ANALISIS TOKSIKOLOGI FORENSIK
Buku Ajar
disusun oleh: Dr.rer.nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, Apt., M.Si. JURUSAN FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA BUKIT JIMBARAN
KATA PENGANTAR Dengan mengucapkan syukur ”Om Awighnam Astu Nahma Sidham” semoga tiada aral yang melintang dan memperoleh wara nugraha Ida Sang Hyang Widhi Wasa. Bahan ajar ini disusun agar dapat memperkaya literatur dan memberi gambaran tentang Analisis Toksikologi Forensik. Analisis toksikologi forensik adalah integrasi berbagai disiplin ilmu diantaranya kimia analisis dan prinsipprinsip dasar toksikologi, yang mencangkup aplikasi dan telaah tentang racun, yang berhubungan dengan tindakan melawan hukum ”kriminal”. Pada tulisan ini diawali dengan sub bahasan: ”Pengantar Menuju Ilmu Forensik” yang menjelaskan definisi forensic science dan bidang ilmu yang tercangkup dalam forensik sains, kemudian dilanjutkan dengan sub bahasan ”Pengantar Toksikologi” yang memberi gambaran tentang pengertian ilmu toksikologi dan sejarah perkembangan ilmu toksikologi. Agar mahasiswa lebih mengerti bagaimana tokson dapat menimbulkan efek keracunan pada sub bahasan berikutnya dibahas ”Fase Kerja Toksik”. Sub bahasan ”Analisis Toksikologi Forensik” dibahas dalam bab IV, karena sebagaian besar sampel analisis toksikologi merupakan materi biologi, maka dalam bab berikutnya dibahas sifat dan cara penanganan materi biologi dalam analisis toksikologi. Bab berikutnya membahas metode analisis yang digunakan dalam penyelenggaraan analisis toksikologi forensik. Sangat disadari tulisan ini masih jauh dari sempurna, namun langkah/usaha sekecil apapun akan sangat berarti sebagai daya awal untuk langkah yang lebih besar. Menyadari hal tersebut penulis sangat mengharapkan masukan dan saran, dari berbagai pihak guna menyempurnakan materi ini. Saran dan masukan dapat dialamatkan ke penulis Jimbaran, Juli 2008 Hormat kami ttd Penulis
Pengantar Menuju Ilmu Forensik
1
DAFTAR ISI
BAB I 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. BAB II 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. BAB III 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. BAB IV 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. BAB V 5.1. 5.2. 5.3. BAB VI 6.1. 6.2. 6.3. BAB VIII 7.1. 7.2. 7.3. 7.4. 7.5. 7.6.
halaman PENGANTAR MENUJU ILMU FORENSIK …………………………………………………… Pengantar ………………………………………………………………………………………… Ruang Lingkup Ilmu Forensik …………………………………………………………………... Peran ilmu forensik dalam penyelesaian kasus kejahatan ......... …………………………... Langkah-langkah Penyidikan ....................................................... …………………………. PENGANTAR TOKSIKOLOGI ...................................................... …………………………. Perkembangan Awal Toksikologi ................................................. …………………………. Pengertian Toksikologi dan Racun ........................................... ………………………….... Cakupan dan Subdisiplin Toksikologi ...................................... …………………………... Perkembangan Mutahir Toksikologi ......................................... …………………………... Prospek Masa Depan ................................................................ ………………………….. FASE KERJA TOKSIK ............................................................. ………………………….... Fase eksposisi ......................................................................... …………………………... Fase toksokinetik ................................................................... …………………………….. Fase Toksodinamik .................................................................. …………………………... Pemodelan Farmakokinetik ...................................................... …………………………... Parameter Farmakokinetik ...................................................... ………………………….... Biotransformasi (metabolisme) ................................................ …………………………... ANALISIS TOKSIKOLOGI FORENSIK .................................... ………………………….... Pendahuluan ................................................................................ ………………………... Bilamana memerlukan pemeriksaan toksikologik ........................ ………………………... Langkah-langkah analisis toksikologi forensik ............................. ………………………... Interpretasi temuan analisis ......................................................... ………………………... Kesimpulan .................................................................................. ………………………... CAIRAN BIOLOGI ....................................................................... ………………………... Sifat Beberapa Cairan Biologik Tertentu ..................................... ………………………... Pengambilan Sampel ………………………...………………………...………………………. Faktor-Faktor yang harus diperhatikan dalam Analisis obat dalam cairan biologi .......... REAKSI WARNA ......................................................................... ………………………... Interpretasi reaksi warna ............................................................. ………………………... Faktor Teknis ............................................................................... ………………………... Beberapa Reaksi Warna .............................................................. ………………………... KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS .................................................. ………………………... Fase Diam ................................................................................... ………………………... Penotolan sampel .......................................................................... ………………………... Sistem pelarut ................................................................................ ………………………... Pengembangan .............................................................................. ………………………... Deteksi Noda ................................................................................. ………………………... Faktor-faktor yang perlu diperhatikan pada KLT ........................... ………………………...
Pengantar Menuju Ilmu Forensik
1 1 2 4 5 9 9 10 12 13 14 16 16 16 21 21 23 24 31 31 31 32 35 39 41 41 43 43 46 46 46 46 50 51 52 52 52 53 54 2
BAB VIII 8.1. 8.2. 8.3. 8.4. 8.5. BAB IX 9.1. 9.2. BAB X 10.1. 10.2. 10.3. 10.4. 10.5. BAB XI 11.1. 11.2. 11.3. 11.4. 11.5. 11.6. 11.7.
PENGGUNAAN KROMATOGRAFI GAS DALAM ANALISIS TOKSIKOLOGI ................. Parameter Retensi ...................................................................... ………………………... Peralatan ..................................................................................... ………………………... Analisis Kualitatif ......................................................................... ………………………... Analisis Kuantitatif ....................................................................... ………………………... Derivatisasi Pada Kromatograti Gas Cair ..................................... ………………………... PENGGUNAAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (HPLC) DALAM ANALISIS TOKSIKOLOGI ................................. ………………………...………………………............ Pemilihan Sistem HPLC .............................................................. ………………………... Analisis Obat ............................................................................... ………………………... APLIKASI SPEKTROMETRI MASSA DALAM ANALISIS PENYALAHGUNAAN OBAT .. Pendahuluan .............................................................................. ………………………... Aliran Analit/Sampel dalam MS ................................................... ………………………... Sistem Pengumpulan Data dan Penampilannya ......................... ………………………... Kepustakaan Spektrum Massa ................................................... ………………………... Analisis Beberapa Kelompok Obat ............................................. ………………………... APLIKASI SPEKTROSFOTOMETRI INFRA MERAH DALAM ANALISIS TOKSIKOLOGI Pendahuluan ............................................................................. ………………………... Hubungan spektra IR dengan struktur molekul ......................... ………………………... Instrumen .................................................................................. ………………………... Teknik Sampling Pada IR ......................................................... ………………………... Berbagai Teknik Yang Dikombinasikan Dengan Spektroskopi IR ……………………… Penerjemahan Spektrum IR ....................................................... ………………………... Spektrum IR obat-obatan yang sering disalahgunakan ............. ………………………...
Pengantar Menuju Ilmu Forensik
55 55 55 57 57 58 60 60 64 66 66 66 66 67 68 73 73 73 74 75 77 78 78
3
BAB I PENGANTAR MENUJU ILMU FORENSIK
1.1. Pengantar Forensik biasanya selalu dikaitkan dengan tindak pinada (tindak melawan hukum). Dalam buku-buku ilmu forensik pada umumnya ilmu forensik diartikan sebagai penerapan dan pemanfaatan ilmu pengetahuan tertentu untuk kepentingan penegakan hukum dan keadilan. Dalam penyidikan suatu kasus kejahatan, observasi terhadap bukti fisik dan interpretasi dari hasil analisis (pengujian) barang bukti merupakan alat utama dalam penyidikan tersebut. Tercatat pertama kali pada abad ke 19 di Perancis Josep Bonaventura Orfila pada suatu pengadilan dengan percobaan keracunan pada hewan dan dengan buku toksikologinya dapat meyakinkan hakim, sehingga menghilangkan anggapan bahwa kematian akibat keracunan disebabkan oleh mistik. Pada pertengahan abad ke 19, pertama kali ilmu kimia, mikroskopi, dan fotografi dimanfaatkan dalam penyidikan kasus kriminal (Eckert, 1980). Revolusi ini merupakan gambaran tanggungjawab dari petugas penyidik dalam penegakan hukum. Alphonse Bertillon (1853-1914) adalah seorang ilmuwan yang pertamakali secara sistematis meneliti ukuran tubuh manusia sebagai parameter dalam personal indentifikasi. Sampai awal 1900-an metode dari Bertillon sangat ampuh digunakan pada personal indentifikasi. Bertillon dikenal sebagai bapak identifikasi kriminal (criminal identification). Francis Galton (1822-1911) pertama kali meneliti sidik jari dan mengembangkan metode klasifikasi dari sidik jari. Hasil penelitiannya sekarang ini digunakan sebagai metode dasar dalam personal identifikasi. Leone Lattes (1887-1954) seorang profesor di institut kedokteran forensik di Universitas Turin, Itali. Dalam investigasi dan identifikasi bercak darah yang mengering „a dried bloodstain”, Lattes menggolongkan darah ke dalam 4 klasifikasi, yaitu A, B, AB, dan O. Dasar Pengantar Menuju Ilmu Forensik
klasifikasi ini masih kita kenal dan dimanfaatkan secara luas sampai sekarang. Dalam perkembangan selanjutnya semakin banyak bidang ilmu yang dilibatkan atau dimanfaatkan dalam penyidikan suatu kasus kriminal untuk kepentingan hukum dan keadilan. Ilmu pengetahuan tersebut sering dikenal dengan Ilmu Forensik. Saferstein dalam bukunya “Criminalistics an Introduction to Forensic Science” berpendapat bahwa ilmu forensik ”forensic science“ secara umum adalah „the application of science to law”. Ilmu Forensik dikatagorikan ke dalam ilmu pengetahuan alam dan dibangun berdasarkan metode ilmu alam. Dalam padangan ilmu alam sesuatu sesuatu dianggap ilmiah hanya dan hanya jika didasarkan pada fakta atau pengalaman (empirisme), kebenaran ilmiah harus dapat dibuktikan oleh setiap orang melalui indranya (positivesme), analisis dan hasilnya mampu dituangkan secara masuk akal, baik deduktif maupun induktif dalam struktur bahasa tertentu yang mempunyai makna (logika) dan hasilnya dapat dikomunikasikan ke masyarakat luas dengan tidak mudah atau tanpa tergoyahkan (kritik ilmu) (Purwadianto 2000). Dewasa ini dalam penyidikan suatu tindak kriminal merupakan suatu keharusan menerapkan pembuktian dan pemeriksaan bukti fisik secara ilmiah. Sehingga diharapkan tujuan dari hukum acara pidana, yang menjadi landasan proses peradilan pidana, dapat tercapai yaitu mencari kebenaran materiil. Tujuan ini tertuang dalam Keputusan Menteri Kehakiman No.M.01.PW.07.03 tahun 1983 yaitu: untuk mencari dan mendapatkan atau setidaktidaknya mendekati kebanaran materiil, ialah kebenaran yang selengkap-lengkapnya dari sutau perkara pidana dengan menerapkan ketentuan hukum acara pidana secara jujur dan tepat dengan tujuan untuk mencari siapakah pelaku yang dapat didakwakan melakukan suatu pelanggaran hukum, dan selanjutnya meminta pemeriksaan dan putusan dari pengadilan guna menemukan apakah terbukti 4
bahwa suatu tindak pidana telah dilakukan dan apakah orang yang didakwa itu dapat dipersalahkan. Adanya pembuktian ilmiah diharapkan polisi, jaksa, dan hakim tidaklah mengandalkan pengakuan dari tersangka atau saksi hidup dalam penyidikan dan menyelesaikan suatu perkara. Karena saksi hidup dapat berbohong atau disuruh berbohong, maka dengan hanya berdasarkan keterangan saksi dimaksud, tidak dapat dijamin tercapainya tujuan penegakan kebenaran dalam proses perkara pidana dimaksud. Dalam pembuktian dan pemeriksaan secara ilmiah, kita mengenal istilah ilmu forensik dan kriminologi. Secara umum ilmu forensik dapat diartikan sebagai aplikasi atau pemanfaatan ilmu pengetahuan tertentu untuk kepentingan penegakan hukum dan keadilan. 1.2. Ruang Lingkup Ilmu Forensik Ilmu-ilmu yang menunjang ilmu forensik adalah ilmu kedokteran, farmasi, kimia, biologi, fisika, dan psikologi. Sedangkan kriminalistik merupakan cabang dari ilmu forensik. Cabang-cabang ilmu forensik lainnya adalah: kedokteran forensik, toksikologi forensik, odontologi forensik, psikiatri forensik, entomologi forensik, antrofologi forensik, balistik forensik, fotografi forensik, dan serologi / biologi molekuler forensik. Biologi molekuler forensik lebih dikenal dengan ”DNAforensic”. Kriminalistik merupakan penerapan atau pemanfaatan ilmu-ilmu alam pada pengenalan, pengumpulan / pengambilan, identifikasi, individualisasi, dan evaluasi dari bukti fisik, dengan menggunakan metode / teknik ilmu alam di dalam atau untuk kepentingan hukum atau peradilan (Sampurna 2000). Pakar kriminalistik adalah tentunya seorang ilmuwan forensik yang bertanggung jawab terhadap pengujian (analisis) berbagai jenis bukti fisik, dia melakukan indentifikasi kuantifikasi dan dokumentasi dari bukti-bukti fisik. Dari hasil analisisnya kemudian dievaluasi, diinterpretasi dan dibuat sebagai laporan (keterangan ahli) dalam atau untuk kepentingan hukum atau peradilan (Eckert 1980). Sebelum melakukan tugasnya, seorang kriminalistik harus mendapatkan pelatihan atau pendidikan dalam penyidikan tempat kejadian perkara yang Pengantar Menuju Ilmu Forensik
dibekali dengan kemampuan dalam pengenalan dan pengumpulan bukti-bukti fisik secara cepat. Di dalam perkara pidana, kriminalistik sebagaimana dengan ilmu forensik lainnya, juga berkontribusi dalam upaya pembuktian melalui prinsip dan cara ilmiah. Kriminalistik memiliki berbagai spesilisasi, seperti analisis (pengujian) senjata api dan bahan peledak, pengujian perkakas (”toolmark examination”), pemeriksaan dokumen, pemeriksaan biologis (termasuk analisis serologi atau DNA), analisis fisika, analisis kimia, analisis tanah, pemeriksaan sidik jari laten, analisis suara, analisis bukti impresi dan identifikasi. Kedokteran Forensik adalah penerapan atau pemanfaatan ilmu kedokteran untuk kepentingan penegakan hukum dan pengadilan. Kedokteran forensik mempelajari hal ikhwal manusia atau organ manusia dengan kaitannya peristiwa kejahatan. Di Inggris kedokteran forensik pertama kali dikenal dengan ”Coroner”. Seorang coroner adalah seorang dokter yang bertugas melalukan pemeriksaan jenasah, melakukan otopsi mediko legal apabila diperlukan, melakukan penyidikan dan penelitian semua kematian yang terjadi karena kekerasan, kemudian melalukan penyidikan untuk menentukan sifat kematian tersebut. Di Amerika Serikan juga dikenal dengan ”medical examinar”. Sistem ini tidak berbeda jauh dengan sistem coroner di Inggris. Dalam perkembangannya bidang kedokteran forensik tidak hanya berhadapan dengan mayat (atau bedah mayat), tetapi juga berhubungan dengan orang hidup. Dalam hal ini peran kedokteran forensik meliputi: − melakukan otopsi medikolegal dalam pemeriksaan menyenai sebab-sebab kematian, apakah mati wajar atau tidak wajar, penyidikan ini juga bertujuan untuk mencari peristiwa apa sebenarnya yang telah terjadi, − identifikasi mayat, − meneliti waktu kapan kematian itu berlansung ”time of death” − penyidikan pada tidak kekerasan seperti kekerasan seksual, kekerasan terhadap anak dibawah umur, kekerasan dalam rumah tangga, − pelayanan penelusuran keturunan, 2
− di negara maju kedokteran forensik juga menspesialisasikan dirinya pada bidang kecelakaan lalu lintas akibat pengaruh obatobatan ”driving under drugs influence”. Bidang ini di Jerman dikenal dengan ”Verkehrsmedizin” Dalam prakteknya kedokteran forensik tidak dapat dipisahkan dengan bidang ilmu yang lainnya seperti toksikologi forensik, serologi / biologi molekuler forensik, odontologi forensik dan juga dengan bidang ilmu lainnya Toksikologi Forensik, Toksikologi adalah ilmu yang menelaah tentang kerja dan efek berbahaya zat kimia (racun) terhadap mekanisme biologi. Racun adalah senyawa yang berpotensial memberikan efek berbahaya terhadap organisme. Sifat racun dari suatu senyawa ditentukan oleh: dosis, konsentrasi racun di reseptor, sifat zat tersebut, kondisi bioorganisme atau sistem bioorganisme, paparan terhadap organisme dan bentuk efek yang ditimbulkan. Lebih khusus, toksikologi mempelajari sifat fisiko kimia dari racun, efek psikologi yang ditimbulkannya pada organisme, metode analisis racun baik kualitativ maupun kuantitativ dari materi biologik atau non biologik, serta mempelajari tindakan-tidankan pencegahan bahaya keracunan. LOOMIS (1978) berdasarkan aplikasinya toksikologi dikelompokkan dalam tiga kelompok besar, yakni: toksikologi lingkungan, toksikologi ekonomi dan toksikologi forensik. Tosikologi forensik menekunkan diri pada aplikasi atau pemanfaatan ilmu toksikologi untuk kepentingan peradilan. Kerja utama dari toksikologi forensik adalah analisis racun baik kualitatif maupun kuantitatif sebagai bukti dalam tindak kriminal (forensik) di pengadilan. Toksikologi forensik mencangkup terapan ilmu alam dalam analisis racun sebagi bukti dalam tindak kriminal. Toksikologi forensik merupakan gabungan antara kimia analisis dan prinsip dasar toksikologi. Bidang kerja toksikologi forensik meliputi: − analisis dan mengevaluasi racun penyebab kematian, − analisis ada/tidaknya alkohol, obat terlarang di dalam cairan tubuh atau napas, yang dapat mengakibatkan perubahan prilaku (menurunnya kemampuan mengendarai kendaraan bermotor di jalan raya, tindak Pengantar Menuju Ilmu Forensik
kekerasan dan kejahatan, penggunaan dooping), − analisis obat terlarang di darah dan urin pada kasus penyalahgunaan narkotika dan obat terlarang lainnya. Odontologi Forensik, bidang ilmu ini berkembang berdasarkan pada kenyataannya bahwa: gigi, perbaikan gigi (dental restoration), dental protese (penggantian gigi yanng rusak), struktur rongga rahang atas “sinus maxillaris”, rahang, struktur tulang palatal (langit-langit keras di atas lidah), pola dari tulang trabekula, pola penumpukan krak gigi, tengkuk, keriput pada bibir, bentuk anatomi dari keseluruhan mulut dan penampilan morfologi muka adalah stabil atau konstan pada setiap individu. Berdasarkan kharkteristik dari hal tersebut diatas dapat dijadikan sebagai acuan dalam penelusuran identitas seseorang (mayat tak dikenal). Sehingga bukit peta gigi dari korban, tanda / bekas gigitan, atau sidik bibir dapat dijadikan sebagai bukti dalam penyidikan tindak kejahatan. Psikiatri forensik, seorang spikiater berperan sangat besar dalam bebagai pemecahan masalah tindak kriminal. Psikogram dapat digunakan untuk mendiagnose prilaku, kepribadian, dan masalah psikis sehingga dapat memberi gambaran sikap (profile) dari pelaku dan dapat menjadi petunjuk bagi penyidik. Pada kasus pembunuhan mungkin juga diperlukan otopsi spikologi yang dilakukan oleh spikiater, spikolog, dan patholog forensik, dengan tujuan penelaahan ulang tingkah laku, kejadian seseorang sebelum melakukan tindak kriminal atau sebelum melakukan bunuh diri. Masalah spikologi (jiwa) dapat memberi berpengaruh atau dorongan bagi seseorang untuk melakukan tindak kejahatan, atau perbuatan bunuh diri. Entomologi forensik, Entomologi adalah ilmu tentang serangga. Ilmu ini memperlajari jenisjenis serangga yang hidup dalam fase waktu tertentu pada suatu jenasah di tempat terbuka. Berdasarkan jenis-jenis serangga yang ada sekitar mayat tersebut, seorang entomolog forensik dapat menduga sejak kapan mayat tersebut telah berada di tempat kejadian perkara (TKP). Antrofologi forensik, adalah ahli dalam mengidentifikasi sisa-sisa tulang, tengkorak, dan 3
mumi. Dari penyidikannya dapat memberikan informasi tentang jenis kelamin, ras, perkiraan umur, dan waktu kematian. Antrofologi forensik mungkin juga dapat mendukung dalam penyidikan kasus orang hidup, seperti indentifiksi bentuk tengkorak bayi pada kasus tertukarnya anak di rumah bersalin. Balistik forensik, bidang ilmu ini sangat berperan dalam melakukan penyidikan kasus tindak kriminal dengan senjata api dan bahan peledak. Seorang balistik forensik meneliti senjata apa yang telah digunakan dalam kejahatan tersebut, berapa jarak dan dari arah mana penembakan tersebut dilakukan, meneliti apakah senjata yang telah digunakan dalam tindak kejahatan masih dapat beroperasi dengan baik, dan meneliti senjata mana yang telah digunakan dalam tindak kriminal tersebut. Pengujian anak peluru yang ditemukan di TKP dapat digunakan untuk merunut lebih spesifik jenis senjata api yang telah digunakan dalam kejahatan tersebut. Pada bidang ini memerlukan peralatan khusus termasuk miskroskop yang digunakan untuk membandingkan dua anak peluru dari tubuh korban dan dari senjata api yang diduga digunakan dalam kejahatan tersebut, untuk mengidentifikasi apakah memang senjata tersebut memang benar telah digunakan dalam kejahatan tersebut. Dalam hal ini diperlukan juga mengidentifikasi jenis selongsong peluru yang tertinggal. Dalam penyidikan ini analisis kimia dan fisika diperlukan untuk menyidikan dari senjata api tersebut, barang bukti yang tertinggal. Misal analisis ditribusi logam-logam seperti Antimon (Sb) atau timbal (Pb) pada tangan pelaku atau terduga, untuk mencari pelaku dari tindak kriminal tersebut. Atau analisis ditribusi asap (jelaga) pada pakaian, untuk mengidentifikasi jarak tembak. Kerjasama bidang ini dengan kedokteran forensik sangat sering dilakukan, guna menganalisis efek luka yang ditimbulkan pada korban dalam merekonstruksi suatu tindak kriminal dengan senjata api. Serologi dan Biologi molekuler forensik, Seiring dengan pesatnya perkembangan bidang ilmu biologi molekuler (imunologi dan genetik) belakangan ini, pemanfaatan bidang Pengantar Menuju Ilmu Forensik
ilmu ini dalam proses peradilan meningkat dengan sangat pesat. Baik darah maupun cairan tubuh lainnya paling sering digunakan / diterima sebagai bukti fisik dalam tindak kejahatan. Seperti pada kasus keracunan, dalam pembuktian dugaan tersebut, seorang dokter kehakiman bekerjasama dengan toksikolog forensik untuk melakukan penyidikan. Dalam hal ini barang bukti yang paling sahih adalah darah dan/atau cairan tubuh lainnya. Toksikolog forensik akan melakukan analisis toksikologi terhadap sampel biologi tersebut, mencari senyawa racun yang diduga terlibat. Berdasarkan temuan dari dokter kehakiman selama otopsi jenasah dan hasil analisisnya, toksikolog forensik akan menginterpretasikan hasil temuannya dan membuat kesimpulan keterlibatan racun dalam tindak kejahatan yang dituduhkan. Sejak awal perkembanganya pemanfaatan serologi / biologi molekuler dalam bidang forensik lebih banyak untuk keperluan identifikasi personal (perunutan identitas individu) baik pelaku atau korban. Sistem penggolongan darah (sistem ABO) pertama kali dikembangkan untuk keperluan penyidikan (merunut asal dan sumber bercak darah pada tempat kejadian). Belakangan dengan pesatnya perkembangan ilmu genetika (analisi DNA) telah membuktikan, bahwa setiap individu memiliki kekhasan sidik DNA, sehingga kedepan sidik DNA dapat digunakan untuk menggantikan peran sidik jari, pada kasus dimana sidik jari sudah tidak mungkin bisa diperoleh. Dilain hal, analisa DNA sangat diperlukan pada penyidikan kasus pembunuhan mutilasi (mayat terpotongpotong), penelusuran paternitas (bapak biologis). Analisa serologi/biologi molekuler dalam bidang forensik bertujuan untuk: - Uji darah untuk menentukan sumbernya (darah manusia atau hewan, atau warna dari getah tumbuhan, darah pelaku atau korban, atau orang yang tidak terlibat dalam tindak kejahatan tersebut) - Uji cairan tubuh lainnya (seperti: air liur, semen vagina atau sperma, rambut, potongan kulit) untuk menentukan sumbernya (“origin”). 4
- Uji imonologi atau DNA individu untuk mencari identitas seseorang. 1.3. Peran ilmu forensik dalam penyelesaian kasus kejahatan Perdanakusuma (1984) mengelompokkan ilmu forensik berdasarkan peranannya dalam menyelesaikan kasus-kasus kriminal ke dalam tiga kelompok, yaitu: 1. Ilmu-ilmu forensik yang menangani tindak kriminal sebagai masalah hukum. Dalam kelompok ini termasuk hukum pidana dan hukum acara pidana. Kejahatan sebagai masalah hukum adalah aspek pertama dari tindak kriminal itu sendiri, karena kejahatan merupakan perbuatan-perbuatan yang melanggar hukum. 2. Ilmu-Ilmu forensik yang menangani tindak kriminal sebagai masalah teknis. Kejahatan dipandang sebagai masalah teknis, karena kejahatan dari segi wujud perbuatannya maupun alat yang digunakannya memerlukan penganan secara teknis dengan menggunakan bantuan diluar ilmu hukum pidana maupun acara pidana. Dalam kelompok ini termasuk ilmu kriminalistik, kedokteran forensik, kimia forensik, fisika forensik, toksikologi forensik, serologi/biologi molekuler forensik, odontologi forensik, dan entomogoli forensik. Pada umumnya suatu laboratorium kriminalistik mencangkup bidang ilmu kedokteran forensik, kimia forensik dan ilmu fisika forensik. Bidang kimia forensik mencangkup juga analisa racun (toksikologi forensik), sedangkan ilmu fisika forensik mempunyai cabang yang amat luas termasuk: balistik forensik, ilmu sidik jari, fotografi forensik. Apabila terjadi suatu kasus kejahatan, maka pada umumnya timbul pertanyaanpertanyaan seperti: − Peristiwa apa yang terjadi? − Di mana terjadinya? − Bilamana terjadinya? − Dengan alat apa dilakukannya? − Bagaimana melakukannya? − Mengapa perbuatan tersebut dilakukan? − Siapa yang melakukan? Pengantar Menuju Ilmu Forensik
Pertanyaan peristiwa apa yang terjadi adalah mencari jenis kejahatan yang terjadi, misalnya pembunuhan atau bunuh diri. Dengan bantuan ilmu kedokteran forensik atau bidang ilmu lainnya, dapat disimpulkan penyebabnya adalah bunuh diri. Oleh sebab itu penyidik tidak perlu melakukan penyidikan selanjutnya guna mencari siapa pelaku dari peristiwa tersebut, karena kematian diakibatkan oleh perbuatannya sendiri. 3. Ilmu-ilmu forensik yang menangani tindak kriminal sebagai masalah manusia. Dalam kelompok ini termasuk kriminologi, psikologi forensik, dan psikiatri/neurologi forensik. Kejahatan sebagai masalah manusia, karena pelaku dan objek penghukuman dari tindak kriminal tersebut adalah manusia. Dalam melakukan perbuatannya, manusia tidak terlepas dari unsur jasmani (raga) dan jiwa. Disamping itu, kodrat manusia sebagai mahluk sosial, yang hidup di tengah-tengah masyarakat. Oleh karena itu perbuatan yang dilakukan juga dipengaruhi oleh faktor internal (dorongan dari dalam dirinya sendiri) dan faktor eksternal (dipengaruhi oleh lingkungannya). Atas asas keadilan, dalam pemutusan sangsi dari tindak pidana, perlu ditelusuri faktorfaktor yang menjadi sebab seseorang itu melakukan kejahatan. Untuk itu perlu diteliti berbagai aspek yang menyangkut kehidupannya, seperti faktor kejiwaan, keluarga, dan faktor lingkungan masyarakatnya. Seseorang melakukan tindak kriminal mungkin didorong oleh latar belakang kejiwaannya, atau karena keadaan ekonomi keluarganya, ataupun karena pengaruh dari keadaan sosial masyarakatnya. Dalam hal ini peran serta kriminolog, psikolog forensik, dan psikiater forensik mempunyai peran penting dalam menyelesaikan kasus kejahatan. Berdasarkan klasifikasi diatas peran ilmu forensik dalam menyelesaikan masalah / kasuskasus kriminal lebih banyak pada penanganan kejahatan dari masalah teknis dan manusia. Sehingga pada umumnya laboratorium forensik dimanfaatkan untuk kepentingan peradilan, khususnya perkara pidana.
5
1.4. Langkah-langkah Penyidikan Dalam sistem peradilan pidana yang berlaku di Indonesia, peradilan perkara pidana diawali oleh penyidikan yang dilakukan oleh penyidik tunggal (lebih tepatnya penyidik umum) yang dilakukan oleh kepolisian (Polri), dalam khasus-khasus khusus (tindak kejahatan ekonomi dan pelanggaran Hak Asasi Manusia) pihak kejaksaan dapat melakukan penyidikan. Sampurna (2000) menggambarkan proses penyidikan sampai ke persidangan (gambar 1.1). Upaya penyidikan pada umumnya bermuara pada proses penuntutan dan disusul oleh proses pengadilan. Proses ini dikenal sebagai upaya litigasi. Upaya penyidikan dilakukan setelah suatu peristiwa atau kejadian dianggap peristiwa hukum, yaitu peristiwa atau kejadian yang dapat mengganggu kedamaian hidup antar pribadi. Lingkup antar pribadi khususnya antara seseorang (memikul kepentingan pribadi) dihadapkan dengan masyarakat atau negara yang memikul suatu kepentingan umum. Penyelasaian kasus-kasus kriminal diperlukan pembuktian peristiwa kasus yang terjadi sampai membuktikan pelaku yang terlibat dalam tindak kriminal tersebut. Pembuktian dari suatu perkara pidana adalah upaya untuk membuktikan bahwa benar telah terjadi tindak pidana yang diperkarakan dan bahwa si terdakwalah pelaku tindak pidana tersebut. Pembuktian dilakukan dengan mengajukan alat bukti yang sah ke depan persidangan. Guna mendapatkan atau setidak-tidaknya mendekati kebenaraan materiil, dalam pembuktian (penyidikan dan pemeriksaan bukti fisik) harus dilakukan pembuktian secara ilmiah. Menurut Kitab Hukum Acara Pidana (KUHAP) pasal 184 ayat 1 menyebutkan bahwa alat bukti yang sah terdiri dari 5 jenis, yaitu: a. Keterangan saksi b. Keterangan ahli c. Surat d. Petunjuk e. Keterangan terdakwa
Pengantar Menuju Ilmu Forensik
Tindak Pidana Dilaporkan ke
Ditemukan oleh polisi Penyelidikan Penyidikan
Pernyataan dan Catatan
Identifikasi
Pemeriksaan TKP
Bukti fisik Penyelidikan lanjutan Pemberkasan Pelimpahan Berkas ke Penuntut Umum Persidangan
Gambar 1.1: Skema penyidikan (Sampurna 2000)
langkah-langkah
Alat bukti yang sah adalah alat bukti yang sesuai dengan hukum, yaitu memenuhi prisip ”admissibility” (dapat diterima) sebagaimana diatur oleh perundang-undangan yang berlaku. Pengertian keterangan saksi menurut KUHAP adalah salah satu alat bukti dalam perkara pidana yang berupa keterangan dari saksi mengenai suatu peristiwa yang ia dengar, ia lihat sendiri, dan ia alami sendiri dan dengan menyebutkan alasan dari pengetahuannya tersebut. Keterangan saksi tidak boleh berupa pendapat atau hasil rekaan saksi, ataupun keterangan dari orang lain (KUHAP pasal 185). Ketentuan keterangan saksi diatur dalam pasal 168, 170, 171 dan 185 KUHAP. Dalam pasalpasal tersebut mengatur ketentuan keterangan saksi siapa-siapa yang berhak, tidak berhak, atau berkompeten menjadi saksi pada suatu tindak pidana. Keterangan saksi dianggap sah apabila diajukan oleh sedikitnya dua orang saksi. Bila berasal dari satu orang saja, harus didukung oleh alat bukti sah lain. Keterangan saksi juga harus diberikan oleh orang yang berkompeten, yaitu orang yang mampu secara 6
hukum. Orang disebut berkompeten apabila tidak di bawah umur dan tidak di dalam pengampuan, misal sakit jiwa. Perngertian umum keterangan ahli, sesuai dengan pasal 1 butir 28 KUHAP adalah keterangan yang diberikan oleh seorang yang memiliki keahlian khusus tentang hal yang diperlakukan untuk membuat terang suatu perkara pidana guna kepentingan pemeriksaan. Pasal 186 KUHAP menjelaskan bahwa: keterangan ahli dapat diberikan pada waktu pemeriksaan oleh penyidik atau jaksa penuntut umum yang dituangkan dalam suatu bentuk laporan dan dibuat dengan mengingat sumpah diwaktu menerima jabatan atau pekerjaan. Jika hal tersebut diberikan pada waktu pemeriksaan oleh tim penyidik atau jaksa penuntut umum, maka pada pemeriksaan di sidang, diminta keterangan dan dicatat dalam berita acara pemeriksaan. Keterangan tersebut diberikan sebelum mengucapkan sumpah janji di depan hakim. Pasal 187 memuat ketentuan tentang surat sebagaimana tersebutkan pada pasal 184 hurup c, surat dibuat atas sumpah jabatan atau dikuatkan dengan sumpah. Surat dapat berupa: a) Berita acara dan surat lain dalam bentuk resmi yang dibuat oleh pejabat umum yang berwenang atau yang dibuat dihadapannya, yang memuat keterangan tentang kejadian atau keadaan yang didengar, dilihat, atau dialami sendiri, disertai dengan alasan yang jelas dan tegas tetang keterangannya itu. b) Surat yang dibuat menurut ketentuan peraturan perundang-undangan atau surat yang dibuat oleh pejabat yang menangani hal yang termasuk dalam tatalaksana yang menjadi tanggung jawabnya dan yang diperuntukkan bagi pembuktian suatu hal atau suatu keadaan. c) Surat keterangan dari seorang ahli yang memuat pendapat berdasarkan keahliannya yang diminta secara resmi dari padanya. d) Surat lain yang hanya dapat berlaku jika ada hubungannya dengan isi dari alat pembuktian yang lain. Yang dimaksudkan surat menurut penjelasan diatas adalah surat yang dibuat oleh pejabatpejabat resmi yang berbentuk berita acara, akte, surat keterangan ataupun surat yang lain Pengantar Menuju Ilmu Forensik
yang mempunyai hubungan dengan perkara yang sedang diadili. Petunjuk menurut KUHAP adalah perbuatan, kejadian atau keadaan, yang karena persuaiannya, baik antara satu dengan yang lain, maupun dengan tindak pidana itu sendiri, menandakan bahwa telah terjadi suatu tindak pidana dan siapa pelakunya. Petunjuk dapat berupa fotografi, foto kopi, kaset rekaman, rekaman vidio, atau barang bukti lainnya yang diketemukan di tempat kejadian perkara (TKP). Barang bukti tersebut dapat digunakan sebagai rekonstruksi kasus atau penelusuran identitas pelaku. Alat yang paling terakhir menurut KUHAP adalah keterangan terdakwa, merupakan keterangan dari terdakwa tentang apa yang ia lakukan, ia ketahui sendiri, atau ia alami sendiri. Bukti fisik yang diketemukan di TKP dapat dikelompokkan menjadi 4 (Sampurna 2000), yaitu: a) Bukti transient. Bukti ini sesuai dengan sifatnya hanya sementara dan akan dengan mudah hilang atau berubah. Sebagai contoh adalah: buah-buahan, suhu, imprints dan indentation (tanda-tanda yang ditimbulkan akibat tekanan, seperti tanda jejak sepatu, atau tapak ban mobil pada kasus kecelakaan bermotor), tanda-tanda seperti lembam mayat, jejak bibir di puntung rokok, bercak darah di pakaian yang akan dicuci, dll. Bukti seperti ini diketemukan oleh penyidik di TKP, dan harus segera dicatat dan didokumentasikan. b) Bukti pola, seperti percikan bercak darah, pola pecahan kaca/gelas, pola kebakaran, pola posisi furnitur, trayektori proyektil, dan posisi mayat, dll. c) Bukti kondisional, seperti derajat kekakuan mayat, distribusi lembam mayat, apakah pintu terkunci, apakah lampu menyala, ketebalan dan arah geraknya asap. d) Bukti yang dipindahkan (transfer), yang merupakan bukti fisik yang paling klasik. Bukti transfer terjadi karena kontak antara orang-orang atau benda-benda, atau antar orang dengan benda. Dalam kriminalistik dikenal dua prinsip utama, yaitu: prinsip Locard yang menyatakan bahwa setiap kontak meninggalkan jejak ”every 7
contact leaves a trace” dan prinsip individualitas yang menyatakan bahwa dua objek mungkin tidak dapat dibedakan, tetapi tidak ada dua objek yang identik. Gabungan kedua prisip ini dapat diturunkan suatu pernyataan bahwa apabila tidak ada dua orang atau benda yang identik, maka setiap jejak yang ditinggalkan orang atau benda harus berbeda dengan jejak orang atau benda yang lain. Ahli forensik dan kriminilalistik berperan dalam upaya pembuktian dengan menyediakan dua alat bukti yang sah, yaitu keterang ahli dan surat (yang dibuat oleh ahli). Dalam hal ini keterangan ahli tidak dibatasi dengan ketentuan tentang ”yang merupa-kan hal-hal yang dialami atau didengar atau dilihat sendiri oleh saksi”, melainkan diberi peluang untuk memberikan pendapat atau opini berdasarkan keahliannya, sepanjang ketentuan yang berlaku. Keterangan ahli atau surat keterangan oleh ahli harus diberikan oleh seseorang ahli yang memenuhi persyaratan kualifikasi dan berisikan keterangan yang berada dalam lingkup keahliannya (bukan keterangan bersifat awam) (Sampurna, 2000). Dalam memberikan atau menuliskan pendapat atau opini seorang ahli harus berdasar-kan hasil temuan atau data adekuat baik yang diperoleh dari pemeriksaan bukti fisik maupun dengan membandingkannya terhadap data di literatur, referensi ilmiah yang terkini, dan secara teknis dianggap benar, serta menggunakan prinsip dan metode ilmiah yang diakui. Pendapat ahli satu dengan yang lainnya tentang suatu hal tentu dapat berbeda, hal ini berdasarkan latar belakang keahliannya (ilmu yang mendasari dalam membuat keterangan), kecanggihan teknologi dari alat yang digunakan memeriksa barang bukti, metode analisis, dan berbagai aspek lainnya. Sehingga pemeriksaan kriminalistik harus diberi peluang untuk melakukan pemeriksaan ulang, baik oleh institusi yang sama maupun institusi yang lain. Secara tradisi di Indonesia, bahwa sejak lama keputusan apakah di dalam pemecahan suatu kasus pidana atau perdata diperlukan buktibukti ilmiah tidak berada ditangan para ahli forensik atau kriminalistik melainkan di tangan para penegak hukum. Para ahli forensik dan kriminalistik cendrung bersikap sebagai Pengantar Menuju Ilmu Forensik
pendukung saja di dalam suatu proses peradilan pidana atau perdata. Hal ini tentunya merupakan kendala dalam pembuktian secara ilmiah kasus pidana maupun penegakan hukum. Akan tetapi di lain sisi sesuai dengan Keputusan Menteri Kehakiman No.M.01.PW.07.03 tahun 1983 dituntut pembuktian secara ilmiah dengan tujuan untuk mendapatkan kebenaran materiil. Untuk itu diperlukan kerjasama antara aparat penegak hukum dan ahli forensik. Meskipun demikian harus diakui pula bahwa pada akhir-akhir ini memang sedang terjadi pergeseran peran ahli forensik, yaitu dari bersifat pasif menjadi akfit. Sampurna (2000) menggambarkan bahwa ahli forensik maupun kriminalistik dapat terlibat pada setiap tahap peyidikan (lihat gambar 1.1). Bahan Bacaan 1) Eckert, W.G., 1980, Introduction to Forensic sciences, The C.V. Mosby Company, St. Louis, Missori 2) Kansil, CST, 1991, Pengantar hukum kesehatan Indonesia, Penerbit Rineka Cipta, Jakarta 3) Loomis, T.A., 1978, Toksikologi Dasar, Donatus, A. (terj.) IKIP Semarang Press, Semarang 4) Perdanakusuma, P., 1984, Bab-bab tentang kedokteran forensik, Ghalia Indonesia, Jakarta 5) Purwandianto, A. 2000, Pemanfaatan Laboratorium Forensik Untuk Kepentingan Non-Litigasi, dalam Tim IBA Kriminalistik, Laporan Kegiatan Buku II, Proyek Pengembangan Kewirahusaan Melalui Itegratif Bahan Ajar Kriminalistik, Lembaga Pengabdian Kepada Masyarakat Universitas Indonesia, Jakarta 6) Saferstein R., 1995, Criminalistics, an Introduction to Forensic Science, 5th Ed., A Simon & Schuster Co., Englewood Cliffs, New Jersey 7) Sampurna, B., 2000, Laboratorium Kriminalistik Segabai Sarana Pembuktian Ilmiah, dalam Tim IBA Kriminalistik, Laporan Kegiatan Buku II, Proyek Pengembangan Kewirahusaan Melalui Itegratif Bahan Ajar Kriminalistik, Lembaga Pengabdian Kepada Masyarakat Universitas Indonesia, Jakarta
8
BAB II PENGANTAR TOKSIKOLOGI 2.1. Perkembangan Awal Toksikologi Sejak perkembangan peradaban manusia dalam mencari makannya, tentu telah mencoba beragam bahan baik botani, nabati, maupun dari mineral. Melalui pengalamannya ini ia mengenal makanan, yang aman dan berbaya. Dalam kontek ini kata makanan dikonotasikan ke dalam bahan yang aman bagi tubuhnya jika disantap, bermanfaat serta diperlukan oleh tubuh agar dapat hidup atau menjalankan fungsinya. Sedangkan kata racun merupakan istilah yang digunakan untuk menjelaskan dan mengambarkan berbagai bahan ”zat kimia” yang dengan jelas berbahaya bagi badan. Kata racun ”toxic” adalah bersaral dari bahasa Yunani, yaitu dari akar kata tox, dimana dalam bahasa Yunani berarti panah. Dimana panah pada saat itu digunakan sebagai senjata dalam peperangan, yang selalu pada anak panahnya terdapat racun. Di dalam ”Papyrus Ebers (1552 B.C.) orang Mesir kuno memuat informasi lengkap tentang pengobatan dan obat. Di Papyrus ini juga memuat ramuan untuk racun, seperti antimon (Sb), tembaga, timbal, hiosiamus, opium, terpentine, dan verdigris (kerak hijau pada permukaan tembaga). Sedangkan di India (500 - 600 B.C.) di dalam Charaka Samhita disebutkan, bahwa tembaga, besi, emas, timbal, perak, seng, bersifat sebagai racun, dan di dalam Susrata Samhita banyak menulis racun dari makanan, tananaman, hewan, dan penangkal racun gigitan ular. Hippocrates (460-370 B.C.), dikenal sebagai bapak kedokteran, disamping itu dia juga dikenal sebagai toksikolog dijamannya. Dia banyak menulis racun bisa ular dan didalam bukunya juga menggambarkan, bahwa orang Mesir kuno telah memiliki pengetahuan penangkal racun, yaitu dengan menghambat laju absorpsi racun dari saluran pencernaan. Disamping banyak lagi nama besar toksikolog pada jaman ini, terdapat satu nama yang perlu mendapat catatan disini, yaitu besar pada jaman Mesir dan Romawi kuno adalah Pendacious Dioscorides (A.D. 50), dikenal sebagai bapak Materia Medika, adalah seorang dokter tentara. Di dalam bukunya dia Pengantar Toksikologi
mengelompok-kan racun dari tanaman, hewan, dan mineral. Hal ini membuktikan, bahwa efek berbahaya (toksik) yang ditimbulkan oleh zat racun (tokson) telah dikenal oleh manusia sejak awal perkembangan beradaban manusia. Oleh manusia efek toksik ini banyak dimanfaatkan untuk tujuan seperti membunuh atau bunuh diri. Untuk mencegah peracunan, orang senantiasa berusaha menemukan dan mengembangkan upaya pencegahan atau menawarkan racun. Usaha ini seiring dengan perkembangan toksikologi itu sendiri. Namun, evaluasi yang lebih kritis terhadap usaha ini baru dimulai oleh Maimonides (1135 - 1204) dalam bukunya yang terkenal Racun dan Andotumnya. Sumbangan yang lebih penting bagi kemajuan toksikologi terjadi dalam abad ke-16 dan sesudahnya. Paracelcius adalah nama samaran dari Philippus Aureolus Theophratus Bombast von Hohenheim (1493-1541), toksikolog besar, yang pertama kali meletakkan konsep dasar dasar dari toksikologi. Dalam postulatnya menyatakan: “Semua zat adalah racun dan tidak ada zat yang tidak beracun, hanya dosis yang membuatnya menjadi tidak beracun”. Pernyataan-pernyataan ini menjadi dasar bagi konsep hubungan dosis reseptor dan indeks terapi yang berkembang dikemudian hari. Matthieu Joseph Bonaventura Orfila dikenal sebagai bapak toksikologi modern. Ia adalah orang Spayol yang terlahir di pulau Minorca, yang hidup antara tahun 1787 sampai tahun 1853. Pada awak karirnya ia mempelajari kimia dan matematika, dan selanjutnya mempelajari ilmu kedokteran di Paris. Dalam tulisannya (1814-1815) mengembangkan hubungan sistematik antara suatu informasi kimia dan biologi tentang racun. Dia adalah orang pertama, yang menjelaskan nilai pentingnya analisis kimia guna membuktikan bahwa simtomatologi yang ada berkaitan dengan adanya zat kimia tertentu di dalam badan. Orfila juga merancang berbagai metode untuk mendeteksi racun dan menunjukkan pentingnya analisis kimia sebagai bukti hukum pada kasus kematian akibat keracunan. Orfila 9
bekerja sebagai ahli medikolegal di Sorbonne di Paris. Orfila memainkan peranan penting pada kasus LaFarge (kasus pembunuhan dengan arsen) di Paris, dengan metode analisis arsen, ia membuktikan kematian diakibatkan oleh keracuanan arsen. M.J.B. Orfila dikenal sebagai bapak toksikologi modern karena minatnya terpusat pada efek zat tokson, selain itu karena ia memperkenalkan metodologi kuantitatif ke dalam studi aksi zat tokson pada hewan, pendekatan ini melahirkan suatu bidang toksikologi modern, yaitu toksikologi forensik. Dalam bukunya Traite des poison, terbit pada tahun 1814, dia membagi racun menjadi enam kelompok, yaitu: corrosives, astringents, acrids, stupefying or narcotic, narcoticacid, dan septica atau putreficants. 2.2. Pengertian Toksikologi dan Racun Secara sederhana dan ringkas, toksikologi dapat didefinisikan sebagai kajian tentang hakikat dan mekanisme efek berbahaya (efek toksik) berbagai bahan kimia terhadap makhluk hidup dan sistem biologik lainnya. Ia dapt juga membahas penilaian kuantitatif tentang berat dan kekerapan efek tersebut sehubungan dengan terpejannya (exposed) makhluk tadi. Apabila zat kimia dikatakan berracun (toksik), maka kebanyakan diartikan sebagai zat yang berpotensial memberikan efek berbahaya terhadap mekanisme biologi tertentu pada suatu organisme. Sifat toksik dari suatu senyawa ditentukan oleh: dosis, konsentrasi racun di reseptor, sifat zat tersebut, kondisi bioorganisme atau sistem bioorganisme, paparan terhadap organisme dan bentuk efek yang ditimbulkan. Sehingga apabila menggunakan istilah toksik atau toksisitas, maka perlu untuk mengidentifikasi mekanisme biologi di mana efek berbahaya itu timbul. Sedangkan toksisitas merupakan sifat relatif dari suatu zat kimia, dalam kemampuannya menimbulkan efek berbahaya atau penyimpangan mekanisme biologi pada suatu organisme. Toksisitas merupakan istilah relatif yang biasa dipergunakan dalam memperbandingkan satu zat kimia dengan lainnya. Adalah biasa untuk mengatakan bahwa satu zat kimia lebih toksik daripada zat kimia lain. Perbandingan sangat kurang informatif, kecuali jika pernyataan tersebut melibatkan informasi tentang mekanisme biologi yang sedang Pengantar Toksikologi
dipermasalahkan dan juga dalam kondisi bagaimana zat kimia tersebut berbahaya. Oleh sebab itu, pendekatan toksikologi seharusnya dari sudut telaah / studi tentang berbagai efek zat kimia atas berbagai sistem biologi, dengan penekanan pada mekanisme efek berbahaya zat kimia itu dan berbagai kondisi di mana efek berbahaya itu terjadi. Pada umumnya efek berbahaya (efek farmakologik) timbul apabila terjadi interaksi antara zat kimia (tokson atau zat aktif biologis) dengan reseptor (tempat berikatnya tokson). Terdapat dua aspek yang harus diperhatikan dalam mempelajari interakasi antara zat kimia (zat aktif biologis) dengan organisme hidup, yaitu kerja farmakon pada suatu organisme (aspek farmakodinamik / toksodinamik) dan pengaruh organisme terhadap zat aktif (aspek farmakokinetik / toksokinetik) aspek ini akan lebih detail dibahas pada sub bahasan kerja toksik. Telah dipostulatkan oleh Paracelcius, bahwa sifat toksik suatu tokson sangat ditentukan oleh dosis (konsentrasi tokson pada reseptornya). Artinya kehadiran suatu zat yang berpotensial toksik di dalam suatu organisme belum tentu menghasilkan juga keracunan. Misal insektisida rumah tangga (DDT) dalam dosis tertentu tidak akan menimbulkan efek yang berbahaya bagi manusia, namun pada dosis tersebut memberikan efek yang mematikan bagi serangga. Hal ini disebabkan karena konsentrasi tersebut berada jauh dibawah konsentrasi minimal efek pada manusia. Namun sebaliknya apabila kita terpejan oleh DDT dalam waktu yang relatif lama, dimana telah diketahui bahwa sifat DDT yang sangat sukar terurai dilingkungan dan sangat lifofil, akan terjadi absorpsi DDT dari lingkungan ke dalam tubuh dalam waktu relatif lama. Karena sifat fisiko kimia dari DDT, mengakibatkan DDT akan terakumulasi (tertimbun) dalam waktu yang lama di jaringan lemak. Sehingga apabila batas konsentrasi toksiknya terlampaui, barulah akan muncul efek toksik. Efek atau kerja toksik seperti ini lebih dikenal dengan efek toksik yang bersifat kronis. Toksin Clostridium botulinum, adalah salah satu contoh tokson, dimana dalam konsentrasi yang sangat rendah (10-9 mg/kg berat badan), sudah dapat mengakibatkan efek kematian. 10
Berbeda dengan metanol, baru bekerja toksik pada dosis yang melebihi 10 g. Pengobatan parasetamol yang direkomendasikan dalam satu periode 24 jam adalah 4 gram untuk orang dewasa dan 90 mg / kg untuk anak-anak. Namun pada penggunaan lebih dari 7 gram pada orang dewasa dan 150 mg/kg pada anakanak akan menimbulkan efek toksik. Dengan demikian, resiko keracunan tidak hanya tergantung pada sifat zatnya sendiri, tetapi juga pada kemungkinan untuk berkontak dengannya dan pada jumlah yang masuk dan diabsorpsi. Dengan kata lain tergantung dengan cara kerja, frekuensi kerja dan waktu kerja. Antara kerja (atau mekanisme kerja) sesuatu obat dan sesuatu tokson tidak terdapat perbedaan yang prinsipil, ia hanya relatif. Semua kerja dari suatu obat yang tidak mempunyai sangkut paut dengan indikasi obat yang sebenarnya, dapat dinyatakan sebagai kerja toksik. Kerja medriatik (pelebaran pupil), dari sudut pandangan ahli mata merupakan efek terapi yang dinginkan, namun kerja hambatan sekresi, dilihat sebagai kerja samping yang tidak diinginkan. Bila seorang ahli penyakit
dalam menggunakan zat yang sama untuk terapi, lazimnya keadaan ini manjadi terbalik. Pada seorang anak yang tanpa menyadarinya telah memakan buah Atropa belladonna, maka mediaris maupun mulut kering harus dilihat sebagai gejala keracuanan. Oleh sebab itu ungkapan kerja terapi maupun kerja toksik tidak pernah dinilai secara mutlak. Hanya tujuan penggunaan suatu zat yang mempunyai kerja farmakologi dan dengan demikian sekaligus berpotensial toksik, memungkinkan untuk membedakan apakah kerjanya sebagai obat atai sebagai zat racun. Tidak jarang dari hasil penelitian toksikologi, justru diperoleh senyawa obat baru. Seperti penelitian racun (glikosida digitalis) dari tanaman Digitalis purpurea dan lanata, yaitu diperoleh antikuagulan yang bekerja tidak langsung, yang diturunkan dari zat racun yang terdapat di dalam semanggi yang busuk. Inhibitor asetilkolinesterase jenis ester fosfat, pada mulanya dikembangkan sebagai zat kimia untuk perang, kemudian digunakan sebagai insektisida dan kini juga dipakai untuk menangani glaukoma.
