedoslýchavost a dentinogenesis imperfecta. V některých případech jsou popisovány defekty plic či vaskulárního systému. Prvotní klasifikace, jejímž autorem byl David Sillence a která rozlišovala čtyři typy OI, vznikla v roce 1979. V průběhu následujících let byla tato klasifikace na základě identifikace nových klinických, radiologických a genetických znaků postupně rozšiřována o další typy až na současných 11 forem OI. Molekulární podstatou prvních čtyř forem jsou mutace genů kolagenu typ I (Collagen, type I, alpha-1 (COL1A1) a Collagen, type I, alpha-2 (COL1A2)), původ zbývajících typů jsou mutace genů Serpin peptidase inhibitor, EJBI – Ročník 8 (2012), číslo 5

EJBI 2012; 8(5):cs30–cs37 zasláno: 15. srpna 2012 přijato: 2. října 2012 publikováno: 22. listopadu 2012

clade F, member 1 (SerpinF1) (OI typ VI), genů 3-prolyl hydroxylačního komplexu - Cartilage associated protein (CRTAP), Leucine- and proline-enriched proteoglycan 1 (LEPRE1) a Peptidyl-prolyl isomerase 1 (Cyclophylin B) (PPIB) (OI typ VII, VIII a IX), a defekty chaperonů Serpin peptidase inhibitor, clade H, member 1 (SerpinH1) a FK506-binding protein 10 (FKBP10) (OI typ X a XI). Etiologie pátého typu OI není v současnosti jasná [5, 18].

1.1

Kolagenní formy osteogenesis imperfecta

OI typ I je nejmírnější formou OI s autozomálně dominantním typem dědičnosti. Riziko vzniku zlomenin je zvýšené v období dětství a následně v postmenopauzálním období žen a po šedesátém roce života mužů. Jedinci dosahují normální tělesné výšky, mohou mít mírně deformované kosti, modré zabarvení bělma a trpět nedoslýchavostí. U některých pacientů může být diagnostikována c

2012 EuroMISE s.r.o.

cs31

Šormová, Mazura, Mařík – Analýza mutací genu COL1A1

dentinogenesis imperfecta (DI). Na základě přítomnosti tohoto znaku rozlišujeme OI typ IA (absence DI) a OI typ IB (přítomnost DI). Přítomnost výše uvedených znaků je vysoce variabilní [9, 17]. OI typ II je perinatálně letální formou. Běžným znakem je mrtvorozenost a vysoká úmrtnost jedinců v perinatálním období, která činí až 80 %. K prvním zlomeninám dochází již během intrauterinního vývoje plodu. Pacienti mají vážně deformované kosti, obličej trojúhelníkového tvaru a modře čí šedě zbarvené skléry. V rámci druhého typu jsou vyčleněny tři podtypy – IIA, IIB a IIC, a to v závislosti na hodnocení výskytu radiologických znaků jako jsou deformace žeber a dlouhých kostí, cefalometrických znaků (makro- či mikrocefalie), typu dědičnosti a mutovaného genu (autozomálně dominantní typy IIA a IIC vznikají v důsledku mutací genů COL1A1 a COL1A2, zatímco kauzálním genem autozomálně recesivního typu IIB je gen CRTAP) [2]. Třetí typ onemocnění je mírně deformující autozomálně dominantní či recesivní formou OI. Pacienti jsou podprůměrného vzrůstu, mají krátké končetiny, vážně deformované kosti, hypermobilní klouby, trojúhelníkový obličej, tmavě modré skléry (během dospívání intenzita zabarvení klesá) a DI. Typickým radiologickým znakem jsou wormianské kůstky přítomné v lebečních švech a „popcornová“ kalcifikace epifýz a metafýz dlouhých kostí. Z důvodu těžké skoliózy, tenkých diafýz dlouhých kostí a vysoké frekvence zlomenin, k nimž dochází během běžných denních aktivit, jsou pacienti po většinu života upoutání na invalidní vozík [13]. OI typ IV je nejvíce heterogenním, autozomálně dominantním typem tohoto onemocnění. Tělesná výška jedinců je podprůměrná až nízká, kosti jsou deformované a podobně jako u předchozího třetího typu, mohou být epifýzy a metafýzy dlouhých kostí „popcornové“ struktury. První fraktury vznikají během porodu, pacienti mají bíle, šedě či modře zbarvené skléry a mohou mít diagnostikovánu otosklerózu. Typickým znakem tohoto typu je basilární imprese. Na základě přítomnosti DI jsou v rámci čtvrtého typu rozlišovány podtypy IVA (absence DI) a IVB (přítomnost DI) [7].

