ANALISIS POLIMORFISME GEN BOVINE GROWTH HORMONE (BGH) EXON III-IV PADA SAPI PERAH FRIESIAN HOLSTEIN DI BPTU BATURRADEN

Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2004

ANALISIS POLIMORFISME GEN BOVINE GROWTH HORMONE (BGH) EXON III-IV PADA SAPI PERAH FRIESIAN HOLSTEIN DI BPTU BATURRADEN (Polymorphisms Analysis of Bovine Growth Hormone (bGH) Gene Exon IIIIV in BPTU Baturraden Holstein-Friesian Dairy Cattle) N. RAHMANI1, MULADNO2 dan CECE SUMANTRI2 1

Puslit Bioteknologi LIPI Cibinong, Jl. Raya Bogor Km. 46 Cibinong, 16911 2 Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor

ABSTRACT The gene and genotypic frequencies of bovine growth hormone loci in BPTU were investigated using PCR-RFLP analyses. Genomic DNA samples were obtained from 256 BPTU Baturraden Holstein-Friesian cows. Four fragment, denoted, A, B, C, D, of 437; 408.29; 299, 138 and 299, 109, 29 bp were respectively found in bGH gene. The frequencies of A, B, C and D alleles for bGH locus were 21.19, 8.94, 3.97, and 65.89% respectively. If the DNA polymorphisms of these candidate genes are associated with economically important traits, they could serve as genetic markers for genetic improvement in future marker-assisted selection programs in BPTU Baturraden Holstein-Friesian cows. Key words: Bovine growth hormone gene, PCR-RFLP, gene frequency, BPTU Baturraden Holstein-Friesian Cows ABSTRAK Frekuensi gen dan genotipe lokus bovine growth hormone (bGH) di BPTU dianalisa dengan menggunakan analisis PCR-RFLP. Sampel DNA diperoleh dari 256 sapi Friesian Holstein di BPTU Baturraden. Ada empat fragment berturut-turut A, B, C, D dengan panjang basa masing-masing 437; 408, 29; 299, 109, 29 bp ditemukan pada gen bGH. Frekuensi masing-masing alel A, B, C dan D berturut-turut adalah 21,19; 8,94; 3,97 dan 65,89%. Jika keragaman polimorfisme dari gen bGH berhubungan dengan sifat-sifat ekonomis penting, maka gen-gen tersebut dapat berfungsi sebagai marker genetik untuk memperbaiki program marker-assisted selection (MAS) pada sapi perah di BPTU Baturraden. Kata kunci: Gen bovine growth hormone, PCR-RFLP, frekuensi gen, sapi FH BPTU Baturraden

PENDAHULUAN Balai Pembibitan Ternak Unggul (BPTU) Sapi Perah Baturraden merupakan salah satu unit pelaksana teknis pemerintah yang mempunyai tugas dan fungsi pokok sebagai pusat pengembangan sapi perah nasional. Pengambilan keputusan dalam kebijakan pemuliaan ternak sapi perah didasarkan pada pencatatan performans individu sapi perah yang dilakukan secara teratur dan berkesinambungan yang meliputi produksi susu dan kualiatas susu, reproduksi, kesehatan ternak dll. Dengan sistem pencatatan ini dapat diketahui produktivitas setiap ekor sapi perah

yang ada kaitannya dengan keefisienan produksi, untuk kepentingan seleksi dalam meramalkan produksi susu yang akan datang, pemuliaan ternak dan perencanaan usaha. Seleksi yang dilakukan secara konvensional untuk sifat produksi susu tersebut masih berjalan lambat dan kurang akurat. Pencapaian perbaikan mutu genetik melalui seleksi tersebut perlu diakselerasi dan ditingkatkan dengan dukungan teknik genetika molekuler melalui pemanfaatan penciri genetik (Marker Assisted Selection) yang diprediksi mempunyai fungsi sebagai gen pengontrol untuk sifat produksi susu. Produksi susu sapi perah merupakan sifat yang dikendalikan oleh

183


banyak gen (kuantitatif), sehingga ekspresinya merupakan akumulasi dari pengaruh genetik, lingkungan dan interaksi keduanya. Dalam program pemuliaan, penggunaan data marker dan data fenotipe dapat menyediakan informasi lebih banyak dibandingkan hanya data fenotipe saja. Penggunaan informasi marker genetik diharapkan dapat mempercepat peningkatan program genetik melalui peningkatan akurasi seleksi, penurunan interval generasi dan peningkatan diferensial seleksi (SOLLER dan BECKMANN, 1983; KASHI et al., 1990; MEUWISSEN dan VAN ARENDONK, 1992). Dengan perkembangan teknik genetika molekuler, telah dihasilkan marker genetik kelas baru berdasarkan keragaman pada level sekuen DNA (CHUNG et al., 1998). Untuk Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLPs) misalnya, dapat menyediakan beberapa harapan baru untuk aplikasi praktis untuk perbaikan mutu genetik ternak (SOLLER dan BECKMANN, 1983). Jika satu atau beberapa marker RFLP tersebut menunjukkan korelasi dengan Quantitative Trait Loci (QTL) atau Economic Trait Loci (ETL), hal tersebut dapat digunakan untuk kriteria seleksi. Proses seleksi ini dikenal sebagai Marker-Assisted Selection (MAS) atau Genotype-Assisted Selection (GAS) (CHUNG et al., 1998). Implementasi dari pendekatan ini akan memerlukan identifikasi marker gen-gen kandidat atau anonymous gene yang berhubungan dengan sifat-sifat ekonomis penting. Gen-gen penyandi protein susu dan hormon pertumbuhan merupakan kandidat utama marker DNA untuk analisis pautan dengan QTL karena signifikan biologisnya pada sifat-sifat kuantitatif yang menarik (MOODY et al., 1996). Yang lebih menarik lagi, keragaman alelik dalam sekuen struktural atau regulator dari gen-gen kandidat tersebut mempunyai kemungkinan berpengaruh langsung atau tidak langsung pada produksi susu dan performan pertumbuhan (FALAKI et al., 1996). Telah diketahui dengan baik bahwa bovine Growth Hormone (bGH) mempunyai peranan utama dalam pertumbuhan, laktasi dan perkembangan kelenjar mammae sapi. Beberapa peneliti juga telah melaporkan hubungan antara marker RFLP bGH dan sifatsifat produksi susu pada sapi perah (HOJ et al., 1993; LUCY et al., 1991; FALAKI et al., 1996; LEE et al., 1996).