Farmakologi
Immunologi Patologi
Biologi Kimia
Kesehatan masyarakat
Matematika
Lingkungan: - Pencemaran - Akumulasi pencemaran - Kesehatan lingkungan kerja
Fisiologi
Toksikologi
Ekonomi (dari segi manfaat): - Perkembangan obat, zat tambahan pada makanan dan pestisida
Forensik: - Aspek medikolegal - Diagnosis - Terapi
Gambar 2.1: Hubungan ilmu dasar dan terapan dengan cabang toksikologi. Toksikologi modern merupakan bidang yang didasari oleh multi displin ilmu, ia dengan dapat dengan bebas meminjam bebarapa ilmu dasar, guna mempelajari interaksi antara zat tokson dan mekanisme biologi yang ditimbulkan (lihat gambar 2.1). Ilmu toksikologi ditunjang oleh berbagai ilmu dasar, seperti Pengantar Toksikologi
kimia, biologi, fisika, matematika. Kimia analisis dibutuhkan untuk mengetahui jumlah toksikan yang melakukan ikatan dengan reseptor sehingga dapat memberikan efek toksik. Bidang ilmu biokimia diperlukan guna mengetahui informasi penyimpangan reaksi kimia pada organisme yang diakibatkan oleh 11
zat tokson. Perubahan biologis yang diakibatkan oleh zat tokson dapat diungkap melalui bantuan ilmu patologi, immonologi, fisiologi. Untuk mengetahui efek berbahaya dari suatu zat kimia pada suatu sel, jaringan atau organisme memerlukan dukungan ilmu patologi, yaitu dalam menunjukan wujud perubahan / penyimpangan kasar, mikroskopi, atau penyimpangan submikroskopi dari normalnya. Perubahan biologi akibat paparan tokson dapat termanisfestasi dalam bentuk perubahan sistem kekebakan (immun) tubuh, untuk itu diperlukan bidang ilmu immunologi guna lebih dalam mengungkap efek zat toksik pada sistem kekebalan organisme. Mengadopsi konsep dasar yang dikemukakan oleh Paracelcius, manusia menggolongkan efek yang ditimbulkan oleh zat tokson menjadi konsentrasi batas minimum memberikan efek, daerah konsentrasi dimana memberikan efek yang menguntungkan (efek terapeutik , lebih dikenal dengan efek farmakologi), batas konsentrasi dimana sudah memberikan efek berbahaya (konsetrasi toksik), dan konstrasi tertinggi yang dapat menimbulkan efek kematian. Agar dapat menetapkan batasan konsentrasi ini toksikologi memerlukan dukungan ilmu kimia analisis, biokimia, maupun kimia instrmentasi, serta hubungannya dengan biologi. Ilmu statistik sangat diperlukan oleh toksikologi dalam mengolah baik data kualitatif maupun data kuantitatif yang nantinya dapat dijadikan sebagai besaran ekspresi parameter-parameter angka yang mewakili populasi. Bidang yang paling berkaitan dengan toksikologi adalam farmakologi, karena ahli farmakologi harus memahami tidak hanya efek bermanfaat zat kimia, tetapi juga efek berbahayanya yang mungkin diterapkan pada penggunaan terapi. Farmakologi pada umumnya menelaah efek toksik, mekanisme kerja toksik, hubungan dosis respon, dari suatu tokson. 2.3. Cakupan dan Subdisiplin Toksikologi Toksikologi sangat luas cakupannya. Ia menangani studi efek toksik “toksisitas” di berbagai bidang, LU (1995) mengelompokkan ke dalam empat bidang, yaitu: − bidang kedokteran untuk tujuan diagnostik, pencegahan, dan terapeutik, Pengantar Toksikologi
− dalam industri makanan sebagai zat tambahan baik langsung maupun tidak langsung, − dalam pertanian sebagai pestisida zat pengatur pertumbuhan, peyerbuk bantuan, dan zat tambahan pada makanan hewan, − dalam bidang industri kimia sebagai pelarut, komponen, dan bahan antara bagi plstik serta banyak jenis bahan kimia lainnya. Di dalam industri kimia juga dipelajari pengaruh logam (misal dalam dalam pertambangan dan tempat peleburan), produk minyak bumi, kertas dan pulpa, tumbuhan beracun, dan racun hewan terhadap kesehatan. LOOMIS (1979) berdasarkan aplikasinya toksikologi dikelompokkan dalam tiga kelompok besar, yakni: toksikologi lingkungan, toksikologi ekonomi dan toksikologi forensik. Toksikologi lingkungan lebih memfokuskan telaah racun pada lingkungan, seperti pencemaran lingkungan, dampak negatif dari akumulasi residu senyawa kimia pada lingkungan, kesehatan lingkungan kerja. Toksikologi ekonomi membahas segi manfaat dan nilai ekonomis dari senobiotik. Tosikologi forensik menekunkan diri pada aplikasi ilmu toksikologi untuk kepentingan peradilan. Kerja utama dari toksikologi forensik adalah analisis racun baik kualitatif maupun kuantitatif sebagai bukti dalam tindak kriminal (forensik) di pengadilan. Masih dijumpai subdisiplin toksikologi lainnya selain tiga golongan besar diatas, seperti toksikologi analisis, toksikologi klinik, toksikologi kerja, toksikologi hukum, dan toksikologi mekanistik. Untuk menegakan terapi keracunan yang spesifik dan terarah, diperlukan kerjasama antara dokter dan toksikolog klinik. Hasil analisis toksikologi dapat memastikan diagnose klinis, dimana diagnose ini dapat dijadikan dasar dalam melakukan terapi yang cepat dan tepat, serta lebih terarah, sehingga ancaman kegagalan pengobatan (kematian) dapat dihindarkan. Analisis toksikologi klinik dapat berupa analisis kualitatif maupun kuantitatif. Dari hasil analisis kualitatif dapat dipastikan bahwa kasus keracunan adalah memang benar diakibatkan oleh instoksikasi. Sedangkan dari hasil analisis kuantitatif dapat 12
diperoleh informasi tingkat toksisitas pasien. Dalam hal ini diperlukan interpretasi konsentrasi toksikan, baik di darah maupun di urin, yang lebih seksama. Untuk mengetahui tepatnya tingkat toksisitas pasien, biasanya diperlukan analisis toksikan yang berulang baik dari darah maupun urin. Dari perubahan konsentrasi di darah akan diperoleh gambaran apakah toksisitas pada fase eksposisi atau sudah dalam fase eleminiasi. Keracunan mungkin terjadi akibat pejanan tokson di tempat kerja. Hal ini mungkin dapat mengkibatkan efek buruk yang akut maupun kronik. Efek toksik yang ditimbulkan oleh kesehatan dan keselamatan kerja merupakan masalah bidang toksikologi kerja. Toksikologi kerja merupakan subbagian dari toksikologi lingkungan. Toksikologi hukum mencoba melindungi masyarakat umum dari efek berbahaya tokson dengan membuat undang-undang, peraturan, dan standar yang membatasi atau melarang penggunaan zat kimia yang sangat beracun, juga dengan menentukan syarat penggunaan zat kimia lainnya. Gambaran lengkap tentang efek toksik sangat diperlukan untuk menetapkan peraturan dan standar yang baik. Profil semacam itu hanya dapan ditentukan lewat berbagai jenis penelititan toksikologi yang relevan, dan ini membentuk dasar bagi toksikologi hukum. 2.4. Perkembangan Mutahir Toksikologi Dalam perkembangan beradaban modern, masyarakat menuntut perbaikan kondisi kesehatan dan kehidupan, diantaranya makanan bergizi, mutu kesehatan yang tinggi, pakaian, transportasi. Untuk memenuhi tujuan ini, berbagai jenis bahan kimia harus diproduksi dan digunakan, banyak diantaranya dalam jumlah besar. Diperkirakan berribu-ribu bahan kimia telah diproduksi secara komersial baik di negara-negara industri maupun di negara berkembang. Melalui berbagai cara bahan kimia ini kontak dengan penduduk, dari terlibatnya manusia pada proses produksi, distribusi ke konsumen, dan terakhir pada tingkat pemakai. Meningkatnya jumlah penduduk dunia menuntut, salah satunya meningkatnya jumlah produksi pangan. Dalam hal ini diperlukan bahan kimia, seperti pupuk, pestisida,rebisida. Pengantar Toksikologi
Tidak jarang pemakaian pestisida yang tidak sesuai dengan atuaran, atau berlebih justru memberi beban pencemaran terhadap lingkungan, perubahan ekosistem, karena pembasmian pada salah satu insteksida akan berefek pada rantai makanan dari organisme tersebut, sehingga dapan juga mengakibatkan berkurangnya atau bahkan musnahnya predator insek tersebut. Pemakaian pestisida, telah ditengarai mengakibatkan mutasi genetika dari insektisida tersebut, sehingga pada akhirnya melahirkan mutan insek yang justru resisten terhadap pestisida jenis tertentu. Pemakaian pertisida yang tidak benar juga merupakan salah satu penginduksi toksisitas kronik (menahun). Petani berkeinginan mendapatkan untung yang tinggi dari hasil pertaniannya, tidak jarang penyemprotan pestisida berlebih justru dilakukan pada produk pertanian satu-dua hari sebelum panen, dengan tujuan buah atau daun sayuran tidak termakan insek sebelum panen, dengan jalan demikian akan diperoleh buah atau sayuran yang ranun, tidak termakan oleh insek. Namun tindakan ini justru membahayakan konsumen, karena pestisida kemungkinan dapat terakumulasi secara perlahan di dalam tubuh konsumen, melalui konsumsi buah atau sayuran yang sebelumnya diberikan pestisida sebelum panen. Banyaknya kasus keracunan masif akut dan keracunan kronis, yang diakibatkan oleh pencemaran lingkungan akibat proses produksi. Seperti pada tahun 1930 di Detroit, Mich. kontaminasi ginger jake oleh Tri-o-kresil, mengakibatkan neurotksis, telah mengakibatkan keracunan syaraf pada 16 ribu penduduk. Di London, pada tahun 1952, terjadi peningkatan jumlah kematian penduduk akibat penyakit jantung dan paru-paru. Hal ini disebabkan oleh kontaminasi udara oleh Belerang dioksida dan partikel tersuspensi, yang merupakan limbah buangan pabrik di Ingris pada saat itu. Penyakit Minamata di Jepang pada tahun 1950an diakibatkan karena pembuangan limbah industri yang mengandung metil merkuri ke teluk Minamata, yang mengakibatkan ikan di teluk tersebut terkontaminasi oleh metil merkuri. Ikan terkontaminasi ini dikonsumsi oleh penduduk disekitar teluk, mengakibatkan 13
deposisi (pengendapan) metil merkuri di dalam tubuh. Metil merkuri adalah senyawa toksik yang mengakibatkan penyakit neurologik berat, salah satunya mengakibatkan kebutaan. Pada akhir 1950-an sampai awal tahun 1960-an, di Eropa Barat terjadi kasus keracunan yang dikenal dengan kasus Talidomid. Talidomid adalah senyawa kimia yang pertama disintesa untuk obat menekan rasa mual, muntah. Karena efeknya tersebut pada waktu itu banyak diresepkan pada ibu-ibu hamil, dengan tujuan menekan mual-mutah yang sering muncul pada trimester pertama pada kehamilan. Efek samping yang muncul dari pemakaian ini adalah terlahir janin dengan pertumbuhan organ tubuh yang tidak lengkap, belakangan diketahui bahwa salah satu dari bentuk rasemat Talidomid ini memberikan efek menghambat tertumbuhan organ tubuh pada janin di masa kandungan. Salah satu contoh, kasus pencemaran lingkungan di Indonesia akibat proses produksi adalah kasus teluk Buyat. Sampai saat ini masih kontropersial didiskusikan. Kejadian-kejadian di atas dan peristiwa tragis keracunan masif lainnya telah menghasilkan program pengujian yang lebih intensif, yang telah mengungkapkan beragamnya sifat dan sasaran efek toksik. Pada gilirannya ini menuntut lebih banyak penelitian pada hewan, lebih banyak indikator toksisitas, persyaratan yang lebih ketat sebelum suatu bahan kimia baru dapat dilepas pemakaiannya ke masyarakat, serta melakukan evaluasi dan pemantauan efek toksik senyawa kimia yang telah beredar dan dimanfaatkan oleh masyarakat. Oleh karena itu, ada kebutuhan untuk mempermudah tugas penilaian toksikologik atas begitu banyak bahan kimia, dimana prosedur pengujian toksisitasnya menjadi semakin komplek. Untuk memenuhi kebutuhan ini, beberapa kreteria telah diajukan dan dipakai untuk memilih menurut prioritasnya bahan kimia yang akan diuji. Disamping itu, ”sistem penilaian berlapis” memungkinkan keputusan dibuat pada berbagai tahap pengujian toksikologik, sehingga dapat dihindarkan penelitian yang tidak perlu. Prosedur ini sangat berguna dalam pengujian karsinogenisitas, mutagenisitas, dan imunotoksisitas karena besarnya biaya yang terlibat dan banyaknya sistem uji yang tersedia. Pengantar Toksikologi
Karena banyaknya orang yang terpejan dengan bahan-bahan kimia ini, maka kita harus berupaya mencari pengendalian yang tepat sebelum terjadi kerusakan yang hebat. Karena itu, bila mungkin, ahli toksikologi modern harus mencoba mengidentifikasikan berbagai indikator pejanan dan tanda efeknya terhadap kesehatan yang dini dan reversibel. Hal ini penting untuk menentukan ketentuan keputusan, pada saat yang tepat untuk melindungi kesehatan masyarakat baik sebagai individu yang bekerja maupun masyasakat yang terpejan. Pencapaian di bidang ini telah terbukti dapat membantu para mengambil keputusan (pemerintah) yang bertanggungjawab dalam menjalankan surveilan medik yang sesuai pada pekerja atau masyarakat yang terpejan. Contoh yang menonjol adalah penggunaan penghambat kolinesterase sebagai indikator pejanan pestisida organofosfat dan berbagai parameter biokimia untuk memantau pejanan timbal. Menggunakan indikator biologi seperti jenis ikan tertentu untuk memantau tingkat cemaran limbah cair insdustri sebelum dinyatakan aman untuk dilepaskan ke lingkungan. ”Petanda biologik” semacam itu dimaksudkan untuk mengukur pejanan terhadap toksikan atau efeknya di samping untuk mendeteksi kelompok masyarakat yang retan. Kemajuan yang dicapai dalam bidang biokimia dan toksikokinetik, toksikologi genetika, imunotoksikologi, morfologik pada tingkat subsel, serta perkembangan ilmu biologimolekular berperan dalam memberikan pengertian yang lebih baik tentang sifat, tempat, dan cara kerja berbagai toksikan. Misalnya perkembangan bidang ilmu tersebut dapat memberikan berbagai metode uji toksikologi secara invitro, dimana target uji langsung pada tingkat sel, seperti uji senyawa yang mengakibatkan kerusakan sel hati ”hepato toksik” dapat dilakukan langsung pada kultur sel hati secara invitro, atau uji toksikan yang mempunyai sifat sebagai karsinogen juga dapat dilakukan pada kultur sel normal, disini dilihat tingkat pertumbuhan sel dan perubahan DNA yang dialamai oleh sel akiat pejanan toksikan uji. Banyak lagi metode uji invitro yang sangat bermanfaat dalam menunjang perkembangan ilmu toksikologi itu sendiri.
14
Salah satu wujud perlindungan kesehatan masyarakat, ahli toksikologi akan selalu terlibat dalam menentukan batas pejanan yang aman atau penilaian resiko dari pejanan. Batas pejanan yang aman mencangkup ”asupan (intake) harian yang diperbolehkan, dan ”nilia ambang batas” dari toksikan yang masih dapat ditolerir, sedangkan penilaian resiko digunakan dalam hubungan dengan efek bahan yang diketahui tidak berrabang batas atau ambang batasnya tak dapat ditentukan. Penentuan ini merupakan penelitian menyeluruh tentang sifat toksik, pembuktian dosis yang aman, penentuan hubungan dosis-efek dan dosisrespon, serta penelitian toksokinetik, biotransformasi. Meluasnya bidang cakupan dan makin banyaknya subdisiplin toksikologi seperti digambarkan di atas memberikan gambaran tersendiri tentang kemajuan akhir dalam toksikologi. 2.5. Prospek Masa Depan Kemajuan di bidang bioteknologi pertanian, telah terbukti memberikan bebagai kemajuan jika dibandingkan pertanian konvensional. Melalui rekayasa genetika pada tanaman pertanian telah terbukti diperoleh bibit unggul, yang dibandingkan dengan pertanian konvensional sangat sedikit membutuhkan tanah, merupakan andalan dalam meningkatkan pasokan makanan kita. Kemanan makanan semacam ini membutuhkan evaluasi keamanan yang memadai. Bersama dengan ilmu-ilmu lain, toksikologi dapat menyediakan bahan kimia alternatif yang lebih aman untuk pertanian, industri, dan kebutuhan konsumen melalui penentuan hubungan strukter-toksisitas. Pengurangan sifat toksik mungkin dapat dicapai dengan mengubah toksisitas sasaran atau dengan mengubah sifat toksokinetiknya. Toksikologi juga berperan dalam pengembangan obat baru, sudah menjadi prasat dalam pengembangan obat baru harus dibarengi baik uji toksisitas akut maupun toksisitas krinis, dengan persyaratan uji yang ketat. Penilaian tentang keamanannya merupakan tantangan dang tunggung jawab toksikologi. Karena imbauan masyarakat untuk mengurangi penggunaan hewan coba dengan alasan Pengantar Toksikologi
prikemanusiaan, maka lebih sering digunakan organ terisolasi, jaringan biakan, sel, dan bentuk-bentuk kehidupan yang lebih rendah. Sistem ini memiliki banyak keuntungan, seperti pengujian yang lebih cepat dan lebih murah, miningkatkan keragaman penelitian terutamanya yang berkaitan dengan mekanisme keracunan. Dengan meningkatnya tuntutan ini akan mendorong perbaikan prosedur pengujian yang lebih sederhana dan handal, seperti misal pengujian karsinogen “uji kanker”, uji mutagenesis, menggunakan “petanda biologik” (biomarker) yaitu kultur sel kanker. Mingkatnya kebutuhan akan uji toksikologik, namun pada kenyataannya terdapat keterbatasan akan fasilitas dan sumber daya manusia yang memenuhi syarat, Oleh sebab itu maka data toksisitas yang dihasilkan dimana saja sebaiknya dapat diterima secara international. Agar data-data tersebut dapat diterima secara umum, kama data tersebut harus memenuhi standar tertentu. Untuk itu lembaga terkemuka dunia mengeluarkan standar seperti yang dikeluarkan oleh Lembaga pengawas obat dan makanan Amerika (FDA) mengeluarkan “Good Laboratory Practice” , dimana standar ini dapat diterima secara international. Pada akhirnya, ahli toksikologi harus terus memperbaiki prosedur uji untuk mengurangi hasil positif palsu dan negatif palsu, dan terus melakukan penelitian yang dirancang untuk meningkatkan pemahaman yang lebih baik akan pentingnya efek toksik sehingga penilaian keamanan/resiko berbagai tokson dapt dilakukan dengan hasil lebih memuaskan. Bahan Bacaan: 1. Lu, F.C., 1995, Toksikologi Dasar, Asas, Organ Sasaran, dan Penilaian Resiko, Nugroho, E. (terj.), UI Press, Jakarta 2. Loomis, T.A., 1978, Toksikologi Dasar, Donatus, A. (terj.) IKIP Semarang Press, Semarang 3. Ariens,E.J., Mutschler,E., Simonis,A.M., 1985, Toksikologi Umum, Pengantar, Wattimena,Y.R.(terj.), Gadjah Mada University Press,Yogyakarta. 4. Ling, L.J., 2000, Toxikology Secrets, Hanley & Belfus, Inc. Philadelphia
15
BAB III FASE KERJA TOKSIK
Dua aspek yang perlu diperhatikan dalam menelaah interaksi senobitika dengan organisme hidup yaitu: kerja senobiotika pada organisme dan reaksi atau efek yang ditimbulkan. Kerja toksik pada umumnya I
Kontak/ Penggunaa
- Bentuk farmasetik hancur - Zat aktif melarut
merupakan hasil sejumlah besar proses biologi yang komplek. Secara umum kerja toksik dapat digambarkan dalam rantai kerja yang terdiri dari: fase eksposisi, toksokinetik dan fase toksodinamik (lihat. Gam. 3.1). II
Zat aktif tersedia untuk diabsorpsi Ketersediaan Farmasetik
III
- Adsorpsi - Distribusi -
Fase: Eksposisi
Metabolism e
Zat aktif tersedia untuk memberikan efek Ketersediaa n biologik
Ekskresi Fase: Toksokinetik
Interaksi toksonreseptor dalam organ efektor
Efek
Fase: Toksodinamik
Gambar 3.1: Rantai fase kerja tokson (racun) pada organisme 3.1. Fase eksposisi: Dalam fase ini organisme terpapar (terkontak) dengan senobiotika. Paparan dapat melalui kulit, oral, saluran pernafasan (inhalasi) atau dengan cara injeksi. Pada pemakaian oral (misal sediaan dalam bentuk padat), maka terlebih dahulu kapsul/tablet akan terdistegrasi, sehingga xenobiotika akan telarut di dalam cairan saluran pencernaan. Xenobiotika yang terlarut akan siap terabsorpsi secara normal dalam
duodenal dari usus halus dan ditraspor melalui pembuluh kapiler mesenterika menuju vena porta hepatika menuju hati sebelum ke sirkulasi sistemik. Paparan xenobiotika (rute administrasi) dapat melalui oral, inhalasi, topikal, rektal, atau vaginal. Sedangkan pemasukan xenobiotika langsung ke sirkulasi sistemik (injeksi), dapat dikatakan bahwa xenobiotika tidak mengalami proses absorpsi.
Tabel 3.1. Beberapa contoh rute pemakaian obat-obat terlarang Rute
Drugs (Obat-Obat terlarang)
Oral
cannabinoide, opiate, LSD, meskalin, benzodiazepin, barbiturate, anti depresan trisiklik, ecstasy
Inhalasi
pelarut-pelarut perangsang (terpentin, kloroform, eter, dll), alkaloid dengan titik didih yang rendah (nikotin, kokain, amfetamin)
Merokok
marijuana, daun ganja, Crack ”kokain”, metamfetamin,
Intravenus
heroin, morfin, kokain, metamfetamin, fensilidin
Intranasal
kokain, heroin, methamfetamin
Dermal
fentanyl, nikotin.
Fase Kerja Toksik
16
3.2. Fase toksokinetik Efek toksik timbul jika tokson terabsorpsi kemudian ditransfer bersama sistem peredaran darah menuju reseptor, hasil interaksi tokson dengan reseptor akan menimbulkan efek farmakologi. Untuk mengakhiri efek yang timbul, oleh tubuh tokson akan dimetabolisme dan dieliminasi dari dalam tubuh. Proses absorpsi, distribusi, metabolisme dan eliminasi (ADME) terangkum dalam fase toksokinetik. Tubuh mengenal drug sebagai senyawa asing atau xenobiotika. Jika tubuh terpejan oleh xenobiotika, maka tubuh akan berusaha menghancurkan dan kemudian mengeliminasi senyawa xenobiotika ini dari dalam tubuh. Farmakokinetik dapat juga dipandang suatu bidang ilmu, yang mengkaji perubahan konsentrasi (kinetika) dari xenobiotika di dalam tubuh organisme sebagai fungsi waktu. Perubahan konsentrasi xenobiotika ditentukan oleh: dimana dan berapa cepat xenobiotika diabsorpsi menuju ke sirkulasi sistemik, bagaimana terdistribusi di dalam tubuh organisme, bagaimana enzim tubuh merubah struktur molekulnya, serta dari mana dan berapa cepat dieksresi dari dalam tubuh (Mutschler dan Schäfer-Korting, 1997). Toksokinetik (farmakokinetik) menelaah perubahan konsentrasi tokson terhadap waktu di dalam organisme. Secara umum toksokinetik menelaah dari mana dan berapa laju absorpsi tokson dari lingkungan ke sistem peredaran darah, bagaimana distribusinya ke seluruh tubuh, bagaimana enzim tubuh memetabolismenya, dari mana dan bagaimana tokson atau metabolitnya dieliminasi dari dalam tubuh. Farmakokinetik melibatkan proses invasi (masuknya xenobiotika ke tubuh), trasportasi dan distribusi (pergerakan xenobiotika di dalam tubuh), serta proses eleminasi (proses hilangnya xenobiotika dari dalam tubuh). Proses ini semua menentukan efficacy (kemampuan xenobiotika mengasilkan efek), efektifitas dari xenobiotika, konsentrasi xenobiotika di reseptor, dan durasi dari efek farmakodinamiknya. Sifat-sifat farmakokinetik suatu xenobiotika digunakan oleh farmakolog, ilmuwan klinik dan toksikolog untuk mengembangkan pengobatan, untuk mengertikan faktor-faktor yang dapat mendorong penyalahgunaan xenobiotika tersebut, serta dijadikan dasar untuk mengetahui kapan dan Fase Kerja Toksik
dalam bentuk apa xenobiotika tersebut masih dapat dideteksi setelah selang waktu pemakaian dan menginterpretasikan efek-efek xenobitika tersebut. 3.2.1. Absorpsi (Proses Invasi) Semua proses transfer tokson dari lingkungan menuju sistem peredaran darah dirangkum kedalam proses invasi, proses ini juga digambarkan sebagai resorpsi. Tokson dapat teresorpsi umumnya berada dalam bentuk terlarut atau terdispersi molekular. Laju resorpsi tokson ditentukan oleh daerah paparan (topikal, oral, inhalasi atau injeksi), bentuk farmasetik tokson (tablet, salep, sirop, aerosol, suspensi atau larutan), proses resorpsi, sifat fisikokimia tokson dan konsentrasinya. Proses invasi disebut juga dengan absorpsi, yang ditandai oleh masuknya xenobiotika dari tempat kontak (paparan) menuju sirkulasi sistemik tubuh. Laju absorpsi xenobiotika ditentukan oleh sifat membran biologis dan aliran kapiler darah tempat kontak serta sifat fisiko kimia dari xenobiotika itu sendiri. Pada pemakaian oral (misal sediaan dalam bentuk padat), maka terlebih dahulu kapsul/tablet akan terdistegrasi, sehingga xenobiotika akan telarut di dalam cairan saluran pencernaan. Xenobiotika yang terlarut ini akan terabsorpsi secara normal dalam duodenal dari usus halus dan ditraspor melalui pembuluh kapiler mesenterika menuju vena porta hepatika menuju hati sebelum ke sirkulasi sistemik. Kelarutan xenobiotika akan sangat mempengaruhi laju absorpsinya, jika xenobiotika terlalu non polar, maka dia akan terlarut cukup kuat dalam lapisan lipofil dari membran sel. Demikian juga jika terlalu polar xenobiotika ini akan mudah terlarut di dalam saluran cerna namun transport melalui membran biologis akan terhambat. Paparan xenobiotika (rute administrasi) dapat melalui oral, inhalasi, topikal, rektal, atau vaginal. Sedangkan pemasukan xenobiotika langsung ke sirkulasi sistemik (injeksi), dapat dikatakan bahwa xenobiotika tidak mengalami proses absorpsi. Rute pemakaian obat akan mempengaruhi onset dari aksi, durasi efek, intensitas dan qualitas efek dari obat. Pada pemakaian intravenus obat dapat langsung ditranspor ke reseptor, rute pemakaian ini tentunya akan memberikan efek yang paling maksimum dan onset aksi yang singkat. Namun pemakaian intravenus pada penyalahgunaan obat 17
terlarang lebih banyak menimbulkan resiko yang berbahanya, oleh sebab itu pada kasus ini pemakaian melalui inhalasi dan merokok merupakan alternatif yang lebih poluler dikalangan junkies. Jika drug dihisap melalui hidung atau bersamaan dengan rokok, maka drug akan sangat cepat terabsorpsi di alveoli paruparu, dan selanjutnya melalui pembuluh darah arteri dibawa ke otak. Oleh sebab itu efek akan lebih cepat timbul. Pemakaian ”crack” (bentuk kokain yang digunakan secara merokok) dengan menghisap akan menimbulkan onset aksi yang sangat singkat, sehingga intesitas eforia akan cepat tercapai. Demikian juga pada pemakain heroin secara inhalasi, efek eforia akan relatif sama tercapainya dibandingkan dengan pemakaian secara intravenus. Heroin biasanya digunakan dengan cara menguapkan dan kemudian uap dihirup, dengan merokok, atau injeksi secara intravenus. Setelah heroin sampai di sirkulasi sistemik, maka heroin sangat cepat menuju otak. Karena sangat cepatnya timbulnya efek pada pemakaian intravenus, maka rute pemakaian ini sangat digemari oleh para junkis. Namun pemakain ini sangat berresiko ketimbang pemakaian secara inhalasi atau merokok, karena sering ditemui muncul penyakit bawaan lain pada pemakaian injeksi, seperti infeksi HIV, hepatitis.
kapiler mesenterika menuju vena porta hepatika menuju hati sebelum ke sirkulasi sistemik, dari sini akan terdistribusi ke seluruh tubuh. 3.2.2. Distribusi Setelah tokson mencapai sistem peredahan darah, bersama darah akan terdistribusi ke seluruh tubuh. WEISS M. (1990) membagi distribusi ke dalam konveksi (transpor tokson bersama peredaran darah) dan difusi (difusi tokson di dalam sel atau jaringan). Transprot tokson intra- dan inter organ di dalam tubuh diprasaranai oleh sistem peredaran darah. Difusi berperan penting dalam transport suatu tokson diantara ekstra dan intra selular. Difusi tokson melalui membran biologi dapat berlangsung melalui berbagai proses difusi, seperti: difusi pasif, difusi aktif (melalui sistem transport tertentu ,”cariier”, melalui finocitose, atau fagocitose) atau melalui poren. Laju difusi suatu tokson sangat ditentukan oleh sifat fisikokimanya (lipofili, ukuran melekul, derajat ionisasi, ikatan dengan protein plasma). Transpor Transport dapat di kelompokkan ke dalam dua proses utama, yaitu konveksi (transport xenobiotika bersama aliran darah) dan difusi (transport xenobiotika melalui membran biologis). Sirkulasi sistemik sangat memegang peranan penting dalam transport xenobiotika antar organ dan jaringan di dalam tubuh. Sehingga laju peredaran darah di dalam organ atau jaringan juga akan menentukan kecepatan distribusi xenobiotika di dalam tubuh.