1.2

Nekolagenní formy osteogenesis imperfecta

OI type V je autozomálně dominantním typem osteogenesis imperfecta s nejasným genetickým původem. Jedná se o mírně deformující formu vyznačující se tvorbou hypertrofického kalu v místě zlomeniny a kalcifikací mezikostní membrány kostí předloktí [5, 12]. Šestý typ této choroby je přenášen autozomálně recesivně. Typickými znaky tohoto typu jsou vzhled kostních lamel, které svým tvarem připomínají rybí šupiny, a osteopenie. Dlouhé kosti pacientů jsou deformované, metafýzy mají bulvózní tvar [12, 13]. Tato forma je způsobena mutacemi genu SerpinF1 [5]. c


OI typ VII je autozomálně recesivní forma OI s vážným až letálním klinickým projevem. Hlavními znaky jsou rhisomelické zkrácení končetin a exoftalmus. Četnost zlomenin klesá během dospívání jedinců. Tento typ vzniká v důsledku mutací genu CRTAP [16]. Další autozomálně recesivním typem OI je typ VIII. Fenotyp postižených jedinců je podobně jako u předchozí formy velice variabilní – od vážného k letálnímu projevu choroby. Typickým klinickým znakem je rhisomelické zkrácení končetin, dalšími běžně se vyskytujícími radiologickými znaky jsou bulbózní metafýzy, zkrácení dlouhých kostí a osteoporóza. Kauzálním genem je gen LEPRE1 [4, 5]. Osteogenesis imperfecta typ IX je mírnou až letální formou vyznačující se klinickými znaky shodnými s III a IV typem OI. Choroba je přenášena autozomálně recesivně a je způsobena defektním genem PPIB [9]. Vážný až letální OI typ X, autozomálně recesivní forma OI, vyplývá z mutací genu SerpinH1. Podobně jako u typů VII a VIII se tento typ vyznačuje rhizomelickým zkrácením končetin postižených jedinců [5]. Posledním typem OI je typ XI. Jedná se o autozomálně recesivní onemocnění, které je výsledkem mutací genu FKBP10. Typickým klinickým znakem jsou podobně jako u šestého typu kostní lamely tvaru rybích šupin [5].

1.3

Molekulárně genetická podstata osteogenesis imperfecta

80-90 % všech případů OI má svou genetickou podstatu v mutacích jednoho ze dvou genů kolagenu typ I – COL1A a COL1A2. Molekula proteinu je tvořena dvěma alpha1 řetězci kódovanými genem COL1A1 na chromozomu 17 a jedním alpha2 řetězcem kódovaným genem COL1A2, který se nachází na chromozomu 7. Nesložené řetězce podléhají mnoha modifikacím (4-prolyl hydroxylace, 3-prolyl hydroxylace, hydroxylace lysinu, glykosylace), které zvyšují stabilitu molekuly proteinu. Takto modifikované řetězce jsou následně ve směru od C- k N-konci skládány v heterotrimer zakončený N- a C-terminálními propeptidy (tímto lze vysvětlit fakt, že mutace situované v C-oblasti molekuly proteinu mají za následek závažnější postižení jedinců) [1, 9]. Nejdůležitější aminokyselinou vyskytující se v alpha řetězci je glycin (Gly), který produkuje meziřetězové vazby. Glycin se nachází na každé třetí pozici 338 repetitivních sekvencí Gly-X-Y a zodpovídá za korektní formaci alpha řetězců do struktury trojšroubovice. Přibližně 75-80 % strukturních defektů kolagenu typ I plyne ze substitucí glycinu jinou aminokyselinou [10]. 36 % substitucí glycinu kódovanými genem COL1A1 vede v letální fenotyp, zatímco v rámci genu COL1A2 má za následek letalitu 19 % záměn této aminokyseliny [5]. Dalšími klíčovými oblastmi alpha řetězců jsou místa vazeb transkripčních faktorů, tedy vazebná místa aktivačních proteinů (tzv. enhancery a silencery) aktivujících či inhibujících transkripci [6]. Dále mezi ně řadíme oblasti bohaté na CpG. EJBI – Ročník 8 (2012), číslo 5

cs32


Obrázek 1: Přehled identifikovaných mutací/polymorfismů v genu COL1A1.

