ANALISIS PERBEDAAN KOLOM PADA DETERMINASI KARBOHDRAT SUSU FERMENTASI DENGAN METODE HPLC

ANALISIS PERBEDAAN KOLOM PADA DETERMINASI KARBOHDRAT SUSU FERMENTASI DENGAN METODE HPLC (Analysis of Column Differences on Carbohydrates Determination of Fermented Milk by HPLC Method) A.N. Al Baarri Fakultas Peternakan Universitas Diponegoro, Semarang

ABSTRAK Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis pengaruh perbedaan tipe kolom dalam instrument kromatografi cair bertekanan tinggi (HPLC), terhadap hasil analisis komposisi karbohidrat (glukosa, galaktosa, laktosa) pada produk susu. Sampel diambil dari yakult, yogurt, kefir kemudian dilakukan preparasi sampel untuk analisis HPLC. Preparasi sampel dilakukan menurut metode Boehringer Mannheim. Data yang diambil meliputi data berbagai jenis karbohidrat (glukosa, galaktosa, laktosa) hasil analisis HPLC pada tiga macam kolom, yaitu kolom Aminex HPX-87H, kolom CLC ODS, kolom Microporosyl Carbohydrates. Data dianalisis dengan metode Completely Randomized Design pola faktorial 3x3. Hasil analisis statistik menunjukkan tidak ada pengaruh yang signifikan pada hasil analisis karbohidrat yakult, yogurt, dan kefir sebagai akibat perbedaan jenis kolom. Kata kunci : HPLC, karbohidrat, produk susu ABSTRACT This research was conducted to analyze the effect of different column types in high performance liquid chromatography (HPLC) method on the determination of carbohydrates composition (i.e. glucose, galactose, lactose) of milk products. This research used three kinds of milk product i.e. yakult, yogurt, kefir, and three tipes of column i.e. Aminex HPX-87H column, CLC ODS column, and microporosyl carbohydrates column. Yakult was used by inoculation of Lactobacillus casei in skim milk. Yogurt was used by fermentation of Streptococcus thermophillus and Lactobacillus bulgaricus in skim milk, and kefir was formed by Streptococcus thermophillus, Lactobacillus bulgaricus and yeast inoculation in skim milk. All of samples were incubated for 6 hours. Samples were prepared as Mannheim Mannheim method for carbohydrate analysis. Data were analysed by completely randomized design for a 3x3 factorial. The results indicated that carbohydrates composition on yakult, yogurt, kefir were not influenced by different kinds of column but the highest carbohydrates level was reached by Aminex HPX-87H column. . Keywords : HPLC, carbohydrates, milk product PENDAHULUAN Cara yang dilakukan untuk determinasi komposisi susu baik secara kualitatif maupun kuantitatif adalah banyak macamnya. Sebagai contoh penentuan kandungan karbohidrat dalam susu secara kuantitatif dan kualitatif dapat dilakukan dengan

beberapa cara, diantaranya adalah dengan metode uji kristal laktosa (Hadiwiyoto, 1992), metode oksidasi dengan kupri, ‘Luff Schroorl’, ‘Munson Walker’, ‘Lane Eynon’, oksidasi dengan larutan feri sianida alkalis, iodometri, kromatografi (Sudarmadji et al., 1989).

Analysis of Column Differences on Carbohydrates Determination by HPLC Method (Al Baarri)

27

Diantara metode determinasi komposisi susu, metode kromatografi adalah metode determinasi komposisi susu yang bersifat lebih praktis, detail, akurat, dan bersifat umum. Kromatografi adalah metode analisa kimia yang memisahkan konstituenkonstituen pengganggu dari konstituen-konstituen yang dikehendaki. Senyawa-senyawa yang akan dipisahkan, ditempatkan pada situasi yang dinamik yaitu dengan melakukan pengaliran. Pada peristiwa pengaliran tersebut, terjadi pelarutan, absorpsi, penguapan (Sudarmadji et al., 1989). Kromatografi merupakan suatu proses migrasi diferensial, komponen-komponen cuplikan yang dibawa oleh fasa gerak ditahan secara selektif oleh fasa diam. Peristiwa tersebut terjadi di dalam kolom. Adanya peristiwa yang komplek pada metode kromatografi, menjadikan kromatografi dapat diandalkan untuk menganalisis senyawa sampai sedetail mungkin (Sastrohamidjojo, 1991). Tingkat presisi yang tinggi, yang dimiliki oleh alat kromatografi, digunakan untuk menganalisis zat tertentu yang peka terhadap perubahan komposisi, misalnya susu dan produk olahannya.Toba (1980) menggambarkan betapa pentingnya kromatografi untuk mengetahui seberapa jauh perubahan komposisi yang terjadi dalam pembuatan yogurt, yakult, dan kefir. Hampir seluruh negara industri maju pembuat yogurt, yakult, dan kefir, memiliki alat kromatografi untuk mendeteksi kualitas produknya. Hal ini adalah bertujuan untuk menjaga rasa yang dihasilkan agar tetap disukai oleh konsumennya. Prinsip kromatografi adalah penggunaan dua fase yang berbeda yaitu fasa tetap dan fasa bergerak (‘mobile phase’). Proses pemisahan tergantung pada gerakan relatif dari dua fasa tersebut. Penggunaan kromatografi cair performan tinggi (‘high performance liquid chromatography’; HPLC) dapat digunakan untuk menganalisis berbagai macam kandungan yang komplek dalam suatu bahan menurut jenis kolom yang digunakan. Senyawa komplek, misalnya karbohidrat, yang masuk kedalam HPLC, terlebih dahulu akan masuk kedalam kolom yang merupakan bagian utama HPLC. Di dalam kolom, senyawa komplek tersebut akan dipisah-pisah menurut ikatan kimianya terutama rantai karbonnya. Senyawa yang mempunyai rantai karbon panjang, akan terdeteksi paling akhir. Didalam kolom, senyawa