Pada paparan melalui oral bentuk farmasetik (tablet, kapsul, dll) akan terdispersi dan melarut di dalam cairan saluran pencernaan. Bentuk terlarut melalui pembuluh kapiler pada saluran pencernaan akan terabsorpsi. Absorpsi ini sebagaian besar berlangsung di pembuluh kapiler usus halus, kemudian melalui pembuluh Tabel 3.2: Laju aliran darah pada berbagai organ pada orang dewasa Organ Prosen (%) dari Prosen (%) dari berat badan volum jantung per menit Aliran darahnya bagus: Ginjal 0,5 20 Hati 2,8 28 Otak 2,0 12 Paru-paru 1,5 100 Jantung 0,5 4 Lambung dan usus saluran 2,8 24 pencernaan Aliran darahnya kurang bagus: Kulit 10 6 Otot-otot 40 23 Aliran darahnya jelek: Jaringan Lemak 18 5 Fase Kerja Toksik
Laju aliran darah (ml/min/100g organ) 400 85 54 400 84 70 5 5 2,1
18
Pada tabel 3.2 menggambarkan perbedaan jalu aliran darah di berbagai organ tubuh. Organ tubuh seperti ginjal, hati, otak, paru-paru, jantung, lambung dan usus, adalah organorgan yang memiliki laju aliran darah (perfusi) yang baik. Karena laju aliran darah dalam organ-organ ini sangat baik, maka xenobiotika akan sangat cepat terdistribusi homogen di dalam organ tersebut, jika dibandingkan pada organ-organ yang memiliki laju aliran darah relatif lambat. Difusi Pada pemodelan farmakokinetik, tubuh dibagi menjadi berbagai ruang difusi (kompartimen). Pembagian ruang ini hanya didasarkan pada laju distribusi xenobiotika. Perlu ditegaskan di sini bahwa, pembagaian kompartimen ini hanya merupakan langkah abstraksi guna mempermudah pemahaman ruang distribusi (difusi) xenobiotika di dalam tubuh. Model yang paling sederhana untuk memahami jalu difusi xenobiotika di dalam tubuh adalah model kompartimen tunggal. Pada model ini tubuh dipandang seperti satu ember besar, dimana difusi xenobiotika hanya ditentukan oleh daya konveksi di dalam ember. Namun pada kenyataannya, agar xenobitika dapat ditransportasi dari saluran kapiler pembuluh darah menuju sel-sel pada jaringan tubuh, haruslah melewati membran biologis, yaitu membran yang menyeliputi sel-sel di dalam tubuh. Secara keseluruhan luas permukaan kapiler tubuh (orang dewasa) diperkirakan berkisar antara 6000-8000 m2, dengan panjang keseluruhan diduga sekitar 95000 km. Di bagian luar kapileredotel ini diselimuti oleh membran basal yang sangat halus dan elastis. Struktur membran basal dapat dibedakan menjadi: - kapiler yang sangat tertutup (contoh: barier sawar darah otak) - kapiler yang berjendela, pada jendela ini terjadi pertukaran cairan yang sangat intensiv, jarak jendela dalam kapiler ini adalah tidak beraturan (contoh:tubulus ginjal), - kapiler yang terbuka, tidak terdapat hubungan antar sel-sel endotel, sehingga pada kapiler ini terdapat lubang-lungang yang besar, yang dapat dilewati oleh plasma darah (contoh: hati). Fase Kerja Toksik
Laju penetrasi xenobiotika melewati membran biologis akan ditentukan oleh struktur membran basal dan juga sifat lipofilitasnya. Senyawa-senyawa lipofil akan dapat menembus membran biologis dengan baik, sedangkan senyawa yang polar (larut air) haruslah melewati lubang-lunag di membran biologis, yang dikenal dengan „poren“. Jumlah poren dalam membran biologis adalah terbatas, oleh sebab itu dapatlah dimengerti, bahwa senyawa lipofil akan terdistribusi lebih cepat dibandingkan senyawa hidrofil (lihat tabel 3.3). Difusi xenobiotika melalui membran biologis dapat berlangsung melalui berbagai proses, seperti: difusi pasiv, difusi aktiv, melalui poren dan juga melalui jembatan intraseluler. Ketika xenobiotika mencapai pembuluh darah, maka bersama darah melalui sirkulasi sistemik siap untuk didistribusikan ke reseptor dan ke seluruh tubuh. Untuk memudahkan memahami sejauh mana suatu xenobiotika terdistribusi di dalam tubuh, para ilmuan farmakokinetik mengumpamakan bahwa xenobitika di dalam tubuh akan terdistribusi di dalam suatu ruang, yang memiliki sejumlah volume tertentu. Jadi kemampuan suatu xenobiotika untuk terdistribusi di dalam tubuh dinyatakan sebagai parameter yang disebut dengan volume distribusi. Distribusi Terdapat banyak faktor yang dapat mempengaruhi proses distribusi dari suatu xenobiotika, dimana faktor-faktor tersebut dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu: a) faktor biologis: - laju aliran darah dari organ dan jaringan, - sifat membran biologis - perbedaan pH antara plasma dan jaringan b) faktor sifat molekul xenobiotika - ukuran molekul - ikatan antara protein plasma dan protein jaringan - kelarutan - sifat kimia Senyawa yang larut lemak akan lebih mudah terdistribusi ke seluruh jaringan tubuh, sehingga pada umumnya senyawa lipofil akan mempunyai volume distribusi yang jauh lebih besar ketimbang senyawa yang hidrofil. TetraHidro-Canabinol (THC) (zat halusinogen dari tanaman ganja) adalah sangat larut lemak, 19
sehingga THC akan sangat mudah terdistribusi jaringan lemak, dan ini akan memperlambat laju ke seluruh jaringan dan akan terdeposisi di eliminasi THC. Etanol (alkohol), senyawa yang jaringan lemak, oleh sebab itu THC memiliki bersifat agak hidrofil, sebagian besar volume distribusi yang relatif besar (4-14 l/kg). terdistribusi di dalam cairan intra- dan Karena kelarutannya yang tinggi, hal itu pun ekstraseluler tubuh. Volume distribusi (Vd) menyebabkan THC sangat lama tertambat di etanol adalah 0,5 l/kg. Tabel 3.3: Permeabilitas beberapa membran biologis (H Nau, 1994) Membran lipid - barier sawar darah otak darah ( liquor) darah ( otak ) - lapisan lendir penanjang saluran pencernaan - lapisan lendir di mulut - tubulus ginjal - kulit
hanya xenobiotika lipofil, tidak terionisasi; xenobitika polar akan terperfusi sangat lambat atau sama sekali tidak
Membran lipid dengan „Poren“ - darah ( hati ) - hati ( empedu ) - paru-paru - plasenta - darah ( kelenjar mamai) - kapilar-kapiler di kulit dan otot - lapisan lendir (mata, hidung, kantung kemih) - glomerulus ginjal (Filtrasi)
xenobiotika lipofil dan hidrofil dapat lewat
3.2.3 Metabolisme dan Ekskresi Metabolisme dan ekskresi dapat dirangkum ke dalam eliminasi. Yang dimaksud proses eliminasi adalah proses hilangnya xenobiotika dari dalam tubuh organisme. Eliminasi seatu xenobiotika dapat melalui reaksi biotransformasi (metabolisme) atau ekskresi xenobiotika melalui ginjal, empedu, saluran pencernaan, dan jalur eksresi lainnya (kelenjar keringan, kelenjar mamai, kelenjar ludah, paruparu). Jalur eliminasi yang paling penting adalah eliminasi melalui hati (reaksi metabolisme) dan eksresi melalui ginjal. Ginjal sangat memegang peranan penting dalam mengekskresi baik senyawa eksogen (xenobiotika) maupun seyawa endogen, yang pada umumnya tidak diperlukan lagi oleh tubuh. Proses utama ekskresi renal dari xenobiotika adalah: filtrasi glumerula, sekresi aktiv tubular, dan resorpsi pasiv tubular. Pada filtrasi glumerular, ukuran melekul memegang peranan penting. Molekul-molekul dengan diameter yang lebih besar dari 4 nm atau dengan berat lebih besar dari 50 kilo Dalton (k Da) tidak dapat melewati filtrasi glumerular. Oleh sebab itu hanya senyawa dengan ukuran dan berat lebih kecil akan dapat terekskresi. Fase Kerja Toksik
Xenobiotika yang terikat dengan protein plasma tentunya tidak dapat terekskresi melalui ginjal. Resorpsi pasiv tubular ditentukan oleh gradien konsentrasi xenobitika antara urin dan plasma di dalam pembuluh tubuli. Berbeda dengan resorpsi tubular, sekresi tubular melibatkan proses transport aktiv. Xenobiotika yang masuk ke dalam tubuh akan diperlakukan oleh sistem enzim tubuh, sehingga senyawa tersebut akan mengalami perubahan struktur kimia dan pada akhirnya dapat dieksresi dari dalam tubuh. Proses biokimia yang dialami oleh ”xenobiotika” dikenal dengan reaksi biotransformasi. Biotransformasi pada umumnya berlangsung di hati dan sebagian kecil di organ-organ lain seperti: ginjal, paru-paru, saluran pencernaan, kelenjar susu, otot, kulit atau di darah. Secara umum proses biotransformasi dapat dibagi menjadi dua fase, yaitu fase I (reaksi fungsionalisasi) dan fase II (reaksi konjugasi). Dalam fase pertama ini tokson akan mengalami pemasukan gugus fungsi baru, pengubahan gugus fungsi yang ada atau reaksi penguraian melalui reaksi oksidasi (dehalogenasi, dealkilasi, deaminasi, desulfurisasi, pembentukan oksida, hidroksilasi, oksidasi alkohol dan oksidasi aldehida); rekasi reduksi 20
(reduksi azo, reduksi nitro reduksi aldehid atau keton) dan hidrolisis (hidrolisis dari ester amida). Pada fase II ini tokson yang telah siap atau termetabolisme melalui fase I akan terkopel (membentuk konjugat) atau melalui proses sintesis dengan senyawa endogen tubuh, seperti: Konjugasi dengan asam glukuronida asam amino, asam sulfat, metilasi, alkilasi, pembentukan asam merkaptofurat. Enzim-enzim yang terlibat dalam biotransformasi pada umumnya tidak spesifik terhadap substrat. Enzim ini (seperti monooksigenase, glukuronidase) umumnya terikat pada membran dari retikulum endoplasmik dan sebagian terlokalisasi juga pada mitokondria, disamping itu ada bentuk terikat sebagai enzim terlarut (seperti esterase, amidase, sulfoterase). Sistem enzim yang terlibat pada reaksi fase I umumnya terdapat di dalam retikulum endoplasmik halus, sedangkan sistem enzim yang terlibat pada reaksi fase II sebagian besar ditemukan di sitosol. Disamping memetabolisme xenobiotika, sistem enzim ini juga terlibat dalam reaksi biotransformasi senyawa endogen (seperti: hormon steroid, biliribun, asam urat, dll). Selain organ-organ tubuh, bakteri flora usus juga dapat melakukan reaksi metabolisme, khususnya reaksi reduksi dan hidrolisis.
3.3. Fase Toksodinamik Setelah tokson didistribusikan ke reseptor (tempat kerja tokson), maka tokson siap berinteraksi dengan reseptor. Hasil interaksi ini diimplementasikan sebagai efek farmakologik (efek racun yang ditimbulkan, seperti efek toksik alergi, schok anafilaktik, mutagenesis, teratogenesis, dan lainnya). Kualitas efek ini sebanding dengan konsentrasi tokson di reseptor. Mekanisme Utama Interaksi tokson-resptor adalah: • Interaksi dengan sistem enzim – Inhibisi enzim tak bolak-balik • Contoh: inhibisi asetilkolenesterase oleh organofosfat – Inhibisi enzim secara reversibel – Pemutusan reaksi biokimia – Inhibisi fotosinteses pada tanaman – Sentesis zat mematikan Fase Kerja Toksik
–
• • • • •
Pengambilan ion logam penting untuk kerja enzim – Inhibisi penghantaran elektron dalam rantai pernafasan Inhibisi pada transport oksigen karena gangguan pada hemoglobin Interaksi dengan fungsi umum sel Gangguan pada sintesa DNA dan RNA Kerja teratogenik Reaksi hipersensitif (alergi)
3.4. Pemodelan Farmakokinetik Dalam mempelajari farmakokinetik suatu xenobiotika haruslah disadari, bahwa semua proses farmakokinetik terjadi tidaklah seperti alur blok yang diskret (satu proses akan diikuti oleh proses yang lain apabila proses sebelumnya telah tuntas berakhir), melainkan lebih merupakan suatu proses kombinasi satu dengan yang lain. Setelah molekul xenobiotika diabsorpsi dan menuju sirkulasi sistemik, maka akan siap di transportasi ke seluruh tubuh, dalam waktu bersamaan akan ada molekul xenobiotika yang berikatan dengan reseptor dan ada terdapat juga molekul yang lain mengalami reaksi metabolisme, atau ada molekul yang langsung dieksresi oleh ginjal. Proses ini yang dimaksud dengan kombinasi satu dengan yang lain. Kompartemen model adalah pemodelan klasik, yang sampai saat ini masih banyak digunakan, yang digunakan untuk menggambarkan sifat disposisi (perubahan konsentrasi sebagai fungsi waktu) xenobiotika di dalam tubuh. Kompartemen model adalah gambaran kinetik, yang mengkarakterisasi sifat-sifat absorpsi, disposisi, dan eliminasi dari suatu xenobiotika di dalam tubuh. Karena kompartemen merupakan gambaran sifat kinetik, maka seharusnya pengertian suatu kompartemen dilandasi (dibatasi) atas laju dari suatu proses. Oleh sebab itu kompartemen disini tidak dapat didefinisikan sebagai suatu ruang, melainkan suatu poses yang memiliki laju yang sama (Weis 1990). Kurva konsentrasi suatu xenobiotika di dalam cairan tubuh merupakan jumlah dari proses invasi, distribusi, dan eliminasi. Proses invasi digambarkan sebagai fungsi input „I(t)“ dan proses ini menggambarkan bagaimana suatu xenobiotika mencapai sirkulasi sistemik. Poses distribusi dan eliminasi dirangkum ke dalam 21
fungsi disposis“fd(t)“. Sehingga kurvakonsentrasi-waktu (konsentrasi profil) suatu xenobiotika merupakan gabungan dari fungsi input dan disposisi dari xenobiotika tersebut. Persamaan matematis dari fungsi ini dapat ditulis dengan menggunakan operasi konvulasi. Operasi ini ditandai dengan asterik (*), sehingga konsentrsi profil suatu xenobiotika dapat ditulis sebagai:
[C ](t ) = I (t ) * fd (t )
(3.1)
Laju invasi dan disposisi mengikuti hukum kinetika orde ke pertama artinya laju invasi dan disposisi berbanding lurus dengan konsentrasi xenobiotika. Secara umum fungsi diposisi ini digambarkan sebagai jumlah fungsi eksponential: (3.2)
i =1
αi dan λi = parameter diposisi n = jumlah fungsi eksponensial (jumlah dari kompartemen) t = waktu
iv p
i
(3.3)
i =1
Div
km
Ap
n
∑ α i e −λ t
= adalah sama dengan fungsi input I(t)
Dalam menganalisis metabolit kinetik digunakan istilah senyawa induk (p) dan juga metabolit primer (mi). Metabolit kinetik adalah analisa matematis dari profil konsentrasi senyawa induk dan metabolit yang terbentuk. Sampai saat ini terdapat beberapa model untuk menganalisa metabolit kenetik dari suatu xenobiotika, yaitu: model kompartemen klasik, model psiologi, dan model komparten terbuka (Wirasuta, 2004).
n
D
[C ](t ) = D iv
Target analisis toksikologi tidaklah hanya senyawa induk, melainkan juga metabolitnya. Memperhatikan hubungan konsentrasi senyawa induk dan metabolit pada setiap waktu dapat menggambarkan keseluruhan jaringan proses farmakokinetik. Konstelasi konsentrasi antara senyawa induk dan metabolitnya sebagai fungsi waktu merupakan hal yang penting bagi toksikolog forensik dalam menginterpretasikan hasil analisis berkaitan dengan pertanyaan kapan suatu paparan itu terjadi. Oleh sebab itu disini dipandang perlu untuk menjelaskan model metabolit kinetik.
Perubahan konsentrsi dari sebagaian besar xenobiotika di dalam tubuh, mengikuti hukum kinetika orde ke pertama, hanya sedikit xenobiotika mengikuti orde ke nol. Alkohol adalah salah satu xenobiotika yang perubahan konsentrasinya di dalam tubuh manusia mengikuti hukum kinetika orde ke nol, yang artinya alkohol dieliminasi dari tubuh dengan kecepatan yang konstan.
fd (t ) = ∑ α i e −λit
Jika suatu xenobiotika diberikan secara intravenus dan perubahan konsentrasinya mengikuti hukum kinetika orde ke pertama, maka fungsi profil konsetrasinya dapat dinyatakan sebagai berikut:
Am
ke m
ku p Up Gambar 3.1: Skema model dari metabolit kinetik A U Div p
: Jumlah total xenobiotika di dalam tubuh : Jumlah xenobiotik yang eliminasi melalui ginjal : Dosis intravenus : Senyawa induk
Analisis metabolit kinetik berdasarkan model kompartemen klasik dan psiologi didasarkan pada pengandaian model terstruktur, dimana perubahan konsentrasi senyawa induk dan Fase Kerja Toksik
ke km ku m
: Konstanta laju eliminasi : Konstanta laju metabolisasi : Konstantan laju eliminasi melalui urin : Metabolit
metabolitnya memenuhi hukum kinetika orde pertama dan eleminasi senyawa induk berlangsung melalui hati (reaksi metabolisme) atau melalui ginjal (ekskresi). Dalam model ini juga diasumsikan bahwa laju distribusi dari 22
senyawa induk dan metabolitnya di dalam tubuh adalah sangat cepat dibandingkan dengan laju eleminasinya (Pang 1981,1985, Pang dan Kwan 1982, Houston 1982). Berikut ini gambaran skematis model metabolit kinetik pada model satu kompartemen:
dipecahkan apabila analisa matematisnya dengan menggunakan model kompartimen terbuka, dimana persamaan matematis diselesaikan dengan menggunakan Transformasi Laplace (Weiss 1998, Wirasuta 2004). Konsep dari model ini didasarkan pada asumsi bahwa perubahan konsentrasi xenobiotika dan metabolitnya di dalam tubuh mengikuti hukum kinetik orde pertama, sehingga profil konsentrasi suatu xenobiotika dapat digambarkan sebagai jumlah persamaan eksponential. Jika xenobiotika (senyawa induk „p“ diberikan secara intravenus maka profil konsentrasinya seperti yang tertulis dalam persamaan (3). Tranformasi persamaan tersebut ke daerah Laplace memberikan persamaan berikut ini: np αi iv p (3.5) [ p](s ) = D p ∑ i =1 s + λi p
Perubahan jumlah xenobiotika dapat dituliskan sebagai berikut:
A p (t ) = D ivp e
− ke pt
(3.3)
Dimana profil jumlah metabolit di dalam tubuh adalah:
Am (t ) =
(k
k m D ivp em
− ke p
) (e
− ke p t
−e
− ke mt
)
(3.4)
Banyak xenobiotika di dalam tubuh tidak mengikuti model satu kompartemen, sehingga dalam melakukan analisis matematik metabolit kinetik xenobiotika seperti ini akan sangat komplek. Masalah ini akan lebih mudah
(
)
Menurut persamaan (3.1), maka profil konsentrasi metabolit primer adalah:
[m]( s) = I m ( s) fd m ( s)
(3.8)
αi p ∑ s + λi i =1 p np
(
10 Fase Eliminasi
1
)
n m αi m ∑ + s λ im i =1
Konsentrasi (mg/ml)
Konsentrasi (mg/ml)
[m](s) = F p_m CL p Ψ p_m (s) D ivp
0,1 0,01
(
)
(3.9)
10
Fase Eliminasi 1 0,1 0,01 0,001
0,001 0
60
Fase Distribusi
120
180
240
Waktu (min)
0
120
240
360
480
600
720
Waktu (min)
Gambar 3.2: Kurva konsentrasi-waktu xenobiotika A (kiri) dengan metabolitnya B (kanan) mengikuti hukum kinetika orde ke pertama. A setelah intravenus, profil konsentrasinya mengikuti model disposisi dua-kompartemen, dimana setelah injeksi A sangat cepat terdistribusi (fase distribusi), yang ditandai dengan penurunan konsentrasi yang sangat cepat, kemudian diikuti dengan fase elminasi, pada saat ini terjadi kesetimbangan kecepatan trasport antara kedua kompartemen. Waktu paruh (t½) fase eliminasi biasanya digunakan oleh toksikolog forensik untuk menghitung/meraka kapan xenobiotika ”drug” pada waktu awal ”initial time” pemakaian.
Reaksi biokimia pembentukan metabolit primer dan transport metabolit yang terbentuk dari tempat reaksi metabolisme ke sirkulasi sistemik membutuhkan waktu. Laju rekasi dan tranport ini dikenal dengan fungsi waktuFase Kerja Toksik
transit-metabolisme „„Ψp_m (t)“ (Weiss 1998). Jika metabolisme berlangsung di hati, maka fungsi ini dikenal dengan fungsi waktu-transitmetabolisme-hepatika, fungsi ini ditulis sebagai: 23
Ψ p_m ( s ) =
λp (s + λ p )
(3.6)
λp_m= konstanta waktu dari fungsi-waktutransit-metabolisme Fungsi input dari biosintesa metabolit primer „Im(s)“ adalah:
I m ( s ) = F p_m CL p Ψ p _m ( s ) [ p ]( s )
(Weiss
1998) Fp_m
(3.7) = Fraksi dari senyawa induk „p“ yang terbentuk menjadi metabolit primer = Clearance senyawa induk CLp Ψp_m (s) = Fungsi waktu-transit-metabolisme dari senyawa induk membentuk metabolit primer 3.5. Parameter Farmakokinetik Clearance (CL) adalah satuan kemampuan dari organisme (organ tubuh) untuk mengeliminasi suatu xenobiotika. Clearence dapat juga dimengerti dengan jumlah volume dari xenobiotika yang mampu dieliminasi oleh organ (organismus) persatuan waktu. Oleh sebab itu satuan clearance adalah volume perwaktu (misal, ml/min). Waktu paruh (t1/2) adalah waktu yang dibutuhkan oleh xenobiotika tereliminasi menjadi setengah konsentrasi awalnya. Waktu paruh pada fase akhir disposisi (fase eliminasi) dikenal sebagai waktu paruh terminal (t1/2 Z). Hurup z menandakan fase akhir disposisi. Fase ini biasanya ditunjukkan oleh proses farmakokintik yang paling lambat. Waktu paruh dari metabolit yang diperoleh dari penghitungan secara logaritma kurvakonsentrasi-waktu metabolit dari senyawa induk biasanya disebut dengan waktu paruh semu ”apparance half life time” (t1/2 app). Waktu paruh setiap fase disposisi, dimana laju eliminasinya memenuhi hukum kinetika orde pertama, dapat dihitung dengan : t 1 i = ln 2 λ l (3.10) 2
Dari persamaan di atas tampak bahwa untuk laju eliminasi orde ke pertama, t½ adalah konstan. Tanpa perlu memperhatikan berapa jumlah atau konsentrasi xenobiotika pada keadaan awal, maka waktu yang diperlukan untuk berkurang menjadi separuhnya adalah konstan Volume distribusi (Vd) adalah volume virtual, dimana kelihatannya suatu xenobiotika Fase Kerja Toksik
terdistribusi atau di mana dianggap xenobiotika tersebut terlarut. Volume distribusi menyatakan suatu faktor yang harus diperhitungkan dalam memperkirakan jumlah xenobiotika dalam tubuh dari konsentrasi xenobiotika yang ditemukan dalam kompartimen cuplikan. Untuk sebagaian besar xenobiotika dianggap bahwa xenobiotika bersetimbangan secara cepat dalam tubuh. Tiap jaringan dapat mengandung suatu konsentrasi xenobiotika yang berbeda sehubungan dengan perbedaan afinitas xenobiotika terhadap jaringan tersebut. Oleh karena itu volume distribusi tidak mengandung suatu arti fiosologik yang sebenarnya dari Dengan asusmsi, bahwa tubuh manusia dapat diandaikan sebagai satu ruang distribusi (model satu kompartemen), maka pada pemakaian injeksi intravenus ”injeksi bolus” ratio antara dosis dan konsentrasi awal ([Co]) adalah menunjukkan volume distribusi xenobiotika tersebut.
V =D
iv
(3.11)
[C ]o
Dalam kinetika kompartemen ganda kita dapat menganggap secara matematik volume hipotetik, seperti volume dari kompartimen sentral (Vc) dan volume kompartemen perifer atau kompartemen jaringan (Vp). Volume distribusi, yang dihitung pada keadaan tunak ”steady state”, dimana laju obat masuk dan keluar dari dan ke kompartemen perifer adalah sama, disebut dengan volume distribusi dalam keadaan tunak. Volume distribusi area adalah volume hipotetik yang dihitung melalui persamaan berikut:
V ß = Varea = D
λ z [ AUC ]∞o
(3.12)
Oleh karena clearance total sama dengan
D
[ AUC ]∞o
, maka Vß dapat dinyatakan
dalam clearance dengan tetapan laju eliminasi pada fase terminal (λz),
V ß = Varea = CL
λz
(3.13)
Volume distribusi area dipengaruhi oleh laju eliminasi obat pada fase terminal dan clearance total obat dari dalam tubuh. Perubahan ini mungkin diakibat oleh perubahan fungsi organ tubuh (ginjal, hati). Sedangkan volume 24
distribusi pada keadaan tunak dipengaruhi perubahan eliminasi obat.
tidak
3.6. Biotransformasi (metabolisme) Senyawa-senyawa lipofil setelah terfiltrasi glumerular akan direabsorpsi melalui tubili ginjal menuju sistem peredaran darah. Ekskresi senyawa ini akan belangsung dengan sangat lambat. Jika senyawa tersebut tidak mengalami perubahan kimia, kemungkinan akan menimbulkan bahaya yang sangat serius. Senyawa lipofil ini akan tingal dalam waktu yang cukup di dalam tubuh, yaitu terdeposisi di jaringan lemak. Pada prinsipnya senyawa yang hidrofil akan dengan mudah terekskresi melalui ginjal. Ekskresi ini adalah jalur utama eliminasi senyawa asing (xenobiotika) dari dalam tubuh. Sehingga sebagian besar senyawa-senyawa lipofil terlebih dahulu oleh tubuh dirubah menjadi senyawa yang lebih bersifat hidrofil. Proses perubahan biokimia dari xenobiotika dikenal dengan biotransformasi. Biotransformasi pada umumnya berlangsung di hati dan sebagian kecil di organ-organ lain seperti: ginjal, paru-paru, saluran pencernaan, kelenjar susu, otot, kulit atau di darah. Pada umumnya biotransformasi akan mengakhiri efek farmakologi dari xenobiotika (detoksifikasi / inaktivasi). Namun ada beberapa xenobiotika setelah termetabolisme mengalami peningkatan aktivitasnya (bioaktivasi), seperti bromobenzen melalui
oksidasi membentuk bentuk bromobenzen epoksid. Bromobenzen epoksid akan terikat secara kovalen pada makromlekul jaringan hati dan mengakibatkan nekrosis hati. Biotransformasi belangsung dalam dua tahap, yaitu reaksi fase I dan fase II. Rekasi fase I melibatkan reaksi oksidasi, reduksi dan hidrolisis. Sedangkan reaksi fase II adalah pengkopelan hasil reaksi fase I (metabolit fase I) dengan suatu senyawa endogen. Reaksi fase II disebut juga reaksi konjugasi. Gambar 1 menggambarkan reaksi-rekasi penting yang terjadi dalam biotransformasi. Enzim-enzim yang terlibat dalam biotransformasi pada umumnya tidak spesifik terhadap substrat. Enzim ini (seperti monooksigenase, glukuronidase) umumnya terikat pada membran dari retikulum endoplasmik dan sebagian terlokalisasi juga pada mitokondria, disamping itu ada bentuk terikat sebagai enzim terlarut (seperti esterase, amidase, sulfoterase). Sistem enzim yang terlibat pada reaksi fase I umumnya terdapat di dalam retikulum endoplasmik halus, sedangkan sistem enzim yang terlibat pada reaksi fase II sebagian besar ditemukan di sitosol. Disamping memetabolisme xenobiotika, sistem enzim ini juga terlibat dalam reaksi biotransformasi senyawa endogen (seperti: hormon steroid, biliribun, asam urat, dll). Selain organ-organ tubuh, bakteri flora usus juga dapat melakukan reaksi metabolisme, khususnya reaksi reduksi dan hidrolisis.
Reaksi Fase I
Reaksi Fase II Metabolit Fase II
Metabolit Fase I
Xenobiotika Oksidasi Reduksi Hidrolisis
Konjugasi dengan: - asam glukoronat - sulfat - asetat l t ti
Gabar 3.3: Proses dan reaksi penting dalam biotransformasi menghasilkan suatu gugus fungsi, yang 3.6.1. Reaksi Fase I selanjutnya pada fase ke II akan terkonjugasi Reaksi fase I ini juga disebut dengan reaksi a. Reaksi oksidasi fungsionalisasi, sebab melalui reaksi fase ini (oksidasi, reduksi atau hidrolisis) 25 Fase Kerja Toksik
Reaksi oksidasi mempunyai peranan penting pada biotransformasi, khususnya reaksi-reaksi yang melibatkan sistem enzim oksidase, monooksigenase dan dioksigenase. Oksidase mengoksidasi melalui masuknya oksigen (elektron). Melalui mono-oksigenase akan dimasukkan satu atom oksigen ke dalam xenobiotika dan molekul oksigen yang lainnya akan direduksi menjadi air. Berbeda dengan dioksigenase, kedua atom oksigen akan dimasukkan ke dalam xenobiotika. Sistem enzim yang yang mengkatalisis rekasi oksigenase ini memerlukan sistem sitokrom P450 dan NADPH-sitokrom P-450 reduktase, NADPH dan molekul oksigen. Oksidasi pada sitokrom P-450 sangat memegang peranan penting dalam biotransformasi xenobiotika. Sitokrom P-450 adalah hemoprotein dengan suatu kharakter puncak absorpsi dari bentuk terreduksi COkompleknya pada panjang gelombang 450 nm. Enzim sitokrom P-450 terletak di retikulum endoplasmik dari beberapa jaringan. Sistem enzim yang mengkatalisis reaksi ini dikenal dengan mikrosomal oksidasi fungsi campur (microsomal mixed-function oxidase, MFO). Reaksi oksidase multi level ini digambarkan secara skematis pada gambar 3.4. R-OH Fe3+ Fe3+
.
R
IOI
H2O
RH
R-H
F e 3+
OH
F e 3+
NADPH +
H+
NADPH + H+
RH
Fp
CYP b5 e
e
Fe 2+ RH
+ 2 H* Fe3+ O22RH
Fe3+
Fe2+
O2-
O2
RH
RH
O2
Gambar 3.4. Sistem Sitokrom P-450 Substrat R-H tertempel pada Sitokrom (CYP), dengan itu CYP-450 reduktase teraktivasi dan satu elektron diserahkan pada CYP-450. CYP450 tereduksi dapat menerima satu melekul O2 dan oksigen mendapat satu elektron dari CYP450. Komplek CYP-450, O2 dan R-H akan terpecah dengan memberikan oksigen pada Fase Kerja Toksik
substrat (R-H) menjadi R-OH begitu juga oksidasi CYP-450Fe3+ . Substrat xenobiotika bereaksi dengan bentuk teroksidasi CYP-450Fe3+ membentuk komplek enzim-subtrat. Sitokrom P-450 reduktase mendapatkan satu elektron dari NADPH, yang akan mereduksi komplek dari CYP-450Fe3+— xenobiotika. Bentuk reduksi dari komplek CYP450Fe2+—xenobiotika bereaksi dengan molekul oksigen dan kemudian mendapatkan elektron yang ke dua dari NADPH, yang diperoleh dari flavoprotein reduktase yang sama, membentuk species oksigen terakivasi. Langkah terakhir satu atom oksigen terlepas sebagai H2O dan atom oksigen yang lain ditransfer ke dalam substrat dan bentuk teroksidasi CYP-450Fe3+ terregenerasi. Sistem enzim CYP-450 monooksigenase mengkata-lisis reaksi seperti berikut (I: inaktivasi efek toksik, A: aktivasi efek toksik) : 1. Hidroksilasi dari rantai karbon dan alkilen: R-CH2-CH2-CH3 → R-CH2-CH2-CH2-OH atau RCH2-CHOH-CH3 contoh: I : Butan → Butanol Etilbenzol → Fentilbenzol Tetrahidrokanabinol (THC) → 11-OH-THC A: Hexan → 2,6-Hexandiol (→ Hexandion) 2. Hidroksilasi dari aromatik menjadi fenol I: Fenitoin → Hidroksifenition 3. Hidroksilasi alkilamin I: Imipramin → Desimipramin Diazepam → Nordiazepam Lidokain → Monoetilglisinsilidid Cocain → Norcocain A: Dimetilnitroamin → Metilnitrosoamin 4. Hidroksilasi dari alkileter, alkiltiol R-CH2O(S)-CH3 → R-CH2(s)OH + HCHO I : Papaverin → O-Desmetilpapaverin A: Kodein → Morphin 5. Epoksidasi dari alifatis atau aromatis rantai ganda O
RCH=CHR
RHC
CHR
O
I : Karbamazepin → Karbamazepinepoksid A:Trikloretilen → [Trikloretilenepoksid] Benzo(a)piren-7,8-dihidridiol → Bezo(a)piren-7,8-dihidrodiol-9,10-epoksid 26
6. Oksidatif desaminasi RCH(CH3)-NH2 → RCHOH(CH3)-NH2 → RCOCH3 + NH3
Tabel 3.4: Bentuk-bentuk spesifisitas substratnya* CYP-450 Substrat
7. Oksidatif desulfurasi (R-O)3P=S → (R-O)3P=O A: Paration → Paraokson
CYP1A1 CYP1A2
8. Oksidasif dehalogenasi RCH2X → RCHXOH → RCHO + HX I: Benzilklorid → Benzaldehid Lindan → Triklorfenol 9. S-oksidatif membentuk sulfoksida dan sulfona R1-CH2-S-CH2-R2 → R1-CH2-SO-CH2-R2 → R1CH2-SO2-CH2-R2 I : Fenotiasin → Solfoksid → Sulfon A: Temefos → Temefos-S-oksid 10. N-oksidatif membentuk N-oksida atau Hidroksil-amin (R)3N → (R)2N-OH I : Amitriptilin → Amitriptilin-N-oksid A: Naftilamin → Naftilaminhidroksilamin 11. Alkohol: Oksidatif membentuk aldehid Sekarang ini telah dilaporkan 4 keluarga gen dari CYP-450-isoenzim (CYP1, CYP2, CYP3 dan CYP4), yang terdiri dari 16 subfamili (SCHMOLD 2003). Sistem standard untuk mengelompokan keluarga CYP-450 multigen adalah berdasarkan kesamaan sequensi dari individual proteinnya. Apabila lebih dari 40% asam amino yang teridentifikasi memiliki kesaman sequen maka akan dikelompokkan ke dalam satu keluarga gen CYP-450. Satu keluarga gen CYP-450 dibagi pula menjadi beberapa sub keluarga, apabila dalam satu famili mempunyai kesamaan lebih dari 55% sequensi maka akan dikelompokkan ke dalam satu subfamili. Tabel 1 memberikan kelompok CYP-450 insoenzim dan kespesifisitas subtratnya. Aktifitas dari CYP-450-isoenzim ini kadang dapat dipisahkan, namun terdapat beberapa famili yang aktivitasnya tumpang tindih. Perbedaan ini mempunyai pengaruh yang sangat relevan terhadap kenetik, inaktivasi atau bioaktivasi dari substrat. Isoenzim CYP2D6 bertanggungjawab pada rekasi N- dan Odealkilasi, telah dilaporkan pada kelompok populasi tertentu diketemukan ganganguan dalam polimorfismus dari isoenzim ini. Sehingga terdapat perbedaan kinetik N- atau Odealkilasi pada sekelompok populasi tersebut. Fase Kerja Toksik
CYP2A1 CYP2A2 CYP2A6 CYP2B1 CYP2B2 CYP2C CYP2C9 CYP2D6 CYP2E1 CYP3A CYP3A4 CYP3A2 CYP4A1 CYP4A2
CYP-450
dan
PAH, arilamin, fenacetin, kafein, benzo(a)piren, aflatoksin B, heterisiklik amin 7a-testosteron 15a-testosteron Dietilnitrosamin Resorufin Cocain Etotoin, heksobarbital, metosuksimid Naproksen Debrisoquin, spartain, kodein, propanolol Umumnya senyawa bermolekul kecil, etanol, benzol, stirol, CCl4, dll Eritromizin, midazolam Nefedifin, etiletradiol, progesteron, aflatoksin, dan banyak lagi substrat yang lain Fluokinolon Asam-asam lemak
* dikutip dari SCHMOLD (2003) Sekitar 5% penduduk asia memiliki kelainan genetik polimufismus CYP2D6, sehingga pada kelompok populasi ini kodein terjadi hambatan dalam N-demetilasi menjadi morfin. Flavinmonooksigenase. Disamping oksidatif yang dikatalisis oleh CYP-450 terdapat juga oksidatif yang tidak tergatung pada CYP-450, yaitu sistem enzim flavonmonooksigenase. Sistem enzim ini merubah amin sekunder menjadi hidroksilamin dan amin tersier menjadi N-oksida. Sistem enzim oksidatif lainnya. Sistem enzim oksidatif selain dua sistim di atas adalah: - Alkoholdehidrogenase, khususnya mendehidrasi etanol menjadi aldehid. - Aldehid oksidase, merubah aldehid menjadi asam karboksilat - Monoaminoksidase, mengoksidasi aminbiogen (seperti: Catekolamin) b. Reaksi reduksi Dibandingkan dengan reaksi oksidasi, rekasi reduksi mempunyai peran minor dalam biotransformasi. Gugus karbonil melalui alkoholdehidrogenase atau citoplasmik aldoketo-reduktase direduksi menjadi alkohol. Pemutusan ikatan azo menjadi amin primer melalui pembentukan hidrazo melibatkan 27
banyak enzim-enzim, diantaranya: NADPH-CYP450-reduktase. Reduktif dehalogenasi sangat beperan penting dalam detoksifikasi dari senyawa-senyawa alifatis halogen (Cl, Br dan I), seperti: Senyawa karbon tetraklorida atau halotan. c. Biohidrolisis Banyak xenobiotika yang mengandung ikatan jenis ester dapat dihidrolisis, diantaranya ester, amid dan fosfat. Reaksi-reaksi biohidrolisis yang penting adalah: - Pemutusan ester atau amida menjadi asam karboksilat dan alkohol (atau amin) melalui esterase atau amidase. - Perubahan epoksida menjadi vicinalen diol melalui enzim epoksidihidratase - Hidrolisis dari acetylen (glikosida) melalui enzim glikosidase. Ester atau amida dihidrolisis oleh enzim yang sama, namun pemutusan ester jauh lebih cepat dari pada amida. Enzim-einzim ini berada di intra- dan juga extra selular, baik dalam keadaan terikat dengan mikrosomal maupun terlarut. Enzim hidrolitik terdapat juga di saluran pencernaan. Enzim-einzim ini akan menghidrolisis metabolit fase II (bentuk konjugat menjadi bentuk bebasnya). Selanjutnya bentuk bebas ini dapat kembali terabsorpsi menuju sistem peredaran darah. Proses ini dikenal dengan siklus enterohepatik. 3.6.2. Reaksi fase II Reaksi fase II melibatkan beberapa jenis metabolit endogen yang mungkin membentuk konjugat dengan xenobiotika atau metabolitnya. Pembentukan konjugat memerlukan adanya pusat-pusat reaktif dari substrat, biasanya gugus -OH, -NH2 dan COOH. Reaksi-reaksi penting pada fase II adalah kunjugasi dengan : - teraktivasi asam glukuronat, - teraktivasi sulfat, - asam amino (khususnya glisin), - oligopeptida dan ikatan dengan turunan asam merkapturat, - teraktivasi asam asetat, - metilasi. Hasil reaksi konjugasi bersifat sangat polar, sehingga sangat cepat tereksresi melalui ginjal Fase Kerja Toksik
bersama urin dan / atau melalui empedu menuju saluran cerna. Pada umumnya melalui reaksi fase II, xenobitika atau metabolit fase I mengalami deaktivasi. Namun belakangan ini telah dilaporkan beberapa metabolit fase II justru mengalami aktivasi, seperti morfin-6glukuronida mempunyai aktivitas antianalgesik yang lebih poten dari pada morfin. a. Glukuronidasi. Glukuronid adalah jenis konjugasi yang paling umum dan penting. Glukuronidasi dari gugus alkohol atau fenol adalah reaksi konjugasi yang paling sering pada reaksi fase II, disamping itu juga asam-asam karboksilat, senyawa sulfidril dan senyawa amin. Kosubstrat dari reaksi ini adalah Asam-uridin-5’-difosfo-α-D-glukuronat (UDPGA). Enzim yang mengkatalisi reaksi konjugasi ini adalah UDP-glukuroniltransferase (UGT). Enzim ini terikat di retikulum endoplasmik dan terdapat sebagian besar di bagian sisi-luminal dari hati atau organ lainnya. Enzim ini dikelompokkan ke dalam dua famili, yaitu UGT1 dan UGT2 (FICHTL 1998). Glukuronat juga mengkonjugasi senyawa endogen, seperti bilirubin, konjugasi ini dikatalis oleh UGT1*1. Enzim UGT dilain hal agak kurang spesifik, namun ada dari subfamilinya yang mempunyai spesifisitas yang tinggi. UGT2B7 adalah enzim yang mengkalisis konjugasi morfin menuju morfin-3glukuronid dan morfin-6-glukuronid dengan perbandingan residu yang berbeda (COFFMAN et al. 1996). UGT2B7 agak kurang spesifik dibandingkan dengan UGT1A1 hanya mengkatalisis morfin menuju morphin-3glukuronid (COFFMANN et al. 1998). b. Konjugasi Sulfat. Reaksi ini dikatalisis oleh sulfotranferase, yang diketemukan dalam fraksi sitosolik jaringan hati, ginjal dan usus. Koenzimnya adalah PAPS (3’-fosfoadenosin-5’-fosfosulfat). Konjugasi ini adalah untuk gugus fungsional: fenol, alkohol alifatik dan amin aromatik. R-OH R-NH2
PAPS
R-O-SO3H R-NH-SO3H
Konjugasi sulfat biasanya sebagian besar terhadap senyawa-senyawa endogen dan relativ jarang dengan xenobiotika. Jumlah cadangan koenzim PAPS biasanya terbatas dan mudah habis, sehingga pada peningkatan 28
jumlah substrat konjugasi sulfat menjadi jalur reaksi fase II yang kurang menonjol. c. Konjugasi dengan Asam amino (glisin). Konjugasi ini dikatalisis oleh konjugat asam amino dan koenzim-A. Asam karboksilat karboksilat, asam arilasetat dan asam akrilat yang mengalami substitusi aril dapat membentuk konjugat dengan asam amino, terutama glisin. d. Ikatan dengan turunan asam merkatofurat (konjugasi glutation). Reaksi konjugasi ini berlangsung dalam beberapa tingkat, sebagian belangsung secara spontan dan juga dikatalisis oleh glutation-Stransferase. Pada awalnya terbentuk konjugat glutation-substrat kemudian mengalami pemecahan enzimatik dari kedua asam amino. Melalui asetilasi dari sistein membentuk produk akhir berupa turunan N-asetilsistein (asam merkaptofurat) yang mudah diekskresi. Glutation dapat berkonjugasi dengan epoksid yang terbentuk akibat oksidasi dari halogen aromatik. Epoksida ini bersifat sangat elektrofilik yang sangat reaktif. Metabolit ini dapat bereaksi dengan unsur-unsur sel dan menyebabkan kematian sel atau pembentukan tomor. Konjugasi glutation akan berikatan dengan metabolit elektrofilik, dengan demikian akan mencegah metabolit ini berikatan dengan sel. Dengan demikian konjugasi glutation sangat berperanan penting dalam pencegahan tembentukan tomor (sel kanker). Selain itu glutation dapat berkonjugasi dengan senyawa alifatik tak jenuh dan menggantikan gugus nitro dalam suatu senyawa kimia. e. Asetilasi. Xenobiotika yang memiliki gugus amin aromatik, yang tidak dapat dimetabolisme secara oksidatif, biasanya akan diasetilisasi dengan bantuan enzim N-asetil transferase dan asetil koenzim A. Asetilasi merupakan fransfer gugus asetil ke amin aromatik primer, hidrazin, hidrazid, sulfoamid dan gugus amin alifatik primer tertentu. Acetil-CoA + RNH2
AT
CH3CONHR + HSCoA
Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat dua kelompok isoenzim N-asetil transferase (NAT1 dan NAT2). Genotif isoenzim NAT2 memiliki sifat plomorfismus, sehingga Fase Kerja Toksik
mengakibatkan perbedaan laju asetilasi (asetilasi cepat dan lambat). Hal ini dapat memberikan makna toksikologis penting pada populasi tertentu terhadap laju eliminasi dari substratnya, seperti: isoniazid, hidralazin, atau prokainamid. f. Metilasi. Di dalam biotransformasi, reaksi metilasi relatif sangat jarang, karena UDPGA tersidia lebih luas sehingga lebih mudah terbentuk glukuronid. Reaksi ini dikatalisis oleh metiltransferase. Koenzimnya adalah SAM (Sadenosinmetionin). Contoh N-metilasi (noradrenalin, nicotinamid, metadon) R1 C R2 C