Tyto nukleotidy mohou podléhat metylacím, jejichž výsledkem je mírný fenotyp, pokud se tak stane v promotoru, exonu 1 či intronu1, a vážný klinický obraz, pokud se metylované CpG nacházejí v kódující oblasti genů COL1A1 a COL1A2. V současnosti je popisováno, že tomuto procesu může podléhat 26 z 338 kodonů glycinu v alpha řetězcích [8]. V rámci molekuly kolagenu dále existují tři vazebné oblast, tzv. Multi Ligand Binding Regions (MLBR1-3), které produkují mezimolekulární vazby s dalšími molekulami pojivové tkáně, jako např. integriny, oligomerní protein chrupavkové matrix (Cartilage Oligomeric Matrix Protein, COMP), SerpinH1 a další. Vazby s těmito proteiny zvyšují pevnost a pružnost kostí a je prokázáno, že mutace oblastí MLBR2 a MLBR3 mají ve většině případů za následek letální typy osteogenesis imperfecta [5, 15].

1.4

Léčba jedinců postižených osteogenesis imperfecta

Léčba jedinců s osteogenesis imperfecta je různá a individuální na základě konkrétního klinického, radiologického a biochemického obrazu. Medikamentózní léčba zahrnuje užívání kalcia, vitaminu D a léčbu bisfosfonáty, které jsou běžně podávány při léčbě mírných a vážných forem OI. Specifickou funkcí bisfosfonátů je inhibice osteoklastů na povrchu kostí, čímž je docíleno zvýšení hustoty kostí a snížení rizika vzniku zlomenin [3]. Ortotická léčba je indikována u pacientů majících skoliózu a lehké deformity kostí končetin. Oproti tomu vážné deformity a zlomeniny se signifikantní dislokací jsou léčeny chirurgicky osteotomií a fixací s použitím nitrodřeňových prutů, hřebů, pinů apod.

Vážnou skoliózu lze korigovat chirurgicky zavedením tzv. Harringtonových prutů, tento způsob léčby však značně omezuje následný rozsah pohyblivosti páteře. V současné době jsou vyvíjeny metody tzv. buněčné a genové terapie. Jejich cílem je nahrazení defektních osteoblastů a deaktivace mutovaných genů, čímž by bylo docíleno zvýšení minerální denzity kostí (buněčná terapie) a snížení klinické závažnosti OI (genová terapie) [9, 11].

2

Materiál a metody

V rámci této studie byly analyzovány vzorky gDNA získaných z žilní krve 25 českých pacientů (čtyři nepříbuzné rodiny a sedmnáct sporadických případů) s diagnózou osteogenesis imperfecta typ I-IV – 19 pacientů postiženo OI typem IA, pět pacientů postiženo třetím typem onemocnění a jeden pacient typem IVB. Všichni vyšetřovaní pacienti podepsali informovaný souhlas povolující provedení molekulárně genetické analýzy jejich DNA. Vzorky krve byly kompletovány na několika pracovištích České republiky – Praha, Brno, Hradec Králové, Olomouc a Ostrava. Molekulárně genetické analýzy izolované gDNA byly zaměřeny na gen COL1A1 proteinu kolagenu typ I. Genomická DNA byla izolována s použitím QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN) izolačního kitu a uchována při teplotě -20◦ C. Kvalita DNA izolátů byla ověřena elektroforeticky, kvantita spektrofotometricky. Takto ověřené vzorky DNA byly amplifikovány metodou polymerázové řetězové reakce (PCR) s použitím pro tuto analýzu speciálně vytvořených 100% komplementárních primerů zaměřených na šest regionů DNA zahrnujících exony 31-40. Tato oblast DNA byla vybrána

Tabulka 1: Přehled identifikovaných mutací/polymorfismů českých OI pacientů. Č. pacienta

OI typ

Pohlaví

1

III

Žena

Věk (v rocích) 23

2

IA

Muž

22

3

IVB

Žena

52

EJBI – Ročník 8 (2012), číslo 5

Změna nukleotidu GGC/TGC ACT/ACC T/C C/G ACT/ACC T/C C/G

Mutace/ Polymorfismus Gly526Cys Thr588Thr I32T15375C I39C17332G Thr588Thr I32T15375C I39C17332G

Umístění v COL1A1 exon 31 exon 33 intron 32 intron 39 exon 33 intron 39 intron 31

c


cs33


Obrázek 2: Sekvenční struktura exonu 31. Pozice substituce Gly526Cys je vyznačena tučně, záměna nukleotidu je zvýrazněna červenou kurzívou.