184

Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji kemungkinan digunakannya gen bGH exon IIIIV sebagai penciri dalam program MAS, yaitu melalui (1) Analisis polimorfisme DNA pada gen bovine Growth Hormone (bGH) exon IIIIV dengan menggunakan metode PCR-RFLP (2) Menentukan frekuensi gen dan frekuensi genotipe lokus tersebut pada sapi perah Friesian Holstein di BPTU Baturraden. Hipotesis yang mendasari penelitian ini adalah adanya polimorfisme DNA pada gen bovine Growth Hormone (bGH) exon III-IV. Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah dapat digunakan sebagai bahan pertimbangan dalam merancang program perbaikan mutu genetik sapi perah melalui seleksi. MATERI DAN METODE Tempat dan waktu penelitian Pengambilan sampel darah dilakukan pada bulan Juni 2002 dan analisis dilakukan di Laboratorium Zoologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan (FMIPA) IPB, mulai bulan Juni - Desember 2002. Bahan dan peralatan Hewan percobaan yang digunakan adalah 256 ekor sapi perah betina FH yang sudah berproduksi dan dara di BPTU Baturraden. Bahan yang digunakan adalah bahan kimia untuk pengambilan sampel darah, ekstraksi DNA, amplifikasi DNA melalui PCR, elektroforesis, silver staining, alkohol 70%, 1XTBE, marker, loading buffer. Alat yang digunakan yaitu alat suntikan, vaccutainer, eppendorf (1,5ml, 0,6ml, 0,2ml), tabung polipropilen/falcon 15ml, mesin PCR, elektroforesis, autoclave, vacum tainer, oven, kaca pencetak gel, pipet mikro, nampan pewarna, gelas piala, pipet mohr, pipet pasteur, magnetic stirer, gunting. Metode Sampel yang akan digunakan sebagai sumber DNA berasal dari darah yang diambil dari vena jugularis. Isolasi DNA dilakukan menurut SAMBROOK et al. (1989) yang telah


dimodifikasi. Tahap awal sebelum isolasi yaitu dilakukan pemisahan sel darah putih (buffy coat) dari whole blood. Isolasi DNA dimulai dari buffy coat ini, meliputi tiga tahap yaitu pelisisan sel, pemisahan DNA dari bahan organik lainnya dan pemurnian DNA. Tahap pelisisan sel secara sentrifugasi dan penambahan proteinase-K. Pemisahan DNA dari bahan organik lainnya dilakukan dengan metode fenol-kloroform-isoamilalkohol. Untuk mengamati kualitas DNA digunakan alat elektroforesis gel agarose. Pita hasil elektroforesis kemudian dipotret dengan foto Polaroid 667. Exon III- Exon IV pada gen bGH diamplifikasi dengan primer forward (F) dengan runutan DNA: 5’ GGT TGC CTT CTG CTT CTC TG 3’ dan reserve (R) dengan runutan DNA: 5’ CCT TCC TCC AGG TCC TTC AG 3’. Sekuen gen bGH yang diamplifikasi oleh primer dapat dilihat pada Gambar 1. Sebelum amplifikasi, DNA didenaturasi pada suhu 95oC selama 6 menit. Selanjutnya, siklus amplifikasi dimulai dengan denaturasi pada suhu 94oC selama 1 menit, penempelan primer/annealing pada suhu 55oC selama 30 detik dan proses sintesis DNA/ ekstensi pada suhu 72oC selama 30 detik. Amplifikasi dilakukan sebanyak 30 siklus. Pendeteksian polimorfisme dilakukan dengan memotong produk PCR dengan enzim restriksi Msp 1. Produk PCR yang telah dipotong dengan enzim restriksi dipisahpisahkan secara elektroforesis pada gel poliakrilamida (PAGE) 5%. Visualisasi fragmen DNA menggunakan teknik pewarnaan perak/silver staining. Pola pita hasil elektroforesis gel poliakrilamida dipelajari untuk menentukan 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801