NH
R1C R2C
3.6.3 Faktor-faktor yang metabolisme xenobiotika.
NCH3
mempengaruhi
Genetik, lingkungan dan psiologik adalah faktor-faktor yang dapat mempengaruhi reaksi biotransformasi (metabolisme). Faktor terpenting adalah genetik yang menentukan polimorfisme dalam oksidasi dan konjugasi dari xenobiotika, penggunaan dengan obatobatan secara bersamaan, paparan polutan atau bahan kimia lain dari lingkungan, kondisi kesehatan dan umur. Faktor-faktor ini diduga bertanggungjawab terhadap penurunan efisiensi biotransformasi, perpanjangan efek farmakologi dan peningkatan toksisitas. Induksi enzim, banyak xenobitika dapat meningkatkan sintesa sistem enzim metabolisme (induksi), induksi sistem enzim tertentu dapat meningkatkan laju biotransformasi senyawa tertentu. Contoh xenobiotika yang bersifat inkduksi enzim adalah fenobarbital. Fenobarbital dapat meningkatkan jumlah CYP450 dan NADPHsitokrom c reduktase. Inhibisi enzim, penghabantan sistem enzim biotransformasi akan mengakibatkan perpanjangan efek farmakologi dan meningkatnya efek toksik. Inhibisi sistem enzim CYP2D6 oleh quinidin, secara nyata dapat menekan metabolime spartain, debrisoquin atau kodein. Faktor Genetik, Telah dikenal dari hasil penelitian pengembangan dan penemuan obat baru, bahwa variabilitas genetik berperan penting pada reaksi metabolisme. Perbedaan 29
variabilitas ini dapat disebabkan oleh Genotipe dari masing-masing sel, sehingga dapat mengakibatkan kekurangan atau kelebihan suatu sistem enzim. Pada kenyataanya perbedaan aktivitas metabolisme ditentukan oleh fenotipe, yang tergantung pada genotipe dan satuan dari ekspresinya. Perbedaan fenotipe ini mengantarkan peneliti untuk mengelompokkan individu ke dalam populasi pematabolit cepat ”extensive metabolizer” dan pemetabolit lambat ”poor metabolizer”. Dalam berbagai kasus penekanan metabolisme melalui pengontrolan laju polimorfisasi dari enzim dapat mengakibatkan peningkatnya efek samping (efek toksik) pada pemetabolit lambat. Sebagai contoh faktor genetik adalah cacat pada system enzim glukuse-6-fosfatdihidrogenase, hal ini diakibatkan oleh kerusakan genetik dari X-kromosomal. Contoh lainnya adalah polimorfismus dari sistem enzim CYP2D6 yang lebih dikenal dengan polimorfismus spartain atau debrisoquin, polimorfismus sistem enzim CYP2C19 (polimorfismus mefenitoin dan polimorfismus N-asetil-transferase. Hampir 10% dari orang eropah memiliki gangguan dalam polimorfismus sistem enzim CYP2D6, yang mengakibatkan lambatnya metabolisme dari spartain, debrisoquin, kodein. Penyakit, Hati adalah organ utama yang bertanggungjawab pada reaksi biotransfromasi. Penyakit hepatitis akut atau kronis, sirosis hati dan nekrosis hati secara signifikan dapat menurunkan laju metabolisme xenobiotika. Pada sakit hati terjadi penurunan sintesa sistem enzim dan penurunan laju aliran darah melalui hati. Senyawa yang memiliki clearance hati (eliminasi persatuan volume) yang tinggi, penurunan laju aliran darah di hati secara signifikan akan menurunkan laju metabolismenya. Dilain hal senyawa-senyawa dengan clearan hati rendah, penurunan laju metabolisme pada kasus ini lebih ditentukan oleh penurunan aktivitas enzim metabolisme. Umur, pada bayi telah dikenal, kalau sistem einzim biotranformasi belum sempurna terbentuk. Pada bayi yang baru lahir (fetus) sistem enzim-enzim, yang terpenting (seperti: CYP-450, glukoronil-trensferase dan Acetiltransferase) belum berkembang dengan sempurna. Pada tahun pertama sistem enzim ini berkembang lebih sempurna, dan pada Fase Kerja Toksik
tahun ke lima fungsi sistem enzim biotransformasi telah mendekati sempurna seperti pada orang dewasa. Namun pada orang lanjut usia terjadi degradasi fungsi organ, hal ini juga mengakibatkan penurunan laju metabolisme. Faktor lingkungan. Pengaruh faktor fisik dan faktor sosial dalam biotransformasi masih sanga sedikit diketemukan di literatur. Namun faktor-faktor ini sering didiskusikan sebagai salah satu faktor, yang dapat berpengaruh pada laju metabolisme. Bahan Bacaan: 1. BENET, L.Z., KROETZ D.L. and SHEINER L.B., (1996), “Pharmacokinetics The dynamics of drug absorption, distribution, and elimination”, in HARDMAN J.G., GOODMAN GILMAN A.., LIMBIRD L.E., “Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics”, 9th edn, McGrawHill, New York p. 3-27. 2. COFFMAN, B.L., KING, C.D., RIOS, G.R. und TEPHLY, T.R. (1998),”The Glucuronidation of opioids, other xenobiotics and androgens by human UGT2B7Y (268) and UGT2B7H (268)”, Drug Metab. Dispos., 26: 73-77 3. COFFMAN, B.L., RIOS, G.R. und TEPHLY T.R. (1996),” Purification and properties of two rat liver phenobarbital-inducible UDPglucuronosyltransferases that catalyze the glucuronidation of opioids”, Drug Metab. Dispos., 24: 329-333 4. FICHTL B et al. , Allgemeine Pharmakologie und Toxikologie, in FORTH W et al. (Ed) Allgemeine und Spezielle Pharmakologie und Toxikologie 7. ed, Spektrum Akademiker Verlag, Berlin 1998, S. 3- 102. 5. LU, F.C. (1995), “Toksikologi dasar, asas, organ sasaran, dan penilaian resiko”, UIPress, Jakarta. 6. MUTSCHLER E. Und SCHÄFER-KORTING M. (1997) “Arzneimittel-Wirkungen Lehrbuch der Pharmakologie und Toksikologie” Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart. 7. SCHMOLD A. (2003), “Wirkungsbedingunen von Giften“, in MADEA, B. und BRINKMANN B., “Handbuch gerichtliche Medizin, Band 2.“, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. S. 14-30 30
BAB IV ANALISIS TOKSIKOLOGI FORENSIK 4.1. Pendahuluan Toksikologi forensik adalah salah satu dari cabang ilmu forensik. Menurut Saferstein yang dimaksud dengan Forensic Science adalah ”the application of science to low”, maka secara umum ilmu forensik (forensik sain) dapat dimengerti sebagai aplikasi atau pemanfaatan ilmu pengetahuan tertentu untuk penegakan hukum dan peradilan. Guna lebih memahami pengertian dan ruang lingkup kerja toksikologi forensik, maka akan lebih baik sebelumnya jika lebih mengenal apa itu bidang ilmu toksikologi. Ilmu toksikologi adalah ilmu yang menelaah tentang kerja dan efek berbahaya zat kimia atau racun terhadap mekanisme biologis suatu organisme. Racun adalah senyawa yang berpotensi memberikan efek yang berbahaya terhadap organisme. Sifat racun dari suatu senyawa ditentukan oleh: dosis, konsentrasi racun di reseptor, sifat fisiko kimis toksikan tersebut, kondisi bioorganisme atau sistem bioorganisme, paparan terhadap organisme dan bentuk efek yang ditimbulkan. Tosikologi forensik menekunkan diri pada aplikasi atau pemanfaatan ilmu toksikologi untuk kepentingan peradilan. Kerja utama dari toksikologi forensik adalah melakukan analisis kualitatif maupun kuantitatif dari racun dari bukti fisik dan menerjemahkan temuan analisisnya ke dalam ungkapan apakah ada atau tidaknya racun yang terlibat dalam tindak kriminal, yang dituduhkan, sebagai bukti dalam tindak kriminal (forensik) di pengadilan. Hasil analisis dan interpretasi temuan analisisnya ini akan dimuat ke dalam suatu laporan yang sesuai dengan hukum dan perundanganundangan. Menurut Hukum Acara Pidana (KUHAP), laporan ini dapat disebut dengan Surat Keterangan Ahli atau Surat Keterangan. Jadi toksikologi forensik dapat dimengerti sebagai pemanfaatan ilmu tosikologi untuk keperluan penegakan hukum dan peradilan. Toksikologi forensik merupakan ilmu terapan yang dalam praktisnya sangat didukung oleh berbagai bidang ilmu dasar lainnya, seperti kimia analisis, biokimia, kimia instrumentasi, farmakologi-toksikologi, farmakokinetik, biotransformasi. Analisis Toksikologi Forensik
Secara umum tugas toksikolog forensik adalah membantu penegak hukum khususnya dalam melakukan analisis racun baik kualitatif maupun kuantitatif dan kemudian menerjemahkan hasil analisis ke dalam suatu laporan (surat, surat keterangan ahli atau saksi ahli), sebagai bukti dalam tindak kriminal (forensik) di pengadilan. Lebih jelasnya toksikologi forensik mencangkup terapan ilmu alam dalam analisis racun sebagi bukti dalam tindak kriminal, dengan tujuan mendeteksi dan mengidentifikasi konsentrasi dari zat racun dan metabolitnya dari cairan biologis dan akhirnya menginterpretasikan temuan analisis dalam suatu argumentasi tentang penyebab keracunan dari suatu kasus. Menurut masyarakat toksikologi forensik amerika “society of forensic toxicologist, inc. SOFT” bidang kerja toksikologi forensik meliputi: - analisis dan mengevaluasi racun penyebab kematian, - analisis ada/tidaknya alkohol, obat terlarang di dalam cairan tubuh atau napas, yang dapat mengakibatkan perubahan prilaku (menurunnya kemampuan mengendarai kendaraan bermotor di jalan raya, tindak kekerasan dan kejahatan, penggunaan dooping), - analisis obat terlarang di darah dan urin pada kasus penyalahgunaan narkotika, psikotropika dan obat terlarang lainnya. Tujuan lain dari analisis toksikologi forensik adalah membuat suatu rekaan rekostruksi suatu peristiwa yang terjadi, sampai sejauh mana obat atau racun tersebut dapat mengakibatkan perubahan prilaku (menurunnya kemampuan mengendarai, yang dapat mengakibatkan kecelakaan yang fatal, atau tindak kekerasan dan kejahatan). 4.2 Bilamana toksikologik
memerlukan
pemeriksaan
Dalam tabel berikut ini digambarkan kasuskasus yang umumnya di negara maju memerlukan pemeriksaan toksikologi forensik. Kasus-kasus tersebut dapat dikelompokkan ke dalam tiga kelompok besar yaitu: a) kematian akibat keracunan, yang meliputi: kematian mendadak, kematian di penjara, kematian pada kebakaran, dan kematian 31
medis yang disebabkan oleh efek samping obat atau kesalahan penanganan medis, b) kecelakaan fatal maupun tidak fatal, yang dapat mengancam keselamatan nyawa sendiri ataupun orang lain, yang umumnya diakibatkan oleh pengaruh obat-obatan, alkohol, atau pun narkoba, c) penyalahgunaan narkoba dan kasus-kasus keracunan yang terkait dengan akibat pemakaian obat, makanan, kosmetika, alat kesehatan, dan bahan berbahaya lainnya,
yang tidak memenuhi standar kesehatan (kasus-kasus forensik farmasi). Dari sekian contoh kasus-kasus yang perlu dilakukan pemeriksaan toksikologik, lalu timbul pertanyaan: Siapa yang memutuskan untuk melakukan pemeriksaan tersebut dan siapa yang berkompeten untuk melakukan pemeriksaan tersebut? Sudah barang tentu yang memutuskan untuk melakukan adalah tim penyidik dan yang melakukan adalah seorang yang berkompeten yaitu “toksikolog forensik”. Lalu dimana lembaga toksikolog forensik tersebut di negara kita?
Tabel 4.1. Kasus-kasus toksikologi forensik yang melibatkan Jenis Kasus Pertanyaan yang muncul Kematian yang tidak wajar (mendadak)
Apakah ada keterlibatan obat atau racun sebagai penyebab kematiannya?
Kematian di penjara
Kecelakaan, pembunuhan yang melibatkan racun atau obat terlarang?
Kematian pada kebakaran
Apakah ada unsur penghilangan jejak pembunuhan? Apa penyebab kematian: CO, racun, kecelakaan, atau pembunuhan? Berapa konsentrasi dari obat dan metabolitnya? Apakah ada interaksi obat? Apakah pengobatannya tepat? Kesalahan terapi?
Kematian atau timbulnya efek samping obat berbahaya akibat salah pengobatan Kematian yang tidak wajar di rumah sakit Kecelakaan yang fatal di tempat kerja, sakit akibat tempat kerja, pemecatan
Apakah ada keterlibatan racun, alkohol, atau obat-obatan? Apakah kematian akibat ”human eror”? Apakah sakit tsb diakibatkan oleh senyawa kimia di tempat kerja?Pemecatan akibat terlibat penyalahgunaan Narkoba? Meyebabkan kematian? Adakah keterlibatan alkohol, obatobatan atau Narkoba? Kecelakaan, atau pembunuhan? Apakah kesalahan pengemudi? Mengemudi dibawah pengaruh obatobatan atau Narkoba?
Kecelakan fatal dalam menyemudi Kecelakaan tidak fatal atau mengemudi dibawah pengaruh obat-obatan Penyalahgunaan Narkoba
Penyalahgunaan atau pasient yang sedang mengalami terapi rehabilitasi narkoba Identifikasi bentuk sediaan, kandungan sediaan obat, penggunaan obat palsu.
Litigasi Kriminal: Pembunuhan Sipil: klaim tanggungan asuransi, tuntunan kepada fabrik farmasi atau kimia Kriminal: pembunuhan Sipil: gugatan tanggungan dan konpensasi terhadap pemerintah Kriminal: pembunuhan Sipil: klaim tanggungan asuransi Malpraktek kedokteran, gugatan terhadap fabrik farmasi Klaim Malpraktek, tindak kriminal, pemeriksaan oleh komite ikatan profesi kedokteran (”IDI”) Gugatan terhadap ”employer”, Memperkerjakan kembali
Kriminal: Pembunuhan, kecelakaan bermotor Sipil: klaim gugatan asuransi Kriminal: Larangan Mengemudi dibawah pengaruh Obat-obatan atau Narkona Sipil: gugatan pencabutan atau pengangguhan SIM Kriminal: Sipil: rehabilitasi
Farmaseutikal dan Obat Kriminal: pengedaran obat ilegal. palsu, atau tidak memenuhi Sipil: tuntutan penggunan obat palsu syarat standar ”Forensik terhadap dokter atau yang terkait Farmasi” Sumber: Finkle, B.S., (1982), Progress in Forensic Toxicology: Beyond Analytical Chemistry, J. Anal. Tox. (6): 57-61
4.3.
Langkah-langkah forensik
analisis
Analisis Toksikologi Forensik
toksikologi
Secara umum tugas analisis toksikolog forensik (klinik) dalam melakukan analisis 32
dapat dikelompokkan ke dalam tiga tahap yaitu: 1) penyiapan sampel “sample preparation”, 2) analisis meliputi uji penapisan “screening test” atau dikenal juga dengan “general unknown test” dan uji konfirmasi yang meliputi uji identifikasi dan kuantifikasi, 3) langkah terakhir adalah interpretasi temuan analisis dan penulisan laporan analisis. Berbeda dengan kimia analisis lainnya (seperti: analisis senyawa obat dan makanan, analisis kimia klinis) pada analisis toksikologi forensik pada umumnya analit (racun) yang menjadi target analisis, tidak diketahui dengan pasti sebelum dilakukan analisis. Tidak sering hal ini menjadi hambatan dalam penyelenggaraan analisis toksikologi forensik, karena seperti diketahui saat ini terdapat ribuan atau bahkan jutaan senyawa kimia yang mungkin menjadi target analisis. Untuk mempersempit peluang dari target analisis, biasanya target dapat digali dari informasi penyebab kasus forensik (keracunan, kematian tidak wajar akibat keracunan, tindak kekerasan dibawah pengaruh obat-obatan), yang dapat diperoleh dari laporan pemeriksaan di tempat kejadian perkara (TKP), atau dari berita acara penyidikan oleh polisi penyidik. Sangat sering dalam analisis toksikologi forensik tidak diketemukan senyawa induk, melainkan metabolitnya. Sehingga dalam melakukan analisis toksikologi forensik, senyawa matabolit juga merupakan target analisis. Sampel dari toksikologi forensik pada umumnya adalah spesimen biologi seperti: cairan biologis (darah, urin, air ludah), jaringan biologis atau organ tubuh. Preparasi sampel adalah salah satu faktor penentu keberhasilan analisis toksikologi forensik disamping kehadalan penguasaan metode analisis instrumentasi. Berbeda dengan analisis kimia lainnya, hasil indentifikasi dan kuantifikasi dari analit bukan merupakan tujuan akhir dari analisis toksikologi forensik. Seorang toksikolog forensik dituntut harus mampu menerjemahkan apakah analit (toksikan) yang diketemukan dengan kadar tertentu dapat dikatakan sebagai penyebab keracunan (pada kasus kematian). 4.3.1. Penyiapan Sampel Analisis Toksikologi Forensik
Spesimen untuk analisis toksikologi forensik biasanya diterok oleh dokter, misalnya pada kasus kematian tidak wajar spesimen dikumpulkan oleh dokter forensik pada saat melakukan otopsi. Spesimen dapat berupa cairan biologis, jaringan, organ tubuh. Dalam pengumpulan spesimen dokter forensik memberikan label pada masing-masing bungkus/wadah dan menyegelnya. Label seharusnya dilengkapi dengan informasi: nomer indentitas, nama korban, tanggal/waktu otopsi, nama spesimen beserta jumlahnya. Pengiriman dan penyerahan spesimen harus dilengkapi dengan surat berita acara menyeran spesimen, yang ditandatangani oleh dokter forensik. Toksikolog forensik yang menerima spesimen kemudian memberikan dokter forensik surat tanda terima, kemudian menyimpan sampel/spesimen dalam lemari pendingin “freezer” dan menguncinya sampai analisis dilakukan. Prosedur ini dilakukan bertujuan untuk memberikan rantai perlindungan/pengamanan spesimen (chain of custody). Beberapa hal yang perlu diperhitungkan dalam tahapan penyiapan sampel adalah: jenis dan sifat biologis spesimen, fisikokimia dari spesimen, serta tujuan analisis. Dengan demikian akan dapat merancang atau memilih metode penanganan sampel, jumlah sampel yang akan digunakan, serta memilih metode analisis yang tepat. Penanganan sampel perlu mendapat perhatian khusus, karena sebagian besar sampel adalah materi biologis, sehingga sedapat mungkin mencegah terjadinya penguraian dari analit. Pemilihan metode ekstraksi ditentukan juga oleh analisis yang akan dilakukan, misal pada uji penapisan sering dilakukan ekstraksi satu tahap, dimana pada tahap ini diharapkan semua analit dapat terekstraksi. Bahkan pada uji penapisan menggunakan teknik “immunoassay” sampel tidak perlu diekstraksi dengan pelarut tertentu. Sampel urin pada umumnya dapat langsung dilakukan uji penapisan dengan menggunakan teknik immunoassay. Namun tidak jarang harus mendapatkan perlakuan awal, seperti pengaturan pH dan sentrifuga, guna menghilangkan kekeruhan. Pemisahan sel darah dan serum sangat diperlukan pada persiapan sebelum dilakukan uji penapisan 33
pada darah. Serum pada umumnya dapat langsung dilakukan uji penapisan menggunakan teknik immunoassay. Tidak jarang sampel darah, yang diterima sudah mengalami hemolisis atau menggupal, dalam hal ini darah dilarutkan dengan metanol, dan kemudian disentrifuga, sepernatannya dapat langsung dilakukan uji penapisan menggunakan teknik immunoassay. Ekstraksi satu tahap sangat diperlukan apabila uji penapisan tidak menggunakan teknik immunoassay, misal menggunakan kromatografi lapis tipis dengan reaksi penampak bercak tertentu. Atau juga ekstraksi bertingkat “metode Stas-Otto-Gang” untuk melalukan pemisahan analit berdasarkan sifat asam-basanya. Metode ekstraksi dapat berupa ekstraksi caircair, menggunakan dua pelarut yang terpisah, atau ekstraksi cair-padat. Prinsip dasar dari pemisahan ekstraksi cair-cair berdasarkan koefisien partisi dari analit pada kedua pelarut atau berdasarkan kelarutan analit pada kedua pelarut tersebut. Pada ekstraksi cair-padat analit dilewatkan pada kolom yang berisi adsorben fase padat (SPE, Si-Gel C-18, Extrelut®, Bund Elut Certify®, dll), kemudian dielusi dengan pelarut tertentu, biasanya diikuti dengan modifikasi pH pelarut. Penyiapan sampel yang baik sangat diperlukan pada uji pemastian “identifikasi dan kuantifikasi”, terutama pada teknik kromatografi. Karena pada umumnya materi biologik merupakan materik yang komplek, yang terdiri dari berbagai campuran baik senyawa endogen maupun senyawa eksogen “xenobiotika”. Penyiapan sampel umumnya meliputi hidrolisis, ekstraski, dan pemurnian analit. Prosedur ini haruslah mempunyai efesiensi dan selektifitas yang tinggi. Perolehan kembali yang tinggi pada ekstraksi adalah sangat penting untuk menyari semua analit, sedangkan selektifitas yang tinggi diperlukan untuk menjamin pengotor atau senyawa penggangu terpisahkan dari analit. Pada analisis menggunakan GC/MS, penyiapan sampel termasuk derivatisasi analit secara kimia, seperi salilisasi, metilisasi, dll. Derivatisasi ini pada umumnya bertujuan untuk meningkatkan volatilitas analit atau meningkatkan kepekaan analisis. Analisis Toksikologi Forensik
4.3.2. Uji Penapisan “Screening test” Uji penapisan untuk menapis dan mengenali golongan senyawa (analit) dalam sampel. Disini analit digolongkan berdasarkan baik sifat fisikokimia, sifat kimia maupun efek farmakologi yang ditimbulkan. Obat narkotika dan psikotropika secara umum dalam uji penapisan dikelompokkan menjadi golongan opiat, kokain, kannabinoid, turunan amfetamin, turunan benzodiazepin, golongan senyawa anti dipresan tri-siklik, turunan asam barbiturat, turunan metadon. Pengelompokan ini berdasarkan struktur inti molekulnya. Sebagai contoh, disini diambil senyawa golongan opiat, dimana senyawa ini memiliki struktur dasar morfin, beberapa senyawa yang memiliki struktur dasar morfin seperti, heroin, monoasetil morfin, morfin, morfin-3-glukuronida, morfin-6-glukuronida, asetilkodein, kodein, kodein-6-glukuronida, dihidrokodein serta metabolitnya, serta senyawa turunan opiat lainnya yang mempunyai inti morfin. Uji penapisan seharusnya dapat mengidentifikasi golongan analit dengan derajat reabilitas dan sensitifitas yang tinggi, relatif murah dan pelaksanaannya relatif cepat. Terdapat teknik uji penapisan yaitu: a) kromatografi lapis tipis (KLT) yang dikombinasikan dengan reaksi warna, b) teknik immunoassay. Teknik immunoassay umumnya memiliki sifat reabilitas dan sensitifitas yang tinggi, serta dalam pengerjaannya memerlukan waktu yang relatif singkat, namun alat dan bahan dari teknik ini semuanya harus diimpor, sehingga teknik ini menjadi relatif tidak murah. Dibandingkan dengan immunoassay, KLT relatif lebih murah, namun dalam pengerjaannya memerlukan waktu yang relatif lebih lama. a) teknik immunoassay Teknik immunoassay adalah teknik yang sangat umum digunakan dalam analisis obat terlarang dalam materi biologi. Teknik ini menggunakan “anti-drug antibody” untuk mengidentifikasi obat dan metabolitnya di dalam sampel (materi biologik). Jika di dalam matrik terdapat obat dan metabolitnya (antigentarget) maka dia akan berikatan dengan “antidrug antibody”, namun jika tidak ada antigentarget maka “anti-drug antibody” akan berikatan dengan “antigen-penanda”. Terdapat berbagai metode / teknik untuk mendeteksi 34
ikatan antigen-antibodi ini, seperti “enzyme linked immunoassay” (ELISA), enzyme multiplied immunoassay technique (EMIT), fluorescence polarization immunoassay (FPIA), cloned enzyme-donor immunoassay (CEDIA), dan radio immunoassay (RIA). Pemilihan teknik ini sangat tergantung pada beban kerja (jumlah sampel per-hari) yang ditangani oleh laboratorium toksikologi. Misal dipasaran teknik ELISA atau EMIT terdapat dalam bentuk single test maupun multi test. Untuk laboratorium toksikologi dengan beban kerja yang kecil pemilihan teknik single test immunoassay akan lebih tepat ketimbang teknik multi test, namun biaya analisa akan menjadi lebih mahal. Hasil dari immunoassay test ini dapat dijadikan sebagai bahan pertimbangan, bukan untuk menarik kesimpulan, karena kemungkinan antibodi yang digunakan dapat bereaksi dengan berbagai senyawa yang memiliki baik bentuk struktur molekul maupun bangun yang hampir sama. Reaksi silang ini tentunya memberikan hasil positif palsu. Obat batuk yang mengandung pseudoefedrin akan memberi reaksi positif palsu terhadap test immunoassay dari anti bodi- metamfetamin. Oleh sebab itu hasil reaksi immunoassay (screening test) harus dilakukan uji pemastian (confirmatori test). b) kromatografi lapis tipis (KLT) KLT adalah metode analitik yang relatif murah dan mudah pengerjaannya, namun KLT kurang sensitif jika dibandungkan dengan teknik immunoassay. Untuk meningkatkan sensitifitas KLT sangat disarankan dalam analisis toksikologi forensik, uji penapisan dengan KLT dilakukan paling sedikit lebih dari satu sistem pengembang dengan penampak noda yang berbeda. Dengan menggunakan spektrofotodensitometri analit yang telah terpisah dengan KLT dapat dideteksi spektrumnya (UV atau fluoresensi). Kombinasi ini tentunya akan meningkatkan derajat sensitifitas dan spesifisitas dari uji penapisan dengan metode KLT. Secara simultan kombinasi ini dapat digunakan untuk uji pemastian. 4.3.3. Uji pemastian “confirmatory test”
Analisis Toksikologi Forensik
Uji ini bertujuan untuk memastikan identitas analit dan menetapkan kadarnya. Konfirmatori test paling sedikit sesensitif dengan uji penapisan, namun harus lebih spesifik. Umumnya uji pemastian menggunakan teknik kromatografi yang dikombinasi dengan teknik detektor lainnya, seperti: kromatografi gas spektrofotometri massa (GC-MS), kromatografi cair kenerja tinggi (HPLC) dengan diode-array detektor, kromatografi cair - spektrofotometri massa (LC-MS), KLT-Spektrofotodensitometri, dan teknik lainnya. Meningkatnya derajat spesifisitas pada uji ini akan sangat memungkinkan mengenali identitas analit, sehingga dapat menentukan secara spesifik toksikan yang ada. Prinsip dasar uji konfirmasi dengan menggunakan teknik CG-MS adalah analit dipisahkan menggunakan gas kromatografi kemudian selanjutnya dipastikan identitasnya menggunakan teknik spektrfotometrimassa. Sebelumnya analit diisolasi dari matrik biologik, kemudian jika perlu diderivatisasi. Isolat akan dilewatkan ke kolom CG, dengan perbedaan sifat fisikokima toksikan dan metabolitnya, maka dengan GC akan terjadi pemisahan toksikan dari senyawa segolongannya atau metabolitnya. Pada prisipnya pemisahan menggunakan GC, indeks retensi dari analit yang terpisah adalah sangat spesifik untuk senyawa tersebut, namun hal ini belum cukup untuk tujuan analisis toksikologi forensik. Analit yang terpisah akan memasuki spektrofotometri massa (MS), di sini bergantung dari metode fragmentasi pada MS, analit akan terfragmentasi menghasilkan pola spektrum massa yang sangat kharakteristik untuk setiap senyawa. Pola fragmentasi (spetrum massa) ini merupakan sidik jari molekular dari suatu senyawa. Dengan memadukan data indeks retensi dan spektrum massanya, maka identitas dari analit dapat dikenali dan dipastikan. Dengan teknik kombinasi HPLC-diode array detektor akan memungkinkan secara simultan mengukur spektrum UV-Vis dari analit yang telah dipisahkan oleh kolom HPLC. Seperti pada metode GC-MS, dengan memadukan data indeks retensi dan spektrum UV-Vis analit, maka dapat mengenali identitas analit. Disamping melakukan uji indentifikasi potensial positif analit (hasil uji penapisan), 35
pada uji ini juga dilakukan penetapan kadar dari analit. Data analisis kuantitatif analit akan sangat berguna bagi toksikolog forensik dalam menginterpretasikan hasil analisis, dengan kaitannya dalam menjawab pertanyaanpertanyaan yang muncul baik dari penyidik maupun hakim sehubungan dengan kasus yang terkait. Misal analisis toksikologi forensik ditegakkan bertujuan untuk memastikan dugaan kasus kematian akibat keracunan atau diracuni, pertanyaan-pertanyaan yang mungkin muncul pada kasus ini adalah: - senyawa racun apa yang terlibat? - berapa besar dosis yang digunakan? - kapan paparan tersebut terjadi (kapan racun tersebut mulai kontak dengan korban)? - melalui jalur apa paparan tersebut terjadi (jalur oral, injeksi, inhalasi)? Dalam praktis analisis menggunakan teknik GC-MS, LC-MS, atau HPLC-Diode array detektor memerlukan biaya analisis yang relatif mahal ketimbang KLT-Spektrofotodensitometri. Sehingga disarankan dalam perencanaan pengadaan /pemilihan peralatan suatu laboratorium toksikologi seharusnya mempertimbangkan biaya operasional penanganan sampel. Hal ini pada kenyataannya sering menjadi faktor penghambat dalam penyelenggaraan laboratorium toksikologi. Karena pada kenyataanya telah diatur dalam KUHAP, bahwa biaya yang ditimbulkan akibat pemeriksaan atau penyidikan dibebankan pada negara, namun pada kenyataanya sampai saat negara belum mampu memikul beban tersebut. 4.4. Interpretasi temuan analisis Temuan analisis sendiri tidak mempunyai makna yang berarti jika tidak dijelaskan makna dari temuan tersebut. Seorang toksikolog forensik berkewajiban menerjemahkan temuan tersebut berdasarkan kepakarannya ke dalam suatu kalimat atau laporan, yang dapat menjelaskan atau mampu menjawab pertanyaan yang muncul berkaitan dengan permasalahan/kasus yang dituduhkan. Berkaitan dengan analisis penyalahgunaan obat-obatan terlarang, mengacu pada hukum yang berlaku di Indonesia (UU no 5 th 1997 tentang spikotropika dan UU no 22 th 1997 tentang Narkotika), interpretasi temuan analisis oleh seorang toksikolog forensik adalah merupakan suatu keharusan (Wirasuta, 2005). Analisis Toksikologi Forensik
Heroin menurut UU no 22 tahun 1997 termasuk narkotika golongan I, namun metabolitnya (morfin) masuk ke dalam narkotika golongan II. Dilain hal kodein (narkotika golongan III) di dalam tubuh akan sebagian termetabolisme menjadi morfin. Namun pada kenyataannya heroin illegal juga mengandung acetilkodein, yang merupakan hasil asetilasi dari kodein, sehingga dalam analisis toksikologi forensik pada pembuktian kasus penyalahgunaan heroin ilegal akan mungkin diketemukan morfin dan kodein. Menurut UU narkotika ini (pasal 84 dan 85), menyatakan bahwa penyalahgunaan narkotika golongan I, II, dan III memiliki konsekuensi hukum yang berbeda, sehingga interpretasi temuan analisis toksikologi forensik, khususnya dalam kaitan menjawab pertanyaan narkotika apa yang telah dikonsumsi, adalah sangat mutlak dalam penegakan hukum. Terdapat beberapa pertanyaan yang harus dijawab oleh toksikolog forensik dalam melakukan analisis: a. Senyawa apa yang terlibat dalam tindak kriminal tersebut (senyawa apa yang menyebabkan keracunan, menurunnya kemampuan mengendarai kendaraan dalam berlalulintas, atau narkoba apa yang telah disalah gunakan)? b. Berapa besar dosisnya? c. Efek apa yang ditimbulkan? d. Kapan tubuh korban terpapar oleh senyawa tersebut? e. Pertanyaan-pertanyaan tersebut dapat terungkap dari hasil analisis toksikologi dan didukung oleh penguasaan ilmu pendukung lainnya seperti farmakologi dan toksikologi, biotransformasi, dan farmakokinetik. Data temuan hasil uji penapisan dapat dijadikan petunjuk bukan untuk menarik kesimpulan bahwa seseorang telah terpapar atau menggunakan obat terlarang. Sedangkan hasil uji pemastian (confirmatory test) dapat dijadikan dasar untuk memastikan atau menarik kesimpulan apakah sesorang telah menggunakan obat terlarang yang dituduhkan. Pernyataan ini terdengar sangatlah mudah, namun pada praktisnya banyak faktor yang mempengaruhi. Untuk lebih jelasnya disini akan diberikan suatu perumpamaan kasus, misal dari hasil uji penapisan menggunakan teknik immunoassay 36
diperoleh dalam sampel darah dan urin tertuduh memberikan reaksi positif terhadap golongan opiat. Hasil ini tidak cukup untuk membuktikan (menuduh) terdakwa telah mengkonsumsi obat terlarang narkotika golongan opiat, karena obat batuk dekstrometrofan mungkin memberikan reaksi positif. Dilain hal senyawa golongan opiat terdistribusi ke dalam golongan narkotika I sampai III, dimana menurut UU Narkotika, penyalahgunaan golongan tersebut memiliki konsekuen hukum yang berbeda. Metabolit glukuronida dari morfin dan kodein tidak dimasukkan ke dalam senyawa narkotika. Kenyataan ini akan membuat interpretasi toksikologi forensik, yang hanya berdasarkan data hasil analisis uji penapisan, menjadi lebih komplek. Dilain hal banyak senyawa obat, dimana metabolitnya memungkinkan memberi reaksi positif (reaksi silang) terhadap test antiamfetamin-antibodi. Senyawa obat tersebut antara lain: a) golongan obat bebas yang digunakan sebagai dekongestan dan anoreksia, seperti: efedrin, pseudoefedrin dan fenilpropanolamin; b) golongan keras (dengan resep): benzofetamin, fenfluramine, mefentermin, fenmeterzine, dan fentermine; c) obat / senyawa obat, dimana amfetamin atau metamfetamin sebagai metabolitnya, seperti: etilamfetamin, clobenzorex, mefenorex, dimetilamfetamin, dll (United Nation, 1995). Pada interpretasi hasil analisis pada kasus kematian, seorang toksikolog forensik dituntut mampu menjawab pertanyaan spesifik seperti: rute pemakaian toksikan, apakah konsentrasi toksikan yang ditetapkan cukup sebagai menyebabkan kematian atau penyebab keracunan. Penetapan rute pemakaian biasanya diperoleh dari analisis berbagai spesimen, dimana pada umumnya konsentrasi toksikan yang lebih tinggi ditemukan di daerah rute pemakaian. Jika ditemukan toksikan dalam jumlah besar di saluran pencernaan dan hati, maka dapat ditarik kesimpulan bahwa paparan melalui jalur oral. Demikian juga apabila konsentrasi yang tinggi ditemukan di paru-paru atau pada organ viseral lainnya mengindikasikan paparan melalui inhalasi. Bekas suntikan yang baru pada permukaan tubuh (seperti telapak tangan, lengan, dll), yang ditemukan pada kasus kematian akibat Analisis Toksikologi Forensik
penyalahgunaan narkotika, merupakan petujuk paparan melalui injeksi. Ditemukannya toksikan dalam konsentrasi yang cukup tinggi baik di saluran pencernaan maupun di darah, dapat dijadikan cukup bukti untuk menyatakan toksikan tersebut sebagai penyebab kematian. Seorang toksikolog forensik dituntut juga dapat menerangkan absorpsi toksikan dan transportasi/distribusi melalui sirkulasi sistemik menuju organjaringan sampai dapat menimbulkan efek yang fatal. Interpretasi ini diturunkan dari data konsentrasi toksikan baik di darah maupun di jaringan-jaringan. Hasil analisis urin biasanya kurang berarti dalam menentukan efek toksik/psikologi dari suatu toksikan. Secara umum hasil analisis urin menyatakan adanya paparan toksikan sebelum kematian. Dari jumlah volume urin dan konstelasi jumlah toksikan dan metabolitnya di dalam kantung kemih, dengan berdasarkan data laju eksresi toksikan dan metabolitnya, maka dimungkinkan untuk menurunkan informasi lamanya waktu paparan telah terjadi sebelum kematian (Wirasuta 2004). Kebanyakan efek farmakologik/psikologi xenobiotika berhubungan dengan tingkat konsentrasinya di darah dan tempat kerjanya (reseptor). Oleh sebab itu tingkat konsentrasi di darah adalah sebagai indikator penting dalam mencari faktor penyebab kematian/keracunan. Dalam menginterpretasikan tingkat konsentrasi di dalam darah dan jaringan sebaiknya memperhatikan tingkat efek spikologis yang sebenarnya dan semua faktor yang berpengaruh dari setiap tingkat konsentrasi yang diperoleh dari spesimen. Interpretasi tingkat konsentrasi dalam darah dan jaringan dapat dibagi menjadi tiga katagori: normal atau terapeutik, toksik, dan lethal. Tingkat konsentrasi normal dinyatakan sebagai keadaan, dimana tidak menimbulkan efek toksik pada organisme. Tingkat konsentrasi toksik berhubungan dengan gejala membahayankan nyawa, seperti: koma, kejangkejang, kerusakan hati atau ginjal. Tingkat konsentrasi kematian dinyatakan sebagai konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian. Contoh: sianida pada konsentrasi yang tinggi (0,17-2,22 mg/l, diketemukan pada kematian akibat keracunan sianida), dinyatakan sebagai penyebab keracunan. Sedangkan pada 37
konsentrasi yang sangat kecil (0,004 mg/l pada orang sehat dan 0,006 mg/l pada perokok), sianida berperan dalam pembentukan vitamin B12. Dalam jumlah kecil sianida juga diabsorpsi dan dibangkitkan selama merokok. Oleh sebab itu mendeteksi sianida di darah pada tingkat dibawah konsentrasi toksik, masih dapat ditolerir sebagai tanpa efek toksik. Beberapa logam berat, seperti arsen, timbal, dan merkuri tidak diperlukan untuk fungsi normal tubuh. Keberadaan logam tersebut dibawah tingkat konsentrasi toksik mengindikasikan bahwa korban telah terpapar logam berat akibat polusi lingkungan. Faktor-faktor yang mempengaruhi respon individu terhadap tingkat konsentrasi toksik (seperti: usia, jenis kelamin/status hormonal, berat badan, status nutrisi, genetik, status immunologi, kelainan patologik dan penyakit bawaan, kelainan fungsi organ, sifat farmakokinetik dari toksikan) seharusnya juga dipertimbangkan dalam menginterpretasikan hasil analisis, yang bertujuan mencari faktor penyebab keracunan. Faktor lain yang juga harus mendapat perhatian adalah fenomena farmakologi seperti toleransi. Toleransi adalah suatu keadaan menurunnya respon tubuh terhadap toksikan sebagai hasil paparan yang berulang sebelumnya, biasanya dalam waktu yang lama. Penurunan respon dapat diakibatkan oleh adaptasi selular pada suatu konsentrasi toksikan, yang dapat berakibat pada penekanan efek farmakologis yang diinginkan. Hal ini sering dijumpai pada kasus kematian akibat menyalahgunaan heroin, dimanakan ditemukan tumpang tindih rentang konsentrasi morfin di darah pada kasus “lethal related heroine (0,010 - 2,200 µg/ml, rataan: 0,277 µg/ml)” dan “non-lethal related heroine (0,010 -0,275 µg/ml, rataan: 0,046 µg/ml)” (Wirasuta 2004). Konsetrasi morfin yang tinggi mungkin tidak mengakibatkan efek toksik pada junkis yang telah berulang memakai heroin, sedangkan pada konsentrasi yang sama mungkin menimbulkan efek kematian pada orang yang baru menggunkan. Bahaya kematian sering dijumpai pada pemakaian dosis tinggi oleh pencadu, yang memulai kembali menggunakan heroin setelah lama berhenti menggunakannya, dimana dosisnya didasarkan pengalaman pribadi saat efek tolerasi masih timbul. Analisis Toksikologi Forensik
Melalui pengamatan ulang riwayat kasus, memperhatikan semua faktor toksokinetik, toksodinamik, dan dengan membandingkan hasil analisis dengan laporan kasus yang sama dari beberapa pustaka atau pengalaman sendiri, seorang ahli toksikologi membuat interpretasi akhir dari suatu kasus. Contoh-contoh di atas dengan jelas memaparkan, bahwa hasil reaksi positif dengan teknik immunoassay belum cukup bukti untuk memastikan/menuduh seseorang telah mengkonsumsi obat terlarang. Lebih lanjut berikut ini diberikan ilustrasi kasus dan interpretasi dari hasil analisis toksikologi forensik yang lengkap: Contoh: Ilustrasi kasus toksikologi forensik (data dikutif dari kasus yang masuk ke Institut of Legal Medicine of Goerg August University, Göttingen, Germany): Berdasarkan Berita Acara Pemeriksaan dari penyidik dilaporkan telah diketemukan mayat di kamar mandi sebuah cafe. Dilengan kanannya masih tertancap jarum suntik. Hasil otopsi melaporkan terdapat baik bekas suntikan yang masih baru maupun yang sudah menua dilengan kanan dan kiri, telapak tangan, kaki. Terdapat udema paru-paru, dan bau aromatis dari organ tubuh seperti saluran cerna. Dokter spesialis Forensik menyimpulkan kematian diduga diakibatkan oleh keracunan obatobatan. Hasil analisis toksikologi forensik: Uji skrining menggunakan teknin immonoassay test (EMIT) terdeteksi positif golongan opiat dan benzodiazepin. Dari penetapan kadar alkohol di darah dan urin terdapat alkohol 0,1 promil dan 0,1 promil. Pada uji konfirmasi dengan menggunakan alat GC-MS diperoleh hasil: - darah sebelum di hidrolisis: - morfin: 0,200 µg/ml, - kodein: 0,026 µg/ml - darah setelah hidrolisis: - morfin: 0,665 µg/ml, - kodein: 0,044 µg/ml - urin sebelum hidrolisis: - 6-asetilmorfin: 0,060 µg/ml, - morfin: 0,170 µg/ml, - kodein: 0,040 µgml - urin setelah hidrolisis : - morfin: 0,800 µg/ml, kodein: 0,170 µg/ml Golongan benzodiazepin yang terdeteksi di darah adalah: diazepam: 1,400 µg/ml; nordazepam: 0,086 µg/ml; oxazepam: 0,730 µg/ml; temazepam: 0,460 µg/ml 38
Dalam menginterpretasikan hasil temuannya seorang toksikolog forensik harus mengulas kembali efek toksik dan farmakologi yang ditimbulkan oleh analit, baik efek tunggal dari opiate dan benzodiazepin maupun efek kombinasi yang ditimbulkan dalam pemakaian bersama antara opiat dan benzodiazepin. Menyacu informasi konsentrasi toksik (“lethal concentration”) dapat diduga penyebab kematian dari korban. Efek toksik yang ditimbulkan oleh pemakaian heroin adalah dipresi saluran pernafasan. Keracunan oleh heroin ditandai dengan adanya udema paru-paru. Sedangkan pemakaian diazepam secara bersamaan akan meningkatkan efek heroin dalam penekanan sistem pernafasan. Hal ini akan mempercepat kematian. Guna mengetahui obat apa yang telah dikonsumsi oleh korban, berdasarkan hasil analisis dan alur metabolisme dari suatu senyawa obat, seorang toksikolog forensik akan merunut balik apa yang telah dikonsumsi korban. Di darah dan urin terdapat morfin dan kodein baik dalam bentuk bebas maupun terikat dengan glukuronidnya namun di urin terdeteksi juga 6-asetilmorfin. Heroin di dalam tubuh dalam waktu yang sangat singkat akan termetabilisme menjadi 6-asetilmorfin, dan kemudian membentuk morfin. Morfin akan terkonjugasi menjadi morfin-glukuronidanya. Dari hasil analisis seorang toksikolog forensik sudah dapat menyimpulkan bahwa korban telah mengkonsumsi heroin. Di dalam tubuh diazepam akan termetabolisme melalui N-demitelasi membentuk desmitldiazepam (nordazepam) dan kemudian akan terhidrolisis membentuk oksazepam, sebagaian kecil akan termetabolisme membentuk temazepam. Sehingga dari temuan analisis dapat disimpulkan korban juga telah mengkonsumsi diazepam. Berdasarkan data farmakokinetik dari heroin serta metabolitnya dan juga konstelasi dari konsentrasi morfin bebas dan terikatnya dapat diambil duga kematian terjadi lebih kurang dari satu sampai dua jam setelah pemakaian heroin (perkiraan ini didasarkan atas model farmakokinetik dari Wirasuta 2004). Semua temuan dan hasil interpretasi ini dibuat dalam suatu laporan (berita acara pemeriksaan) yang akan diserahkan kembali ke polisi Analisis Toksikologi Forensik
penyidik. Berkas berita acara pemeriksaan ini dikenal dengan keterangan ahli. Interpretasi akan menjadi bernar secara ilmiah apabila didasarkan pada data analisis yang valid, dan harus didukung oleh pemahaman ilmu toksikologi-farmakologi, farmakokinetik, biotransformasi yang baik. Untuk mendapatkan data analisis yang valid/sahih, harus dilakukan validasi terhadap semua prosedur analisis dan mengevalusai sumber-sumber yang mungkin memberikan kesalahan analisis. Mengevaluasi/menganalisis validasi dari hasil analisis dapat ditinjau dari tiga tingkat faktor utama yang menentukan hasil analisis (DFG, 1990, 1995), yaitu: 1) Tataran teknis analisis yang menghasilkan data analisis. Dalam tataran ini kesalahan dapat diakibatkan oleh faktor metode analisis. Untuk mendapatkan data analisis yang valid, perlu dilakukan validasi prosedur analisis, sesuai dengan kentuan yang diatur secara international (misal mengikuti ketentuan validasi prosedur analisis yang dimuat dalam Farmakope International, USP, AOAC, dll). 2) Tataran biologis, variansi matrik biologis dari sampel memungkinkan ikut memberikan sumbangan kesalahan terhadap hasil analisis. Terdapat tiga langkah yang dapat dilakukan dalam mengevaluasi data analisis dari sudut pandang tataran biologis, yaitu: kontrol plausibilitas, evaluasi longitudinal dan transversal. Kontrol plausibilitas mencangkup: - Kontrol data ekstrim, data ini dikontrol berdasarkan data medikal misalnya data analisis tidak sesuai dengan data yang telah diperoleh dari populasi manusia atau sangat jauh menyimpang secara statistik. - Kontrol konstelasi yaitu membandingkan dari berbagai data analisis, yang diperoleh dari matrik biologis yang berbeda tetapi seri data tersebut masih memiliki parameter yang saling bergantungan. Misal membandingkan data analisis toksikan dan metabolitnya di darah dan di urin, konstelasi data yang ditimbulkan dikontrol berdasarkan sifat farmakokinetik dari toksikan dan metabolitnya. 39
- Kontrol trend data: data analisis yang diperoleh dari satu pasien (korban) dievalusi terhadap perubahan waktu, hal ini bertujuan untuk mengetahui sifat perubahan biologis (misal: laju eliminasi) yang terjadi pada pasien tersebut. Tujuan dari krontrol plausibilitas adalah untuk mencari kesalahan analisis, dimana dari tataran teknik analitik tidak teridentifikasi, sehingga diharapkan diperolehnya data analsis yang sahih. evaluasi ini Analisis tongitodinal, didasarkan terhadap sifat farmakokinetik (toksokinetik) dan reaksi biotransformasi dari toksikan dan metabolitnya. Data analisis (toksikan dan metabolitnya) dari pasien yang sama, yang diperoleh dari selang waktu pengambilan sampel (penerokan) yang berbeda dibandingkan satu sama lainnya. Dari hasil pembandingan data analisis tersebut, dengan didasarkan sifat farmakokinetik, maka dapat dijadikan dasar untuk menduga/mengontrol konsentrasi aktuel (waktu terjadinya keracunan). Lebih lanjut data ini dapat dijadikan dasar untuk memperkirakan waktu terjadinya eksposisi. Analisis transversal, data analisis yang diperoleh dari satu pasien dibandingkan dengan kelompok kontrol. Data dari kelompok kontrol mungkin dapat berupa data konsentrsi toksikan/obat, yang diambil dari interval waktu tertentu, seperti interval waktu konsentrasi efek terapeutik, interval konstrasi toksik atau “lethal dosis”. 3) Tataran nosologi (ilmu pengelompokan penyakit), kesalahan dapat ditimbulkan akibat kesalahan dalam mendiagnose keracunan atau mungkin muncul akibat kesalahan menginterpretasikan temuan patologis atau psiologis pasient (korban). Kesalahan ini mungkin muncul karena keracunan dapat menampakkan kelainan patoligis. 4.5. Kesimpulan Toksikologi forensik mencangkup terapan ilmu alam dalam analisis racun sebagi bukti dalam tindak kriminal, dengan tujuan mendeteksi dan mengidentifikasi konsentrasi dari zat racun dan bentuk metabolitnya dari dalam cairan biologi dan akhirnya menginterpretasikan temuan Analisis Toksikologi Forensik
analisis dalam suatu argumentasi tentang penyebab keracunan dari suatu kasus. Analisis toksikolog forensik (klinik) dapat dikelompokkan ke dalam tiga tahap yaitu: 1) penyiapan sampel, 2) Analisis meliputi uji penapisan dan uji konfirmasi yang meliputi uji identifikasi dan kuantifikasi, dan 3) interpretasi temuan analisis dan penulisan laporan analisis. Data temuan hasil uji penapisan dapat dijadikan petunjuk bukan untuk menarik kesimpulan bahwa seseorang telah terpapar atau menggunakan obat terlarang. Sedangkan hasil uji pemastian (confirmatory test) dapat dijadikan dasar untuk memastikan atau menarik kesimpulan apakah sesorang telah menggunakan obat terlarang yang dituduhkan Bahan Bacaan 1. DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft), (1990), Orientierende Angaben zu therapeutischen und toxischen Konzentrationen von Arzneimitteln und Gifften in Blut, Serum, oder Urin, VCH Verlag, Weinheim. 2. DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft), (1995), Einfache toxikologische Laboratoriums-untersuchungen bei akuten Vergiftunen, VCH Verlag, Weinheim. 3. Eckert, W.G., 1980, Introduction to Forensic sciences, The C.V. Mosby Company, St. Louis, Missori 4. Kerrigan, S, (2004), Drug Toxicology for Prosecutors Targeting Hardcore Impaired Drivers, New Mexico Department of Health Scientific Laboratory Division Toxicology Bureau, New Mexico. 5. Madea, B. und Brinkmann B., Handbuch gerichtliche Medizin, Band 2,, SpringerVerlag, Berlin, Heidelberg, New York 6. Moffat, Ac., Jackson, J.V., Moss, M.S. and Widdop, B., 1986, Clark’s isolation and indentification of drugs in pharmaceuticals, body fluids, and post-mortem material, 2nd Ed. The Pharmaceutical Press, London 7. Mueller B., 1975, Gerichtliche Medizin, Springer-Verlag, Berlin 8. Saferstein R:, 1995, Criminalistics, an Introduction to Forensic Science, 5th Ed., A Simon & Schuster Co., Englewood Cliffs, New Jersey. 40
9. SOFT (Society of Forensic Toxicologist, Inc.) and AAFS (the American Academy of Forensic Sciences, Toxicology Section), (2002), Forensic Toxicology Laboratory Guidelines, SOFT / AAFS. 10. United Nations, (1995) Recommended methods for the detection and assay of heroin, cannabinoids, cocaine, amphetamine and ring-substituted amphetamine derivates in biological specimens manual for use by national laboratories, United Nation International Drug Control Programme, New York 11. Wirasuta I M.A.G. (2004), Untersuchung zur Metabolisierung und Ausscheidung von Heroin im menschlichen Körper. Ein Beitrag zur Verbesserung der
Analisis Toksikologi Forensik
Opiatbefundinterpretation, Cuvillier Verlag, Göttingen. 12. Wirasuta, I M.A.G., (2005), Hambatan dalam pengegakan Undang-Undang No 22 th 1997 tentang Narkotika, khususnya pada penyalahgunaan narkotika golongan opiat ditinjau dari sifat farmakokinetiknya, dalam Wirasuta, I M.A.G., et al. (Ed.) (2005), Peran kedokteran forensik dalam penegakan hukum di Indonesia. Tantangan dan tuntuan di masa depan, Penerbit Udayana, Denpasar 13. Wirasuta, I M.A.G., (2005), Peran Toksikologi forensik dalam penegakan hukum kesehatan di Indonesia, dalam Wirasuta, I M.A.G., et al. (Ed.) (2005), Peran kedokteran forensik dalam penegakan hukum di Indonesia. Tantangan dan tuntuan di masa depan, Penerbit Udayana, Denpasar
41
BAB V CAIRAN BIOLOGI Cairan biologi (darah, urin, saliva, sisa muntahan, organ) adalah merupakan sebagian besar sample dari analisis toksikologi. Materi biologi adalah campuran komplek, yang terdiri dari berbagai komponen. Dari sekian banyak materi biologi, darah, plasma (serum) dan urine sample murupakan sampel yang memiliki frekuensi yang paling tinggi dalam toksikologi analisis forensik. Beberapa metode analisis tertentu cukup spesifik untuk digunakan langsung menetapkan obat dalam cairan biologik, tetapi pada umumnya masalah yang akan timbul pertama-tama adalah bagaimana cara pemisahan obat dari materi endogen yang ada. Kemudahan suatu sampel dianalisis akan bergantung pada derajat fluiditas. Untuk memperbesar fluiditas, sampel padat atau semi-solid dihancurkan terlebih dahulu dengan prosedur mekanik. 5.1. Sifat Beberapa Cairan Biologik Tertentu a) Darah Darah merupakan cairan biologik yang paling kompleks. Darah manusia atau hewan terdiri dari cairan jernih yang terdapar yang mengandung protein tersolubilisasi, lemak dan garam terlarut, dan sel-sel yang tersuspensi. Konstituen utama sel darah merah (eritrosit), dapat terpisah dari cairan jernih (plasma) dengan sentrifugasi sederhana. Tetapi jika darah tidak diperlakukan dengan hati-hati, sel-sel ini akan pecah dan metodelogi pemisahan akan semakin sulit. Sel darah merah ini dapat pecah oleh pemanasan, oleh pembekuan, atau perlakuan mekanik seperti misalnya penyadukan, tetapi penyebab yang paling umum adalah perubahan dalam kekuatan ion dari cairan sekitarnya misalnya dengan penambahan air; osmosis yang dihasilkan menyebabkan sel menggelembung dan pecah. Oleh karena itu, setiap manipulasi yang melibatkan perubahan volume harus dilakukan dengan salin (larutan NaCl fisiologik) isotonik.