Obrázek 3: Sekvenční struktura exonu 33. Pozice substituce Thr588Thr je vyznačena tučně, záměna nukleotidu je zvýrazněna červenou kurzívou.

Obrázek 4: Sekvenční struktura intronu 32. Pozice polymorfismu I32T15375C je vyznačena červenou kurzívou.

Obrázek 5: Sekvenční struktura intronu 39. Pozice substituce I39C17332G je vyznačena červenou kurzívou.

na základě přítomnosti oblasti multi ligand binding region 2. Sekvence použitých primerů jsou následující: G1-1 CATCCGTCAAGGTGCGTCG a G1-2 CCTGCCCTGGTCTTTTCCC produkující 350bp dlouhý amplikon zahrnující exon 31; G2-1 CTGGAGTCTGGGCTGTGAG a G2-2 GTGTTCTGCTTGTGTCTGGG primery syntetizující produkt o velikosti 660bp obsahující exon 32; G3 1 CCAGACACAAGCAGAACACT a G3-2 CTGAGAGCAAGGGACAAGA zaměřené na 402bp dlouhý region s obsaženým exonem 33; G4-1 TCAACCTGGGAACCTGGAG a G4-2 CAGCATCGCCTTTAGCACC, které produkují 662bp dlouhý PCR produkt zahrnující exony 34 a 35; G5-1 TTCCTGCCTCCATTACT GC a G5-2 AACAGCCAACTCATCCGAC amplifikující oblast o velikosti 426bp obsahující exony 36 a 37; a poslední pár primerů G6-1 GGTGCTACTGGTTTCCCTGG a G62 TCTGTTCTCCTTGGCTCC GC vymezující 645bp dlouhý úsek DNA s exony 38, 39 a 40. Pro polymerázovou řetězovou reakci byla připravena reakční směs o finálním objemu 50 µl. Složení reakční směsi bylo následující: 100 ng genomické DNA, 25 µl Taq PCR MasterMix (1000U) (QIAGEN) (tento mastermix obsahuje Taq polymerázu (5 U/µl), PCR Buffer, MgCl2 (1,5 mM), dNTPs (4 x 200 µM)) a 0,5 µl (50 pmol) každého primeru. c


PCR byla provedena v 35 opakujících se cyklech zahrnujících 0,5 min při 95◦ C, 0,5 min při 59◦ C (systém G1)/ 58◦ C (systémy G2, G4 a G6)/ 57◦ C (systém G3)/ 53◦ C (systém G5), a 1 min při 72◦ C. Získané produkty byly elektroforeticky ověřeny na 2% agarózovém gelu. Sekvenční analýza PCR amplikonů genu COL1A1 byla provedena metodou automatického kapilárního sekvenoR vání. V této studii byl použit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technologies Corporation, USA). Získaná data byla porovnávána s odpovídajícími segmenty genu COL1A1 zdravé populace použitím PC proR gramů DNA Baser a SeqScape Software for Mutation Profiling v2.7. Identifikované změny DNA byly následně porovnávány s databází OMIM.

3

Výsledky

Prostřednictvím molekulárně genetických analýz byly odhaleny mutace u tří z pětadvaceti českých OI pacientů. Změny byly nalezeny jak v kódujících, tak v nekódujících oblastech DNA, konkrétně v exonech 31 a 33 a intronech 32 a 39 (Tab. 1, Obr. 1). EJBI – Ročník 8 (2012), číslo 5

cs34


Substituce glycinu cysteinem na pozici 526 exonu 31 (Obr. 2) byla odhalena v DNA vzorku pacienta postiženého třetím typem OI (viz. kapitolu 3.1.1). Jedná se o mutaci běžně se vyskytující u této formy choroby. Poprvé byla popsána v roce 1989 (Starman et al.) [14]. Další mutace kódující sekvence byla odhalena u pacientů s diagnózou osteogenesis imperfecta typ IA (viz. kapitolu 3.1.2) a IVB (viz. kapitolu 3.1.3) (Obr. 3). V obou případech se jedná o tichou mutaci threoninu na pozici 588 exonu 33. U těchto pacientů byly dále identifikovány změny v oblastech intronů 32 (Obr. 4) a 39 (Obr. 5).