gacagagata ctccatccag cccccacggg caagaatgag gcaggggacc tccttcatcc cttctccccg aggtggcgga ggcaggaggt cctcgggcag ccgaccaccc acctgccagc gtcgtggctt gggcccctgc cacctcggac cgtgtctatg

aacacccagg gcccagcaga taagtaggct ggttgttgga aggccgacct aggacttgga agttcctcag agaagctgaa

tipe alel yang muncul pada kedua lokus yang diamati. Frekuensi alel ditentukan dengan metode perhitungan yang dikemukakan oleh NEI (1987). HASIL DAN PEMBAHASAN Analisis polimorfisme gen bovine Growth Hormone (bGH) dilakukan dengan menggunakan metode PCR-RFLP. Pola fragmen restriksi dapat dilihat pada Gambar 2. Produk DNA yang teramplifikasi didigesti dengan enzim Msp I. Terdapat empat tipe alel yaitu A, B, C dan D dengan lima genotipe yaitu AA, AD, BD, CD dan DD. Dari 256 sampel yang diamplifikasi, hanya 151 sampel yang berhasil teramplifikasi. Jumlah masingmasing individu untuk genotipe AA, AD, BD, CD dan DD secara berturut-turut adalah 8, 48, 27, 12 dan 56 ekor. Frekuensi alel A, B, C dan D secara berturut-turut masing-masing adalah 21,19; 8,94; 3,97 dan 65,89%. Alel A terdiri atas satu fragmen yaitu 437 bp; alel B terdiri atas dua fragmen 408 bp dan 29 bp; alel C terdiri atas dua fragmen yaitu 299 dan 138 bp dan Alel D terdiri atas tiga fragmen yaitu 299 bp, 109 bp dan 29 bp. Data frekuensi alel dan frekuensi genotipe dapat dilihat pada Tabel 1. Data tipe alel pada masing-masing individu dapat dilihat pada Tabel 2. Dari data tipe alel, frekuensi alel maupun frekuensi genotipe yang diperoleh dari penelitian ini berbeda dengan hasil-hasil penelitian sebelumnya yang telah dilakukan di luar negeri (Tabel 3.). Ada beberapa faktor yang menyebabkan, diantaranya bangsa sapi yang dianalisa (apakah tipe perah atau pedaging), daerah/lokasi/negara tempat sapi

ttgccttctg cttctctgaa aatcagtgag tggcaacctc gccccagctc ccgcac↓cggc tggcagtgga ggatgatggt tgcagggctg ccccagaccc gctgcttcgc atctcactgc cagagtcttc accaacagct ggacctggag gaaggcatcc

accatcc↓cgg ggaccgagga ctggggcggc gggcggtggt gcggcaccca tcctcatcca tggtgtttgg tggccctgat

Gambar 1. Urutan Nukleotida Gen bGH yang Diamplifikasi oleh Primer. Nukleotida yang diberi garis bawah adalah sekuen tempat penempelan primer, tanda ↓ menunjukkan letak situs Digesti Enzim Msp I (GORDON et al., 1983)

185


Gambar 2. Pola pita hasil analisa PCR-RFLP. Produk PCR dari Exon III-Exon IV Gen bovine Growth Hormone (bGH) yang diikuti dengan Digesti Enzim Msp I dalam 5% Gel Poliakrilamida. Lane 1 adalah ladder 100 pb; lane 1 dan 12 adalah produk PCR; lane 2 dan 3 adalah genotipe AA; lane 4 dan 5 adalah genotipe AD; lane 6 dan 7 adalah genotipe CD lane 8 dan 9 adalah genotipe BD dan lane 10 dan 11 adalah genotipe DD Tabel 1. Frekuensi alel dan genotipe gen Bovine Growth Hormone pada sapi perah di BPTU Baturraden Tipe alel A B C D Jumlah

Frekuensi alel (%) 21,19 8,94 3,97 65,89 100

dianalisa, jumlah sampel yang dianalisa, jenis kelamin sapi yang dianalisa (jantan atau betina), bagian gen bGH yang dianalisa (exon, intron, daerah 3’, daerah 5’ dsb.), metode yang digunakan (RFLP, RAPD, SSCP dsb), dengan metode RFLP khususnya juga dipengaruhi oleh jenis enzim yang digunakan (Msp I, Alu I, Pst I, Taq I, Ava II, Eco 01091, Hae III, dsb). Empat tipe alel yang ditemukan pada gen bGH exon III – exon IV ini menunjukkan adanya kesesuaian sekuen daerah/terkait dengan sekuen yang dilaporkan oleh GORDON et al. (1983), dimana pada exon III – exon IV ini terdapat dua situs enzim Msp I. Situs Msp I pertama terletak pada basa ke-29 (exon III) dan situs ke-2 pada basa ke-138 (intron 3) dari sekuen yang diamplifikasi oleh primer, sedangkan kalau dari sekuen gen bGH sendiri

186

Tipe genotipe AA AD BD CD DD

Frekuensi genotipe (%) 5.29 31.79 17.88 7.95 37.09 100

letak situs pertama dan kedua Msp I adalah pada basa ke-1438 (exon III) dan ke-1546 (intron 3). Jika kedua situs Msp I tidak terpotong oleh enzim Msp I maka akan diperoleh satu fragmen dengan panjang basa sama dengan produk PCR-nya yaitu 437 pb (alel A). Seandainya pada situs pertama yang terpotong oleh enzim Msp I maka akan terdapat dua fragmen masing-masing 29 bp dan 409 pb (alel B). Jika situs kedua yang terpotong maka akan diperoleh dua fragmen juga yaitu 138 dan 299 pb (alel C). Seandainya dua situs terpotong semuanya maka akan ditemukan tiga fragmen masing-masing adalah 29, 109, 299 bp (alel D). Alel A, B dan D ditemukan pada exon III sampai exon IV, Alel C ditemukan pada intron 3 dan exon IV.