Cairan Biologik
Jika darah dibiarkan tanpa penambahan agen anti koagulan, maka sel darah merah akan menggumpal (clotting) dan cairan diatasnya yaitu serum dapat dienap tuangkan. Serum dalam banyak hal sama dengan plasma terkecuali tidak mengandung faktor pelarutan yang mengakibatkan terjadinya penggumpalan. Sebaliknya jika ditambahkan anti-koagulan dan dibuat plasma, maka faktor ini tetap tinggal yang memberikan sedikit perbedaan jika plasma dan serum dianalisis. Pada umumnya darah tidak langsung diekstraksi, tetapi plasma atau serum dibuat terlebih dahulu. Jika darah diekstraksi langsung, harus ditangani dengan hati-hati untuk mengurangi pecahnya sel darah merah. b) Serum dan Plasma Sifat umum serum dan plasma adalah mengandung protein dalam jumlah besar. Protein sangat berbeda secara fisikokimia dengan molekul obat yang bermolekul kecil. Tetapi sering kali ada afinitas yang sangat kuat antara protein dengan obat, dan penghilangan langsung protein dengan ultrafiltrasi atau dialisis dapat juga menghilangkan obatnya. Selain itu setiap pengukuran langsung obat dapat menghilangkan obat total yang ada, dan hanya mengukur obat yang bebas. Walaupun obat bebas merupakan satuan yang penting secara psiologik, karena sebagian besar obat terikat pada protein, maka konsentrasi obat bebas adalah sangat rendah, hingga biasanya yang diukur adalah obat total dalam plasma atau serum. Masalahnya adalah merusak ikatan obat-protein dan kemudian obat total diekstraksi dan dianalisis. Juga harus diketahui bahwa karena ikatan protein-obat merupakan prosentase yang tetap dari jumlah pada rentang konsentrasi yang lebar, maka penentuan obat total hanya menggunakan suatu faktor amptifikasi, maka kesimpulan keseluruhan masih tetap berlaku. Tahap pertama penyiapan sampel serum atau plasma untuk analisis adalah mendapatkan larutan dalam air yang bebas protein yang sesuai untuk diekstraksi dengan pelarut organik. Metode yang paling sederhana dan 42
paling tua adalah mengendapkan proteinnya, dan mengisolasi filtrat yang terjadi. Protein terdenaturasi oleh pengendapan, dan ikatan obat-protein dirusak dan diharapkan obat tetap dalam larutan. Pereaksi asam yang populer untuk pengendapan protein adalah asam triklorasetat, asam perklorat, dan asam tungstat. Akan tetapi pereaksi yang merupakan asam kuat ini dapat mempunyai efek merugikan pada obat yang hendak diekstraksi dan penggunaannya harus diuji terlebih dahulu dengan senyawa murni/standard, dan jangan digunakan langsung sebagai pereaksi umum. Selain itu dapat juga digunakan aluminium klorida atau amonium sulfat. Aluminium klorida merupakan pereaksi yang paling aman untuk mengendapkan protein dalam darah total. Penemuan kembali yang rendah disebabkan baik oleh mengendapnya obat dengan protein atau oleh degradasi. Ketidak stabilan obat pada pH rendah di atas dengan penggunaan pelarut organik untuk denaturasi dan mengendapkan protein. Dapat digunakan metanol atau etanol dan paling tidak dua volume etanol untuk mengendapkan
semua protein yang ada dalam plasma. Akhirakhir ini banyak digunakan asetonittril, yang dapat digunakan untuk analisis obat antikuvulsan dan analgetik, pada mana plasma dicampur dengan volume sama asetonitril, larutan dijenuhkan natrium bisulfat-natrium klorida, kemudian larutan sebelah atasnya dapat digunakan untuk analisis. Protein juga dapat didenaturasi menggunakan enzim proteolitik. Walaupun enzim seperti ini sering digunakan pada penyimpanan jaringan untuk analisis, enzim substilisin telah berhasil digunakan untuk merusak protein plasma. Penemuan kembali sejumlah obat seperti benzodiazepin, fenitoin dan asam salisilat dari plasma lebih efisien jika digunakan enzim ini, dibandingkan dengan prosedur ekstraksi langsung. Hidrolisis menggunakan enzim adalah sangat berguna untuk prosedur skrining umum jika tidak mungkin untuk mengoptimasikan prosedur ekstraski yang biasa untuk obat tertentu. Sejumlah enzim lain yang juga dapat digunakan dapat dilihat pada tabel berikut
Tabel 5.1. Enzim proteolitik yang dapat digunakan pada penyiapan sampel biologik untuk analisis obat Obat yang hedak dianalisis Enzim Amitriptilin Subtilisin, tripsin, proteinase Klorpormazine Substilisin, papain, ketodase, tripsin, protease Diazepam Tripsin, proteinase, substilisin, ketodase Difenhidramin Substilisin, ketodase, papain Fenobarbaital Tripsin, protease Fenitoins Substilisin, tripsin, proteinase
Walaupun plasma merupakan cairan yang amat kompleks, komposisinya sangat stabil, bahkan juga dalam pasien, pH plasma jarang terletak diluar 7,3 - 7,5 dan protein total serta konsentrasi garamnya dapat dikontrol. Sebaliknya kandungan lemaknya dapat bervariasi, yang seringkali dipengaruhi waktu dan sifat makanan. Lemak ini dapat mempengaruhi analisis dan terutama untuk sampel yang berlemak, memerlukan tahap partisi spesifik untuk menghilangkan lipida. Yang harus juga, diketahui adalah bahwa perubahan dalam konstituen plasma dapat memberi impact pada level obat dalam plasma, dan berbeda dengan faktor yang menggangu analisis. Ekstraksi juga dapat dilakukan tanpa mendenaturasi protien terlebih dahulu. Walaupun obat terikat kuat dengan plasma Cairan Biologik
protein, ikatannya adalah reversibel. Oleh karena itu pada pH yang tepat, sampel dapat langsung diekstraksi dengan pelarut organik. Jika partisi bentuk yang tak terinonisasi ke dalam pelarut organik cukup tinggi, maka kesetimbangan ikatan dapat digeser sedemikian hingga memberikan ekstraksi yang efesien ke dalam pelarut organik. Caranya adalah dengan menambahkan dapar yang sesuai dengan volume sama, kemudian diekstraksi dengan 2-3 kali volume pelarut organik. Keuntungan dari cara ini adalah bahwa tidak diperlukannya tahap filtrasi atau dekantasi dan dapat digunakan sebagai prosedur rutin untuk sejumlah besar sampel. Pemecahan ikatan protein-obat ini dapat juga dengan kolom adsorben untuk memekatkan obatnya yang kemudian dielusi dengan pelarut organik. Adsorben yang digunakan harus cukup kuat untuk merebut obat dari proteinnya 43
serta cukup lemah untuk melepaskan obat pada waktu dielusi. Sebagai adsorben dapat digunakan arang aktif, beberapa jenis resin seperti XAD-2 dan S-X3. Yang perlu juga diperhatikan pada plasma atau serum adalah kemungkinan adanya enzim yang dapat melanjutkan degradasi obat, terutama esterase yang dapat menguraikan ester menjadi asam bebas dan alkohol. Sifat dan aktivitas estrase ini dapat tergantung dari pasiennya. c) Urine Urine, tidak seperti plasma, bebas dari protein dan lipida, karena itu umumnya dapat langsung diekstraksi dengan pelarut organik. Dibandingkan dengan plasma atau serum, komposisinya bervariasi cukup besar yang dapat dilihat dari warna gelap urine malam dibandingkan dengan warna yang pucat dari urine yang dikumpulkan pada siang hari. Komposisi urine keseluruhan tergantung pada diet yang memang menyebabkan warna yang berbeda. Keuntungannya adalah bahwa jenis senyawa yang umum terdapat dalam urine adalah larut air, sedangkan sebagian besar obat adalah larut lemak, hingga dapat diekstrasi dengan pelarut yang sesuai. Yang menjadi kesukaran adalah bahwa adanya perbedaan yang besar dari volumen urine yang dihasilkan pada satu tenggang waktu.
tidak boleh dikocok melainkan tabung dibolakbalik secara pelahan-lahan. Pemilihan tabung, harus hati-hati dan cocok untuk fraksi darah yang diperiksa agar senyawa obat terjamin kemantapanya untuk dianalisa. Untuk analisa plasma dan serum diperhatikan zat tambahan yang digunakan sehingga gangguan pada tahap analisis dapat ditekan sekecil mungkin. Seperti contoh Tris(2butoksi-etil)fosfat (TBEP), suatu pengental yang terdapat pada tutup tabung pengental, ternyata dapat mendesak beberapa ikatan obat dengan protein, menyebabkan obat masuk ke dalam eristrosit. Sehingga memberi kesalahan dalam penentuan obat dalam plasma. Jika darah atau serum yang hendak dianalisis perlu segera dipisahkan eritrositnya karena kadar obat menjadi menurun yang disebabkan oleh beberapa faktor seperti metabolisme obat oleh eritrosit dan penyerapan obat ke dalam sel darah. Jadi makin lama obat bersentuhan dengan sel menyebabkan makin besar penurunan kadar obat tersebut. Perlu diperhatikan adsorpsi obat oleh dinding wadah karena kadar obat sangat kecil. Untuk mengatasi hal ini biasanya ditambahkan amilalkohol. Setelah disentrifuga hati-hati dalam pemisahan, agar sel darah tidak terikut dipipet.
Urine dapat mempunyai rentang pH yang lebar, terutama tergantung dari diet atau pengobatan. Misalnya antasida, jika diabsorpsi akan menyebabkan urine basa.
Wadah vial seharusnya inert, tertutup rapat dan tahan terhadap kondisi penyimpanan. Pada wadah ditandai dengan: tanda pengenal subjek, nama kajian, tenggang waktu perlakuaan /pengobatan, macam contoh (serum, plasma, darah total), jam pengambilan sampel, tanggal, nomer klas untuk setiap sampel, volume sampel.
5.2. Pengambilan Sampel
b. Sampel urine
Analisis toksikologi forensik biasanya menerima sampel dari kedokteran patologi forensik yang dilengkapi dengan Berita Acara Pengiriman Sampel.
Yang perlu diperhatikan dalam sampling urine adalah: 1) selang waktu pengambilan akan berpengahur terhadap volume yang ditampung, dihindari hilangnya urine (tumpah selama pengambilan sampel); 2) untuk mencegah tumbuhnya bakteri dalam sampel sebaiknya didinginkan dalam lemari pendingin, dalam beberapa hal biasanya ditambahkan pengawet seperti: timol, toluen, formaldehid, borat, dan kloroform. Penyawetan bertujuan untuk mencegah obat tidak terurai oleh bakteri.
a) Darah. Darah diambil dari pembuluh vena dengan menggunakan: jarum dan spuit; jarum dan tabung pengambil darah hampa; kateter vena yang dipasang tetap pada infus. Dalam pengambilan darah harus diperhatikan agar sel darah merah tidak terhemolisis baik pada saat pengambilan dalam vena harus pelan-pelan. Penambahan antikoagulan (heparin) tabung Cairan Biologik
Sebelum analisa urine perlu dikocok agar homogen, dan perlu pengukuran volum urine (volum urin total), analisis biasanya 44
memerlukan 10 - 15 mL urine. Penandaan pada wadah dilakukan seperti pada sampel darah tetapi perlu dicatat volume urine total. 5.3. Faktor-Faktor yang harus diperhatikan dalam Analisis obat dalam cairan biologi. A. Penyimpanan Sampel Dalam penyimpanan ini yang harus diperhatikan adalah adanya enzim esterase serum. Oleh karena itu sebagai anti koagulan digunakan natrium forida dengan kadar 5 mg/ml karena dapat menginhibisi kerja enzim. Cara yang paling banyak digunakan untuk penyimpanan adalah pendinginan di dalam freezer. Kerugian dari cara ini adalah terjadi efek apple jack yaitu obat akan terkonsentrasi dalam tetes pertama yang membeku hingga akan tinggal dipermukaan dan akan lebih mudah teroksidasi. Setelah beku obat belum tentu tetap stabil seperti misalnya apomorfin, sebagian besar senyawa katekol ternyata tetap akan teroksidasi menjadi senyawa koinon walaupun disimpan pada suhu -15 °C, terkecuali jika ditambahkan vitamin C sehagai anti oksidan. Indometasin juga tidak stabil jika dibekukan. Selain itu bekuan cairan/materi biologi dapat mengakibatkan protein yang ada rusak yang natinya dapat menggangu analisis obatnya. Karena pada waktu pencairan sampel sebelum dianalisis dapat terjadi efek konsentrasi terlokalisasi, sampel dikocok homogen sebelum dilakukan analisis. Sampel yang sudah mencair harus segera dianalisis untuk menghambat kerja enzim. Pencairan sebaiknya jangan dilakukan dengan pemanasan yang tinggi karena mungkin dapat menguraikan obatnya. B. Ekstraksi Cara yang paling umum yang sering digunakan untuk pemurnian parsial obat adalah metode ekstraksi dengan pelarut organik. Agar obat dapat terekstraksi dalam pelarut organik, harus dalam bentuk tidak terionisasi. Oleh karena itu pH fase air harus dioptimasi untuk masingmasing obat agar diperoleh bentuk tak terionisasi dengan sempurna. Pada tahap ekstraksi, densitas pelarut pengekstraksi juga harus diperhitungkan. Jika hendak mengunakan corong pisah maka pelarut pengekstraksi sebaiknya lebih berat Cairan Biologik
dari air. Jika ekstraksi dilakukan dalam tabung sentrifuga terlebih-lebih jika sejumlah banyak sampel yang harus dianalisis, maka sebaiknya pelarut pengekstraksi lebih ringan dari air. Pemilihan ini tentunya disesuaikan dengan apakah fase air atau fase organiknya yang hendak digunakan selanjutnya. Selain pada densitas, pemilihan pelarut ini juga dapat didasarkan pada kemudahan menguapnya. Untuk ini paling banyak digunakan adalah eter walaupun akan memberikan masalah pada waktu sentrifugasi. Sifat kimia pelarut pengekstraksi juga dapat menimbulkan efek yang tidak dikehendaki. Misalnya amin primer seperti etilamin akan bereaksi dengan keton dan aldehida membentuk basa Schiff. Sebaliknya metil butil keton sebagai pelarut dapat bereaksi dengan amin primer. Dalam beberapa hal reaksi dapat terjadi tanpa diketahui dan obat dapat ditentukan tanpa kesalahan besar. Etil asetat akan terurai pada pH lebih dari 9,0 membentuk etanol dan asetat. Kloroform dan diklormetan jika terkena udara akan terbentuk fosgen yang sangat rekatif. Oleh karena kloroform / diklormetan mengandung pengawet / antioksidan seperti etanol yang dapat mengakibatkan adanya / terjadinya etilkloformat yang selanjutnya merupakan alat pada perubahan norkodein menjadi norkodein karbonat. Terjadinya turunan karbonat ini juga ditunjukkan jika antidepresan trisiklik diekstraksi dengan kloroform yang tidak mengandung etanol sebagai pengawet. Fosgen dapat dihilangkan dari kloroform dengan mencuci dengan air, dan etanol dengan kromatografi kolom alumina. Untuk memperbesar partisi senyawa ionik ke dalam fase organik, fase air dapat dijenuhkan dengan garam seperti ammonium sulfat yang dapat juga memperkecil kecendrungan terbentuknya emulsi, untuk memisahkan dua lapisan cairan yang bercampur atau untuk merubah fase organik yang lebih berat dari air menjadi lebih ringan seperti halnya campuran eter-kloroform. C. Pemisahan Fase/Lapisan. Untuk pemisahan obat dalam cairan biologik secara ekstraksi cair-cair jarang digunakan corong pisah, karena volume sampel umumnya 45
kecil. Biasanya pemisahan dilakukan dengan tabung sentrifus.
dibandingkan menggunakan natirium sulfat anhidrat.
Kerusakan yang paling umum adalah yang disebabkan oleh pembentukan emulsi yang bertahan akibat pengocokan kuat. Pada pengocokan kuat akan terjadi gelembung gelembung kecil dari satu fase masuk ke campuran dua fase, dan jika tegangan permukaannya rendah, maka gelembung ini akan bertahan. Emulsi yang bertahan ini akan terbentuk jika dilakukan pengocokan kuat dengan adanya protein, sabun atau detergen. Untuk memecahkan emulsi ini dapat dengan sentrifugasi, pembekuan kemudian diikuti pencairan, filtrasi, diaduk dengan batang pengaduk gelas, penjenuhan fase air dengan garam atau penambahan sejumlah sedikit alkohol. Penambahan alkohol sebaiknya tidak dilakukan jika dikehendaki reprodusibilitas ekstraksi yang baik.
E. Penguapan Sampai Kerring
D. Pengeringan Fase Organik Setelah dipisahkan dari fase air, fase organik harus betul-betul bebas air, karena jika fase organik hendak diuapkan sampai kering, maka tetes terakhir air dapat menyebabkan diperlukannya kondisi yang labih kuat dibandingkan dengan kondisi yang dibutuhkan pelarut sendiri, yang mungkin justru dapat menguraikan obatnya. Untuk mempercepat penguapan dapat ditambahkan beberapa tetes etanol, walaupun hal ini dapat menimbulkan terjadinya esterifikasi asam organik yang tidak dikehendaki atau pembentukan ketal dengan gugus okso. Residu penguapan dapat mengandung asam atau basa mineral. Adanya air dalam fase organik dapat merubah komposisi fase gerak pada HPLC. Pada GC penyuntikan garam atau protein yang larut air yang dikandung fase organik dapat menyebabkan terbentuknya tumpukan zat padat pada awal kolom atau airnya sendiri dapat menarik fase diam kolom. Sesepora air dapat dihilangkan dari fase organik dengan penambahan sedikit natrium sulfat anhidrat, larutan yang sudah bebas air dituangkan dengan meninggalkan garam yang terhidrasi sebagai bongkahan kecil di dalam tabung. Jika jumlah airnya hanya sesepora untuk menghilangkan air ini cukup dengan menyaring melalui kertas saring kering dengan kehilangan akan obat yang lebih kecil Cairan Biologik
Pada tahap penguapan sampai kering ini sering kehilangan akan obat, akibat terutama oleh bumping (muncrat), adsorpsi oleh wadah gelas dan menguapnya obat, seperti yang dialami oleh anti depresan trisiklik. Jika hal ini terjadi dapat diatasi dengan mengselanisasi alat gelas yang digunakan, pelarut diuapkan pada 40 °C memindahkan residu obat segera dan menggunakan standard internal. Penguapan sampai kering dapat dilakukan dengan evaporator. F. Sumber Pencemaran Cemaran adalah senyawa yang tidak dikehendaki yang masuk ke dalam sampel selama proses pembuatan (cemaran endogen) yang sebenarnya merupakan sebagian masalah analisis. Adanya cemaran yang sebenarnya berasal dari proses analisis. Yang juga harus diketahui adalah bahwa cemaran suatu prosedur tertentu belum tentu merupakan cemaran pada prosedur yang lain. Jadi pelarut yang diperuntukkan untuk spektroskopi misalnya dapar saja mengandung senyawa yang tidak mengabsorpsi yang memungkinkan mempengaruhi sifat kromatografi. Masuknya cemaran dapat terjadi dari mulai tabung pengumpul spesimen, senyawa kimia yang, sengaja ditambahkan ke dalam sampel misalnya antikoagulan pada sampel darah dapat merupakan cemaran pada analisa menggunakan HPLC. Staf laboratorium dapat juga merupakan sumber cemaran. Cemaran lain dapat berupa serat dan tisu atau jas Lab. Cemaran juga dapat berasal dari alat lab yang tidak bersih. KEPUSTAKAAN 1. Chamberliain, J.. (1985), Analysis of Drugs in Biological Fluids, CRC Press, Inc., Boca Raton. 2. Moffat, C.A., et al., (1986), Clarke's Isolation and Identification of Drugs, 2nd ed. The Pharmaceutical Press, London. 3. Sriewoelan, S. (1988), .Analisis Obat Dalam Cairan Biologi, Jakarta 46
BAB VI REAKSI WARNA Reaksi warna adalah prosedur kimia dalam pengujian senyawa dengan menggunakan pereaksi dengan mengamati warna yang terbentuk atau perubahan warna yang terjadi. Banyak senyawa kimia dapat memberikan warna tertentu jika berkontak dengan pereaksi tertentu. Warna yang dihasilkan oleh pereaksi tersebut mungkin spesifik untuk senyawa tersebut, atau juga tidak. Reaksi warna tidak dapat dijadikan dasar untuk mengidentifikasi satu senyawa obat, tetapi warna yang terbentuk mungkin positif terhadap sekelompok senyawa atau positif terhadap gugus fungsi tertentu, sehingga reaksi warna berhubungan dengan aspek gugus fungsi dari struktur senyawa obat tersebut.
yang sama. Warna yang dihasilkan harus dicatat apakah dihasilkan oleh bentuk asam atau bentuk basanya, sebab dalam hal tertentu bentuk asam dan basanya memberikan warna yang berbeda pada pH yang berbeda. Seperti contoh senyawa obat dalam bentuk garam hidroklorida biasanya memberi warna merah dengan uji Mendelin's dan memberi warna biru oleh reagen Koppayi-Zwikker (sebelum ditambahkan pirolidin). Fenomena ini jika diterapkan pada materi biologi tidak menimbulkan masalah, tetapi akan muncul masalah jika diterapkan pada sediaan farmaseutika.
Yang paling penting dari reaksi warna adalah skrining cepat dari sampel urine memungkinkan analisa tanpa ekstraksi lebih dahulu. Toksikolog harus memperhatikan keterbatasan reaksi warna dan sumber-sumber yang memungkinkan reaksi positif palsu.
Pemilihan pereksi warna yang tepat untuk senyawa obat yang diduga terdapat dalam sampel didasarkan atas rumus bangun dari senyawa obat tersebut. Jika dikenal strukturnya maka dapat diketahui gugus fungsi (golongan) yang terdapat didalamnya, sehingga pemilihan pereaksi dapat berdasarkan reaksi positif terhadap gugus fungsi tersebut. Ataupun pemilihan pereaksi warna dapat didasarkan pada pereksi yang memang spesifik untuk senyawa bersangkutan.
6.1. Interpretasi reaksi warna. Rentang warna yang dihasilkan oleh rekasi warna tidak mungkin mengatakan dalam derajat, karena sangat terbuka untuk memberikan deskripsi yang subjektif. Lebih jauh rentang warna tersebut mungkin sangat luas atau sempit, rentang warna tersebut sangat tergantung pada kondisi percobaan, jumlah analit yang terdapat dalam sampel, dan terdapatnya senyawa lain dalam sampel yang mungkin menimbulkan reaksi positif atau negatif palsu. Warna yang ditunjukan dibagi menjadi warna dasar seperti: merah, oranye, kuning, hijau, biru, ungu, dan ping, coklat, abu-abu, hitam. Biru yang bervariasi mungkin dihasilkan dua warna seperti merah - coklat, oleh karena itu perlu dijelaskan perubahan warna yang terbentuk selama melakukan uji, atau dicatat warna yang dominan muncul merah - coklat atau terjadi perubahan warna merah → coklat. Kesimpulan akhir dari reaksi warna harus disertai reaksi pembandingan, dengan mereaksikan baku pembanding pada kondisi Reaksi Warna
6.2. Faktor Teknis
Rekasi warna dapat diterapkan langung pada sampel baik berupa sediaan atau dari spesimen cairan biologi. Reaksi warna juga digunakan sebagai penampak noda pada plat KLT atau sebagai uji skrining maupun konfirmasi menggunakan KLT. 6.3. Beberapa Reaksi Warna 6.3.1. Reaksi golongan a. Sifat khas senyawa nitrogen Nitrogen dalam bentuk nitrat dan nitrit; sebagai senyawa nitro dalam ikatan dengan senyawa karbon; sebagai amin primer, sekunder, atau tersier yang bersifat basa; sebagai amonium kuarterner; golongan amin aromatik; asam amida netral; garam ion zwitter seperti asam amino: dan dalam bentuk lain. Pemeriksaan nitrat 47
Semua nitrat larut dalam air. Dengan menambahkan FeSO4 dan H2SO4 pekat terbentuk cincin berwarna coklat. Pemeriksaan senyawa nitro aromatik Sejumlah 50 mg zat dilarutkan dalam 3 ml etanol. Sesudah pemberian 3 ml HCl encer, 4 ml air, dan 200 mg Zn, campuran dipanaskan di penangas air selama 10 menit. Lalu 2 ml filtratnya direaksikan dengan 2 tetes pereaksi Diazo I. Selanjutnya larutan dituangkan ke dalam 2 ml pereaksi Diazo II; terbentuk warna jingga atau endapan, misalnya pada nitrazepam dan klorazepam. Pereaksi Diazo I: 10 g NaN02 dalam 100 ml aquades Pereaksi Diazo II : 0,25; g 2-naftol dalam 100 ml 3N NaOH. Pemeriksaan senyawa basa amin Dengan pereaksi Mayer senyawa basa amin membentuk endapan kekuning-kuningan. Caranya: ke dalam larutan zat yang jernih, yang bersifat asam lemah akibat penambahan asam sulfat, ditambahkan beberapa tetes pereaksi. Reaksi tidak sama untuk semua senyawa basa amin. Morfin dan efedrin hanya memberikan sedikit endapan atau sama sekali tidak. Pereaksi Mayer: 1,35 g HgCl2 dalam 100 ml larutan KI 5% Pemeriksaan amin alifatik primer ( reaksi Senfol) Larutan amin dalam etanol dituangi karbondisulfida sama banyak, dipanaskan sampai karbondisulfida yang berlebih menguap. Pada sisa larutan ditambahkan beberapa tetes larutan raksa (II) klorida 5 %; tercium bau khas `mustard' jika ada amin alifatik primer. Pemeriksaan amin aromatik primer ( reaksi Diazo) Sejumlah 50 mg zat dilarutkan dalam 1 ml 3N HCl. Larutan direaksikan dengan 2 tetes pereaksi Diazo I, dan kemudian dituangkan ke dalam 2 ml perekasi Diazo II; terbentuk warna merah jingga atau endapan. Reaksi positif untuk benzokain, etrakridin, PAS, prokain, dan sulfonamida. Etakridin sudah berwarna merah ketika ditambahkan Diazo I, sedangkan imipramin berwarna biru. Rekasi dapat juga positif jika zat dipasakan dulu dengan 3N HCl selama 3-15 menit dan kemudian didinginkan, misalnya untuk klordiazepoksida, furosemida, oksazepam, fenasetin. Reaksi Warna
Pemeriksaan amin sekunder Zat dilarutkan dalam 2 ml 3N HCl, didinginkan pada 5°C, kemudian dengan 2 ml larutan NaNO2 1%. Lima menit kemudian larutan diencerkan dengan 5 ml air dan dikocok dua kali, setiap kali dengan 5 ml eter. Larutan eter dicuci, dan akhirnya diuapkan sampai kering. Kepada sisa penguapan ditambahkan 50 mg fenol, dipanaskan sebentar, didinginkan, direaksikan dengan 1 ml H2SO4 : terbentuk warna biru-hijau pekat yang bila hasil rekasi dituangkan ke dalam air berubah menjadi merah. Jika dibasakan warna hijau-biru semula timbul kembali (percobaan nitrosamin dan Liebermann) Pemeriksaan amin alifatik primer dan amin aromatik ( rekasi Isonitril) Sedikit zat dilarutkan dalam etanol, direkasikan dengan beberapa tetes kloroform dan basa alkali dalam etanol, kemudian dipanaskan dengan api kecil. Tercium bau khas isonitril Pemeriksaan asam amino ( rekasi Ninhidrin) Kedalam 1 ml larutan zat yang netral ditambahkan 2 tetes larutan ninhidrin 1 % dalam air, kemudian dipanaskan, sampai mendidih. Terbentuk warna kemerah-merahan, ungu, atau biru. Rekasi positif antara lain untuk : efedrin (merah), tolbutamid (ungu), asam askorbat (merah tua). Pemeriksaan golongan guanidin (reaksi Sakaguchi) Ke dalam larutan 1 mg zat dalam 5 ml air ditambahkan 1 ml larutan NaOH 10 % dan 1 ml larutan 1-naftol 0,05 % dalam etanol. Campuran didinginkan pada ± 15 °C lalu ditambahkan 3 tetes larutan natrium hipobromit ( 2 g NaOH dalam 7,5 ml air + 0,5 ml Brom, ditambahkan air sampai 10 ml). Terbentuk warna merah-ungu (streptomisin). Pemeriksaan turunan piridin Pada pemanasan 100 mg zat dengan 100 mg natrium karbonat kering bau piridin tercium. Hal itu terjadi pada sebagian besar turunan piridin. ii. Sejumlah 5 mg zat dicampur atau digerus dengan 10 mg 1-klor-2,4dinitrobenzol, lalu dilumerkan sebentar. Lumeran yang sudah dingin dilarutkan dalam 2 ml 0,5N KOHetanol. Terbentuk warna merah tua (nikotinamida)
i.
