ANALISIS PHYLOGENIC TREE DAN CONSENSUS SEQUENCE VIRUS NEWCASTLE DISEASE ISOLAT ASAL WILAYAH KERJA BALAI VETERINER LAMPUNG TAHUN

Prosiding Seminar Nasional Sains dan Inovasi Teknologi Pertanian

ANALISIS PHYLOGENIC TREE DAN CONSENSUS SEQUENCE VIRUS NEWCASTLE DISEASE ISOLAT ASAL WILAYAH KERJA BALAI VETERINER LAMPUNG TAHUN 2010-2013 Liza Angeliya Laboratorium Bioteknologi, Balai Veteriner Lampung ABSTRAK Penyakit Newcastle disease pada unggas disebabkan oleh virus ND yang tergolong dalam famili Paramyxoviridae, genus Avulavirus, spesies Avian paramyxovirus. Avian paramyxovirus Tipe I (APMV-I) adalah merupakan sinonim dari virus ND yang memiliki genotip bervariasi. Virus ND genotip VII dinyatakan sebagai penyebab kejadian penyakit ND di Asia sejak tahun 1980. Wabah ND tahun 2010 di indonesia pernah dilaporkan disebabkan oleh virus ND genotip VII. Penelitian ini bertujuan menentukan genotip virus ND asal Balai Veteriner Lampung tahun 2010-2013. Amplifikasi fragmen gen F menggunakan primer asal Balai Veteriner Lampung dan dilanjutkan sekuensing. Data hasil sekuensing dianalisis dengan software Mega5. Berdasarkan analisis phylogenic tree dan consensus sequence isolat asal Balai Veteriner Lampung tahun 2010-2013 termasuk dalam genotip VII subtipe a (VIIa) dan d (VIId). Kata kunci: analisis phylogenic tree, analisis consensus sequence, newcastle disease, Lampung

ABSTRACT PHYLOGENIC TREE AND CONSENSUS SEQUENCE ANALYSIS OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS ISOLATES IN DISEASE INVESTIGATION CENTER LAMPUNG WORKING AREA FROM 2010 TO 2013. Newcastle disease is an infectious poultry disease that caused by Newcastle disease virus which is belongs to family Paramyxoviridae, genus Avulavirus and Avian paramyxovirus spesies. Avian paramyxovirus type I (APMV-I) is a synonym of the ND virus that has genotypes varians. ND virus genotype VII caused Newcastle disease outbreak in Asia since around 1980. Outbreaks of ND in Indonesia 2010 have been reported due to the ND virus genotype VII. The purpose of this study to genotiping the ND virus isolates in Disease Investigation Center Lampung from 2010 to 2013. Amplification of F gene fragment using primers designed by Disease Investigation Center Lampung and continued sequencing. Data of sequencing results were analyzed with Mega5 soft ware. Based on the phylogenic tree and consensus sequences analysis of isolates origin Disease Investigation Center Lampung from 2010 to 2013 included in genotype VII subtype a (VIIa) and d (VIId). Key words: phylogenic tree analysis, consensus sequence analysis, newcastle disease, Lampung

474


PENDAHULUAN Newcastle disease (ND) adalah penyakit pada unggas yang masih menjadi permasalahan penting karena menimbulkan kerugian ekonomi pada industri peternakan unggas baik di Indonesia maupun di dunia (Tabbu, 2000; Robinson, 1961; Hodder et al., 1993). Penyakit ND disebabkan oleh virus yang tergolong dalam famili Paramyxoviridae, genus Avulavirus, spesies Avian paramyxovirus

serogrup

Avian

paramyxovirus

Tipe

I

(APMV-I).