3.1

Kazuistika

3.1.1

Osteogenesis imperfecta typ III

Prvním popisovaným případem je 23letá žena narozená z druhé gravidity nepostižených rodičů. Porod byl proveden císařským řezem, následně musel být novorozenec resuscitován. Porodní hmotnost byla 2450g, porodní délka byla 45cm. Diagnóza byla stanovena ihned po narození pacientky.

mobilní klouby. U pacientky nebyla stanovena ani nedoslýchavost ani dentinogenesis imperfecta. Během porodu došlo ke zlomeninám obou femurů, rentgenové snímky však dále odhalily zhojené zlomeniny žeber a levé klíční kosti z prenatálního období. Pacientka utrpěla během dětství a dospívání četné zlomeniny kostí, především dlouhých kostí končetin. Poslední fraktura – zlomenina pravé klavikuly, byla zaznamenána v 19 letech. Pacientka začala chodit až ve věku 6 let a to pouze s pomocí ortéz dolních končetin, od jedenácti let je upoutána na invalidní vozík. Osteoporóza byla diagnostikována radiologickým vyšetřením kostry ve věku 15 a následně potvrzena ve věku 18 let. Snížení denzity kostní hmoty (BMD) bylo zároveň prokázáno denzitometrickým vyšetřením. Antropologickým a rentgenologickým vyšetřením byly u pacienta potvrzeny následující klinické projevy onemocnění: soudkový tvar hrudníku, deformovaná žebra, pectus carinatum, vážná skolióza, platyspondylie hrudních obratlů, vyšší těla bederních obratlů, bikonkávní tvar obratlů hrudní a bederní páteře, deformace lebečních kostí, angulace pravého předloktí a femurů, šavlovité deformace humerů a tibií a zkrácené femury. Metafýzi a epifýzy kostí v oblasti kolenních kloubů vykazují „popcornovou“ strukturu (Obr. 6), tedy znak typický pro třetí typ této choroby. Medikamentózní léčba, konkrétně kalcitoninem, byla zahájena ve věku 7 let. O sedm let později byla u pacienta zavedena léčba bisfosfonáty. Součástí léčby je dále suplementace kalcia a vitaminu D3. Od věku dvou let podstoupila pacientka několik chirurgických zákroků (korekční osteotomie s nitrodřeňovou fixací). Součástí komplexní léčby byla ve věku od 6 do 16 let léčba ortotická. Molekulárně-genetické vyšetření identifikovalo mutaci typickou pro tento typ OI – Gly526Cys. Další analýzy odhalily u pacientky mutaci genu MTHFR (A1298C), jejímž důsledkem je zvýšená srážlivost krve. 3.1.2

Osteogenesis imperfecta typ IA

Druhým případem je 22letý muž postižený prvním typem onemocnění. Pacient se narodil z třetího těhotenství zdravého páru. Porodní hmotnost byla 2800g, porodní délka byla 50cm.

Obrázek 6: „Popcornová“ struktura epifýzy femuru pacienta s diagnózou třetího typu OI.

Obrázek 7: Světle modré zbarvení bělma u pacienta postiženého OI typem IA.

Klinické znaky prezentované u tohoto jedince jsou Pacient má modrý kolorit sklér (Obr. 7) a trpí nemodré skléry, trigonocefalie, hyperbrachycefalie, wormian- doslýchavostí a tinnitem. Na kůži obličeje, krku a hrudské kůstky v lebečních švech, mírný exoftalmus a hyper- níku lze pozorovat četné lentigines. Dalšími klinickými EJBI – Ročník 8 (2012), číslo 5