48
b. Pemeriksaan senyawa pereduksi Reaksi Fehling Ke dalam 1 ml campuran pereaksi Fehling I dan II sama banyak ditambahkan 20 mg zat, lalu dipanaskan di penangas air. Bila ada reduksi terbentuk endapan tembaga (I) oksida berwarna merah-biru bata. Positif pada suhu kamar : asam askorbat. Positif pada pemanasan : isoniasida, gula pereduksi, hidrokortison, sorbitol yang sebelumnya dioksidasi dengan KMnO4, sukrosa setelah dihidrolisis dengan asam. Perekasi Fehling I: larutan CuS04.5H20 7 %. Pereaksi Fehling II: 35 g KNa-tartrat + 10 g NaOH + air sampai 100 ml. Rekasi adisi dengan brom Sejumlah 50 mg zat dilarutkan dalam 2 ml asam asetat, lalu ditambahkan tetes demi tetes air brom (1,0 g Br2 atau 0,3 ml Br2 / 100 ml asam asetat). Apabila ada ikatan tak jenuh warna brom akan hilang. c. Pemeriksaan aldehid Zat dilarutkan atau disupensikan dalam air, diasamkan dengan 3 N HCl sampai pH mencapai kurang dari 3, lalu ditambahkan perekasi Schif yang tak berwarna dengan volum sama banyak. Setelah beberapa waktu terbentuk warna, merah sampai ungu. Rekasi blanko terhadap perekasi perlu dilakukan. 6.3.2. Reaksi khusus Test asam amalic a. Tets asam amalic Metode : Tambahakan ke dalam sampel beberapa tetes 10 M HLCl, diikuti beberapa kristal KCl, kemudian uapkan sampai kering. Amati warna yang terbentuk pada residu, tambahkan 2-3 tetes 2 M NH4OH, amati kembali rawna yang terbentuk Indikasi :Residu berwarna merah, ping, orange, atau kuning berubah menjadi ping, merah atau violet setelah ditambahkam amoniumhidroksida. Mengindikasikan terdapatnya senyawa berinti xantin. b. Perak Ammoniumnitrat Pereaksi: Ke dalam 20 ml peraknitrat 0,1 M ditambahkan larutan ammonium pekat secukupnya untuk melarutkan peraknitrat yang tidak melarut. Reaksi Warna
Metode : Larutkan sampel ke dalam sesedikit air, dengan tambahan etanol bila perlu, tambahkan pereaksi sejumlah volum yang sama, catat warna yang terjadi, kemudian panaskan di dalam tangas air pada 100°C selama 30 detik. Indikasi : Merah, kuning, coklat, atau hitam (pada suhu kamar) menunjukkan adanya senyawa pereduksi. Ini terjadi jika atom karbon pada cincin terikat gugus hidroksil, gugus hidroksil pada posisi meta tidak memberi respon, sedangkan pada posisi para menunjukkan respon. Beberapa pereduksi juga positif adalah ikatan etinil, tetapi bukan ikatan etilenik. c. Antimoni Pentaklorida Pereaksi: Keringkan sejumlah antimoni triklorida pada fosfor penta oksida, lelehkan bahan yang telah dikeringkan ( titik leleh 73°C), dan lewatkan gas klorin kering ke dalam lelehan sampai terbentuk cairan berwarna kuning. Tambahkan kloroform 10 kali volum cairan kuning, saring larutan ke dalam botol berwarna gelap dan simpan di dalam desikator. Metode : Tempatkan satu tetes larutan etanol dari sampel pada kertas saring, tambahkan pereaksi, dan segera keringkan di atas uap air. Indikasi : Berbagai variasi warna terbentuk oleh glikosida jantung dan warna tertentu oleh estrogen dan kortikosteroid. d. Aromatik Metode 1: Tempatkan sejumlah sampel masingmasing ke dalam dua tabung reaksi, salah satu tabung tambahkan NaOH padat. Panaskan tabung dengan hati-hati hingga semua uap keluar, tambahkan pereaksi Marquis dan amati warna yang terjadi. :Warna merah dan orange Indikasi mengindikasikan bahwa sampel mengandung aromatik alam. Warna mungkin diberikan oleh sesepora hidrokarbon aromatik. Jika warna diberikan setelah pemanasan dengan NaOH menunjukan adanya asam aromatik, tetapi jika tanpa NaOH menunjukkan adanya fenol, asam fenolat, mengandung aldehid dengan gugus hidroksil lebih dari satu. Reaksi negatif tidak berarti sampel bukan non-aromatik. Metode 2: Tambahkan 2- 3 tetes asam nitrat ke dalam sampel panaskan pada tangas air 100°C 49
selama 1 menit, dinginkan tambahkan air 2-3 kali volum, buat larutan menjadi basa dengan menambahkan NaOH 40%. Indikasi : Perubahan warna dari tidak berwarna atau warna kekuningan dalam larutan asam menjadi warna gelap; seperti contoh orange atau orange-merah setelah penambahan NaOH menunjukkan terdapat cincin benzen di dalam molekul, mungkin dihasilkkan oleh nitrofenol atau senyawa nitro lainnya. Seyawa tertentu (contoh : diazepam, metaqualon) memberi hasil yang negatif. Warna orange dapat diberikan oleh senyawa kortikosteroid non-aromatik tertentu ( Kortison). e. Reaksi Mureksid Sejumlah 10 mg zat ditambahkan 1,5 ml hidrogen pereksida dan 5 tetes asam sulfat pekat, kemudian dipanaskan di penangas air samapi kering. Sisa diberikan beberapa tetes 6N NH3. Bila ada senyawa purin ( teofilin, kofein, teobromin) terbentuk warna merah ungu. Sewaktu menguap, warna sudah terbentuk, yang kemudian diperkuat oleh oksidasi. f. Reaksi Zwikker Ke pada 10 mg zat dipelat tetes ditambahkan 10 tetes pereksi Zwikker I. Penambahan 2 tetes pereaksi Zwikker II menimbulkan warna ungu jika reaksi positif. Isoniasida dan beberapa zat lain menggangu rekasi hingga lebih baik jika zat dipisahkan dulu dengan ekstraksi. Reaksi Zwikker positif untuk barbiturat, glutetimida, hidantoin, beberapa sulfonamida, dan purin. Basa hidroksida atau basa fosfat membentuk warna biru-hijau yang setelah ditambahkan pereaksi Zwikker II berubah menjadi biru tua atau ungu. Reaksi ini terutama positif untuk furosemida (biru kuat), mefrosida (biru-kelabu), nipagin M, hidroklortiazida, dan sakarin Na (berwarna biru hanya dengan perekasi Zwikker I). Pereksi Zwikker I: kobal (II) nitrat dalam metanol Peraksi Zwikher II : piridin 10 % dalam metanol.p-Dimetilaminobenzaldehid Tambahkan ke dalam sampel di dalam tabung reaksi, bila perlu dipanaskan, amati warna yang terbentuk, kemudian tambahkan air dengan hati-hati. Warna ungu diberikan oleh alkaloid ergot, kanabinoid dan beberapa cincin indol memberikan warna merah yang berubah Reaksi Warna
menjadi ungu jika diencerkan, beberapa fenol juga memberikan warna seperti kanabinoid. Pereaksi : Larutkan 0.5 g pdimetilaminobenzaldehid dalam 50 ml campuran larutan (60 volume etanol dan 40 volume asam sulfat). Peraksi harus dibuat segar. h. Pereaksi Dragendruff Larutkan sampel ke dalam 3 tetes 2M HCl, tambahkan 2-3 ml perekasi, encerkan dengan 2 ml air, amati warna yang terjadi; warna orange, merah-orange, coklat-orange diberikan oleh alkaloid. Amin primer, skunder, tersier, dan kuartener juga memberi reaksi positif. Pereaksi: Larutkan 1 g bismut subnitrat dalam 3 ml 10 M HCl untuk tujuan pemanasan. Encerkan dengan 20 ml air, larutkan 1 g KI ke dalam campuran tersebut. Jika Bismut hitam dengan tri-iodida terpisah tambahkan asam HCl 2M dan sedikit KI. i. Pereksi Duquinois Sejumlah sampel atau ekstrak eter simplisia, di dalam tabung reaksi, uapkan ekstrak tambahkan 0,5 ml pereaksi dan sejumlah volume yang sama 10 M HCl, panaskan perlahan-lahan amati warna yang terjadi, tambahkan klorform kemudian dikocok, amati wama yang terekstraksi. Perubahan warna dari abu-abu - hijau- biru- violet- biru diduga diberikan oleh kanabis, tetapi perlu dilakukan pembandingan dengan kopi yang disangrai, dan minyak patcholi yang juga memberi rekasi positif. Hanya kanabis memberikan warna ungu yang terekstraksi ke dalam kloroform. Perekasi :Larutkan 2 g vanilin dan 0,3 ml asetaldehid dalam 100 ml etanol. Peraksi harus disimpan dalam lempat yang gelap. j. Formaldehid - asam sulfat Campurkan sampel dengan pereaksi panaskan pada 100 oC selama satu menit. Senyawa benzodiazepin umumnya memberikan warna orange kecuali bromazepam dan klozapin (kuning), dan lurazepam (pink). Senyawa lain juga berreaksi, positif adalah fenotiasin, tioxanten, tryplamin tertrasiklin, dan zomepirak. Pereaksi ke dalam 4 volume H2S04 tambahkan 6 volume larutan formaldehid, aduk 50
manggunakan pipet, larutan akan panas lebih dari 1 jam, apabila memberikan warna buram panaskan dalam, penangas air 100 °C selama 1 menit. Catatan pereaksi ini tidak sama dengan pereaksi Marquis.
Pereaksi : 2 ml Natriumplatina 5% dan 5 g KI ditambahkan air 98 ml kocok hingga larut.
k. Pereaksi lodoplatinat
1. Kovar. A, 1987, Identifikasi Obat,Penerbit ITB, Bandung.
Larutkan sampel dalam 2 tetes 2 M HCl, tambahkan 2-3 ml pereaksi, encerkan dengan 10 ml air. Reaksi positif diberikan oleh alkaloid base membentuk warna ungu, biru-ungu, coklat-ungu, abu-abu-ungu.
Reaksi Warna
Kepustakaan.
2. Stevens, HM., 1986, Color Test, Moffat, C.A. et.al., Clarke `s Isolation and Identification of Drugs, 2 nd ed., 128 - 176 The Pharmaceutical Press, London.
51
BAB VII KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS Kromatograti lapis tipis (KLT) adalah suatu salah satu komponen dari campuran metode pemisahan campuran analit dengan diadsorpsi lebih kuat dari komponen yang mengelusinya melalui fase diam yang datar lainnya. Karena adsorpsi merupakan pada plat penyangga. KLT termasuk fenomena permukaan, maka derajat kromatografi adsorpsi, walaupun sebenarnya pemisahan dipengaruhi oleh luas permukaan mekanisme yang terjadi adalah kombinasi yang ada atau secara tidak langsung adsorpsi dan partisi. Dalam kromatografi dipengaruhi oleh ukuran partikel fase diam adsorpsi fase diam berupa padatan seperti (adsorpben). Walaupun begitu yang silika gel atau alumina sedangkan fase gerak merupakan faktor kunci setiap bentuk berupa cairan atau gas. Dalam KLT fase gerak kromatografi adalah koefisien distribusi/partisi ini berupa cairan. Pemisahan akan terjadi jika senyawa antara ke dua fase dalam sistem.
Koefisien distribusi" partisi" (K) =
Jumlah senyawa per satuan fase diam Jumlah senyawa per satuan fase gerak
Dalam kromatografi adsorpsi harga “K” ini dipengaruhi oleh suhu dan konsentrasi senyawa. Pada suatu suhu tertentu hubungan antara jumlah senyawa pada fase diam dan jumlah senyawa yang ada pada fase gerak dapat dinyatakan secara grafik sebagai isoterem distribusi. Kelandaian isoterm linier berbanding langsung dengan koefisien distribusi/partisi, hingga kondisi untuk mendapatkan pemisahan yang optimum adalah kondisi pada mana harga koefisien distribusi ini adalah sama dengan satu. Efisiensi pemisahan pada kromatografi dapat dinyatakan sebagai jumlah plat teoritis. Jumlah plat teoritis (N) berhubungan dengan panjang plat KLT (L) atau panjang kolom pada kromatografi kolom dan H adalah tinggi plat teoritis (Height equivalent a theoretical plat)
N=L
H
(7.2)
Untuk menghitung kinerja KLT perlu mengidentifikasi parameter yang mungkin menurunkan harga H. Empat parameter yang terpenting pada KLT adalah viskositas, temperatur, laju linier dari fase gerak dan ukuran dari fase diam. Efisensi dari kromatografi cair dapat digambarkan seperti pada persarnaan Van Deemter
H=B
µ + Cs µ + Cm µ
(7.3)
Dimana µ = laju linier fase gerak, Cs dan Cm adalah konsentrasi analit pada fase diam dan fase gerak. Proses difusi longitudinal dinyatakan sebagai B dan berhubungan dengan kecenderungan dari molekul analit Kromatografi Lapis Tipis
(7.1)
untuk bermigrasi dari konsentrasi tinggi di tengah-tengah noda pada KLT menuju zone konsentrasi yang lebih rendah di pinggiran noda. Hal ini akan menimbulkan pelebaran noda yang akan membuat pemisahan tidak efisien. KLT dengan fase diam yang berukuran sangat kecil (3 - 5 µm) dikenal dengan KLT kinerja tinggi (HPTLC = High Performance Thin-Layer Chromatography). HPTLC memerlukan waktu elusi yang singkat, jarak elusi yang lebih pendek dan jumlah elusi analit yang lebih sedikit dibandingkan dengan KLT. Parameter migrasi analitik pada KLT dinyatakan dengan Rf.
Rf = D A
(7.4)
DM
dimana DA jarak titik awal ke pusat zone A setelah elusi dan DM adalah jarak dari titik awal ke tepi muka pelarut. Faktor kapasitas relatif dari dua komponen merupakan ukuran kemampuan kolom/plat untuk memisahkan keduanya. Hal ini dinyatakan sehagai:
K ' = (1 − Rf )
(7.5)
Rf
Kemampuan sistem KLT untuk memisahkan dua komponen A dan B dapat dinyatakan sebagai resolusi (Rs):
( ) Rs = 2 D A − D B
(W A + WB )
(7.6)
dimana DA dan DB adalah jarak yang ditempuh noda A dan B, sedangkan WA dan WB adalah lebar noda/bercak A dan B. Jika Rs ≥ 1 pemisahan 52
yang terjadi adalah sempurna. Faktor selektivitas (S) juga diukur sebagai daya resolusi
S=
k ' B D A (DM − D B ) = K ' A D B (DM − D D )
(7.7)
Batas Pengembangan WA WB
DM DA
Eluent
DB
Awal Penotolan
Gambar 7.1. Diagram alat kromatografi lapis tipis 7. 1. Fase Diam Sebagai fase diam pada KLT digunakan adsorpben dengan partikel halus yang dilapiskan pada lempeng penyangga kaca, logam atau plastik. Adsorpben yang dapat digunakan diklasifikasi berdasarkan sifat kimia atau daya ikatanya. Adsorpben pada KLT adalah analog dengan yang digunakan pada kromatografi kolom, hanya berbeda ukuran partikelnya, 1) Silika gel (asam silikat), yang paling banyak digunakan dan bersifat asam lemah. Sering ditambahkan CaSO4, hemihidrat sebagai pengikat agar melekat kuat pada pengangga dan mempercepat mengeringnya plat. Juga dapat ditambahkan indikator fluoresensi yang akan berfluoresensi di bawah sinar UV pada 254 nm, hingga bercak yang mengabsorpsi pada frekuensi ini berfluoresensi hijau kuning. 2) Alunima, bersifat basa lemah. Tidak sebaik silika gel lebih reaktif secara kimia senyawa yang sensitif dapat terdegradasi. Juga dapat ditambahkan CaSO4 dan indikator fluoresensi. 3) Kieselguhr (tanah diatome), merupakan adsorpben netral dengan aktivitas rendah. Daya resolusinya juga kecil. Dapat ditambahkan sebagai campuran pada silika Kromatografi Lapis Tipis
gel yang akan memberikan adsorpben campur yang kurang aktif. Juga dapat ditambahkan CaSO4. 4) Selulosa, sebagai adsorpben pada kromatografi lapis tipis memberikan lapis tipis yang sitatnya analog dengan kromatograti kertas dan memberikan lapis tipis yang cukup baik tanpa pengikat. Dapat ditambah indikator fluoresensi atau kalsium asetat. Digunakan untuk pemisahan senyawa hidrofil. Kerugiannya ialah tidak dapat digunakan pereaksi yang korosif seperti asam sulfat atau pereaksi destruksi lainnya. 5) Poliamida, merupakan magnesium silikat. Daya melekatnya tidak sebaik adsorben lainya. Biasanya ditambah pengikat seperti selulosa atau amilum. Mempunyai kapasitas yang besar dan banyak digunakan untuk pemisahan senyawa fenol. 6) Fase diam cair terikat secara kimia, pengikatan fase diam secara kimia pada penyangga menyangkut reaksi silika dengan dimetilklorsilan tersubstitusi. Proses reaksi pengikatan meliputi pengaktipan permukaan silika dengan HCl sehingga terbentuk silanol pada permukaan silika. Silanol yang terbentuk 53
direaksikan tersubstitusi
dengan
dimetilklorsilan
▓-Si -OH + Cl-Si(CH3)-R →Si-OSi(CH3)3R + HCl
Untuk membuat berbagai macam fase terikat dilakukan dengan menganti-ganti gugus fungsi R yang terikat pada pereaksi sililasi. ▓-Si -OH + ROH → ▓Si-OR + H2O ▓-Si -OH + SOCl2 → ▓Si-Cl + SiO2 + HCl ↓ RMgBr (Gridnard)
Metode lain: untuk esterifikasi dari gugus silanol permukaan dengan alkohol atau konversi gugus silanol ke SiCl mengnunakan ionilklorida diikuti dengan senyawa organometalik. Reaksi esterifikasi : Fase diam ini umum digunakan pada HPLC namun sekarang telah banyak dijumpai pada KLT. Sistem ini lebih dikenal kromatografi fase balik.
▓-Si -R (gugus Si-C yang sangat stabil)
7.2. Penotolan sampel Titik penotolan harus ditandai terlebih dahulu, dapat di lakukan dengan pinsil atau dengan jarum, 1, 5 - 2 cm dari tepi bawah plat. Sampel dan pembanding jika mungkin dilarutkan dalam pelarut organik yang non-polar dengan titik didih rendah agar mudah menguap setelah larutan ditotolkan. Penotolan dapat dilakukan dengan pipet mikro atau pipet lamda atau jarum suntik mikro sebanyak 1- 5 µL dari larutan 1%. Diameter penotolan hendaknya sekecil mungkin (5 mm) umumnya lebih kecil. 7.3. Sistem pelarut Yang menjadi permasalahan adalah bagaimana memperoleh suatu sistem pelarut yang sesuai karena melibatkan berbagai jenis fase diam yang berbeda dan sifat dari gaya yang terlibat dalam prosedur kromatografi. Yang sering digunakan adalah sistem bukan air seperti metanol, asam asetat, etanol, aseton, etil asetat, eter, kloroform, benzen, sikloheksan, dan petrolium eter, kloroform. Sistem pelarut ini dapat berupa pelarut tunggal atau campuran beberapa pelarut. Hanya hendaknya sistem multikomponen dihindari karena komposisinya dapat berubah dan akan terbentuk suatu gradien fase gerak dalam lapis tipis yang dapat menyebabkan reprodusibilitasnya berkurang. Untuk fase diam yang polar dapat digunakan fase gerak dari nonpolar (n-heksana) sampai paling polar. Untuk fase diam non-polar (sistem fase balik) biasanya digunakan fase gerak larutan berair, metanol, asetonitril dan isopropanol.
Kromatografi Lapis Tipis
Pemilihan fase gerak sangat tergantung pada jenis pemisahan yang hendak dicapai. Secara umum pemilihan fase gerak harus dihindari menggunakan pelarut berbahaya atau beracun. Beberapa hal yang dipertimbangkan dalam pemilihan pelarut adalah: - pelarut harus tidak toksik menyebabkan masalah kesehatan baik jangka - pendek maupun jangka panjang, - tidak mudah meledak pada kondisi normal, - tidak reaktif atau bereaksi secara kimia dengan analit atau fase diam, - tidak memberikan masalah pada pembuangan (ramah lingkungan). Kloroform, metilenklorida, benzen dan 1-4 dioksan adalah pelarut yang bersifat karsinogen. Kloroform adalah pelarut yang sukar didegradasi dilingkungan. Dalam beberapa sistem pelarut organik dan silika, sering ditambahkan amonia yang bertujuan untuk menangani masalah bercak berekor. Etilasetat - amonia adalah campuran pelarut yang sangat berguna, tetapi asetat dapat bereaksi dengan amonia menghasilkan sistem pelarut yang lemah. Cember seharusnya diisi dengan pelarut segar sekurang-kurangnya setiap hari. 7.4. Pengembangan Teknik pengembangan kromatografi lapis tipis sama dengan kromaografi kertas. Pemilihan tipe bejana tergantung dari tujuan analisisnya. Fase gerak diisikan ke dalam bejana paling kurang satu jam sebelum digunakan. Dinding bejana dapat dilapisi dengan kertas saring tebal yang dibasahi pelarut pengembang untuk 54
mendapatkan atmosfer jenuh akan uap pelarut dalam bejana. Diketahui beberapa macam pengembangan yaitu: 1) Pengembangan menaik. Teknik pengembangan ini yang paling umum dalam KLT. 2) Pengembangan ganda. Pengembangan ganda ini biasanya dilakukan jika pemisahan terjadi belum sempurna dengan pengambangan tunggal. Dalam hal ini lempeng dikeluarkan dari bejana setelah pengembangan pertama selesai, dikeringkan di udara, kemudian dikembangkan kembali dengan pelarut yang sama. Cara ini dapat digunakan untuk senyawa yang bergerak lambat. 3) Pengembangan horizontal. Fase gerak dialirkan dengan pertolongan tekanan. 4) Pengembangan bertahap. Jika suatu campuran senyawa mengandung komponenkomponen yang polaritasnya sangat berbeda, maka untuk mendapatkan pemisahan yang sempurna, dapat dilakukan migrasi secara progresif dengan menggunakan pelarut pengembang yang berbeda. Pelarut pengembang pertama dapat berupa pelarut polar misalnya metanol untuk memisahkan komponen polar. Kemudian pengembangan dilanjutkan dengan pelarut non-polar misalnya sikloheksan sampai selesai. Dengan cara ini dapat dipisahkan senyawa non-polar yang bermigrasi dengan muka perat pertama. Teknik ini disebut leknik elusi gradien. 5) Pengembangan lewat. Teknik pengembangan ini pada kromatografi lapis tipis jarang digunakan karena sukar melakukannya dan membutuhkan suatu peralatan yang khusus. Dalam hal ini pengembangan dilakukan sampai tepi atau lapis tipis dan selanjutnya pelarut pengembangnya dihilangkan dengan jalan penguapan. 6) Pengembang dua demensi. Dengan pengembangan cara ini sampel ditotolkan pada satu sisi, dikembangkan dan dikeringkan. Kemudian dikembangkan dalam sistem pelarut pengembang yang lain dari/terhadap dengan posisi 90° pengembangan pertama. 7.5 Deteksi noda Kromatografi Lapis Tipis
Cara deteksi noda tergatung dari adsorben dan bahan pengangga yang digunakan. Untuk deteksi secara fisika atau kimia, adsorpben yang baik adalah adsorben anorganik, bewarna putih dan bahan penyangga dari kaca. Sebaiknya adsorben juga tidak mengandung bahan pengikat. 1) Metode deteksi secara fisika. Dapat menggunakan sinar UV 254 nm dan 366 nm Dapat menggunakan lapis tipis yang mengandung indikator fluoresensi untuk mendeteksi senyawa yang memadamkan fluorosensi dalam sinar UV atau senyawa yang tidak memadamkan fluoresensi sinar UV gelombang pendek. Cara fisika lainnya adalah dengan menggunakan deteksi ionisasi nyala. Dalam hal ini pemisahan kromatograti dilakukan pada batang pengaduk yang dilapisi dengan adsorben. Setelah pengembangan, batang pengaduk dilewatkan dengan cepat melalui nyala detektor ionisasi nyala. 2) Metode deteksi secara kimia. Deteksi secara kimia ini tergantung dari reaksi senyawa yang bersangkutan. Reaksi dilakukan dengan meyemprot, mencelup atau melewatkan kromarogram melalui larutan pereaksi/larutan penampak bercak. Jika kromatogram dicelup pelarut penampak bercak yang digunakan, hendaknya larutan ini tidak melarutkan senyawa bersangkutan. Setalah penyemprotan kromatogram dikeringkan. Sering kali setelah direkasikan dengan pelarut penampak noda, perlu dilakukan pengeringan/pemanasan dalam oven selama beberapa saat. Pereaksi yang digunakan sebagai penampak noda ini dapat berupa pereaksi umum, selektif atau spesifik. Bila mengalisa suatu senyawa yang tidak diketahui maka digunakan pereaksi umum terlebih dahulu, kemudian untuk memastikan baru digunakan pereaksi selektif atau spesifik. Sebagai peraksi umum dapat digunakan: a) Asam sulfat pekat, akan memberikan bercak yang berwarna setelah atau tanpa pemasan. Pemanasan dapat merubah warna tertentu atau memperbesar intensitas warna. Hanya saja harus dilakukan dengan hati-hati, sebab jika tidak bercak akan mengarang hingga tidak 55
spesifik lagi karena pengarangan ini akan diberikan oleh semua senyawa organik. Data juga digunakan asam sulafat 50 % dalam air. Tetapi karena larutan air tidak berpenetrasi ke dalam adsorben dapat memberikan penyemprotan yang tidak merata. Akan memberikan hasil yang lebih baik jika digunakan pelarut organik. Sebagai pengganti asam sulfat dapat digunakan campuran amonium sulfat dan amonium hidroksida dengan perbandingan 1:1. b) Uap iodium, akan memberikan noda berwarna coklat, karena terbentuknya kompleks adisi lemah dengan beberapa senyawa. Caranya dapat dengan penyemprotan dengan larutan iodium 1% dalam metanol atau meletakkan kromatogram di atas wadah yang mengandung uap iodium. Perlu diketahui bahwa iodium yang sudah terikat akan terlepas kembali setelah beberapa waktu lamanya atau jika kromatogram dipanaskan dan warna coklat yang terjadi akan hilang. Tetapi ada beberapa senyawa yang bereaksi secara iriversibel dengan iodium yaitu beberapa steroid aromatik yang mengandung cincin A. c) Asam lainya, seperti asam perklorat 2%, asam ortofosfat 50% yang akan memberikan noda yang berfluorosensi. Asam fosfomolibdat 10% memberikan noda yang berwarna. Asam-asam ini digunakan sebagai larutan dalam metanol. d) Campuran asam sulfat dengan oksidator kuat seperti serisulfat, kalium permanganat, kalium bikroomat dan asam nitrat memberikan noda yang mengarang setelah pemanasan. e) Halida logam seperti antimon triklorida, antimon pentaklorida, seng klorida dan besi(III)klorida dalam pelarut organik memberikan noda berfluorosensi dengan senyawa. Sebagai pereaksi selektif dapat digunakan : a) Ninhidrin untuk gugus amin primer. b) Klorinasi, kalium ionida dan amilum untuk gugus amina sekunder.
Kromatografi Lapis Tipis
c) Pereaksi Dragendorff atau iodoplatinat untuk gugus amin tersier dan amonium kuarterner. d) Indikator asam-basa, misalnya biru bromfenol untuk gugus asam atau basa. e) Para-dimetil-amonium-benzaldehida untuk gugus amina aromatik atau cincin indol. f) Assay sulfanilat yang terdisosiasi untuk gugus fenol. g) 2,4-dinitrofenilhidrazin untuk senyawa oso. 3) Metode deteksi secara enzimatik dan biologik. Metode enzim digunakan untuk mendeteksi enzim atau mendeteksi substrat, misalnya untuk amilase. Dalam hal ini lapis tipis disemprot dengan larutan amilum, dinkubasi untuk beberapa saat lamanya, kemudian disemprot dengan larutan iodium. Amilase akan terlilhat sebagai bercak tak berwarna dengan latar belakang biru. 7.6 Faktor-faktor yang perlu diperhatikan pada KLT 1) KLT seperti metode kromatografi lainnya adalah metode pembandingan. Untuk identifikasi suatu senyawa haruslah digunakan senyawa pembanding dan tidak dapat digunakan harga Rf yang ada dalam pustaka. 2) Jika suatu sampel yang tidak diketahui memberikan satu noda setelah pengembangan dengan sistem pelarut tertentu, belum berarti bahwa sampel hanya mengandung satu senyawa. Untuk memastikan harus dilakukan pengembangan dengan sistem pelarut yang lainnya atau digunakan metode pengembang lainnya. 3) Jika suatu senyawa yang tidak diketahui menunjukkan harga Rf yang sama dengan senyawa pembanding, belum berati bahwa kedua zat tersebut adalah identik. Untuk memastikan maka harus dikembangkan dengan sistem pengembangan yang lain. Kepustakaan 1. Chamberlain, J., 1985, Analysis of Drugs in Biological Fluid, CRC Press Inc. Boca Raton. 2. Ho.K.I., Loh,H.H.. Leong Way,E.. Mini Thinlayer Chromatography in The Detection of Narcotics in Urine from Subjects on A 56
3. 4. 5.
6.
7.
Methadone Maintenance Program., J. Chrorrtatogr., 65., 1972, hal. 577-579. Johnsan. E.L., Stevenson,R., 1991, Dasar Kromatografi Cair, Penerbit ITB, Bandung. Kovar. A, 1987, Identifikasi Obat,Penerbit ITB, Bandung. Loh, H.H., et al., Mini Thin-layer Chromatography III: A Rapid and Sensitive Methode for The Estimation of Amphetamine and Methamphetamine, J. Chromatogr., 65 1972, 189-293. Moffat, A.C., et al. (Ed), 1986,Clark's Isolation and Identification of Drugs in Pharmaceuticals, Body Fluids, and Post mortem Material, Second ed., The Pharmaceutical Press, London. Roberson, J.C., 1991, The Use of Thin-layer Chromatography in the Analysis of Drugs of Abuse, Gough, T, The Analysis of Drugs
Kromatografi Lapis Tipis
of Abuse, 3-22, Jhon Wiley& Sons, Chichester. 8. Skoog; D.A., Leary, J.J., 1992, Princiles of lnstrumental Analysis, 4th Ed., Harcourt Brace Publisher, New York. 9. Sriewoelan, S. 1988, Analisis Obat Dalam Cairan Biologik, ITB, Bandung 10.Unated Nation, 1995, Recommended Methods for The Detection and Assay of Heroin, Cannabinoids, Cocaine, Amphetamine Methamphetamine and RingSubstituted Amphetamine Derivaties in Biological Specimens Manual for Use by National Laboratories, United Nations International Drug Control Programme, New York. 11.Willard. H.H., et all 1989, Instrumental Methods of Analysis, Wadsbuorth Publising Company, California.
57
BAB VII I PENGGUNAAN KROMATOGRAFI GAS DALAM ANALISIS TOKSIKOLOGI Jika dalam suatu sistem kromatografi sebagai fase gerak digunakan gas, maka tekniknya disebut kromatografi gas. Ada dua jenis kromatografi gas yaitu kromatografi gascair jika fase diamnya berupa cairan dan kromatografi gas-padat jika fase diamnya berupa padatan. Kromatografi gas-cair merupakan kromatografi partisi, sedangkan gas padat merupakan kromatografi adsorpsi. Proses pemisahan pada kromatografi gas didasarkan atas prinsip yang sama seperti pemisahan kormtografi jenis lainnya. Kromatografi sering digunakan untuk analisis obat, baik untuk analisis toksikologi maupun analisis senyawa obat itu sendiri. Keunggulan kromatografi gas adalah dapat memisahkan senyawa dan secara langsung dapat melakukan analisis kualitatif dan kuantitatif memiliki reprodusibilitas yang tinggi pada penggunaan rutin. Seperti metode analisis lainnya kromatografi gas juga memiliki keterbatasan. Bentuk obat yang disalahgunakan adalah komplek tidak homogen, dengan variasi yang luas pada volatilitas, polaritas. dan reaktivitasnya. Sehingga diperlukan pertimbangan yang mendasar jika hanya menggunakan kromatografi gas sebagai salah satu alat metode analisis. 8.1. Parameter Retensi Waktu retensi tR adalah waktu yang dibutuhkan untuk mengelusi maksimum zone dihitung dari waktu menyuntikan sampel. Laju aliran Fa adalah laju aliran fase gerak (dalam ml / menit), diukur pada outlet kolom pada suhu kamar. Laju aliran dalam kolom Fc , akan berbeda dengan Fa jika suhu kolom Tc, berbeda dengan suhu lingkungan Ta. H ubungan antara besaran-besaran ini adalah:
T F c = F a C T a
(8.1)
dimana suhunya adalah suhu absolut. Volume retensi eksperimantal VR adalah:
Penggunaan GC Dalam Analisis Toksikologi
T V R = Fa C Ta
(8.2)
Dengan cara yang sama volume fase gerak kolom VM diberikan oleh persamaan: (8.3) VM = Fc t M dimana tM adalah waktu retensi suatu senyawa yang tidak ditambat oleh kolom. VM seringkali disebut volume mati dan merupakan volume minimum gas pembawa yang harus dipindahkan sebelum suatu puncak dielusi. Di dalam kolom dapat terjadi penurunan tekanan dengan tiba-tiba yang akan menyebabkan variasi laju aliran gas sepanjang kolom. Oleh karena itu volume retensi harus dikoreksi terhadap efek ini dengan faktor koreksi penurunan tekanan tiba-tiba j:
j = 2 3
( ) ( ) Pi
Pi
2
Po
3
Po
− 1 − 1
(8.4)
dimana Pi dan Po adalah tekanan inlet dan outlet. Dalam hal ini, volume retensi yang dikoreksi V°R adalah :
V Ro = jV R
(8.5)
VRo ini banyak digunakan untuk mengukur
retensi senyawa dan karena mempunyai hubungan dengan koefisien partisi senyawa dapat digunakan untuk identifikasi senyawa. Selain itu dikenal juga volume retensi yang disesuaikan V R' :
V R' = V R − VM = t R FC − t ud FC
(8.6)
dimana tud adalah waktu retensi udara. Dalam kromatografi gas, fase gerak dapat ditekan. Karena gas bergerak lebih lambat dekat inlet dari pada di outlet kolom, maka harus dilakukan koreksi gradien tekanan atau koreksi dengan faktor kompresibilitas j terhadap volume retensi yang disesuaikan memberikan volume retensi bersih (netto ) VN
V N = jV R'
(8.7)
8.2. Peralatan 58
Skema alat kromatografi gas terlihat pada gambar (8.1). Sampel disuntikkan ke dalam aliran gas pada pintu sampel. Setelah dari kolom aliran efluen melewati detektor yang akan memberikan sinyal listrik yang proposional pada beda antara kandungan eluat dan efluen. Pintu sampel, kolom dan detektor berada dalam oven yang suhunya dikontrol. Gas pembawa biasanya adalah nitrogen atau helium. Kolom terbuat dari gelas/kaca atau
logam berdiameter ⅛ atau 1/4 inci dengan panjangnya berkisar 30 meter. Fase diam harus tidak mudah mengurai pada suhu yang digunakan untuk pemisahan dan harus mempunyai selektivitas yang mencukupi untuk campuran yang hendak dipisahkan. Selektivitas dapat pemisahan dapat diprediksi dari perbedaan harga koefisien partisi komponenkomponen yang hendak dipisahkan.
Gambar 7.1. Skema alat kromatografi gas. Sampel biasanya disuntikkan sebagai larutan sebanyak 1 - 50 µL ke dalam aliran gas. Ukuran sampel sebaiknya sekecil mungkin dan disuntikkan sebagai zone yang sempit untuk mengurangi lebar puncak yang terelusi. Pintu sampel dipanaskan agar sampel yang disuntikkan segera menguap dan dibawa oleh gas pembawa ke dalam kolom. Terdapat beberapa jenis detektor yang digunakan pada kromatografi gas: i) Detektor konduktivitas termal (thermal condacctnIty detector, TCD) yang didasarkan atas prinsip bahwa panas akan hilang dari kawat panas yang diletakkan di dalam gas dengan laju yang dipengaruhi oleh sifat dari gas. Dengan mengukur tahanan listrik kawat, konduktivitas termal gas dapat diukur. ii) Detektor ionisasi nyala (flame ionisation detector, FID). Dalam hal ini efluen dialirkan ke nyala hidrogen. Senyawa dalam efluen akan terbakar dalam nyala dan menghasilkan ion. Nyala ditempatkan diantara dua elektroda yang diberi potensial. Arus yang dibawa di antara elektroda ini oleh nyala, adalah proporsional terhadap konsentrasi Penggunaan GC Dalam Analisis Toksikologi
senyawa di dalam efluen, sinyal listrik yang terjadi diamplifikasi dan direkam. iii) Detektor penangkap elektron (electron capture detector. ECD), didasarkan juga pada proses ionisasi gas, tetapi dalam hal ini gas pembawa yang terionisasi, bukan senyawanya. Jika suatu molekul senyawa mengandung atom elektronegatif kuat masuk kearah efluat, elektron akan ditangkap oleh senyawa yang akan mengakibatkan berkurangnya arus latar belakang. Perubahan dalam arus ini yang memberikan sinyal pada kromatogram. Detektor ini sangat resposif terhadap molekul yang mengandung halogen dan senyawa elektronegatif lainnya, oleh karena itu banyak digunakan dalam analisis pestisida, iv) Nitrogen fosfor detektor (NPD) Dari keempat detektor ini detektor konduktivitas termal adalah universal dan memberikan respon terhadap semua senyawa; detekrtor ionisasi nyala memberikan respon terhadap semua senyawa organik, sedangkan detektor penangkap elektron hanya memberikan respon terhadap molekul atau atom elektronegatif. Detektor konduktivitas 59
termal memberikan respon dalam jumlah mikrogram, detektor ionisasi nyala terhadap jumlah nanogram dan detektor penangkap elektron terhadap jumlah pikogram. Fase diam, terdapat banyak pilihan fase diam, pada suatu katalog 1986 terdapat 440 pilihan. Di dalam literatur menunjukkan bahwa SE 30/OV-1 dan OV-17 adalah fase diam yang sangat luas digunakan untuk analisis obat. Pada fase polar beberapa obat tidak dapat dipisahkan menggunakan kolom SE 30. Frekuensi distribusi obat pada fase diam SE-30 dan OV-17 hampir mendekati rectangular, dimana ini berarti memiliki daya diskriminasi yang optimum. Sehingga fase diam ini sangat luas digunakan dan telah terkumpul data kepustakaan waktu retensi obat-obatan. Data ini sangat penting untuk uji skrining. 8.3. Analisis Kualitatif Terdapat dua pendekatan untuk melakukan analisis kualitatif: i) Pada khasus dimana terdapat indikasi kuat untuk mengidentifikasi senyawa yang diduga, kromatografi gas digunakan sebagai tahap untuk pembuktian senyawa kimia tersebut. ii) Indikasi suatu senyawa tidak diketahui, kromatografi gas sebagai metode untuk mereduksi sejumlah jumlah kemungkinan dengan mengkunjugasikan dengan spektrofotometer atau teknik lainnya. 8.3.1. Pembandingan waktu tambat. Analisa dari suatu senyawa dapat dilakukan dengan membandingkan waktu tambat senyawa yang diduga dengan baku pembanding. Untuk menghindari pergeseran waktu tambat akibat pengaruh konsentrasi (khususnya pada kolom polimer yang poros akibat pengepakan yang tidak sempurna) dapat diatasi dengan menggunakan konsentrasi yang sama. Variasi waktu tambat antara senyawa dan baku pembanding disebabkan oleh variasi dari radas-radas pada alat kromatograti gas, pengaruh waktu, pengaruh cara penyuntikan dan juga faktor keterulangan antara operator yang berbeda. Contoh reprodusibilitas waktu tambat untuk menggunakan penyuntikan otomatis sebaiknya lebih kecil dari 0,03 %. Penggunaan GC Dalam Analisis Toksikologi
8.3.2.Waktu tambat relatif Dari beberapa khasus telaah senyawa yang belum diketahui dengan menggunakan kramatografi gas dapat diperkecil dugaannya dengan membandingkan waktu tambatnya terhadap sejumlah senyawa pembanding. Biasanya data waktu tambat pembanding bukan merupakan data absolut, tetapi menunjukan variasi yang besar yang disebabkan oleh jenis gas dan kecepatan laju elusi, temperatur dan konsentrasi. Untuk mengurangi variasi ini data dikelompokan ke dalam sistem / variabel yang hampir berdekatan. Langkah pertama, waktu tambat dinyatakan sebagai hasil bagi / nisbah dari waktu tambat senyawa pembanding (waktu tambat relatif = RRf) pada kondisi yang sama. Pemilihan senyawa pembanding sebaiknya dipilih senyawa yang telah sering digunakan untuk analisis pada laboratorium tersebut dan memberikan kinerja kromatografi yang baik. Kelemahan metode ini adalah setiap lababoratorium menggunakan senyawa pembanding yang berbeda, sesuai dengan analit yang ditetapkan, kadang juga lababoratorium yang sama menggunakan pembanding yang berbeda untuk senyawa yang berbeda. 8.3.3. Indek Waktu Tambat Metode berikutnya adalah metode Kovats atau indeks waktu tambat yang menggunakan nalkana sebagai standard. Pada kondisi isotermal, logaritmik waktu tambat dari alkana adalah sebanding dengan jumlah atom C-nya. Keuntungan dari metode ini adalah relativ tidak bergantung pada laju aliran gas, persen fase diam dan panjang kolom. 8.3.4. Indek respon Faktor tambahan yang digunakan untuk menentuan identifikasi dari suatu senyawa adalah dengan membandingkan respon relatif senyawa tersebut pada dua detektor yang berbeda. Untuk mendapatkan reabilitas yang tinggi perlu digunakan internal standard. Beker menggunakan kolom OV-17 yang diujungnya terdapat pemisah dan detektor FID/NPD kofein sebagai internal standard. Data dinyatakan sebagai: 57
Indeks respon =
U NPD S NPD
U FID
(8.8)
S FID
dimana U respon detektor terhadap analit dan S adalah serpon terhadap standard. 8.4. Analisis Kuantitatif Kromatografi gas terutama digunakan untuk analisis kualititatif campuran senyawa, tetapi kromatogram yang dihasilkan juga mengandung informasi yang memungkinkan untuk melakukan analisis kuntitatif. Hal ini disebabkan kenyataan bahwa luas area dibawah kurva pada kromatogram adalah proporsional dengan jumlah senyawa yang terkandung oleh zone yang terelusi. Analisis kuantitatif meliputi pengukuran area/luas dan menentukan proporsionalitasnya. Apabila radas kromatogram tidak dilengkapi dengan integrator, secara sederhana pengukuran puncak dapat dilakukan dengan mengasumsikan kromatogram sebagai segitiga, dengan menerapkan prinsip pengukuran luas segitiga, maka luas kromatogram dapat dihitung. Belakangan ini hampir semua peralatan analisis dikontrol oleh komputer, sehingga sistem kromatografi otomatis luas ini dapat ditentukan dengan komputer. Kuantitas yang didapat selanjutnya harus dikonversikan ke dalam jumlah atau persentase komponen yang terdapat dalam sampel. Ada tiga cara yang berbeda untuk melakukan hal ini: i) Kalibrasi dengan standard eksternal, cara ini sebenarnya adalah analog dengan cara menggunakan kurva kerja/kurva standar dalam spektroskopi. Satu seri sampel yang mengandung jumlah senyawa yang hedak dianalisis dalam jumlah yang berbeda dikromatografi pada kondisi yang sama. Kurva dari tinggi puncak / luas puncak versus ukuran konsentrasi sampel akan memberikan kurva kalibrasi linier. Suatu sampel yang tidak diketahui dapat dianalisis dengan mengkromatografinya pada kondisi yang sama, dan membaca jumlah komponen konsenirasi yang bersangkutan pada kurva kalibrasi. Kelemahan metode ini adalah bahwa Penggunaan GC Dalam Analisis Toksikologi
diperlukan kondisi yang sama untuk standar dan sampel ii) Kalibrasi dengan sandard internal, kelemahan pada metode di atas dapat diatasi dengan standard internal, yang merupakan suatu senyawa yang ditambahkan pada sampel. Standard internal ini harus terpisah sempurna dari semua komponen yang terdapat dalam sampel, harus mempunyai waktu tambat mendekati waktu tambat senyawa yang hendak ditentukan. Cara ini dilakukan dengan menyiapkan kurva standard melalui kromatografi ratio bobot tertentu dari standard dan komponen sampel. Kurva dibuat dari ratio As/Ais versus Ws/Wis, dimana A adalah luas puncak dan W adalah bobot, s = standard, dan is = standard internal. Dengan menambahkan jumlah standard internal yang sama ke dalam suatu rentang konsentrasi standard, kurva linier akan diperoleh dari As/Ais versus Ws/Wis karena Ais dan Wis adalah konstan pada rentang konsentrasi standard. Sampel yang tidak diketahui cheat ditentukan dengan menambahkan suatu bobot internal standard yang sama seperti pada pembuatan kurva kalibrasi kepada sampel, campuran dikromatografi ratio luas puncak diukur, dan ratio bobot dibaca pada kurva. Karena semua kuantitas merupakan ratio, metode standard internal ini akan mengkonpensasi perubahan dalam kondisi kromatografi selama perubahan ini akan mempengaruhi baik standarard ataupun komponen sampel dengan cara yang sama. iii) Normalisasi luas puncak, misalkan suatu sampel mengandung komponen x, y, dan z dan bahwa respons kromatograti gas adalah sama untuk semua komponen dengan basis molar. Maka persentase komponen x dalam sampel adalah sama dengan persentase luas total pada kromatogram untuk x: (8.9) 100 (luas x ) %X = (luas x + luas y + luas z )
Jika faktor respons adalah berbeda untuk berbagai komponen, harus dilakukan koreksi. 8.5. Derivatisasi Pada Kromatograti Gas Cair
58
Banyak senyawa dapat ditentukan dengan kromatografi gas, senyawa yang mudah menguap dapat ditentukan dengan mudah. Masalah akan muncul apabila menganalisa senyawa dengan titik didih yang tinggi atau senyawa tidak stabil pada suhu analisa. Sehingga untuk dapat menganalisa senyawa seperti itu, dibuat derivat yang mudah menguap. Derivat ini biasanya akan mempertinggi stabilitas dalam kromatografi berlangsung, mempertinggi volatilitas untuk analisis, memperkecil adsorpsi, identifikasi yang lebih positif, memperbaiki pemisahan dan spesifisitas terhadap gangguan atau "background", dari mempertinggi sensitfitas respons detektor. Seringkali senyawa yang labil jika dikromatografi akan mengalami dekomposisi termal dan/ atau penguraian katalitik seperti misalnya steroida. Hal ini dapat menyebabkan puncak yang terdistorsi, puncak yang sangat lebar dan respons non-linier. Mengurangi suhu kolom dan penggunaan sistem all-glass dapat mengurangi sebagian masalah ini, tetapi seringkali tidak berhasil. Dengan membuat derivat/turunan yang sesuai, stabilitas senyawa mungkin dapat dipertingi dan seringkali derivatisasi dapat mempertinggi volatilitas hingga analisis dapat dilakukan pada suhu yang lebih rendah. Derivatisasi ini juga dapat diterapkan untuk senyawa yang karena bobot molekulnya dan tekanan uapnya tidak dapat dikromatografi pada kondisi yang umum. Melalui pembentukan derivat/turunan pada mana gugus interaksi polarnya dilindungi (masking) oleh bagian non-polar dapat mengatasi interaksi adsorpsi. Sebagai contoh morfin dan narkotik kerabatnya yang penentuan kadarnya mengalami kesukaran terlebih-lebih dalam jumlah sub-mikrogram. Hal ini disebabkan oleh puncak yang berekor dan respon tergantung pada jenis kolornnya selain pada jumlah sampel yang disutikan. Manisfestasi ini dapat diatasi dengan membuat
Penggunaan GC Dalam Analisis Toksikologi
derivat/turunan eter trimetilsilil yang akan memberikan puncak yang cukup simetris dan respons yang tidak saja linier tapi lebih baik dibandingkan dengan basa bebasnya. Derivatisasi ini juga berguna jika menghadapi kerusakan yang terdiri dari gangguan blangko biologik dan latar belakang. Kepustakaan 1. Huizer, H., (1991), The use of gas chhromatography for the detection and quantitation of abused drugs, Gogh, T., A., The Analysis of Drugs Abuse, John Wiley & Sons, Chichester, 23- 92. 2. Sriewoelan, S. (1988), Analisis Obat Dalam Cairan Biologik, ITB, Bandung. 3. Moffat, A.C., et.al,, (Ed), (1986), Clark's Isolation and Identification of Drugs in Pharmaceuticals, Body Fluids, and PostMoterm Material, Second ed., The Pharmaceutical Press, London. 4. Johnsan, E.L., Stevenson,R., (1991), Dasar Kromatografi Cair, Penerbit ITB, Bandung. 5. Skoog, D.A., Leary, J.J., (1992), Principles of Instruniental Analysis, 4th Ed., Harcourt Brace Publisher., New York. 6. Willard, HH.; et al., (1989), Instrumental Methods of Analysis, Wadsbuorth Publising Company. California. 7. Chamberlain, J., (1985), Analysis of Drugs in Biological Fluid, CRC Press Inc, Boca Raton. 8. United Nations, (1995) Recommended methods for the detection and assay of heroin, cannabinoids, cocaine, amphetamine and ring-substituted amphetamine derivates in biological specimens manual for use by national laboratories, United Nation International Drug Control Programme, New York
59
BAB IX PENGGUNAAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI ”High Performance Liquid Chromatography (HPLC)” DALAM ANALISIS TOKSIKOLOGI
Metode analisis obat pada penyalahgunaan obat-obatan seharusnya sederhana dan spesifik untuk obat-obatan tertentu atau untuk kelompok obat tertentu, dan seharusnya memberikan ketepatan dan ketelitian analisis yang tinggi. HPLC adalah salah teknik analisis yang tepat untuk kriteria tersebut di atas. Khususnya dalam menganalisis senyawa yang termolabil seperti analog gugus asam karboksilat dari kanabinoid yang sangat susah dianalisis menggunakan kromatografi gas. HPLC juga lebih fleksible dibandingkan kromatografi gas, karena dapat memilih berbagai fase gerak atau fase diam yang akan digunakan untuk keperluan analisis.
pengoperasiannya pada temperatur rendah sehingga dapat meminimalkan terjadinya dekomposisi termal; dapat digunakan untuk menganalisa senyawa non-volatile atau senyawa polar; kemampuannya dalam memisahkan senyawa dengan perbedaan rentang polaritas yang luas; HPLC fase batik menggunakan fase gerak (pelarut) larut air. Potensialitas HPLC sangat berguna untuk pemisahan, identifikasi, dan penetapan kadar senyawa obat dan metabolitnya, walaupun waktu dan uhasa yang keras akan menentukan apakah metode dapat diterapkan dosentilitas, kesederhanaan, dan sarana yang diinginkan.