Avian

paramyxovirus Tipe I (APMV-I) adalah merupakan sinonim dari virus ND yang memiliki genotip yang bervariasi (Alexander and Senne, 2008). Virus ND terbagi menjadi empat panzootik besar. Genotip II dan IV merupakan epizootik pertama dari virus ND. Genotip V dan VI berhubungan dengan panzootik kedua dan ketiga. Genotip VII saat ini berkaitan dengan kejadian pandemik keempat dari ND (Lien et al., 2007). Genotip VII dinyatakan sebagai penyebab kejadian penyakit ND di Asia sejak sekitar tahun 1980. Genotip VII subgenotip VIId berdasarkan gen F merupakan patogen yang dominan di negara China (Liu et al., 2008; Rui et al., 2010), Korea (Kwon et al., 2003) dan Taiwan (Lien et al., 2008). Wabah ND di indonesia pernah dilaporkan di Banjarmasin, Sukorejo, Sragen, Kudus. Wabah tersebut disebabkan oleh virus ND genotip VII (Xiao et al., 2012). Analisis phylogenic tree dan consensus sequence pada posisi asam amino tertentu dapat digunakan untuk menentukan genotip dari virus ND (Qin et al., 2008). Penelitian ini menggunakan analisis phylogenic tree dan consensus sequence pada fragmen gen F untuk menentukan genotip virus ND asal Balai Veteriner Lampung tahun 2010-2013. Fragmen gen F yang dianalisis pada posisi nukleotida ke 103-626. MATERI Sampel yang digunakan adalah 12 isolat ND yang telah dikoleksi dari beberapa daerah di wilayah kerja Balai Veteriner Lampung. Sebanyak 12 isolat berasal dari ayam yang dipelihara di lokasi wabah maupun paska wabah ND. Data mengenai sampel tersebut dapat dilihat pada Tabel 1.

475


Tabel 1. Isolat ND yang dilakukan pengujian No

Kode sampel

Asal sampel

Tahun

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.

10.172/Ay/BPPV/02.10 11.154/PBM/LP/BPPV/02.11 11.990/Ay/BPPV/10.11 11.992/Ay/BPPV/10.11 11.112/Ay/BPPV/01.11 12.44/Ay/BPPV/01.12 12.139/Ay/BPPV/02.12 12.785/Ay/BPPV/09.12 13.55/Ay/BPPV/01.13 13.1461/Ay/BPPV/11.13 13.1462/Ay/BPPV/11.13 13.1528/Ay/BPPV/12.13

Jati Agung Prabumulih Batang Hari Natar Batu Raja Timur Metro Kota Palembang Bandar Lampung Bekri Muara Enim Muara Enim Way Kanan

2010 2011 2011 2011 2011 2012 2012 2012 2013 2013 2013 2013

Jenis ayam Layer Buras Layer Layer Buras Buras Buras Buras Buras Buras Buras Buras

Bahan-bahan yang diperlukan pada teknik molekuler antara lain: Purelink viral RNA/DNA minikit (Invitrogen) yang terdiri dari: viral lysis buffer, wash buffer (I dan II), proteinase K (20 mg/mL), carrier RNA, Nukleasease free water, viral spin columns with collection tubes, wash tubes 2,0 mL, recovery tubes 1,5 mL, purelink filter plate, receiver plate, deep well plate dan foil tape; Primer forward dan reverse (Tabel. 2); Super Script III One Step RT-PCR Platinum Taq HiFi (Invitrogen) yang terdiri dari: Super Script III RT/Platinum Taq mix, 2x reaction mix (0,4 mM dari masing-masing dNTP dan 6mM MgSO4), 50mM MgSO4; TBE buffer 1 x; Sybr safe dan 100 bp DNA Ladder (Invitrogen). Isolat yang digunakan sebagai kontrol berasal dari Balai Veteriner Lampung. Isolat virus ND digunakan sebagai kontrol positif dan isolat virus Avian Influenza sebagai kontrol negatif, serta nuclease free water (NFW) sebagai non template control (NTC). Tabel 2. Sekuen nukleotida primer forward dan reverse gen F Primer F

Sekuen 5'-3'

Produk Posisi

Forward GCTGTATCTGTCTGACAAGCTCTC Reverse

AGGTTGAGTTCTACACCAACCTGT

476

565 bp 71-635

Keterangan Balai Veteriner Lampung


METODOLOGI Amplifikasi gen F menggunakan program RT (suhu 500C selama 30 menit) sebanyak 1 siklus; pre denaturasi (suhu 950C selama 5 menit) sebanyak 1 siklus; denaturasi (suhu 950C selama 15 detik), annealing (suhu 540C selama 45 detik), elongasi (suhu 720C selama 60 detik) sebanyak 35 siklus; post elongasi (suhu 720C selama 4 menit) sebanyak 1 siklus (Angeliya dan Cahyaningsari, 2012). Produk PCR yang diperoleh dilanjutkan dengan sekuensing. Analisis data hasil sekuensing menggunakan perangkat lunak molecular evolution genetics analysis (MEGA) versi 5. Data yang diperoleh dilakukan multiple alignment dengan clustal W, prediksi asam amino dan analisis phylogenic tree. Gambaran phylogenic