Tabel 2. Tipe Alel Gen bovine Growth Hormone di BPTU Baturraden INDIV 43-88 44-88 97-89 173-89A 267-90 279-90 280-90 284-90A 286-90CTH 300-90P 304-90P 315-91 349-91A 367-91N 388-91 416-91 426-92 432 436-92 444-92 450-92 451-92 456-92 458-92 465-92 480-93 483-93 486-93 499-93 513-93 514-93

TA DD DD DD DD DD DD DD DD AD DD AD DD AD AD AD CD DD BD DD DD CD BD DD CD BD BD BD BD BD DD BD

INDIV 515-93 522-93 539-93 553-93 554-93 571-94 572-94 580-94 586-94 588-94 589-94 591-94 597-94 603-94 605-94 608-94 610-94 617-94 621-94 625-94 627-94 628-94 629-94 639-94 646-94 666-95 667-95 675-95 676-95 679-95 681-95

TA BD BD BD DD BD BD DD AD DD AD AD BD BD DD BD CD CD BD DD DD CD DD BD DD DD AD DD AD AD CD DD

INDIV 685-95 688-95 689-95 696-95 698-95 710-95 712-95 713-95 716-95 749-96 770-96 781-96 801-97 810-97B 836-97 842-97 844-97 848-97 853-97 867-97 870-97 874-97 880-97 882-97 886-97 893-98 894-97D 897-98 904-98 906-98B 910-98

TA DD DD AD DD AD CD DD AD AD AD AA AD AD AD AD DD AD AD AD AD AA AD AD AD BD DD AA DD BD AD BD

INDIV 914-98 917-98 922-98 928-98 929-98 931-98 941-98 942-98 947-98 955-98 959-98 960-98 963-98 964-98 966-98 969-98 970-98 977-98 979-98 980-98 1301-00 A06-99 A07-99 A08-99 A09-99 A10-99 A11-99 A13-99 A16-99 A20-99 A29-99

TA AA BD BD AD DD BD AD CD DD BD AD AD AD AD AA AA AD AD DD AD AA AD DD AD DD AA DD AD DD AD AD

INDIV A31-99 A33-99 A35-99 A38-99 A50-99 A61-99 A69-99 A80-99 A84-99 A89-99 B01-00 B28-00 B33-00 B48-00 B52-00 B53-00 B54-00 B55-00 B72-00 B74-00 B77-00 B80-00 B84-00 B88-00 B89-00 B92-00 B97-00

TA DD DD DD CD BD AD BD DD DD DD DD DD DD CD DD CD DD AD AD AD AD DD AD DD DD DD DD

187


Tabel 3. Hasil penelitian analisa polimorfisme pada Gen bovine Growth Hormone (bGH) pada beberapa bangsa sapi di dunia Daerah yang dianalisis

Metode

Lokus bGH

RFLPs

Lokus bGH

Lokus bGH

Bangsa dan jumlah sapi (ekor)

Hasil

Peneliti

FH, Pedaging (Baladix HerefordxSimmentalx Charolais)

RFLPs bGH : konsekuensi dari I/D pada daerah downstream gen struktural, Dua Hind III-RFLPs bGH : serangkaian mutasi titik

HALLERMAN et al. (1987)

RFLP-Taq I Shouthern blot

FH : 3 Angus : 37 Brahmann : 15 Hereford : 13 Jersey : 8

- Brahman = B :33; C : 17; D : 3 % - Holstein = A : 88; B : 12% - Angus = A : 1ekor - Hereford = A : 96; C : 5; D : 1,5% - Jersey = A : 63; B : 37%

THEILMANN et al. (1989)

Southern Hibridisasi dengan probe: cDNA bGH

Pejantan Holstein :14

- Alel C : 700 bp, D : 459 bp alel A,B tidak ada

COWAN et al. (1989)

Exon V

-

FH

- Betina Holstein = 8%, - Polimorfis exon V pada 2141 (valin – leusin)

LUCY et al. (1991)

Lokus bGH

PCR-RFLP (Alu I)

Japanese Black, Aberden Angus, FH, Hereford : 61

Alel B = Japanese Black : 56, Aberden Angus : 41, Holstein : 22 Hereford : 20 %

KOICHI et al. (1991)

Gen bGH

PCR-RFLP (Alu I)

Sapi Japanese

- Polimorfisme : kodon 127 gen bGH - Situs Alu I pada alel A

CHIKUNI et al. (1991)

- I/D : 0,9 – 1,0 Kbp pada daerah 3’ - Dua situs polimorifs Msp I pada intron 3

RFLP (Alu I)

-

Mutasi : substitusi C-G pada 2141 aa leusin (CTG) menjadi valin (GTC) pada posisi 127