HPLC memiliki beberapa keunggulan seperti:
Gambar 9.1: Skema peralatan HPLC Peralatan HPLC terdiri dari empat bagian utama: 1) pompa untuk menyuplai fase gerak. 2) sistem penyuntikan sampel, 3) kolom, dan 4) detektor diperdadangan dengan nama dagang SepPak 9.1. Pemilihan Sistem HPLC atau Bond-Elut atau merek lainnya. Fase padat atau kolom tersebut dapat berupa silika terikat 9.1.1. Pra-kolom dan ekstraksi fase padat dengan derivat etil, oktil; pertukaran ion; nonPada analisis toksikologi forensik sebelum ionik polisterin-divinil benzen-co polimer XADsampel diinjeksikan ke dalam kolom terlebih 2. Penggunaan pra kolom dan ekstraksi fase dahulu dapat dilewatkan pada pra-kolom yang padat ini memungkinkan menginjeksikan memungkinkan terjadi ekstraksi obat pada fase materi yang relatif murni ke dalam kolom HPLC. padat dari materi biologi atau dari ekstrak Sehingga akan dapat mem-perpanjang umur kasar, seperti cannabis, opium, atau kolom. Untuk memperpanjang umur kolom amfetamin. Pada tahap ini obat pada HPLC biasanya dilengkapi Guard colum dipekatkan/terkonsentrasi pada fase padat dan yang berfungsi menahan partikel - partikel kecil kemudian dielusi dengan pelarut yang tepat, yang terbawa dalam sampel, sehingga tidak sehingga diperoleh fraksi analit. akan menyumbat kolom. Pra-kolom dikemas ke dalam kolom yang berukuran kecil yang banyak tersedia Penggunaan HPLC Dalam Analisis Toksikologi
9.1.2. Sistem injeksi 60
Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agar sedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Analit yang diinjeksikan harus tidak, mengandung partikel yang tersuspensi sehingga diperlukan mikrofilter sebelum diinjeksikan ke dalam kolom. Metode yang paling luas digunakan untuk menginjeksikan sampel adalah sistem katup kitar "sampling pool" alat ini menyatu dengan HPLC, dan dapat mamasukkan sampel antara 5-500 µL. Mikro sampling injkesi dapat menginjeksikan volum 0,5 - 5 µL. Perlu juga diperhatikan jika menginjeksikan pelarut dapar (dapar fosfat) sebab dapar tersebut dapat mengkristal jika tercampur dengan pelarut organik (fase gerak). Sistem injeksi automatis banyak dijumpai pada sistem HPLC, dengan kerja injeksi pneumatik, dibawah kontrol komputer. Sistem ini biasa digunakan pada analisis rutin dengan jumlah sampel yang banyak. 9.1.3. Sistem Pompa Terdapat dua jenis pompa yang digunakan untuk memompakan fase gerak melalui kolom yaitu tekanan tetap dan pendesakan tekanan. Pompa pendesakan tetap dapat dibagi menjadi pompa torak dan pompa semprit. Pompa torak mengasilkan aliran berdenyut, jadi memerlukan peredam denyut atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis alas detektor yang, stabil jika detektor peka terhadap aliran. Kelebihan utamanya ialah tandonnya yang tidak terbatas. Pompa semprit menghasilkan aliran yang tak berdenyut, tetapi tandonya terbatas. 9.1.4. Kolom Kolom merupakan jantung kromatografi keberhasilan atau kegagalan analitis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi kerja. Kolom dapat dikelompokkan menjadi dua kelompok : i) Kolom analitik: garis tengah dalam 2 - 6 mm. Panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50 - 100 cm, untuk kemasan mikro pelikel 10 -30 cm. Untuk analisis obat volume sampel yang diinjeksikan antara 20 50 µL, mengandung 20-50 µg obat. Untuk mengelusi analit diperlukan tekanan 1000 2500 psi dan volume elusi 50 ml. Penggunaan HPLC Dalam Analisis Toksikologi
ii) Kolom preparatif ; umumnya bergaris tengah 6 mm atau Iebih besar dan panjangnya 25 - 100 cm. Terdapat berbagai variasi kolom yang digunakan untuk analisis obat, seperti fase normal, silika, kromatografi fase balik; oktadesil yang terikat dengan silika atau fase terikat rantai hidrokarbon yang lainnya Untuk analisis obat secara rutin pada periode waktu yang lama dan data waktu tambat digunakan sebagai uji skrining dan konfirmasi. Sangat direkomendasikan untuk membeli kolom dengan nomer batch yang sama, sebab nomer batch yang berbeda memberikan data indeks retensi yang berbeda. 9.1.5. Fase Gerak Pada kromatografi cair susunan pelarut atau fase gerak merupakan salah satu variabel (peubah) yang mempengaruhi pemisahan. Berbagai macam pelarut dipakai dalam semua ragam HPLC, tetapi ada beberapa sifat yang diinginkan berlaku umum. Fase gerak harus: murni, tanpa cemaran; tidak bereaksi dengan kemasan; sesuai dengan detektor; dapat melarutkan sampel/analit; mempunyai tokskositas rendah; memungkinkan memperoleh kembali analit/sampel dengan mudah jika diperlukan; harganya wajar. Dari semua persyaratan empat yang, pertama yang paling penting. Elusi isokratik adalah metode pengelusi dimana komposisi fase gerak mulai sampel di injeksikan ke dalam kolom sampai semua sampel terelusi adalah tetap. Elusi isokratik untuk pemisahan sampel dengan rentang harga k' (koefisien partisi) yang luar biasanya memberikan resolusi yang tidak baik, sangat susah untuk mendeteksi akhir dari suatu puncak (puncak yang dihasilkan berekor), dan memerlukan waktu analisis yang sangat lama. Untuk memisahkan sampel dengan rentang harga k' yang luas biasanya digunakan elusi terprogram. Elusi terprogram, analog dengan pemrograman suhu pada GC. Elusi terprogram juga disebut elusi gradien, yang melihatkan perubahan komposisi fase gerak secara bertahap atau secara continu selama proses elusi. Biasanya semua sampel pada awal/ saat diinjeksikan tertahan pada kepala kolom. Setelah elusi gradien dimulai kekuatan pengelusi akan meningkat. Sampel dengan 61
harga k' yang, kecil akan terelusi terlebih dahulu, diikuti oleh senyawa lain sesuai dengan peningkatan harga k' dan kekuatan pengelusi. Persamaan dasar untuk elusi gradien dapat menggunakan persamaan k' diganti dengan k rata-rata selama elusi gradien berlangsung. Persamaan tersebut adalah : Waktu tambat: t g = t M k log(2,3 k o / k ) (9.1)
N (α − 1) k k + 1 (9.2) 4
Resulusi: Rs =
Pelebaran pita: σ g =
VM (1 + k ) N 2
(9.3)
dimana ko adalah harga k' pada saat elusi gradien dimulai, t waktu tambat pada elusi gradien, dan σg lebar pita gradien (satu kali standard deviasi). Harga k pada saat elusi dari solut seharusnya berada antara 1 < k < 10, seperti pada elusi isokratik. Pada saat pita meninggalkan kolom , k masing-masing sangat kecil ( ∞ 1). Harga k, yang kecil pada waktu dari akan memberikan pita yang sempit. Lebar pita sempit berarti meningkatkan sensitititas (detektor). Interaksi antara solute dengan gugus siloksil bebas dari silika dan isoterm adsorpsi nonlinier adalah alasan utama yang menyebabkan noda berekor pada kromatografi fase normal. Masalah ini dapat diatasi jika molekul solut dapat berinteraksi dengan pelarut lebih polar. Dengan secara konstan merubah komposisi fase gerak pada periode analisis, sehingga daya elusi dapat ditingkatkan. Dengan metode elusi gradien dimulai dengan pelarut non-polar hingga pelarut polar. Laju pencampuran pelarut dapat secara linier atau eksponensial. Pada HPLC sudah dilengkapi radar (device) untuk mengatur pencampuran pelarut ini. Metode elusi gradien ini tidak hanya dapat mengatasi puncak berekor tetapi juga akan memberikan resolusi yang lebih baik. Yang lebih penting dapat menurunkan waktu analisis campuran komplek, yang memiliki harga k' berbeda. Sistem ini memberikan analisis yang sangat selektif karena memberikan puncak yang lebih tajam. HPLC modern menyediakan radas elusi gradien sampai menggunakan empat campuran pelarut yang berbeda. Penggunaan HPLC Dalam Analisis Toksikologi
Pemilihan sistem pengelusi untuk kromatografi partisi fase normal, daya elusi pelarut mengikuti derajat eluotropik. Pada rangkaian pelarut ini meningkat daya eluotropiknya: heksana < toluen < dietileter < kloroform < etilasetat < etanol < metanol < pirirdin < asam asetat. Pelarut yang umum digunakan pada HPLC fase balik adalah air (atau larutan dapar), asetonitril metanol, dan tetrahidrofuran. Pelarut ini paling sering digunakan dalam analisis obat. Kromatografi pasangan ion telah digunakan untuk analisis obat khususnya pada sistem kromatografi fase balik. Prosedur ini tergatung pada kemampuan obat membentuk ion pada larutan dapar yang sesuai. Ion lawan yang sesuai larut dalam pengelusi, biasanya konsentrasi ion lawan dalam 5 mM. Pasangan ion obat dan ion lawan dielusi sebagai satu kesatuan pada sistem kromatograti fase balik, dan akan tertahan lebih lama pada fase diam yang lifofilik. Beberapa contoh ion lawan adalah garam-garam asam heptan sulfonat, dan nitrium lauril sulfat, tetraetil atau tetreapenilamonium halida untuk untuk obatobatan yang mengandung gugus karbonil aatau fenate 9.1.6. Detektor Detektor yang sering digunakan untuk analisis obat adalah UV detektor. Detektor ini dikelompokkan menjadi tiga kelompok: detektor panjang gelombang tatap, detektor panjang gelombang variabel atau panjang gelombang tersebar, detektor diode-array. Detektor panjang gelombang tetap menggunakan panjang gelombang tertentu pada satu panjang gelombang, biasanya dihasilkkan oleh lampu merkuri (254 nm), kadang-kadang juga oleh Iampu cadmium (225nm) dan zink (212 nm). Panjang gelombang yang diemisikan oleh lampu ini tidaklah monokromatis tetapi intensitas radiasi panjang gelombang yang lainnya sangat rendah. Untuk menghilangkan radiasi ini ditambahkan filter antara sumber radiasi dan sel detektor. Tidak semua obat mempunyai panjang gelombang maksimum pada 254 nm, sebagai konsekuensinya tidak semua senyawa obat dapat dideteksi menggunakan detektor ini. Masalahnya yang timbul juga tidak semua obat dapat dideteksi pada serapan maksimumnya. 62
Tabel 8.1. Sifat dari pelarut yang digunakan untuk kromatografi cair (1) Pelarut
UVa
RIb
BP (oC)c
ηd
ρe
εf
δg
kelompok
Isooktana 197 1.389 99 0.47 0.1 0.01 1.94 n-heksana 190 1.372 69 0.30 0.1 0.01 1.88 Sikloheksana 200 1.423 81 0.90 -0.2 0.04 2.02 Siklopentana 200 1.404 49 .42 -0.2 0.05 1.97 Karbon disulfide 380 1.624 46 0.34 0.3 0.15 2.64 Karbontetraklorida 265 1.457 77 0.90 1.6 0.18 2.24 Trietilamin 1.398 89 0.36 1.9 0.54 2.4 I Isopropil eter 220 1.36 68 038 2.4 0.28 3.9 I Dietil eter 218 1.350 35 0.24 2.8 0.38 4.3 I Benzen 280 1.498 80 0.6 2.7 0.32 2.3 VII Diklormetan 233 1.421 40 0.41 3.1 0.42 8.9 V 1-2 Dikloroetan 1.442 83 0.78 3.5 0.44 10.4 V ter- bulanol 1.385 82 3.60 4.1 0.70 12.5 II Butanol 210 1.397 118 2.60 3.9 0.70 17.5 II Propanol 240 1.385 97 1.90 4.0 0.82 20.3 III Tetrahidrofuran 212 1.405 66 0.46 4.0 0.57 7.6 III Etil asetat 256 1.370 77 0.43 4.4 0.58 6.0 Via Isopropanol 205 1.384 82 1.90 3.9 0.82 20.3 II Kloroform 245 1.443 61 0.53 4.1 0.40 4.8 VIII Etil metil keton 1.376 80 0.38 4.7 18.5 VIa 0.51 Aseton 330 1.356 56 0.30 5.1 0.56 VIa Etanol 210 1.359 78 1.08 4.3 0.85 24.6 II Asam Asetat 1.370 1118 1.10 6.0 6.2 IV Asetonitril 190 1.341 82 0.34 5.8 0.65 37.5 VIb Metanol 205 1.326 65 0.54 5.1 0.95 32.7 II Air 1.333 100 0.89 10.2 80.2 VIII a pelarut tidak dapat digunakan untuk deteksi pada panjang gelombang tersebut b indeks Keterangan: refraksi pada 25 oC; c Titik didih dalam oC; d Viskositas pada 25 oC, e Parameter polaritas pelarut; g konstanta dielektri pada 20oC; h kelompok selektivitas pelarut. susunan diode, masing celah diode merekam Untuk memecahkan masalah ini digunakan satu panjang gelombang. Sehingga masingdetektor panjang gelombang variabel atau masing celah tersebut dapat digunakan untuk diode array detektor. Sumber radiasi detektor mengukur serapan pada λmak analit yang panjang gelombang variabel menggunakan melewati sel detektor, atau semua diode lampu deuterium dan yang memberikan radiasi merekam radian power (intensitas) yang pada daerah UV. Antara sumber radiasi dan sel dielusi. Detektor ini dapat juga digunakan detektor ditempatkan monokromator, radiasi untuk menentukan kemurnian analit yang monokromatis yang melewati sel detektor akan dipisahkan dengan cara mengukur sepektrum ditangkap oleh photocell. Oleh photo sel dari waktu ke waktu selama puncak tersebut intensitas radiasi dirubah menjadi sinyal listrik dielusi. Apabila spektra puncak tersebut kemudian dimanipulasi sehingga dapat terbaca berubah selama pengukuran tersebut sebagai data adsorban atau transmitan. menunjukan puncak terelusi adalah tidak Untuk HPLC yang menggunakan penghenti tunggal. Kebanyakan diode array detektor aliran, serapan spektra senyawa yang dideteksi dilengkapi dengan pengukuran rasio absorban dapat diukur. Berbeda dengan diode array pada dua panjang gelombang yang berbeda, detektor tidak melewatkan radiasi seperti yang digunakan untuk penetapan monokrimatis ke dalam sel detektor. Radiasi barbiturat. polikromatis yang dilewatkan ke sel detektor Detektor fluoresensi. Walaupun sangat sedikit dilewatkan menuju monokromatis halokisi yang digunakan untuk analisis obat detektor mendispersikan radiasi polikromatis menuju fluoresensi memiliki keuntungan dalam Penggunaan HPLC Dalam Analisis Toksikologi
63
sensitivitas dibandingkan dengan detektor UV. kususnya dalam batas deteksinya. Tidak semua obat berfluoresensi, tetapi banyak dapat dibuat manjadi turunan berfluoresensi dengan pereaksi fluoresen yang sesuai, seperti asam amino dapat dibuat menjadi turunan berfluoresensi dengan menggunakan reagent o-ftalaldehid atau fluorescamin. Morfin dapat dibuat berfluoresensi dengan pereaksi ferisianida membentuk apomorfin dengan intensitas fluoresensi yang kuat. Detektor elektrokimia adalah representatif untuk monitoring penyalahgunaan obat. Detektor ini sangat sensitive dan menunjukan selektivitas yang tinggi. Hanya saja detektor ini hanya dapat digunakan untuk menetukan obat yang dapat dioksidasi atau direduksi. Respon dari detektor ini muncul dari aliran elekro yang dihasilkan oleh reaksi redok pada permukaan elektroda. Detektor indek refraksi, detektor ini mengukur perubahan indeks refraksi eluen yang disebabkan oleh adanya senyawa yang pada waktu keluar dari kolom. Detektor ini tidak dapat digunakan secara sefektif dengan elusi gradien karena adanya perubahan pada baseline (perubahan indeks refraksi pelarut jika gradien berubah) atau jika pelarut mempunyai indek refraksi mendekati indeks refraksi zat terlarut. Selain itu detektor ini sensitif terhadap perubahan suhu. Dengan diketemukan Fourier transform infrared (FTIR) spektrofotometer dimungkinkan digunakan sebagai detektor pada HPLC detektor ini akan sangat berguna untuk memonitoring penyalahgunaan obat-obatan karena dapat melakukan identifikasi absolut dari obat yang dianalisa. Spcetrum IR yang direkam digunakan sebagai dasar untuk uji konfirmasi. 9.2. Analisis Obat Tidak semua analisis obat dapat dilakukan dengan menggunakan HPLC, peryataan ini dikemukan oleh Gough dan Beker(2.3) yang melaporkan penggunaan kromatografi untuk mendeteksi penyalahgunaan obat-obatan sampai tahun 1983. Analisis obat-obatan pada penyalahgunaan obat harus mengikuti prototkol yang baku, dari penyumpulan sampel sampai pada penanganan Penggunaan HPLC Dalam Analisis Toksikologi
data analisis, sehingga data yang berhubungan dengan sampel obat harus dicatat. khususnya penampilan mikroskopi maupun makroskopiknya seperti, pembungkus sampel, dan penandaaan yang terdapat pada sampel/pembungkus. Semua historis data ini sebagai bukti di pengadilan. Penggunaan HPLC didalhului oleh uji skrining, menggunakan reaksi warna atau reaksi skrining lainnya. Analisis obat menggunakan HPLC biasanya didahului oleh praperlakuan, seperti ekstraksi analit dari sampel. Metode ekstraksi tergantung pada jenis sampel dan sifat fisikokimia dari analit. Setelah sampel diekstraksi dapat langsung diinjeksikan ke dalam kolom melalui mikrofilter (biasanya berdiameter 2µm) atau sebelum diinjeksikan ekstrak kering kemudian dilarutkan ke dalam fase gerak. Perlu diperhatikan sifat mikrofilter yang kadang terlarut dengang pelarut organilk tertentu. K e p u st a k a a n . 1 . Caddy, B., 1991, The use of high performance liquid chromatography for the detection and quanitation of abussed drugs, Goglt, T., A., The Analysis of Drugs of Abuse, John Wiley & Sons, Chichester, 1 2 1 - 174. 2. Sriewoelan, S. 1988, Analisis Obat Dalam Cairan Biologik, ITB, Bandung. 3. Moffat, A.C., et.all., (Ed), 1986,Clark's Isolation and Identification of Drugs in Pharmaceuticals, Body Fluids, and PostMortenz Material, Second ed., The Pharmaceutical Press,London. 4. Johnsan, E.L., Stevenson,R., 1991, Dasar Kromatografr Cair, Penerbit ITB, Bandung. 5. Skoog, D.A., Leary, J.J., 1992, Principles of Instrumental Analysis, 4"' Ed., Harcourt Brace Publisher, New York. 6. Willard, H.H., et all.. 1989, Instrumental Methods of Analysis, Wadsbuorth Publising Company, California. 7. Chamberlain, J., 1985, Analysis ofDrugs in Biological Fluid, CRC Press Inc, Boca Raton. 8. United Nations, (1995) Recommended methods for the detection and assay of heroin, cannabinoids, cocaine, 64
amphetamine and ring-substituted amphetamine derivates in biological specimens manual for use by national laboratories, United Nation International Drug Control Programme, New York 9. Lawry, W.T., Gsrriott, J,C., 1979, Forensic Toxicology Controlled Substances and Dangerous Drugs, Plenum Press, New York, 103-346. 10. Ferrara, S.D., e all, , 1992, Solid-Phase Extraction and HPLC-UV Confirmation of Drugs of Abuse in Urine J. An. Toxicology, 16, 217-222. 11. Ziegler, H.W., Beasly, T.H., Smit, D.W., 1975, Simultaneous Assay for Six Alkaloids in Opium, Using High-Perfomence Liquid
Penggunaan HPLC Dalam Analisis Toksikologi
Chromatograpy, J. ofAOAC, 58 (5), 888897. 12. Hyds, P.M., 1985, Evaluation of Drug Extraction Procedures from Urine, J. of Toxic olo gy , 9 (Nov/Des), 265-272. 13. Lurie Ira, 1977, Application of Reverse Phase lon-Pair Partition Chromatography to Drugs of Forensic Intere-t, JJ ofAOAC, 60 (5), 1035-1040 14. Chao, M.K.C., Albert,K.S., Fusari,S.A., 1977, Phenobarbital, in Florey,K. (Ed), Analytical Profiles ofDrug Substances, 7, Academic Prees, New York, 359-395. 15. Macdonald,A., Michatlis, A.F., Senkauski, 1977, Uiarcpam, in in FIor'cy,K. (V d), Analitical of Profiles Drugs Substances, 7 Academic Prees, New York, 79-101.
65
BAB X APLIKASI SPEKTROMETRI MASSA DALAM ANALISIS PENYALAHGUNAAN OBAT 10. 1. Pendahuluan Dalam bab ini akan dibahas identifikasi dan kuantisasi obat menggunakan spektrometri massa. Spektrometri massa merupakan teknik analisis yang sangat handal yang dapat memberikan bukti/data terdapatnya suatu obat yang diduga, MS utamanya telah digunakan untuk memastikan identitas suatu obat, yang telah di skrining atau diduga sementara menggunakan teknik lain (R-X warna, TLC, dll). MS menghasilkan partikel bermuatan yang terdiri dari susunan ion dan pecahan (fragmen) ion dari molekul asalnya dan urutan susunan ion ini sesuai dengan rasio massa/muatan ionnya. Spektrum massa dari asal senyawa adalah karakteristik oleh senyawa tersebut. Apabila spektrum massa dari suatu senyawa dilengkapi dengan data spektronik lainnya seperti IR, UV-Vis, NMR, dapat dianalisis struktur molekul senyawa tersebut. Keuntungan utama MS dibandingkan metode instrumental analitik lainnya adalah mempunyai sensitivitas dan spesivitas yang paling tinggi untuk mengidentifikasi atau mengkonfirmasikan suatu senyawa yang telah
diduga. Spesivitas yang sangat tinggi dihasilkan karakteristik pola pemecahan/fragmentasi, yang dapat memberikan informasi tentang berat molekul dan struktur molekul. Dengan berkembangnya teknologi sekarang banyak dijumpai MS yang digabungkan dengan instrumen lain seperti HPLC, GC, dan atau digabungkan dengan suatu analizer MS (tendem MS/ MS-MS). 10.2. Aliran Analit/Sampel dalam MS Fungsionalitas dari MS secara prinsip dapat dibagi menjadi 3 bagian fungsi utama: 1) menciptakan fragmen ion dalam bentuk gas dari sampel, 2) mengion/ion-ion tersebut sesuai dengan massanya (tepatnya rasio massa/muatan), 3) mengeluarkan massa relatif dari fragmen ion-ion dari setiap massa. Diagram balok komponen dari MS dapat dilihat pada gambar 10.1. Bagian-bagian yang terpenting adalah: 1. Sampel inlet sistem, 2. Sumber ion, 3. Percepatan ion atau analizer massa (ion), 4. Sistem pengumpul ion, 5. Sistem pengolah data, 6. Sistem vakum.
Sampel
Inlet sistem
Sumber ion
Sistem Vakum
Analizer Massa
Detektor
Sistem Pengolahan Data
Gambar 10.1. Diagram balok komponen dari MS Tujuan dari inlet sistem adalah memungkinkan untuk memasukkan sampel ke dalam sumber ion dengan kehilangan vakum yang sangat kecil. Pada MS ada 3 jenis inlet sistem: batch inlet, direct probe inlet, kromatografi inlet. MS yang digabungkan sistem kromatografi gas/HPLC memungkinkan melakukan pemisahan dan mengidentifikasi secara langsung senyawa Spektroskopi Massa
tersebut. Penggabungan kromatografi dengan MS memerlukan sistem inlet yang khusus. 10.3. Sistem Pengumpulan Data dan Penampilannya Sekarang ini spektrometer terhubung dengan berbagai bentuk sistem data sangat bergantung dari tujuan analisis. Sistem data yang modern akan mengontrol operasional MS, pengumpulan
66
data dan memproses data termasuk pencarian dalam data kepustakaan. Metode yang lama spektra direkam di atas kertas yang sensitif dengan UV dan massa ditentukan secara manual dari masing-masing puncak spektra. Cara ini akan sangat lama pengerjaannya, dan jumlah senyawa yang dapat dianalisis akan sangat terbatas. Sistem data tidak hanya dapat menangani operasi pengumpulan data spektra penetapan massa dari puncak tetapi juga dapat memanipulasi data sesuai dengan kebutuhan. Sistem data juga dapat secara simultan mengoperasikan data dari berbagai data Spektrofotometer (UV, IR, NMR). Sistem data dapat dibeli terpisah atau telah disatukan dengan spektrometer. Secara umum operasional data sistem adalah merekam massa dan intensitas ion pada saat spektrometer melakukan scaning. Perfluorokerosene adalah senyawa kimia yang biasa digunakan untuk mengkalibrasi skala massa dari MS. Pada analisis forensik toksikologi (senyawa obat) diperlukan MS beresolusi tinggi, sebab MS dengan resolusi rendah sering tidak berhasil dalam pencarian data dengan sistem data pustaka, karena memerlukan data massa yang akurat, dan daftar formula empiris sangat berhubungan dengan semua data ion yang terfragmentasi. Informasi spektra MS biasanya dipadukan dengan data spektra IR, NMR untuk dapat digunakan dalam identifikasi obat yang tidak diketahui/obat baru. Total ion current atau jumlah total muatan ion adalah penjumlahan semua intensitas muatan ion terfragmen pada saat melakukan scaning. Jika MS secara berulang melakukan scaning dari sumber (inlet) GC rekonstruksi jumlah total muatan ion dari suatu analit dapat dilakukan. Data sistem akan mensubstrak spektra dengan yang lainnya (spektra latar belakang) sehingga spektra analit bebas dari spektra latar belakang pengganggu. Sistem data spektra juga dapat merata-ratakan semua spektra dari puncak GC dengan membandingkan spektra dari puncak GC sebelumnya atau sesudahnya, komponen yang tidak terdeteksi dapat dihindari sehingga diperoleh semua spektra dari masing-masing komponen. Sistem data juga dapat memplot/merajah variasi intensitas masing-masing dari ion terhadap waktu, metode ini dikenal dengan “single-ion Spektroskopi Massa
chromatogram” (kromatogram ion tunggal). Kromatogram ion tunggal sangat berguna dalam mendeteksi obat tertentu dalam suatu campuran. Juga berguna dalam mendeteksi obat-obat yang berbeda setelah semua spektra terekam, tetapi metode ini tidak sensitive. Jika ingin mendeteksi obat tertentu yang diduga ada beberapa teknik analitik yang digunakan yaitu monitoring ion selektif / “selektif ion monitoring”/SIM yang juga dikenal sebagai monitoring puncak ganda / “multi peak monitoring”/MPM, atau deteksi ion ganda /”multiple-ion detection”/MID. Mode operasi dari teknik ini tidak merekam keseluruhan spektra, tetapi hanya merekam sinyal karakteristik dari ion-ion tersebut untuk mengidentifikasi obat yang diinginkan. Khususnya terdapat tiga ion yang berbeda yang akan direkam yaitu termasuk ion molekuler yang utama dan dua ion yang lainnya sebagai ion diagnostik. Intensitas absolut dari ion-ion direkam dan intensitas relatif yang mewakili ion molekuler dicek untuk memastikan memang pada rasio yang benar, apabila dibandingkan spektra massa normal. Intensitas absolut memungkinkan menentukan konsentrasi suatu obat dengan membandingkan dengan intensitas baku pembanding. Keuntungan dari teknik ini adalah lebih sensitive dibandingkan merekam keseluruhan spektra, memerlukan waktu yang lebih sedikit untuk memonitor masing-masing ion. 10.4. Kepustakaan Spektrum Massa Identifikasi obat yang positif diketahui memerlukan pembandingan terhadap spektrum massa yang ada pada data kepustakaan. Pada sistem data yang modern biasanya dilengkapi dengan fasilitas pencarian data spektrum pembanding pada data pustaka, prosedur ini dikerjakan secara automatis. Secara komersial terdapat banyak data kepustakaan tersimpan dalam disket-disket pencarian pembandingan data kepustakaan dapat dilakukan melalui internet di mana “home page” tertentu menyediakan jasa ini. Secara komersial seperti contoh “Environmental protection Ajency/National Institutes of Health Main Spectral Database”. Sistem ini jauh lebih menguntungkan daripada analisis mengumpulkan data spektra massa manual. Jika analisis melakukan pencarian pembanding spektra secara manual dan menghabiskan banyak waktu dan sering muncul penafsiran yang subyektif dan memerlukan
67
pengalaman yang panjang dalam pekerjaan mencocokkan spektra. Untuk menghindari penyimpangan atau kesalahan pembandingan spektrum yang tidak diketahui hasil dari pencarian data pustaka biasanya ditunjukkan beberapa spektrum yang hampir mendekati. Faktor ketepatan biasanya dengan skala 0-1000 adalah menampilkan spektrum yang tepat/cocok dan mengukur kedekatan antara spektrum senyawa yang tidak diketahui dengan spektrum data pustaka. Penghitungan didasarkan atas perbedaan intensitas antara ion-ion yang tepat/cocok dalam spektra yang sesuai. Beberapa sistem ini juga menampilkan faktor kemurnian. Faktor ini dihitung dari puncak spektrum senyawa yang tidak diketahui, tidak terdapat dalam spektrum pembanding dan dapat menunjukkan adanya pengotor atau pengganggu. Pada kasus ini faktor ketepatan yang bagus dengan faktor kemurnian rendah menunjukkan ketidak tepatan atau ketidak benaran. 10.5. Analisis Beberapa Kelompok Obat
(‘drugs”/obat ilegal) baik dalam bentuk sediaan atau bahan baku maupun yang terdapat dalam cairan biologi berada dalam konsentrasi yang sangat kecil dan dalam matriks yang sangat kompleks. Oleh karena itu perlu prosedur “cleanup” atau pemurnian sebelum analisis MS. Pemurnian dapat menggunakan teknik kromatografi atau membuat derivatnya sebelum dikromatografi untuk meningkatkan kinerja kromatografi. Seperti contoh asam dapat dirubah menjadi bentuk metil esternya dan barbiturat dalam bentuk metil-barbiturat. Untuk analisis kuantitatif sebaiknya digunakan internal standard yang sesuai, seharusnya mempunyai sifat kimia yang sama dengan analit hal ini sangat penting jika dilakukan derivatisasi. Internal standard yang ideal adalah isotop berlabel yang analog dengan analit, bagaimanapun juga sebelum pemilihan isotop analog yang spesifik beberapa faktor harus dipertimbangkan seperti: massanya berbeda, kemurnian isotop, dan karakteristik fragmentasi spektrum massanya.
Pada sub bab ini dikhususkan pada pembahasan analisis obat-obat yang sering disalahgunakan
Tabel 10. 1. Spektrum massa kanabis yang karakteristik Senyawa Model ionisasi CBN CBD ∆9-THC Kanabinoid (umum) THC-COOH, metilasi THC-COOH, metilasi, deuterasi, IS THC-COOH trimetilsilil THC-COOH trimetilsilil, deuterasi, IS THC-trifluoroasetil THC-trifluoroasetil, deuterasi, IS THC-COOH trifluoroasetil THC-COOH trifluoroasetil, deuterasi, IS THC-OH, trifluoroasetil, IS THC-OH, trifluoroasetil, deuterasi, IS THC THC, deuterasi, IS EI =“elektron impact”(tumbukan elektron), “(baku dalam) Dikutif dari: Huizer, H., (1991) A. Kanabis
EI 310, 295, 238 EI 314, 299, 258, 246, 231 EI 314, 299, 258, 246, 231, 193 EI 314, 299, 271, 258, 246, 243, 231 EI 372, 357, 313 EI 375, 316 EI 488, 473, 371 EI 491, 374 CI negatif (hidrogen/metana) 410 CI negatif (hidrogen/metana) 413 CI negatif (hidrogen/metana) 454 CI negatif (hidrogen/metana) 457 CI negatif hidrogen metana) 409 CI negatif (hidrogen/metana) 412 EI 314,2 EI 317,2 CI=“Chemical ionization” (ionisasi kimia), IS=“internal standard
Pada analisis kanabis dari produk ilegal dalam bentuk simplisia, hasis, dll, dapat dilakukan secara langsung. Beberapa mg produk langsung dimasukkan ke dalam inlet probe kemudian diperoleh spektrum total. Ion-ion yang karakteristik dapat diperoleh dengan melakukan Spektroskopi Massa
ion-ion yang diamati (m/z)
scaning berulang. Dengan cara ini semua komponen dari kanabis dapat diamati dalam tabel 10.1. Analisis statistikal dapat dilakukan dengan mengadakan intensitas ion-ion terpilih. Apabila ingin mendeteksi adanya campuran kanabinoid dapat dilakukan dengan membandingkan spektrum sampel dengan spektrum kontrol kanabinoid. Cara ini digunakan atau konfirmasi 68
adanya daun, resin atau cairan dari kanabis dan pembandingan sampel berlainan didasarkan atas perbedaan konsentrasi.
Untuk memperoleh data spektrum dari masingmasing kanabinoid sebelum injek ke inlet MS sebaiknya dilakukan proses pemurnian baik menggunakan GC atau HPLC. Pada analisis menggunakan GC kanabinoid terlebih dahulu dibuat sebagai turunannya dengan sililasi. Beberapa kanabinoid sangat tidak stabil pada GC sehingga harus segera dianalisis GC setelah sililasi dan memerlukan penanganan khusus. Pemurnian menggunakan HPLC seperti mengatasi masalah termolabil dari kanabinod sehingga dapat langsung menganalisis kanabinoid. Kanabis pada rokok dapat langsung dianalisis dari kondensat asapnya menggunkan GC-MS. Kanabinoid (CBD), ∆9 THC dan CBN dapat dideteksi langsung sebagai turunan trimetilsilil. Penetapan kanabinoid dalam cairan biologi ditentukan sebagai metabolit kanabinoid. Di dalam urine ditentukan sebagai metabolit utama dari THC yaitu asam 11-nor-∆9-THC-9 karboksilat (THC-COOH). Metabolit ini diekskresi sebagai bentuk bebasnya atau
terkonyugasi dengan asam glukoronat. Analisis THC-COOH sebagai metabolit primer dari kanabinoid menggunakan MS diperlukan pemurnian sebelum dianalisa. Berbagai metode ekstraksi dapat diterapkan seperti ekstraksi menggunakan pelarut organik karena dikeringkan, atau menggunakan ekstraksi fase padat. Sebelum dimasukkan ke inlet MS metabolit tersebut dipisahkan dengan kromatografi (GC/HPLC). Analisis menggunakan GC-MS, THC-COOH dibuat dalam berbagai derivatnya seperti derivat metil ester menggunakan iodometan dan tetrametil hidroksida; derivat trimetilsilil menggunakan N,O, bis-(trimetilsilil) trifluoroasetat (BSTFA) ditambah 1% trimetilklorosilan (TMCS). Analisis kuantitatif internal standard seperti oksigen butana, isotop deuterium dari THCCOOH. Pada analisis GC-MS dengan menganalisa THC-COOH sebagai derivat metil ester dengan metan-kimia ionisasi, menunjukkan spektrum MS prominan ion molekuler terprotonisasi pada m/z 378. Sebagai derivat trimetilsilil menggunakan BSTFA diperoleh ion metastabil m/z 371 sesuai dengan M+ Æ (MCH3)+ dalam spektrum derivat THC.
B. Opiat Analisis opiat menggunakan MS senyawanya seperti dilihat pada tabel 10.2. Tabel 10. 2. Spektrum massa opiat yang karakteristik Senyawa model ionisasi Diamorfin EI Diamorfin CI (Isobutana) Asetilkodein CI (Isobutana) kofein CI (Isobutana) Diamorfin CI (Nitrogen/10% oksida nitrat) 6-asetilmorfin, pentafluoropropionil EI 6-asetilmorfin, propionil EI 6-asetilmorfin, propionil, deuterasi, IS EI Asetilkodein EI Morfin, trifluoroasetil CI (Asetonitril) 6-asetilmorfin, trifluoroasetil CI (Asetonitril) Kodein, pentafluoropropionil EI Nalorfin, penta-fluoropropionil, IS EI Morfin, trifluorosetil EI Kodein, trifluorosetil EI Nalorfin, trifluoroasetil, IS EI Morfin, pentafluoropropionil EI 6-asetilmorfin, pentafluoropropionil EI Morfin EI
ion-ion yang diamati (m/z) 369 (M+), 327. 310, 268 370 (MH+), 310, 268 342, 282 195 370 (MH+), 327, 310, 268, 473 384, 383, 324 389, 333 341, 282 478, 364 424, 364 445, 282 603, 440 477, 364 395, 282 503, 390 577,414, 361 473, 414 268, 256, 242, 228, 215 EI =“elektron impact”(tumbukan elektron), CI=“Chemical ionization” (ionisasi kimia), IS=“internal standard “(baku dalam) Dikutif dari: Huizer, H., (1991).
Aplikasi spektrosfotometri massa dalam analisis Toksikologi
69
C. Kokain Spektrum massa elektron impact dari kokain sangat karakteristik sehingga memungkinkan untuk identifikasi dengan membandingkan terhadap spektra standard. Analisis kuantitatif dilakukan dengan memonitor intensitas ion molekuler pada m/z 303 yang dibandingkan terhadap standard. Kokain ilegal biasanya dikotori dengan ekogenin, metil ekogenin dan benzoil ekogenin,
seperti diperlukan pemisahan sebelum analisis. Analisis menggunakan GC-MS terhadap kokain ilegal perlu diperhatikan pengotor metil ekgonin yang dapat membentuk artefak di muka injektor dari GC pada temperatur tinggi (>250oC). Benzoilekgonin dan ekgonin adalah metabolit utama dari kokain sehingga pada analisis kokain dalam materi biologi kedua metabolit tersebut dianalisa.
Tabel 10. 3. Spektrum massa kokain yang karakteristik Senyawa model ionisasi ion-ion yang diamati (m/z) Ekgonin, metilester EI 82 Fenklikidin EI 200 Kokain EI 303, 182, 82 Kokain, deuterasi, IS EI 306, 185, 85 Benzoilekgonin ester EI 361, 240, 82 Benzoilekgonin ester, deuterasi, IS EI 364, 243, 85 Kokain EI 303 Kokain, deuterasi, IS EI 308 p-Fluorokokain EI 321 p-Fluorokokain, deuterasi, IS EI 324 n-propilkokain EI 331 n-propilkokain, deuterasi IS EI 334 Kokain EI 303 Kokain, deuterasi, IS EI 306 Norkokain, trifluoroasetil EI 263 Norkokain, trifluoroasetil, deuterasi, IS EI 266 Kokain CI (Isobutana) 304, 182 Benzoilekgonin CI (Isobutana) 290, 186, 168, 124 EI =“elektron impact”(tumbukan elektron), CI=“Chemical ionization” (ionisasi kimia), IS=“internal standard “(baku dalam) Dikutif dari: Huizer, H., (1991).