tree

dibuat

dengan

metoda

Neighbor-Joining

menggunakan

parameter model Kimura2. Data pembanding diambil dari sekuen isolat virus ND yang

ada

di

national

center

for

biotechnology

information

(ncbi/www.ncbi.nlm.gov). HASIL DAN PEMBAHASAN Analisis filogenetik berdasarkan fragmen gen F sepanjang 524 nukleotida. Posisi nukleotida yang dianalisis dalam penelitian ini adalah nukleotida nomer 103 sampai 626 pada gen F. Sebanyak 12 isolat asal Balai Veteriner Lampung dibandingkan dengan isolat Virus ND yang berasal dari gene bank. Hasil analisis filogenetik dapat dilihat pada Gambar 1. Phylogenic tree menunjukkan bahwa dari semua virus yang dianalisis membentuk

9 genotip

yaitu genotip I-IX. Isolat dalam penelitian ini berada dalam kelompok genotip VII. Isolat tersebut berada bersama dengan NDV/cockatoo/Indonesia/90 (AY562985), NDV/Jakarta/2007 (JX393313), Banjarmasin/2010 (HQ697254), Kudus/2010 (HQ697259), Sragen/2010 (HQ697258), Bali/2007 (AB605247), Sukorejo/2010 (HQ697255), TW/2000 (AF358786), Muscovy duck/china/2011 (FJ872531) dan GD09-1/2011 (HQ17357). Isolat dalam penelitian ini berhubungan dekat dengan isolat asal Indonesia yang pernah dilaporkan sebelumnya di Bali (Adi et al., 2010) dan di Sukorejo, Banjarmasin, Sragen, Kudus (Xiao et al., 2012). Hasil analisis filogenik menunjukkan bahwa isolat dalam penelitian ini berhubungan jauh dengan isolat asal Amerika (JX901372) dan isolat GB 1168.84 asal Inggris (AF109885). Isolat yang berasal dari Amerika dan Inggris termasuk dalam genotip V dan VI. Hal ini menunjukkan bahwa isolat asal Balai Veteriner Lampung tahun 2010-2013 yang

477


meliputi wilayah Sumatera bagian selatan merupakan virus Indonesia dan bukan merupakan virus asal negara-negara tersebut. Hasil analisis phylogenic tree menunjukkan bahwa isolat ND asal Balai veteriner Lampung masih sama dengan virus yang menyebabkan kasus ND di Bali tahun 2007 (Adi et al., 2010), Sukorejo, Sragen, Kudus dan Banjarmasin (Xiao et al., 2012) serta di negara-negara Asia seperti Taiwan (Lien et al., 2007; Ke et al., 2010), China (Liu et al., 2008) yang merupakan genotip VII. Isolat tersebut sangat berbeda dengan strain La Sota yang termasuk dalam genotip II. Strain La Sota digunakan sebagai strain vaksin di wilayah kerja Balai Veteriner Lampung dan Indonesia pada umumnya. Virus yang bersirkulasi di wilayah kerja Balai Veteriner Lampung yang meliputi Sumatera bagian selatan ini secara genotip berbeda dengan isolat vaksin yang digunakan. Hal ini menunjukkan bahwa wabah penyakit ND yang terjadi di wilayah kerja Balai Veteriner bukan disebabkan oleh virus ND yang berasal dari isolat vaksin tetapi virus lapang genotip VII yang merupakan penyebab wabah penyakit ND di Indonesia seperti yang pernah dilaporkan di Indonesia sebelumnya (Adi et al., 2010; Xiao et al., 2012). Virus ND asal Bali tahun 2007 (AB605274) merupakan ND genotip VIIa (Adi et al., 2013) sedangkan virus ND cockatoo/Indonesia/14698/90 (AY562985) adalah genotip VIIc berdasarkan data yang diperoleh dari gen bank. Isolat ND asal Jakarta yang diisolasi pada tahun 1997 (JX393313) merupakan virus ND genotip VIIb berdasarkan consensus sequence pada posisi asam amino tertentu. Isolat tersebut memiliki R101, A176, H272, F314 yang merupakan consensus sequence yang membedakan genotip VIIb dari VIIa, VIIb dan VIIc (Qin et al., 2008). Xiao et al. (2012) melaporkan bahwa isolat virus ND asal Indonesia yang meliputi Banjarmasin (HQ697254), Kudus (HQ697259), Sukorejo (HQ697255) dan

Sragen

(HQ697258)

merupakan

genotip

VII.