ZHANG et al. (1992)

Lokus bGH

-

-

Dua bentuk bGH recombinant aa valin menjadi leusin pada posisi 127

EPPARD et al. (1992)

Intron 2 daerah 3’ : 177pb Exon III : 117 pb Intron 3 : 227 pb Exon IV : 162 pb Intron 4 daerah 5’ : 208 pb Total : 891 bp

PCR-RFLP (Msp I)

Pejantan FH : 35,

- Alel C : 526, 193, 109, 63 bp - Alel D : 635, 193, 63 bp (FH : 26%) - Hereford : semua alel C homozigot - Situs polimorfisme : intron 3/1547 - 102 ekor : Ava II, Alu I, Eco 01091, Pst I : tdk ada polimorfisme

ZHANG et al. (1993a)

Exon V, daerah 5’ gen bGH

188

Hereford : 30


Tabel 3. Hasil penelitian analisa polimorfisme pada Gen bovine Growth Hormone (bGH) pada beberapa bangsa sapi di dunia (lanjutan) Metode


PCR-RFLP (Alu I)sequencing

Pejantan delapan bangsa U.S(443) : Holstein (266), Limousin (23), Angus(47), Simmental(22), Hereford(46), Gelbvieh(22),Charolais(7), Wagyu(10)

- Alel B = Holstein : 9%, Limousin : 24%, Angus : 26%, Simmental : 27%, Hereford : 35%, Gelbvieh : 39%, Charolais : 43%, Wagyu : 1/heterozigot

SP Red Danish : 58,

- I/D ± 0,9 Kbp pada daerah 3’ gen bGH,

Norwegian Red : 32

- situs polimorfis Msp I (+/-) intron 3(daerah 5’ + 830

Daerah yang dianalisis Lokus bGH

Daerah 3’ gen bGH,

PCR-RFLP(Msp I)

intron 3

Hasil

Peneliti ZHANG et al. (1993b)

- alel A : leusin pada posisi 127, - alel B : valin pada posisi 127 - Pedaging (29%) 3X >>>>

Holstein (9%) HOJ et al. (1993)

bp), - haplotipe I (Msp I +)/ D (Msp I -) - Alel D Msp I (-) : 28, 5% (Red Danish), 9, 0% (Norwegian Red) Lokus bGH

-

FH

Alel A : 93,0 %

LUCY et al. (1993)

Lokus bGH

GH-Taq I RFLPs

Sapi pejantan : - Holstein : 269 - Italia : 48, - Hungarian Simmental : 45 - Normande : 30 Double muscle Belgian White Blue (pejantan : 41 induk : 13)

- A : 6, B : 5,2 C : 4,4 D : 4,2 Kbp

SNEYERS et al. (1994)

Pejantan delapan bangsa : 184

- E = 268, 102, 71 = 441 bp

Exon V, daerah flangking 5’ (2637)

PCR-RFLP III)

(Hae

- Normande : AB (53%) >< (7-24%) - Double muscle Belgian White Blue : AA berat lahir (7 & 13 bulan) >>> AB

- EE= 89,

FF= 3%,

EF= 8%

UNANIAN et al. (1994)

- F = 268, 102, 71, 50 pb - Situs polimorfis pada daerah 3’ = 2637

189


Tabel 3. Hasil penelitian analisa polimorfisme pada Gen bovine Growth Hormone (bGH) pada beberapa bangsa sapi di dunia (lanjutan) Daerah yang dianalisis Exon V

Exon V


Metode -

RFLP- Alu I

Pejantan Bavarian

Simmental

-

Hasil - A/L = 68%

B/V = 32%

- Hererozigot berhubungan dengan berat karkas dan kualitas daging - Alel B/V = German Black & White : 20%, Bavarian & Tyrolean Brown : 10%, Simmental : 29%

Peneliti SCHLEE et al. (1994a) SCHLEE et al. (1994b)

Polimorfisme Alu I (+/-) : LL berhubungan dengan [sirkulasi GH] >>>> LV Gen bGH

ASO-Hybridization (allele-specific oligonucleotida)

Lokus bGH

Exon I (basa ke-7) – exon V(basa ke-21)

RFLP-Shouthern blot (Taq I, Msp I)

Sapi Japanese

Polimorfisme : pergantian posisi Thr oleh Met pada posisi 172


Sapi Korean Native (Hanwoo) pejantan : 18 & progeni saudara tiri sebapak : 139

Alel A : 75,0%

HAN et al. (1996)

Pejantan FH Itali : 91

- Taq I : Alel A (6,2 Kb) : 85,2 %; B (5,2Kb) : 14,8%; AA : 70,3, AB : 29,7%

FALAKI et al. (1996)

- Msp I : A (7Kb), B (5Kb), C (700pb), D (300 pb); GH-Msp I = ABCD : 34,1%, BCD : 65,9% Lokus bGH

PCR-SSCP

FH Israel

14 haplotipe gen bGH

LAGZIEL et al. (1996)

Gen bGH (2,7Kb)

SSCP

FH

Polimorfisme ada 4 fragment : GH1, GH4 (mutasi intron 3:1547, 1692), GH5, GH6(mutasi exon V : 2141, 2291)