c


cs35


znaky jsou štíhlý hrudník s úzkými vertikálně postavenými žebry, vysoké patro, ochablé svalstvo, hypermobilní klouby a asymetrická ramena. První zlomeninu prodělal ve věku 2 let, další v 9 letech (fraktura hrudních obratlů), v 11 letech (fraktura obou loketních kostí) a v 15 letech života (fraktura druhého metakarpu pravé ruky). Rentgenové snímky zobrazují deformity páteře – napřímení hrudní kyfózy, oploštění bederní lordózy, platyspondylie hrudních obratlů a mírná skolióza. Dlouhé kosti dolních končetin vykazují mírné deformace a pacient má zkrácený čtvrtý a pátý paprsek nohou. Denzitometrické vyšetření prokázalo sníženou minerální denzitu kostí vzhledem k danému kalendářnímu věku (Z-skóre je nižší než -2,0). Pacient je léčen bisfosfonáty, kalciem a vitaminem D3 a podstoupil několik operací zahrnujících nitrodřeňovou fixaci Kirschnerovými dráty a tympanotomii.

kloubní hypermobilita, zkrácený trup a dolní končetiny a časté bolesti zad. Ve věku dvou let prodělala četné zlomeniny zejména kostí dolních končetin. Poslední fraktura byla zaznamenána ve věku 14 let. Radiologická vyšetření prokazují přítomnost bikonkávních obratlů hrudní a bederní páteře, šavlovité deformity tibií (Obr. 8) a pravého femuru, varózní krčky kostí stehenních a valgózní paty. Medikamentózní léčba bisfosfonáty byla u pacientky zavedena ve věku 42 let. Současně je léčena vitaminem D3. Pacientka podstoupila pouze jeden chirurgický zákrok ve věku 47 let, konkrétně korekční operaci levého femuru. V současnosti se pohybuje s pomocí invalidního vozíku či francouzských holí a používá kolenní ortézu. Další molekulárně genetická vyšetření odhalila přítomnost heterozygotní mutace v genu MTHFR (A1298C) a dále homozygotní mutace 7TA/7TA genu UGT 1A1, která se projevuje tzv. Gilbertovým syndromem. 3.1.3 Osteogenesis imperfecta typ IVB Zajímavá je zároveň rodinná anamnéza pacientky, neboť manžel a dcera jsou postiženi syndromem Charcot V posledním případě se jedná o 53letou ženu posti- Marie Tooth v kombinaci s diabetickou neuropatií. Dcera ženou čtvrtým typem osteogenesis imperfecta. Jedná se pacientky vykazuje dále svalovou atrofii, křeče a parestezii o první dítě narozené v rodině bez známek zvýšené fragi- dolních končetin. lity kostí. Porodní antropometrické parametry pacienta byly 2840g a 47cm.

4

Diskuze

Osteogenesis imperfecta je vysoce heterogenní onemocnění s molekulárně genetickou podstatou v mutacích genů kolagenu typ I. Klinický obraz postižených pacientů vykazuje značné rozdíly jak mezi jednotlivými typy nemoci, tak v rámci stejné formy onemocnění. V současnosti je ve světové literatuře popisováno několik korelací mezi pozicí mutace a jejím výsledným fenotypovým projevem. Obecně lze říci, že letální fenotyp mají za následek mutace lokalizované v C-oblasti alpha řetězců, substituce glycinu a nahrazení aminokyselinového zbytku aminokyselinou (amk) s rozvětveným postranním řetězcem. Tento fenotyp mají dále za následek mutace vedoucí v tzv. skipping exonů v 3´ oblasti genu COL1A1 (zejména exony 14, 20, 22, 27, 30, 44 a 47) a exonů nacházejících se 5´ k exonu 27 genu COL1A2 a mutace vytvářející nová střihová místa [8]. V rámci alpha řetězců byly vymezeny dvě oblasti (nazývané MLBR2 a MLBR3) v sekvenci alpha1 řetězce a osm oblastí alpha2 řetězce, jejichž mutace mají za následek především letální OI typ II nebo III. Naopak mutace prvních 200 amk zbytků, substituce glycinu v prvních 8590 amk zbytcích, nonsense mutace vytvářející tzv. STOP kodon a změny v N-terminální oblasti proteinu mají za výsledek především neletální klinický obraz [4, 8]. Závěrem lze říci, že mutace genu COL1A1 vedou obecně ve vážnější fenotypový projev onemocnění než muObrázek 8: Šavlovitá deformita levé tibie pacienta s diagnózou tace genu COL1A2. Nesmíme však zapomínat, že exprese OI typ IVB. mutací je kromě genetických faktorů dále ovlivňována např. nutričními či environmentálními změnami. Do této Pacientka má modré skléry, otosklerózu a trpí onemoc- studie bylo zahrnuto 25 českých pacientů postižených jedněním dentinogenesis imperfecta – druhou dentici ztra- nou z kolagenních forem osteogenesis imperfecta. Defektní tila již ve věku 20 let. Dalšími znaky jsou generalizovaná DNA byla odhalena u tří z těchto pacientů, přičemž se ve c