Isolat

Banjarmasin

(HQ697254), Kudus (HQ697259) dan Sragen (HQ697258) termasuk dalam VIId berdasarkan consensus sequence. Isolat tersebut memiliki V52 dan G520 yang merupakan sekuen pada genotip VIId sedangkan genotip VIIa dan VIIb memiliki I52 dan V520. Consensus sequence antara genotip VIIa, VIIc dan VIId banyak memiliki persamaan. Substitusi asam amino pada genotip VIId yang menciri adalah pada I52 menjadi V52. Tabel di atas menunjukkan bahwa isolat ND nomer 8, 9 dan 12 memiliki I52 akan tetapi pada phylogenic tree masuk dalam percabangan genotip

478


VIId yang dekat dengan isolat 5, 6, 7, 10 dan 11 yang memiliki V52. Isolat-isolat tersebut dalam phylogenic tree berada pada percabangan dengan isolat Banjarmasin (HQ697254), Kudus (HQ697259) dan Sragen (HQ697258) yang memiliki V52 dan G520 sehingga isolat ND nomer 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 dan 12 dalam penelitian ini merupakan virus ND genotip VIId. Isolat ND nomer 1, 2, 3 dan 4 pada urutan consensus sequence memiliki urutan yang berbeda dengan isolat 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 dan 12. Data dalam tabel tersebut tidak dapat membedakan antara genotip VIIa dan VIIc. Isolat asal Bali tahun 2007 (AB605274) yang merupakan genotip VIIa (Adi et al., 2013) memiliki F314. Asam amino F314 juga dimiliki oleh isolat asal Sukorejo (HQ697255). Isolat ND nomer 1, 2, 3 dan 4 berdasarkan analisis phylogenic tree berada dalam percabangan bersama dengan isolat asal Sukorejo dan Bali. Sehingga isolat tersebut digolongkan dalam genotip VIIa. Sampel 5

74 54

Sampel 6 Sampel 7

51

Sampel 10 43

98

Sampel 11

Banjarmasin HQ697254

VIId

Kudus 2010 HQ697259

33 94

Sragen 2010 HQ697258 100

Sampel 8

77

Sampel 9

31

Sampel 12 Bali 2007 AB605247

VII

Sukorejo HQ697255 96

Sampel 1

63 97

100

Sampel 2 90

Sampel 3 87

Sampel 4

NDV cockatoo/Indonesia/14698/90/AY562985 43

VIIa

VIIc

taiwan AF358786

47

muscovyduckchina FJ872531

95

ND sh09 GU124591

99

88

98

VIId

isolat GD09-1 HQ717357

Jakarta 1997 JX393313 96

ND Sterna/Astr/2755/2001 AY865652 99

ND-chicken-Sweden-97GU585905 GB 1168.84 AF109885

97

ND strain 1.3 EF026583

98

99 ND strain 248VB EF026584

miyadera M18456

IV

Herts 33 AY741404

44

V VIII III

ND QH1 FJ751918 Aus 32-III M24700

89

VI

usa2009 JX901372

99

54

VIIb

F48E9 AY508514

IX

100 FJ.1/85 AF458009. 96 100

lasota DQ195265 B I TakaakiAF 375823

II

china EU315123 australia 1998 GU332645

79

D26/76 M246921

99 84

Malaysia 2009 JQ697740

I

100 V4 JX524203

0.01

Gambar 6. Phylogenic tree Isolat asal wilayah kerja Balai Veteriner Lampung. Bootstrap 1000, tanda “ ” : isolat penelitian, posisi nukleotida pada 103-626.

479


KESIMPULAN Berdasarkan analisis phylogenic tree dan consensus sequence, fragmen gen F posisi nukleotida nomer 103 sampai 626 isolat ND asal Balai Veteriner Lampung tahun 2010-2013 merupakan virus ND genotip VII. Sebanyak 4 isolat termasuk dalam genotip VIIa dan 8 isolat adalah genotip VIId.