D. LSD dan Halusinogen lainnya Halusinogen yang paling sering disalahgunakan adalah LSD dan analognya, psilosin, psilosibin, 2,5-dimetoksi-4-metil amfetamin, meskalin, ergotamine Analisis LSD sangat sulit karena dosis yang sangat poten
dari LSD sehingga dalam urine atau materi biologi hanya berada pada konsentrasi yang sangat kecil, piko-nano gram/mL. Dalam cairan biologi LSD dianalisa sebagai bentuk tak termetabolisme LSD.
Tabel 10. 4. Spektrum massa LSD dan halusinogen lainnya yang karakteristik Senyawa model ionisasi ion-ion yang diamati (m/z) LSD, trimetilsilil EI 395, 293, 279, 268, 253, 73 LSD EI 323 (M+) Psilokin EI 204 (M+), 159, 146, 130, 117 STP EI 166 LSD, trimetilsilil EI 395 (M+), 293, 268 LSD, trimetilsilil, deuterasi, IS EI 398 (M+) LSD, N-trifluoroasetil CI negatif (metana) 419 LSD, N-trifluoroasetil, deuterasi, IS CI negatif (metana) 429 N-Dimetil-LSD, trifluoroasetil CI negatif (metana) 501 EI =“elektron impact”(tumbukan elektron), CI=“Chemical ionzation” (ionisasi kimia), IS=“internal standard “(baku dalam) Dikutif dari: Huizer, H., (1991). Aplikasi spektrosfotometri massa dalam analisis Toksikologi
124
E. Turunan Amfetamin Spektrum massa turunan amfetamin menggunakan teknik fragmentasi elektron impact atau tumbukan elektron sangat tidak memuaskan untuk digunakan sebagai dasar identifikasi, karena ion-ion molekuler dari turunan amfetamin muncul sangat lemah bahkan sering tidak tampak. Umumnya senyawa turunan amfetamin mempunyai puncak dasar yang sama pada m/z 58. Untuk mengatasi hal ini biasanya digunakan teknik
ionisasi yang lain seperti ionisasi secara kimia atau merubah menjadi bentuk derivatnya yang akan memberikan spektrum massa yang bermakna untuk identifikasi. Metode yang tepat untuk menganalisis amfetamin dan metabolitnya (amfetamin, phidroksi metamfetamin dan p-hidroksi amfetamin) didahului dengan hidrolisis kemudian ekstraksi dan merubah menjadi turunan heptafluorobutiril dengan menggunakan fentermin sebagai standard internal (2).
Tabel 10. 5. Spektrum massa amfetamin yang karakteristik Senyawa
Model ionisasi
DOB Amfetamin, trikloroasetil Metamfetamin, trikloroasetil 2-metilfenetilamin, trikloroasetil, IS Amfetamin, 4-karbetoksiheksa-fluorobutiramida Amfetamin, 4-karbetoksiheksa-fluorobutiramida, deuterasi, IS Metamfetamin, 4-karbetoksiheksa-fluorobutiramida Metamfetamin, 4-karbetoksiheksa-fluorobutiramida, deuterasi, IS Amfetamin, heptafluorobutirat Metamfetamin, heptafluorobutirat N-Propilamfetamin, heptafluorobutirat, IS Turunan d- and l-amfetamin Turunan d- and l-amfetamin, deuterasi, IS Amfetamin, trifluoroasetat
CI (amonia) EI EI EI EI EI
Ion-ion yang diamati (m/z) 274 (MH+), 186 188, 118, 91 202, 118, 91 118, 105 294, 266, 248 298, 270
EI EI
308, 280, 262 315, 287
EI EI EI CI (metana) CI (metana) EI
240 254 282 427 429 140
EI =“elektron impact”(tumbukan elektron), CI=“Chemical ionization” (ionisasi kimia), IS=“internal standard “(baku dalam) Dikutif dari: Huizer, H., (1991).
Aplikasi spektrosfotometri massa dalam analisis Toksikologi
70
F. Pencilidin Pola fragmentasi dari pencilidin yang karakteristik muncul spektra ion molekuler
yang kuat pada m/z 243. Spektrum karakteristik pencilidin seperti dilihat pada tabel 10.6.
Tabel 10. 6. Spektrum massa pencilidin yang karakteristik Senyawa model ionisasi ion-ion yang diamati (m/z) EI 249 (M+) 1-{1-(2-tienil)sikloheksil}piperidin EI 251 (M+) 1-{1-(2-tienil)sikloheksil}morfolin EI 235 (M+) 1-{1-(2-tienil)sikloheksil}pirolidin EI 245 (M+) 1-{1-fenilsikloheksil}morfolin EI 229 (M+) 1-{1-fenilsikloheksil}pirolidin PCE EI 203 (M+) PCC CI (metana) 193 (MH+), 192, 191, 166 PCP, deuterasi, IS CI (metana) 243, 159 PCP, heptafluorobutirat; 4-fenil 4- piperidino CI (metana) 248, 164 242 Sikloheksanol, heptafluorobutirat; dan 1-{1-fenilsikloheksil}- CI (metana) 4-hidroksi piperidin, heptafluorobutirat CI (metana) 245 1-(1-fenilsikloheksil}morfolin, heptafluorobutirat, IS EI 304 5-{N-(1’fenilsikloheksil) amino} asam pentanoat, trimetilsilil 293 5-{N-(1’fenilsikloheksil) amino} asam pentanoat, trimetilsilil, EI deuterasi, IS EI 289, 246, 159 5-{N-(1’fenilsikloheksil) amino} asam pentanoat, metilester EI 294, 254, 164 5-{N-(1’fenilsikloheksil) amino} asam pentanoat, metilester, deuterasi, IS EI =“elektron impact”(tumbukan elektron), CI=“Chemical ionization” (ionisasi kimia), IS=“internal standard “(baku dalam) Dikutif dari: Huizer, H., (1991). G. Senyawa lainnya Spektrum beberapa
massa yang karakteristik dari senyawa, seperti metaqualon,
pentobarbital, fentanil, aprazolam, trizolam, bromazepam adalah senyawa yang juga sering disalahgunakan dapat dilihat pada tabel 10.7.
Tabel 10. 7. Spektrum massa yang karakteristik dari metaqualon, pentobarbital, fentanil, dan benzodiazepin Senyawa model ionisasi ion-ion yang diamati (m/z) Metaqualon EI 250 (M+) Metaqualon CI (isobutana) 251 (MH+, 100%), 235 (20%) Metaqualon CI (metana atau isobutana) 251 (MH+) Pentobarbiton EI 156 Pentobarbiton, deuterasi, IS EI 161 Fentanil CI (metana) 337 (MH+) Fentanil, deuterasi, IS CI (metana) 340 (MH+) Fentanil EI 245, 189, 146 Alfentanil, IS EI 373, 282, 236 Alprazolam CI negatif (metana) 308 Triazolam, IS CI negatif (metana) 306 Triazolam CI negatif (metana) 306 (M+) triazolam, deuterasi, IS CI negatif (metana) 312 (M+) Bromazepam CI (amonia) 318 (MH+, isotop 81Br), 316 EI =“elektron impact”(tumbukan elektron), CI=“Chemical ionisation” (ionisasi kimia), IS=“internal standard “(baku dalam) Dikutif dari: Huizer, H., (1991). Kepustakaan:
Aplikasi spektrosfotometri massa dalam analisis Toksikologi
124
1. Chamberlain, J., 1985, Analysis of Drugs in Biological Fluid, CRC Press Inc, Boca Raton 2. Chapman, J.R., 1985, Practical Organic Mass Spectrometry, John Wiley & Sons. 3. Huizer, H., 1991, The use of mass spectrometry for the detection and quantitation of abused drugs, Gogh, T., A., The Analysis of Drugs of Abuse, John Wiley & Sons, Chichester. 4. Moffat, A.C., et all., (Ed), 1986, Clark’s Isolation and Identification of Drugs in
Pharmaceuticals, Body Fluids, and PostMortem Material, Second Ed., The Pharmaceutical Press, London. 5. Skoog, D.A., Leary, J.J., 1992, Principles of Instrumental Analysis, 4 th Ed., Harcourt Brace Publisher, New York. 6. Willard, H.H., et all., 1989, Instrumental Methods of Analysis, Wadsbuorth Publishing Company, California
Aplikasi spektrosfotometri massa dalam analisis Toksikologi
124
BAB XI APLIKASI SPEKTROSFOTOMETRI INFRA MERAH DALAM ANALISIS TOKSIKOLOGI
11. 1. Pendahuluan Rentang panjang gelombang spektrum elektromagnetik inframerah (IR) adalah dari 0,8 sampai 500 µm (12.500-20 cm-1). Spektrum IR dapat dibagi menjadi 3 daerah: IR dekat (12.500-4000 cm-1); IR tengah (4000-400 cm1),dan IR jauh (400-20 Cm-1). Kebanyakan instrumen spektrometri IR beroperasi pada daerah IR tengah. Semua senyawa organik mengabsorpsi radiasi IR, dan absorpsi dari senyawa tersebut adalah karakteristik terhadap gugus fungsi dan struktur dari senyawa tersebut. Spektroskopi IR adalah salah satu instrumen yang sangat berguna bagi kimia suatu langkah awal dalam mengelusidasi struktur suatu molekul. Identifikasi kimia dapat diperoleh dari vibrasi gugus fungsi/pita absorpsi gugus fungsi yang spesifik dari senyawa tersebut. Dari spektrum IR dapat melakukan analisis kualitatif dan kuantitatif terhadap suatu molekul. Pada suhu biasa (tertentu) molekul-molekul organik dalam keadaan vibrasi yang tetap, setiap ikatan mempunyai frekuensi rentangan/stretching dan binding yang karakteristik dan dapat menyerap energi radiasi pada frekwensi tersebut. Penyerapan radiasi IR oleh molekul akan menyebabkan eksitasi vibrasional yang akan mengakibatkan perubahan momen dipol pada molekul tersebut. Momen dipol pada molekul hanya diberikanoleh vibrasi yang asimetrik ditimbulkan oleh eksitasi vibrasional. Intensitas penyerapan vibrasi IR adalah sebanding dnegan momen dipolnya. 11. 2. Hubungan spektra IR dengan struktur molekul Untuk analisis kualitatif salah satu yang paling berarti pada spektrum IR dari suatu senyawa adalah posisi pita-pita absopsi gugus fungsi spesifik, absopsi atau lemah-kuanya absopsi pada frekwensi yang spesifik sesuai dengan vibrasional dari gugus fungsi yang terikat pada molekul tersebut. Sehingga interpretasi dari
suatu spektrum IR adalah mungkin untuk menentukan ada atau tidaknya gugus fungsi tertentu yang terikat pada molekul tersebut.Dari suatu data spektrum IR dapat mengestimasikan dugaan senyawa/gugus fungsi yang dapat melakukan identifikasi dengan membandingkan dengan data pustaka. Karena pada kuliah penetapan struktur molekul telah secara jelas dibahas sehingga pada bab ini dibahas secara umum. Daerah IR tengah adalah dasar yang sangat berguna dan sering digunakan untuk analisis kualitatif suatu molekul. Daerah ini dibagi menjadi dua bagian besar yaitu daerah gugus fungsi (4000-1300 cm-1) (2,50-7,69 µm) dan daerah sidik jari, 1300-650 cm-1 (7,69-15,38 µm) pada daerah gugus fungsi. Absorpsi/serapan diberikan oleh vibrasi dua atom dari molekul tersebut, bilangan gelombang serapan tergantung pada gugus fungsi yang memberikan absopsi dan telah diperiksa oelh keseluruhan molekul. Daerah gugus fungsi dapat dibagi lagi dengan interval 4000-2500 cm1 (2,50-4,00 µm), absorpsi diberikan oleh vibrasi stretching hidrogen dari gugus fungsi yang karakteristik, dengan unsur bermassa atom 19 atau kurang. Frekwensi stretching dari -C-H sangat berguna untuk menetapkan jenis senyawa yang terdapat dalam sampel; seperti contoh C= C-H muncul sekitar 3300 cm-1 (3,03 µm) C-H aromatik dan ikatan tak jenuh muncul pada 3000-3100 cm-1 (3,33-3,23 µm), dan alifatik pada 3000-3800 cm-1 (3,33-3,57 µm). Rentang frekwensi intermediet 2500-1540 cm-1 (4,00-6,44 µm), biasanya disebut dengan daerah tak jenuh. Ikatan rangkap tiga muncul dari 2500-2000 cm-1 (4,00-5,00 µm). Frekwensi ikatan rangkap dua muncul antara 2000-1540 cm-1 (5,00-6,49 µm). Dengan pengalaman yang tinggi dan berbagai data empirik dapat membedakan pita antara C=O, C=C, C=N, N=O, dan S=O. Daerah sidik jari (1300-650 cm-1) (7,69-15.38 µm) diberikan oleh frekwensi stretching ikatan tunggal dan vibrasi-vibrasi ikatan yang melibatkan gerakan ikatan gugus fungsi pada
Aplikasi spektrosfotometri IR dalam analisis Toksikologi
73
molekulnya. Multiplisitas dari spektrum sangat penting untuk meyakinkan identifikasi dari masing-masing pita, tetapi secara kolektif pitapita serapan digunakan untuk identifikasi suatu material atau bahan senyawa. 11. 3. Instrumen IR instrumen dibagi menjadi 2 kelompok: dispersive dan non dispersive. Instrumen dispersive menggunakan prisma atau kisi untuk mendispersikan radiasi polikromatis. Spektrometer non dispersive menggunakan filter interferensi, sumber lampu laser “tunable
laser” atau interferometer yang sangat populer dalam spektrometri fourier transfer inframerah (FTIR) a. Spektrometer Inframerah Dispersive Disebut spektrometer dispersive karena spektrometer ini mendispersikan radiasi elektromagnetik inframerah menjadi berbagai frekwensi menggunakan alat pendifraksi seperti prisma, kisi. Pada keseluruhan alat spektrometer dispersive terdapat 5 bagian: sumber radiasi, ruang sample, fotometer, kisi atau monokromator, dan detektor.
Gambar 11.1.Skematik sistem optik spektrometer IR dispersive double beam Masalah-masalah di atas telah dipecahkan oleh Terdapat beberapa kendala yang berhubungan FTIR modern. dengan spektrometer IR dispersive, seperti kecepatan skening, sensitivitas, dan ketepatan yang rendah. Dalam spektrometer ini terdapat banyak alat yang bergerak-gerak, sehingga b. Spektrometer FTIR kegagalan sering diakibatkan oleh kegagalan mekanik. Lamanya waktu skening sekitar 15 Spektrometer FTIR menggunkan interferometer menit atau lebih untuk mendapatkan spektrum yang menganalisa informasi frekwensi dan resolusi yang tinggi, karena spektrometer IR intensitas dengan merubah frekwensi IR menggunakan celah “slits” untuk menjadi auto frekwensi. Interferometer meningkatkan resolusinya, intensitas dengan Mickelson sangat banyak digunakan yang menurunkan sensitivitas. Tidak adanya terdiri dari cermin permanen dan bergerak dan reference internal. Untuk mengkalibrasi pembagi sinar “beam spliter”. Cara kerja ketepatan frekwensi dan selalu dibutuhkan interferometer Mickelson digambarkan sebagai kalibrasi dengan spektrum reference. Spektrum berikut. Dalam gambar 11.2. radiasi dari polistirene biasa digunakan untuk sumber radiasi IR (A), diteruskan menuju mengkalibrasi spektrum IR. Pada spektrometer interferometer. Pada saat menuju dispersive kemungkinan terjadadi efek panas interferometer, sinar cahaya IR berkontak pada sampel karena penempatan sampel yang dengan pembagi sinar (B), yang membagi berdekatan dengan sumber radiasi, hal ini berkas sinar dengan energi yang sama. Sekitar terkadang menimbulkan masalah karena 50% cahaya dari pembagi cahaya diteruskan detektor merekam emisi radiasi IR dari sampel menuju cermin permanen (C) dan 50% yang sering terjadi kesalahan pembacaan serapan dipentulkan dari pembagi cahaya diteruskan oelh detektor yang diakibatkan oleh hamburan menuju cermin bergerak (D). Berkas cahaya radiasi yang dihasilkan oleh sistem optik. tersebut akan dipantulkan oleh cermin-cermin tersebut dan akan digabungkan oleh pembagi 74 Aplikasi spektrosfotometri IR dalam analisis Toksikologi
cahaya. Total interferensi yang terjadi tergantung dari posisi relatif cermin bergerak terhadap cincin permanen. Akhirnya berkas cahaya hasil interferensi ini diterukan menuju
sampel sehingga akan terjadi absorpsi selektif oleh sampel, berkas cahaya akan diteruskan menuju detektor. Detektor mengukur frekwensi dan intensitas dalam kawasan audio.
Gambar 11.2. Skematik diagram spektrometer FTIR Tabel 11.1. Rangkuman perbedaan IR dispersive dengan FTIR Dispesive IR FTIR - Banyak yang bergerak - Secara mekanik sederhana (hanya satu bagian yang bergerak - Kecepatan scaning rendah - Kecepatan scaning tinggi - Sensitivitas rendah - Sensitivitas tinggi - Tidak terdapat referen internal - He-Ne-laser digunakan sebagai reference internal - Diperlukan kalibrasi dengan suatu reference - Tidak membutuhkan kalibrasi - Sampel dekat dengan sumber cahaya IR - Sampel jauh dengan sumber cahaya IR - Digunakan berkas cahaya yang sedikit - Diperlukan berkas cahaya yang tinggi - Mungkin terjadi hamburan cahaya - Hamburan cahaya tidak menggunakan detektor - Emisi radiasi sampel akan terukur oleh detektor - Emisi radiasi oleh sampel tidak termodulasi sehingga tidak terukur oleh detektor - Terjadi perubahan resolusi dengan berubahnya - Resolusi konstan dari semua rentang spektra. rentang spektra. 11. 4. Teknik Sampling pda IR Pada penggunaan spektra IR, senyawa yang diidentifikasi harus relatif murni dan jumlahnya harus cukup untuk menyerap radiasi dan mendeteksi radiasi yang diserap. Di dalam prakteknya sampel-sampel yang datang di Laboratorium Forensik umumnya dalam bentuk campuran dan tidak murni sehingga diperlukan pemurnian, sebelum dilakukan analisis. Teknik
pemurnian atau pemisahan yang tepat tergantung pada jenis sampel, konsentrasi analit dan demikian juga jenis pengotor yang terdapat.
Senyawa yang hendak dianalisa sedikitnya memiliki tingkat kemurnian 95% untuk meminimalkan spektra pengganggu dari pengotor. Dispersive IR membutuhkan sampel 1 mg sedangkan FTIR dapat mendeteksi hingga nanogram. Cara-cara penanganan sampel 73 Aplikasi spektrosfotometri IR dalam analisis Toksikologi
tergantung daripada jenis sampel yaitu apakah terbentuk gas, cairan atau padatan. Gaya-gaya intermolekul sangat berbeda antara gas, cairan atau padatan, dan spektrum IR biasanya akan menunjukkan efek dari perbedaan-perbedaan ini dalam bentuk pergeseran frekwensi atau pita-pita tambahan dan sebagainya. Oleh sebab itu penting mencatat spektrum dengan caracara penanganan yang sesuai. 11.4.1. Teknik sampling tradisional a. Gas Untuk menangani cuplikan berbentuk gas, maka cuplikan harus dimasukkan dalam sel gas; sel ini menghadap langsung pada berkas sinar. Dalam bentuk yang dimodifikasi, cermin internal yang digunakan dapat memantulkan berkas sinar berulang kali melalui cuplikan untuk menaikkan sensitivitas. Sejumlah kecil senyawa-senyawa organik dapat ditentukan dalam bentuk gas, bahkan dalam sel-sel yang dipanaskan. b. Cairan Cara yang paling mudah dalam penanganan cuplikan bentuk cairan adalah menempatkan cuplikan tersebut sebagai film yang tipis di antara dua lapis NaCl yang transparan terhadap inframerah. Karena digunakan NaCl maka setelah selesai segera dibersihkan dengan mencuci menggunkan pelarut-pelarut seperti toluena, kloroform, dan sebagainya. NaCl harus dijaga tetap kering dan selalu dipegang pada ujung-ujungnya. Untuk spektra di bawah 250 cm-1, maka digunkan CSl, untuk cuplikan yang mengandung air dapat digunkan CaF2. Cuplikan cairan dapat juga ditentukan dalam larutan. c. Padatan Wujud cuplikan padat dapat bermacam-macam di antaranya, kristal, amorf, serbuk, gel, dan lain-lain. Bermacam-macam metoda telah dikembangkan untuk penyediaan cuplikan padat hingga dapat langsung diukur. Ada tiga cara yang umum untuk mencatat spektra bentuk padatan: pelet KBr, mull, dan bentuk film / lapisan tipis. Padatan juga dapat ditentukan dalam larutan tetapi spektra larutanmngkin memberikan kenampakan yang ebrbeda dari spektra bentuk padat, karena gaya-gaya intermolekul akan berubah. Pelet KBr dibuat dengan menumbuk cuplikan (0,1-2,0% berat) dengan KBr kemudian ditekan
hingga diperoleh pelet. KBr harus kering dan akan baik bila penumbukan dilakukan di bawah lampu inframerah untuk mencegah terjadinya kondensasi uap dari atmosfer yang akan memberikan serapan lebar pada 3500cm-1. Mull, atau pasta, dibuat dengan mencampur cuplikan dengan setetes minyak; pasta kemudian dilapiskan di antara dua keping NaCl yang transparan. Bahan pasta harus transparan terhadap inframerah, tetapi hal ini tidak pernah ada dan struktur yang dihasilkan selalu menunjukkan serapan yang berasal dari bahan pasta yang super impos dengan cuplikan yang sering digunakan sebagai bahan pasta adalah parafin cair (nujol). Lapisan tipis padatan dapat dilapiskan pada kepingan NaCl dengan cara meneteskan larutan dalam pelarut yang mudah menguap pada permukaan kepingan NaCl dan dibiarkan hingga pelarut menguap. Plimer-polimer berbagai lilin atau behan-bahan lemak sering memberikan hasil yang baik, tetapi ada juga yang membentuk kristal yang tajam hingga tidak memberikan serapan. Larutan, Cuplikan dapat dilarutkan dalam pelarut seperti karbontetraklorida, karbon disulfida atau kloroform, dan spektrum dari larutan ini dicatat. Larutan (biasanya 1-5%) ditempatkan dalam sel larutan yang terdiri dari bahan transaparan. Sel yang kedua berisi pelarut murni ditempatkan pada berkas sinar referensi, sehingga serapan dari pelarut dapat dikensel dan spektrum yang dicatat merupakan senyawanya sendiri. Meskipun demikian untuk meyakinkan bahwa serapan dari pelarut tidak mengganggu spektrum dari cuplikan, maka sebaiknya perlu dibuat spektrum dari pelarut yang digunkan untuk mengetahui serapanserapan yang diberikan. 11.4.2. Teknik sampling yang lain Dalam beberapa tahun terakhir telah berkembang teknik sampling yang lain, beberapa dari teknik tersebut telah diterapkan dalam kimia forensik. Metode ini termasuk spekular reflektan, diffusi reflektan, total attenuasi reflektan, dan fotoaqoustik detektion. Beberapa teknik ini adalah sangat baru tetapi telah banyak dikenal dikalangan analisis forensik. a. Spekular reflektan (pemantulan spekular)
Aplikasi spektrosfotometri IR dalam analisis Toksikologi
76
Spekular reflektan adalan suatu teknik di mana spketrum diperoleh dari pemantulan radiasi IR pada permukaan sampel. Radiasi dikumpulkan pada sudut yang sama dengan sudut datang. Secara komersial terdapat aksesoris dengan sudut pantul yang tetap atau ebrubah-ubah. Aksesoris ini dapat digunkan pada spekrometer dispersive atau FT-IR. Puncakpuncak serapan pemantulan spekular mungkin memberikan geseran menuju frekwensi yang lebih tinggi daripada spektrum absorpsi. Teknik ini diterapkan untuk merekam spektrum IR dari suatu senyawa terdeposisi pada cermin. b. Difusi reflektan Difusi reflektan dan spektrometri FTIR difusi reflektan hampir mirif dengan spekular reflektan tetapi difusi reflektan memantulkan radiasi yang berpenetrasi ke dalam sampel. Radiasi yang dipantulkan dikumpulkan oleh cermin kolimator. Diagram aksesoris difusi reflektan dari “spectra-tech” dapat dilihat pada gambar 11.1 dan 11.2 Keuntungan utama difusi reflektan dibandingkan dengan spekular reflektan adalah spektrum yang diperoleh analog dengan spektrum IR secara tradisional. Sampel dianalisis secara langsung atau dengan mendispersikan pada bahan tan-erap (nonabsorbing). Telah dilaporkan jumlah sampel minimum yang dapat dianalisis adalah 20 µg masih memberikan spektr yang bagus. Prosedur penyerapan sampel adalah sampel dicampur dengan logam alkali halida kemudian ditempatkan pada cawan sampel. Cawan sampel ditempatkan dalam aksesories atau sampel dipekatkan pada bubuk kalium bromida dengan melarutkan sampel dalam kloroform kemudian dicampur dengan KBr, kemuidan kloroform diuapkan sehingga hampir semua sampel teradsorpsi pada permukaan bubuk KBr. c. “Attenuated Total Reflectance” Teknik “attenuated total reflectance” (ATR) sama seperti spekular reflektan dan difusi reflektan. Teknik ini biasa digunakan untuk merekam spektrum IR dengan bahan yang tidak transparan. Teknik ini sangat jarang digunkan pada kimia forensik kimia obat karena memerlukan jumlah sampel yang besar.
d. Spektroskopi fotoacoustik Dasar kerja dari spektrokopi fotoacoustik adalah penyearpan cahaya IR yang termodulasi dalam sampel. Panas terlokalisasi dihasilkan oelh penyerapan radiasi oleh sampel ditransfer dari permukaan sampel menuju atmosfer gas di atas permukaan sampel. Perpindahan panas dari gas diukur melalui variasi tekanan yang dideteksi sebagai suara oleh mikroption bersensitivitaas tinggi. Suatu interferogram dibangkitkan yang ditransformasikan dan dirasiokan terhadap panas jenuh suatu bahan (karbon hitam). Hasilnya adalah spektrum fotoacoustik dari sampel. Keuntungan dari metode ini adalah sangat sedikit atau tanpa pra perlakuan seperti penyerapan sampel pelarutan. Kelemahan utamanya adalah waktu yang lama diperlukan untuk menghasilkan spektrum dan aksesorisnya sangat mahal. 11. 5. Berbagai Teknik Yang Dikombinasikan Dengan Spektroskopi IR Dalam beberapa tahun terakhir ini banyak instrumen lain digabungkan dengan spektroskopi IR seperi GC, HPLC, dan KLT. Sekarang ini, juga kromatografi cair superkritis. GC-FTIR juga dikombinasikan dengan MS. Diameter dari semua penggabungan ini spektroskopi IR berfungsi sebagai detektor. Diameter spektroskopi FT-IRanalisis termografimetrik (TGA-FTIR) dan FT-IR mikrospektroskopi juga digunakan untuk analisis obat. a. GC-FTIR Pemisahan sampel untuk kromatografi gas memungkinkan mendapatkan senyawa murni. Untuk spektroskopi IR berbagai sistem kombinasi telah dikembangkan. Pada awalnya teknik adalah aliran terperangkap dalam suatu kopolimer tembus sinar IR. Teknik ini sangat sukar untuk memilih puncak-puncak analit yang telah dipisahkan oleh GC. Perkembangan berikutnya sinar IR dilewatkan langsung pada kolom kapiler tembus sinar. Sehingga sinar IR langsung melewati aliran efluen. Sinar IR dapat langsung menganalisa puncak-puncak analit yang terpisahkan oleh GC.
Pada tahun terakhir ini, dikatakan kimia forensik telah mengenal kombinasi GC-FTIRMS. Sistem “cryolect” dari Mattsun dan sistem 77 Aplikasi spektrosfotometri IR dalam analisis Toksikologi
tracer dari bijilab dapat mengkombinasikan GCFTIR dengan MS akhirnya. Dengan sistem ini memungkin-kan mendapat informasi yang akurat dalam uji skrining dan konfirmasi karena dari IR dan MS dapat melakukan elusidasi struktur suatu senyawa atau dengan perbandingan dengan data “Library”. b. Kromatografi cair -FTIR Salah satu keuntungan HPLC dan GC adalah sistem tidak terjadi perusakan / destruksi analit dalam efluen. Lebih banyak sampel dapat dianalisis oelh HPLC. Secara umum kapasitas kolom HPLC lebih besar dari GC, sehingga lebih banyak sampel dapat dianalisis oleh IR spektroskopi. Deteksi IR dari eluen kromatografi cair dilengkapi dengan alat yang dapat menguapkan pelarut sebelum deteksi IR atau deteksi langsung pada lairan kolom. Teknik penguapan eluen sebelum dianalisis adalah paling baik, namun akan memerlukan lebih banyak waktu dan susah untuk diautomisasi. Deteksi langsung pada aliran menggunkan “flow-cell detection” HPLC-FTIR sering menimbulkan 2 masalah adalah gangguan absorpsi oelh pelarut dan terjadi interaksi antara analit (solut) dengan pelarut sehingga mengakibatkan geseran pita absorpsi. Metode absorpsi lainnya adalah deteksi “flow-cell” aliran terjadi yaitu aliran ditentukan pada saat scaning IR. c. Kromatografi lapis tipis-FTIR Teknik ini adalah “chromalect TLC-FTIR” sistem ini dikembangkan oleh Anabect. Awal dari instrumen ini, spektrum IR dari suatu senyawa diukur pada pelat KLT yang telah terpisah atau secara manual dikerok kemudian diukur transmitan atau difusi reflektornya. Sistem “chromalect” adalah sampel yang telah terpisahkan oelh KLT, sampel dipindahkan ke serbuk IR-transparan kemudian diukur spektrum IRnya. Pemisahan pada KLT dilakukan secara konvensional. Plat KLT kemudian dikeringkan atau diikatkan dengan alat untuk memindahkan sampel ke dalam suatu cawan difusi reflektan yang mengandung bubuk khusus untuk pengukuran IR. Alat ini dilengkapi pemutar plat 90o dan menggunakan sumbu stenslesstill, seperti kromatogram dua dimensi. Analit pada alat KLT dipisahkan dari plat melalui aliran pengembang pada sumbu stenless sampai analit terkonsentrasi pada
serbuk IR transparan dalam cawan difusi reflektan. Serbuk IR transparan berasal dari gelas - germanium - antimony - selenium. Pada prosedur ini pelarut dihilangkan dengan memanaskan cawan sehingga pelarut menyerap sempurna. Metode pemindahan ini dapat meminimalkan kehilangan, dekomposis sampel atau terjadi kontaminasi oelh senyawa pengotor selama proses pemisahan. Alat ini bekerja secara otomatis. Setelah analit terkonsentrasi pada cawan difusi reflektan, diukur spektrum IRnya. d. Spektroskopi mikrospektroskopi FTIR Teknik mikrospektroskopi FTIR dapat digunakan untuk identifikasi obat, serat, dan cat. Sinar IR difokuskan pada sampel untuk memperoleh spektrum IRnya. Serbuk obat dapat diukur dengan mudah di bawah mikroskop. Di bawah sinar-sinar mikroskop berbagai komponen kristal di dalam sampel dapat dapat dipisahkan melalui bentuk kristal, tekstur dan morfologinya. Sinar IR kemudian difokuskan pada satu kristal tersebut. Jika kristal tersebut terlalu tebal maka spektrum IR yang diperoleh sangat kasar/ ditutupi oleh pitapita yang lebar. Masalah ini dapat diatasi dengan memindahkan fokus sinar IR pada ujung atau bagian tertipis dari kristal tersebut. Melalui mikroskop ini pemisahan / pemilihan kristal dapat dilakukan. Permasalahan timbul banyak kristal obat mengalami polimorfisme seperti senyawa-senyawa barbiturat dan amfetamin. 11.6. Penerjemahan Spektrum IR Terdapat dua prinsip dasar untuk menentukan identitas suatu senyawa dengan spektroskopi IR adalah melakukan analisis gugus fungsi dan secara langsung membandingkan dengan spektrum senyawa yang sudah diketahui. Analisis gugus fungsi didasarkan atas pita-pita serapan yang muncul pada daerah gugus fungsi dan sidik jari. Dari pita-pita tersebut dapat diperoleh informasi gugus fungsi yang mungkin terdapat pada spektrum tersebut. Penafsiran gugus fungsi secara umum telah dijelaskan sebelumnya.
Setelah gugus fungsi suatu spektrum / analit dapat dikenali langkah berikutnya membandingkan dengan spektrum senyawa yang sudah diketahui. Beberapa perbedaan / geseran pita-pita pada spektrum dari suatu 78 Aplikasi spektrosfotometri IR dalam analisis Toksikologi
senyawa dapat diakibatkan oleh alat yang berbeda atau metode penyiapan sampel yang berbeda. Perbedaan atau geseran pita-pita oleh suatu alat diakibatkan oleh resolusi, noise, respon, gain, dan berbagai faktor yang lain. Untuk mengatasi dapat dilakukan pengukuran pembanding dengan alat resolusi yang sama. 11. 7. Spektrum IR obat-obatan yang sering disalahgunakan
Pada tabel 11.2. terdapat ringkasan puncak pita-pita dari senyawa obat yang sering disalahgunakan dan sering dianalisis oleh Laboratorium Kimia forensik. Seperti pada MS kebanyakan instrumen FTIR dilengkapi dengan program manipulasi database yang dapat membantu dalam analisis atau penerjemahan spektrum suatu analit. Database spektra IR juga dilengkapi data kepustakaan yang memuat semua informasi spektrum IR.
Tabel 11.2. Ringkasan spektra utama beberapa obat yang umum Senyawa Narkotika :
Bilangan gelombang (cm-1) Kokain 1728. 1264, 1104, 729 Kodein 1499, 1443, 1267, 1069 Diamorfin-HCl 1753, 1732, 1365, 1230 Hidromorfon 1717, 1443, 1027, 964 Hlusinogen: MDA 1485, 1435, 1253, 1034 MDMA sama dengan MDA Fensiklidin 1442, 963, 759, 702 (beberapa amfetamin yang karakteristik) Depresan: Amilobarbiton 1428, 842, 498, 406 fenobarbiton 1350, 1308, 561, 504 (beberapa barbiturat yang serupa) Diazepan 1681, 1484, 885, 709 Alprazolam 1611, 1484, 822, 695 Stimulan: Amfetamin 1512, 1393, 737, 702 Metamfetamin 1491, 1456, 752, 702 Fenmetrazin 1491, 1449, 759, 702 Fendimetrazin 1449, 1111, 752, 702 Keterangan: MDA = 3,4- Metilendioksiamfetamin, MDMA = 3,4- Metilendioksimetilamfetamin Kepustakaan 1. Chamberlain, J., 1985, Analysis of Drugs in Biological Fluid, CRC Press Inc, Boca Raton 2. Hardjono Sastrohamidjojo, 1992, Spektroskopi Inframerah, Liberty, Yogyakarta. 3. Mills, III. And G.J. Fontis. 1991. “Aplications of infrared spectroscopy in drug analysis”, Goush, T.A. “The Analysis of Drug of Abuse, John Wileys sons Ltd, Chiehester, 226-281.
4. Moffat, A.C., et all., (Ed), 1986, Clark’s Isolation and Identification of Drugs in Pharmaceuticals, Body Fluids, and PostMortem Material, Second Ed., The Pharmaceutical Press, London. 5. Skoog, D.A., Leary, J.J., 1992, Principles of Instrumental Analysis, 4 th Ed., Harcourt Brace Publisher, New York. 6. Sriewoelan, S., 1988, Analisis Obat Dalam Cairan Biologi, ITB, Bandung. 7. Willard, H.H., et all., 1989, Instrumental Methods of Analysis, Wadsbuorth Publishing Company, California
Aplikasi spektrosfotometri IR dalam analisis Toksikologi
79
Bibliografi Penulis Nama
: Dr.rer.nat. I Made Agus Gelgel Wirasita, M.Si., Apoteker Kantor : - Institute of Forensic Sciences and Criminology – Udayana University – Denpasar – Bali, Indonesian - Department of Pharmacy – Faculty Mathematic and Basic Sciences Udayana University Email :
[email protected] Telp : 0361-7952455 081337742733 Residence : Jl Udayana Lodge, Blok E-52, Pasraman Udayana, Jimbaran – Bali Riwayat Pendidikan: 1987 - 1992 : Sarjana Farmasi di Jurusan Farmasi Institut Teknologi Bandung 1992 - 1993 : Apoteker di Jurusan Farmasi Institut Teknologi Bandung 1995 - 1997 : Magister Program di Jurusan Farmasi Institut Teknologi Bandung 2000 - 2004 : Doktor Program di Institute Farmasi-Universitas Hamburg -German dan di Institute Kedokteran Forensik – Universitas Georg-August Goettingen - German Pengalaman Kerja: 1994 - 2005 : Staf Dosen Jurusan Kimia-FMIPA Universitas Udayana, pada Bidang Ilmu Kimia Forensik 1997 - 1999 : Kepala Laboratorium Kimia Forensik-Jurusan Kimia FMIPA Universitas Udayana 2000 – 2004 : Staf Peneliti di Laboratorium Toksikologi – Forensik - Institut Kedokteran Forensik -Universitas Georg-August, Gettingen, German 2005 – sekarang : Staf Dosen Jurusan Farmasi-FMIPA-Universitas Udayana 2005 – sekarang : Ketua Pelakasana Harian Lembaga Forensik Sains dan Kriminologi Universitas Udayana 2005 – sekarang : Staf peneliti Bidang Toksikologi Forensik, Bidang-Kajian Ilmu Toksikologi Forensik – Lembaga Forensik Sains dan Kriminologi Universitas Udayana 2008 – sekarang : Ketua Jurusan Farmasi – FMIPA-Universitas Udayana Presentasion: 1. Die Entwicklung der Drogenproblematik in Indonesien und Deutschland am Beispiel der BTM-Befunde der forensischen Institute in Denpasar und Göttingen. “Möglichkeiten und Grenzen der Befundinterpretation“, Poster presentation 80th International Conference of German Legal Medicine Society in Interlaken, Switzerland, 2001 2. Möglichkeiten und Grenzen der rechnerischen Simulation der Pharmakokinetik des Heroins im menschlichen Körper“, Oral Presentation in 81th International Conference of German Legal Medicine Society in Rostock, Germany, 2002 3. “Rechnerische Simulation der Pharmakokinetik der Opiate im menschlichen Körper zur Unterscheidung einer Codeinaufnahme von einem Straßenheroinkonsum” Oral Presentation in 82th International Conference of German Legal Medicine Society in Münster, Germany, 2003 4. Aplikasi spektrosfotometri IR dalam analisis Toksikologi
73
5. “Rekonstruktion der individuellen Pharmakokinetik des Morphins, Codeins, und deren Glucuronide nach Strassenheroinkonsum”, Oral Presentation in 83th International Conference of German Legal Medicine Society in Göttingen, Germany, 2004 6. “Study of the morphine’s and codeine’s pharmacokinetics after illicit heroin consumption”, Poster presentation in 3rd Indonesian Biotechnology Conference, 2004 7. Clinical toxicological analysis: New Challenge for Indonesian pharmacist, oral presenter by Regional Conference of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Bandung, Indonesia, 15 - 16 Sep. 2005 8. Pharmacokinetic simulation of the time course of the ratio morphine glucuronides to morphine after i.v. administration of heroin, oral presenter, by the 14th Congers of Indonesian Pharmacists Association, Kuta, Indonesia, Juni 16-19th, 2005 9. “Hambatan-hambatan dalam penegakan hukum (undang-undang no 22 th 1997 tentang narkotika ) bagi penyalahgunaan golongan opiat berdasarkan sifat-sifat farmakokinetiknya” , oral presentation, by Kongres ilmiah XIV Ikatan Sarjana Farmasi Indonesia, Kuta, 16-19 Juni 2005 2004 10. Analitical Forensic toxicology and Interpretation of analytical Result, Oral Presenter, at National Workshop on Forensic Toxicology, BPOM, Jakarta December, 17-18th, 2005 11. Drugs profiling as tool for identify the origin of drugs, Oral Presenter, on Second National Workshop on forensic Toxicology, BPOM, Jakarta, May, 22-24th, 2007 12. Pemanfaatan TLC dalam Drugs Screening Tinjauan keungguan dan kelemahan dibandingkan dengan teknik immonoassay, Oral Presenter, on Second National Workshop on forensic Toxicology, BPOM, Jakarta, May, 22-24th, 2007 13. Aspek-aspek teknis yang perlu diperhatikan dalam pemeriksaan skringing dan konfirmasi NAPZA dalam rangka peningkatan mutu pemeriksaan NAPZA, dalam Rapat Konsultasi Pemantapan Mutu Eksternal Laboratorium Kesehatan 2008 di Denpasar oleh Direktorat Jendral Bina Pelayanan Penunjang Medik, Denpasar, July, 31st – August, 2nd, 2008 14. Pemaknaan Hasil Analisis Laboratorium Pemeriksaan Narkoba Dalam Rangka Proses Penegakan Hukum, Lokakarya Peran Laboratorium Pemeriksaan Narkoba dalam Proses Penegakan Hukum, BNN, Jakarta, 24-25 Mei 2008 15. Dasar-dasar kromatografi lapis tipis dan pemilihan eluen dalam uji skrining dan Konfirmasi, Pelatihan Peningkatan Kemampuan Teknis Pemeriksaan NAPZA di Surabaya, oleh oleh Direktorat Jendral Bina Pelayanan Penunjang Medik, Denpasar, August, 25-29th, 2008 Publication 1. Wirasuta, I M.A.G., (2004) “Untersuchung zur Metabolisierung und Ausscheidung von Heroin im menschlichen Körper. Einbeitrag zur Verbesserung der Opiatbefundinterpretation“, Cuvillier Verlag, Göttingen 2. Wirasuta, I M.A.G., (2005) “Peran Toksikologi forensik dalam penegakan hukum kesehatan di Indonesia” dalam Wirasuta, I M.A.G., et al. (Ed.) (2005), “Peran kedokteran forensik dalam penegakan hukum di Indonesia. Tantangan dan tuntuan di masa depan”, Penerbit Udayana, Denpasar 3. Wirasuta, I M.A.G. (2008), Analisis Toksikologi Forensik Dan Interpretasi Temuan Analisis, Indonesian Journal of Legal and Forensic Sciences 2008; 1(1):47-55 4. Wirasuta, I M.A.G. dan K Suardemana (2007), Analisis Toksikologi Klinik: Tantangan Baru Bagi Farmasis Indonesia Acta Pharmaceutica Indonesia, Vol 32, No: 2, 2007, 5962
Aplikasi spektrosfotometri IR dalam analisis Toksikologi
74
Research on going 1. Pemanfaatan Teknik High Performace Thin Layer Chromatography (HPTLC)Spektrofotodensitometri Untuk Analisis Kharakteristik Kimia „Drugs Profiling“ Narkoba, didanai oleh HIBAH UDAYANA 2008 2. Analisis Kharakteristik Kandungan Kannabinoida Daun Ganja Yang Tumbuh Di Indonesia, DANA DIPA UDAYANA 3. Analisis Opiat dalam Urin dan Darah dengan TLC/HPTLC-Densitometrik Jimbaran, Juli 2008 Hormat Penelitia
Dr.rer.nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si., Apotheker
Aplikasi spektrosfotometri IR dalam analisis Toksikologi
75