Yao et al., 1996a

Lokus bGH

-

FH Korea

Alel A : 74,2; B : 25,8 %

CHUNG et al. (1996)

Lokus bGH

-

FH

Alel A : 86,3 %

LEE et al. (1996)

Lokus bGH

RFLP- Taq I

Simmental Italia = induk : 279 , pejantan : 148

Alel A : 6,2 Kbp ; NP PS BB >> AA

FALAKI et al. (1997)

190

B : 5,2 Kbp; NP PProt BB >> AA, AB


Tabel 3. Hasil penelitian analisa polimorfisme pada Gen bovine Growth Hormone (bGH) pada beberapa bangsa sapi di dunia (lanjutan) Daerah yang dianalisis

Metode


Hasil

Peneliti

Intron 4, exon V

-

Ayrshire, Jersey, FH

Alel V = Pejantan Ayrshire : 29%, Pejantan Jersey : 24%, FH : 9%

SABOUR et al. (1997)

Gen bGH

ASM-PCR (allelespecific, multiplex PCR)

Sapi Japanese : 37

Alel A : 347, B : 483, C : 656 bp


Intron IV, V

PCR-RFLP (Alu I)

Sapi Korea

Alel A = 171, 52 bp; Alel B = 223 bp

CHUNG et al. (1998)

Induk : A (76,9),B (23,1),AA(55,8),AB(42,1) dan BB(2,1) Jantan : A (78,4), B (21,6), AA(60), AB(36,7) dan BB(3,3) Lokus bGH

RFLP- Alu I

Pejantan Slovak Simmental

Lokus bGH

PCR-RFLP

FH Polish : 214

Exon V, Intron C,

PCR-RFLP

pejantan FH : 553

- Pejantan Slovak Simmental = 44% - Berat badan VV <<< LL, LV

daerah 3’ gen bGH

CHRENEK et al. (1998)

Alel Leu : 69%; Val : 31%

GROCHOWSKA et al. (1999)

- Exon V (GH427) : A : 91,4; B : 8,6%

VUKASINOVIC et al. (1999)

- Intron C (GH 891) : C : 90,5; D : 9,5% - Daerah 3’ gen bGH : E = 84,0; F = 16,0%

Lokus bGH

SSCP-Msp I

FH Israel : 523

Heterozigot (+/-) Msp I : 246, Homozigot (+/+) Msp I : 277

LAGZIEL et al. (1999)

Lima haplotipe : A, B, C, D, E Lokus bGH

PCR-SSCP

Sapi Korea (Hanwoo) : 200 ( NP t : 110,NP r : 90)

AA : 13, 10%; AB : 23, 20%; AC : 19, 12%, BB : 25, 35%, BC : 15, 20%; CC : 6,2%

CHUNG et al. (2000)

Lokus bGH

PCR-RFLP (Alu I) sequensing

Pejantan delapan bangsa indigenous Portugis : 195

- L/A : 75,9%; V/B : 24,1%

REIS et al. (2001)

- VV : 211 pb (8,2%) LL : 159, 52 pb (60%) - LV : 211, 159, 52 pb (31,8%) - MA = VV : 37,5 %, V : 60,4%

191


Panjang daerah exon III, intron 3 dan exon IV yang dianalisa pada gen bGH masingmasing adalah 117, 227, 162 bp. Hal ini sama dengan studi yang dilakukan oleh Zhang et al. (1993a), dimana selain ketiga daerah tersebut juga menganalisa pada daerah intron 2 daerah 3’ dan exon IV daerah 5’. Berdasarkan hasil penelitian ini dapat diketahui bahwa terdapat dua situs polimorfis pada gen bGH exon III-exon IV yaitu satu situs terletak pada exon III pada basa 1438 dan satu situs lainnya terletak pada intron 3 pada basa ke 1546. Adanya polimorfisme gen bGH pada intron 3 di BPTU Baturraden ini mengkorfirmasi keberadaan situs polimorfis pada intron 3 dari hasil penelitian sebelumnya oleh HOJ et al. (1993); COWAN et al. (1989), ZHANG et al. (1993a); YAO et al. (1996a) serta VUKASINOVIC et al. (1999). Tetapi ada sedikit perbedaan dengan hasil penelitian tersebut yaitu posisi basa yang mengalami mutasi pada situs polimorfis tersebut berbeda. Misalnya, COWAN et al. (1989) yang menganalisa dengan menggunakan hibridisasi shouthern dengan probe dari cDNA bGH menyatakan bahwa situs polimorfis Msp I pada intron 3 dari 14 pejantan FH yang dianalisa ada dua situs. Mengenai posisi polimorfismenya agak sedikit beda dengan hasil penelitian YAO et al. (1996a) dan ZHANG et al. (1993a), dimana keduanya menemukan letak situs polimorfis yang sama pada intron 3 yaitu pada posisi 1547, berbeda satu basa (pada penelitian ini pada posisi 1546) walaupun keduanya menggunakan metode yang berbeda. Metode yang digunakan oleh ZHANG et al. (1993a) adalah PCR-RFLP (Msp I) pada bangsa sapi FH dan Hereford, sedangkan Yao et al.(1996a) menggunakan metode SSCP pada bangsa sapi FH. COWAN et al. (1989) menyatakan bahwa situs polimorfis pada intron 3 terletak pada daerah 5’ intron 3 + 830 bp, sedangkan HOJ et al. (1993) menyatakan bahwa tidak ditemukannya situs Msp I pada intron 3 sehingga menyebabkan terjadinya mutasi yaitu insersi basa T pada posisi + 837 (relatif terhadap start kodon translasi) dan perubahan basa C menjadi basa G pada posisi + 838. YAO et al. (1996a) memperkuat penelitian ini dengan menemukan adanya dua mutasi pada fragment keempat (GH4) pada intron 3 ini. Panjang fragment GH4 ini adalah 345 bp,