DAFTAR PUSTAKA Adi, A. A. A. M., Kardena, I. M., Astawa, N. M., Putra, K. S. A., Hayashi, Y., and Matsumoto, Y., 2010. Isolation and characterization of pathogenic newcastle disease virus from natural case in Indonesia. J. Med. Vet. Sci. (72) 3: 313-319. Adi, A. A. A. M., Astawa, N., Putra, K., Hayashi, Y., and Matsumoto, Y., 2013. Molecular Characterization of The Complete Genom of A Viscerotropic Velogenic Newcastle Disease Virus Bali-1/07. www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB605247. Alexander, D. J., and Senne, D. A., 2008. Newcastle disease and other Paramyxovirus Infection. In: Disease of Poultry 12th ed. Syaif, Y. M., Fadly, A.M., Glysson, J.R., Mc.Douggald, L.B., Nolan, L.K. and Swyne, D.E. Blackwell publishing professional. IOWA. USA: 75-100 Angeliya, L., dan Cahyaningsari, D., 2012, Pengembangan Metode Diagnosa Newcastle Disease dengan Menggunakan teknik RT-PCR di BPPV regional III. Prosiding Rapat Teknis dan Pertemuan Ilmiah Kesehatan Hewan. Kementerian Pertanian. 1(3): 126-131. Hodder, A. N., Liu, Z. Y., Sellecck, P. W., Corino, G. L., Shiell, B. J., Grix, D. C., Morrow, C. J., and Gorman, J. J., 1994. Characterization of field isolats of newcastle disease virus using antipeptide antibodies dalam Avian Disease. 38: 103-118. Ke, M. G., Yu, S. W., Ho, C. H., Chu, P. Y., Ke, L. Y., Lin, K. H., Tsai, Y. C., Liu, H. J., and Lin, M. Y., 2010. Characterization of newly emerging newcastle disease viruses during 2002-2008 in Taiwan. Virus Research. 147: 247257. Kwon, H. J., Cho, S. H., Ahn, Y. J., Seo, S. H., Choi, K. S., and Kim, S. J., 2003. Molecular epidemiology of Newcastle Disease in Republic Korea. Veterinary Microbiology. 95: 39-48. Lien, Y. Y., Lee, J. W., Su, H. Y., Tsai, H. J., Tsai, M. C., Hsieh, C. Y., and Tsai, S. S., 2007. Phylogegenic characterization of newcastle disease viruses isolated in Taiwan During 2003-2006. Veterinary Microbiology. 123: 194202. Liu, H., Wang, Z., Wu, Ya., Wu, Yb., Sun, C., Zheng, D., Xu, T., and Li, J., 2008. Molecular characterization an phylogenetic analysis of new newcastle

480


disease virus isolated from the mainland China. Veterinary Science. 85: 612-616. Robinson, L., 1961. Modern Poultry Husbandry. Crosby Lockwood ltd. London: 694-701. Rui, Z., Yu, S. W., Ho, C. H., Chu, P. Y., Ke, L. Y., Lin, K. H., Tsai, Y. C., Liu, H. J. and Lin, M. Y., 2010. Phylogenetic characterization of newcastle disease virus isolated in the mainland of China during 2001-2009. Veterinary Microbiology. 141: 246-257. Tabbu, C. R., 2000. Penyakit Ayam dan Penanggulangannya. Kanisius. Yogyakarta. 15: 164-186. Qin, Z. M., Tan, L. T. Xu, H. Y., Ma, B. C., Wang, Y. L., Yuan, X. Y., and Liu, W. J., 2008. Pathotypical characterization and molecular epidemiology of newcastle disease virus isolats from different host in China from 1996 to 2005. Journal of Clinical Microbiology. 46: 601-611. Xiao, S., Paldurai, A., Nayak, B., Samuel, A., Bharoto, E. E., Prajitno, T. Y., Collins, P. L., and Samala, S. K., 2012. Complete genome sequences of newcastle disease virus strains circulating in chicken populations of Indonesia. Journal of Virolog: 5969-5970.

481

ANALISIS PHYLOGENIC TREE DAN CONSENSUS SEQUENCE VIRUS NEWCASTLE DISEASE ISOLAT ASAL WILAYAH KERJA BALAI VETERINER LAMPUNG TAHUN

Recommend Documents