cs36


dvou z těchto případů jednalo o nové jednobodové mutace Poděkování či polymorfismy. Poděkování patří Mgr. Tomáši Pexovi a RNDr. MarSubstituce glycinu cysteinem na pozici 526 byla sta- kétě Zachové, Ph.D. za poskytnutí laboratorního zázemí novena u pacienta s třetím typem OI. Poprvé tuto mu- pro molekulárně genetické analýzy a MUDr. Olze Hudátaci popsal Starman et al. v roce 1989 na případu irác- kové za poskytnutí užitečných informací z hlediska klinického chlapce. Klinický obraz popisovaný u iráckého pro- kého popisu jednotlivých typů této choroby. Práce vznikla banda vykazuje shodné projevy onemocnění jako u čes- za podpory projektu CBI č IM06014 a projektem SVVkého pacienta. Oba jedinci mají modré skléry, defektní 2012-264 513 Univerzity Karlovy v Praze. tvorbu dentinu (avšak bez příznaků dentinogenesis imperfecta), deformované kosti, wormianské kosti a prodělali během porodu zlomeniny [14]. Substituovaný glycin Literatura se z hlediska lokalizace mutace v rámci alpha řetězců na[1] Alanay Y, Avaygan H, Camacho N, Utine GE, Boduroglu lézá v oblasti vazby integrinů. Změny v tomto úseku DNA K, et al. Mutations in the Gene Encoding the RER Protein FKBP65 Cause Autosomal-Recessive Osteogenesis Imperpostihují tvorbu intermolekulárních vazeb, a tudíž vedou fecta. The American Journal of Human Genetics. 2010 Apr; 86: k poklesu pevnosti kostní hmoty. Protože se jedná o nej551–559. frekventovanější mutaci v rámci třetí formy OI, můžeme předpokládat, že má tato substituce za následek vážné de[2] Barnes AM, Chang W, Morello R, Cabral WA, Weis M, Eyre DR, et al. Deficiency of cartilage associated protein in recesformace kostí. Mutace Thr588Thr byla identifikována u dvou pacientů postižených odlišnými formami OI – typem IA a IVB. I přesto vykazují oba pacienti shodné klinické rysy, jako například modrý kolorit sklér, nedoslýchavost, kloubní hypermobilitu či osteoporózu. I když tato mutace nepostihuje transkripci, může mít negativní vliv na následnou translaci a tvorbu mezimolekulárních vazeb s proteinem chrupavkové matrix (COMP), který se váže k molekule kolagenu typ I v oblasti definované kodony 582-638. Lze předpokládat, že „tiché“ mutace v místech vazeb COMP mohou být jedním ze signálů budoucího rozvoje osteopenie a osteoporózy. Zatím se však jedná pouze o spekulaci. V současnosti není tato identifikovaná změna DNA popisována v žádné zahraniční literatuře. Oba polymorfismy (I32T15375C, I39C17332G), identifikované v rámci této studie, byly nalezeny u pacientů se substitucí Thr588Thr exonu 33. Žádná z těchto změn nevede ani k tvorbě STOP kodonů, ani k produkci prodlouženého či zkráceného produktu důsledkem vzniku nových míst střihu. Z toho lze soudit, že nepostihují tvorbu kolagenu typ I. Tyto polymorfismy nebyly doposud popsány v žádné zahraniční literatuře.