192

memiliki situs Msp I nonpolimofis yang terletak pada posisi 1438-1439. Jika fragment GH4 ini dipotong dengan Msp I maka akan diperoleh dua fragment masing-masing adalah 59 dan 286 bp. Fragment 286 bp selanjutnya dipotong lagi dengan Msp I akan menghasilkan fragment 109 dan 177 bp ketika ada situs Msp I-nya. Mutasi pada fragment GH4 tersebut disebabkan oleh adanya transisi basa T-C pada posisi 1547 (GH4.1) dan pada posisi 1692 (GH4.2). Penelitian terakhir pada intron 3 ini dilakukan oleh VUKASINOVIC et al. (1999) dengan menggunakan metode yang sama (PCR-RFLP). Dari hasil penelitian ini ditemukan dua alel pada intron C/3 masingmasing adalah alel C = 90,5% dan alel D = 9,5% dengan produk PCR pada intron 3 ini adalah 891 bp. Tidak ada penjelasan panjang basa untuk masing-masing alel tersebut. Hasil penelitian ini sama dengan yang dilakukan oleh ZHANG et al. (1993a), yang juga menemukan dua alel masing-masing adalah alel C = 526, 193, 109, 63 bp dan alel D = 635, 193, 63. Frekuensi alel D dari 35 pejantan yang dianalisa adalah 26%. KESIMPULAN DAN SARAN Berdasarkan hasil analisis molekuler menunjukkan bahwa analisis polimorfisme gen bovine Growth Hormone (bGH) berhasil dengan baik pada 151 sampel dengan diidentifikasikannya empat tipe alel (A : 437 bp; B: 408, 29 bp; C : 299, 138 bp; D : 299, 109, 29 bp) dan lima tipe genotipe (AA, AD, BD, CD, DD). Frekuensi masing-masing alel secara berturut-turut adalah 21,19; 8,94; 3,97; 65,89%, sedangkan frekuensi masing-masing genotipe adalah 5,29; 31,79; 17,88; 7,95; 37,09%. DAFTAR PUSTAKA CHIKUNI, K., FURNINORI TERODA, SOICHI KAGEYANA, TSUNEKICHI KOISHIKAWA, SADAOKATO and KYOUHEI OZUTSUMI. 1991. Identification of DNA sequence variants for amino acid residue 127 of bovine growth hormone using the polymerase chain reaction method. Anim. Sci. Technol. 62(7): 660-666.


CHIKUNI, K., T. NAGATSUMA and T. TABATA. 1994. Genetic variants of the growth hormone gene in Japanese cattle. Anim. Sci. Technol. 65: 230-232.

KASHI, Y., E. HALLERMAN and M. SOLLER. 1990. Marker-assisted selection of candidate bulls for progeny testing programmes. Anim. Prod. 51: 63.

CHUNG, E.R., W.T. KIM and C.S. LEE. 1998. DNA polymorphisms of κ–casein, lactoglobulin, growth hormone and prolactin genes in Korean Cattle. J.Dairy Sci. 11(4): 422-427.

LAGZIEL, A.E. LIPKIN and SOLLER. 1996. Association between SSCP haplotypes at the bovine growth hormone gene and milk protein percentage. Genetics 142: 945-951.

COWAN, C.M., M.R. DENTINE, R.L. AX and L.A. SCHULER. 1989. Restriction fragment length polymorphisms associated with growth hormone and prolactin genes in Holstein bulls: evidence for a novel growth hormone allele. Anim.Genet. 20:157.

LEE, B.K., G.F. LIN, B.A. CROOKER, M.P. MURTAUGH, L.B. HANSEN and H. CHESTERJONES. 1996. Association of somatotropin (BST) gene polymorphism at the 5th exon with selection for milk yield in Holstein cows. Domest. Anim. Endocrinol. 13: 373-381.

EPPARD, P.J., L.A. BENTLE, B.N. VIOLAND, S. GANYULI, R.L. HINTZ, L. KUNG, JR., G.G. KRIVI and G.M. LANZA. 1992. Comparison of the galactopoetic response to pituitary-derived and recombinant-derived variants of bovine growth hormone. J. Endocrinol. 132: 47-56.

LUCY, M.C., S.D. HAUSER, P.J. EPPARD, G.G. KRIVI and R.J. COLLIER. 1991. Genetic polymorphism within the bovine somatotropin (bST) gene detected by polymerase chain reaction and endonuclease digestion. J. Dairy Sci. 74 (Suppl.1): 284.