5

Závěr

V současnosti probíhá shromažďování dalšího biologického materiálu (venózní krev, kostní tkáň, embryonální tkáň) českých pacientů s diagnózou osteogenesis imperfecta typu I-IV pro navazující molekulárně genetické analýzy ostatních kódujících oblastí genu COL1A1. Pro tyto analýzy je plánováno použití High Resolution Melting analýzy a technologie Sangerova sekvenování. Studie bude provedena ve spolupráci s molekulárně genetickou laboratoří Centre for Medical Genetics, Univerzita Antverpy, Edegem, Belgie. EJBI – Ročník 8 (2012), číslo 5

sive lethal osteogenesis imperfecta. New Eng J Med. 2006; 355: 2757-2764. [3] Becker J, Semler O, Gilissen C, Li Y, Bolz HJ et al. Exome Sequencing Identifies Truncating Mutations in Human SERPINF1 in Autosomal-Recessive Osteogenesis Imperfecta. The American Journal of Human Genetics. 2011 Mar; 88: 362–371. [4] Cabral WA, Chang W, Barnes AM, Wies MA Scott MA, Leikin S, et al. Prolyl 3-hydroxylase 1 causes a recessive metabolic bone disorder resembling lethal/severe osteogenesis imperfecta. Nat Genet. 2007 Mar; 39(3): 359-365. [5] Forlino A, Cabral WA, Barnes AV, Marini JC. New perspectives on osteogenesis imperfecta. Nat. Rev. Endocrinol. 2011; 7: 540–557. [6] Ghosh AK. Factors Involved in the Regulation of Type I Collagen Gene Expression: Implication in Fibrosis. Exp. Biol. Med. 2002; 227: 301-314. [7] Kashyap RR, Gopakumar R, Gogineni SB, Sreejan CK. Osteogenesis imperfecta type IV. Kerala Dental Journal. 2009 Jan; 32(1): 47-49. [8] Marini JC, et al. Consortium for Osteogenesis Imperfecta Mutations in the Helical Domain of Type I Collagen: Regions Rich in Lethal Mutations Align With Collagen Bonding Site for Integrins and Proteoglycans. Human Mutation. 2007; 28(3): 209-221. [9] Marini JC. Osteogenesis imperfecta. 2010. Available at: http://www.endotext.org/parathyroid/parathyroid17 /parathyroid17.pdf. (Revised 1 March 2010). [10] Marini JC, Cabral WA, Barnes AM. Null mutations in LEPRE1 and CRTAP cause severe recessive osteogenesis imperfecta. Cell Tissue Res. 2010 Jan; 339(1): 59–70. [11] Niyibizi C, Wang S, Mi Z, Robbins PD. Gene therapy approaches for osteogenesis imperfecta. Gene Therapy. 2004; 11: 408-416. [12] Roughley PJ, Rauch F, Glorieux FH. Osteogenesis imperfecta – clinical and molecular diversity. European Cells and Materials. 2003; 5: 41-47. [13] Sorin H, Cornel C, Cristian CG, Iuliana P. Osteogenesis imperfecta: forensic assessment of traumatic injuries. Case report and literature review. Rom J Leg Med. 2008; 16 (4): 275 – 282.

c



[14] Starman BJ, Eyre D, Charbonneau H, Harrylock M, Weis MA, Weiss L, Graham JM, Byers PH. The position of substitution for glycine by cysteine in the triple helical domain of the proalpha1(I) chains of type I collagen determines the clinical phenotype. J. Clin. Invest. 1989; 84:1206–1214. [15] Sweeney SM, Orgel JP, Fertala A, McAuliffe JD, Turner KR, Di Lullo GA, et al. Candidate cell and matrix interaction domains on the collagen fibril, the predominant protein of vertebrates. J Biol Chem. 2008 Jul 25; 283(30): 21187-21197. [16] Ward LM, Rauch F, Travers R, Chabot G, Szout EM, La-

c


cs37 lic L, Roughley PJ, Glorieux FH. Osteogenesi imperfecta type VII: an autosomal recessive form of brittle bone disease. Bone. 2002; 31: 12-18. [17] Wollina U, Koch A. Osteogenesis imperfecta type I and psoriasis – a report on two cases. Egyptian Dermatology Online Journale. 2006 Jun; 2(1): 15. [18] Yang Z, Zeng C, Wang Z, Shi HJ, Wang LT. Mutation characteristics in type I collagen genes in Chinese patients with osteogenesis imperfecta. Genetics and Molecular Research. 2011; 10 (1): 177-185.


Analýza mutací genu COL1A1 českých pacientů s diagnózou osteogenesis imperfecta, typ I-IV

Recommend Documents