FALAKI, M, N. GENGLER, M. SNEYERS, A. PRANDI, S. MASSART, A. FORMIGONI, A. BURNY, D. PORTETELLE and R. RENAVILLE. 1996. Relationships of polymorphisms for growth hormone and growth hormone receptor genes with milk production traits for Italian Holstein-Friesian Bulls. J. Dairy Sci. 79: 1446-1453.

LUCY, M.C., S.D. HAUSER, P.J. EPPARD, G.G. KRIVI, J.H. CLARK, D.E. BAUMAN and R.J. COLLIER. 1993. Variants of somatotropin allele in cattle: gene frequencies in major dairy breeds and associated milk production. Dom. Anim. Endocrinal. 10: 325-333.

GORDON, D.F., D.P. QUICK, C.R. ERWIN, J.E. DONELSON and R.A. MAURER. 1983. Nucleotide sequence of the bovine growth hormone chromosomal gene. http://www.ncbi.nlm.nih.gov//gen bank/index html/ [July 5, 2002]. HALLERMAN, E.M., A. NAVE, Y. KASHI, Z. HOLZER, M. SOLLER and J.S. BECKMANN. 1987. Restriction fragment length polymorphisms in dairy and beef cattle at the growth hormone and prolactin loci. Anim. Genet. 18(3): 213222.

MEUWISSEN, T.H.E. and J.A.M. VAN ARENDONK. 1992. Potential improvements in rate of genetic gain from marker-assisted selection in dairy cattle breeding schemes. J. Dairy Sci. 75: 1651. MOODY, D.E., D. POMP, S. NEWMAN and M.D. MACNEIL. 1996. Characterization of DNA polymorphisms in three populations of Hereford cattle and their associations with growth and maternal EPD in line 1 Herefords. J. Anim. Sci. 74: 1784-1793. NEI, M. 1987. Molecular Evolutionary genetics. Columbia University Press. New York. SAMBROOK, J., E.F. FRITSCH and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbour Lab. Press. New York.

HAN, J.Y., B.W. CHO, K.J. LEE, D.H. LEE and K.J. JEON. 1996. Detection of polymorphic DNA marker related to the traits of economic importance in Korean Native Cattle. Proc. Partnerships for Sustainable Livestock Production and Human Welfare. The 8th AAAP Animal Science Congress. Japanese Society of Zootechnical Science. Tokyo Japan. Vol 2.

SCHLEE, P., R. GRAML, E. SCHALLENBERGER, D. SCHAMS, O. ROTTMANN, A. OLBRICH-BLUDAU and F. PIRCHNER. 1994b. Growth hormone and insulin-like growth factor I concentrations in bulls of various growth hormone genotypes. Theor. Appl. Genet. 88: 497-500.

HOJ, S., M. FREDHOLM, N.J. LARSEN and V.H. NIELSON. 1993. Growth hormone gene polymorphism associated with selection for milk fat production in lines of cattle. Anim. Genet. 24: 91-96.

SCHLEE, P., R. GRAML, O. ROTTMANN and F. PIRCHNER. 1994a. Influence of growthhormone genotypes on breeding values of Simmental bulls. J. Anim. Breed. Genet. 111: 253-256.

193


SOLLER, M. and J.S. BECKMANN. 1983. Genetic polymorphisms in varietal identification and genetic improvement. Theor. Appl. Genet. 67: 25-33. STRANGE, R., F. LI, S. SAURER, A. BURKHARDT and R. R. FRIIS. 1992. Apoptotic cell death and tissue remodelling during mouse mammary gland involution. Development. 115: 49-58. THEILMANN, J.L., L.C. SCOW, J.F. BAKER and J.E. WOMACK. 1989. Restriction fragment length polymorphisms for growth hormone, prolactin, osteonectin, α-crystallin, γcrystallin, fibronectin and 21-steroid hydroxylase in cattle. Anim. Genet. 20: 257. UNANIAN, M.M., S.K. DENISE, H.M. ZHANG and R.L. AX. 1994. Rapid communication: polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism in the Bovine growth hormone gene. J. Anim. Sci. 72: 2203. VUKASINOVIC, N. S.K., DENISE and A.E. FREEMAN. 1999. Association of growth hormone loci with yield traits in Holstein Bulls. J. Dairy Sci. 82: 788-794.

194

YAO, J. S.E. AGGREY, D. ZADWORNY, J.F. HAYES and U. KUHNLEIN. 1996. Sequence variations in the bovine growth hormone gene characterized by single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis and their association with milk production traits in Holsteins. Genetics. 144: 1809-1816. ZHANG, H.M., D.R. BROWN, S.K. DENISE and R.L. AX. 1992. Nucleotide sequence determination of a bovine somatotropin allele. Anim. Genet. 23: 578. ZHANG, H.M., D.R.BROWN, S.K. DENISE, and R.L. AX. 1993a. Rapid communication: polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis of the bovine Somatotropin gene. J. Anim. Sci. 71: 2276. ZHANG, H.M., K.C. MADDOCK, D.R. BROWN, S.K. DENISE and R.L. AX. 1993b. Bovine growth hormone gene frequencies in samples of US AI bulls. J. Anim. Sci. 71: 93.

ANALISIS POLIMORFISME GEN BOVINE GROWTH HORMONE (BGH) EXON III-IV PADA SAPI PERAH FRIESIAN HOLSTEIN DI BPTU BATURRADEN

Recommend Documents