28

komplek tersebut dipanaskan menurut ketentuan penggunaan kolom (Biorad, 1998) Pemilihan kolom merupakan langkah yang pertama dan utama untuk penggunaan kromatografi. Ketepatan dalam pemilihan kolom sangat berpengaruh terhadap performan kromatogram (Supelco, 1992). Jenis kolom yang dapat digunakan untuk menganalisis komposisi karbohidrat di dalam susu, diantaranya adalah ‘Aminex HPX-87H’, ‘Waters Microporosyl Carbohydrate’, CLC ODS. Jenis kolom yang dipakai harus sesuai dengan kondisi optimal dan juga sesuai dengan tujuan analisis (Biorad, 1998). Sebelum sampel diinjeksikan kedalam perangkat HPLC, terlebih dahulu dilakukan penyaringan dengan menggunakan ‘filter milipore’ dengan diameter 0,45 µm. Namun untuk tujuan tertentu, misalnya untuk sterilisasi dari bakteri, mungkin saja dilakukan penyaringan dengan menggunakan ‘filter milipore’ dengan diameter 0,22 µm. Penyimpanan sampel untuk jangka waktu yang lama, sebaiknya menggunakan milipore dengan diameter 0,22 µm agar kontaminasi bakteri dapat diminimalisir (Mannheim, 1997). Perlakuan lain pada sampel adalah dengan menggetarkan sampel pada ‘ultrasonic beam’ agar terbebas dari gelembung udara. Selanjutnya setelah melakukan tahap ini, dilakukan pengeluaran gas (‘degas’) dengan menarik gelembung udara dari dalam media dengan menggunakan peralatan pompa vakum (Mannheim, 1997) Kemampuan kolom Aminex dalam mendeterminasi karbohidrat susu maupun susu fermentasi, adalah baik. Hal ini sesuai dengan yang dilaksanakan Toba et al. (1982), yang menggunakan kolom jenis ‘Aminex HPX’ untuk mendeteksi karbohidrat dalam yogurt. Karbohidrat yang terdeteksi pada kromatogram adalah sukrosa, laktosa, glukosa, galaktosa dan fruktosa. Pirisino (1983) juga melakukan analisis deteksi karbohidrat pada susu dengan kolom ‘Aminex HPX87C’. Jenis karbohidrat yang terdeteksi adalah laktosa, glukosa, dan galaktosa. Kolom ‘Waters Microporosyl Carbohydrate’ dan kolom CLC ODS, dapat mendeterminasi karbohidrat susu fermentasi namun tidak dapat memisahkan karbohidrat disakarida yang

J.Indon.Trop.Anim.Agric.28(1) March 2003

terdeterminasi. Namun puncak grafik yang bersatu ini masih dapat dipisahkan dengan perhitungan khusus. Analisis kromatografi tersebut dijalankan dengan menggunakan eluen Asetonitril, H2O dan SAM (‘silica amine modifier’) II dengan perbandingan berturut-turut 75 : 25 ; 0,1 persen w/v. (Mannheim, 1987) Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perbedaan yang dihasilkan pada analisis karbohidrat tiga jenis susu fermentasi yaitu yakult, yogurt, kefir dengan menggunakan metode HPLC dengan jenis kolom yang berbeda-beda.

MATERI DAN METODE Materi Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah susu segar, starter yakult, yogurt, kefir, serta bahan untuk preparasi sampel yaitu TCA, NaOH, aquades, aquabides. Alat yang digunakan untuk penelitian meliputi perangkat HPLC, penangas air, lemari es, filter milipore 0,45 µm. Khusus untuk kromatografi, dugunakan alatalat yaitu syringe injektor, ‘column oven’, ‘Communication Bus Module’, ‘Load Chromatograph’ (LC), ‘Refractive Index Detector’, Pencetak data (printer). Fase bergerak kolom Aminex adalah H2SO4 0,005 M, sedangkan untuk kolom ‘Water Microporosyl Carbohydrate’ dan kolom CLC ODS, digunakan methanol 70% sebagai fase rgeraknya. Metode Cara kerja penelitian ini dibagi dalam tiga tahap. Tahap pertama adalah tahap pembuatan sampel dengan cara menginokulasi susu skim dengan berbagai macam baktreri. Yakult dibuat dengan cara menginokulasikan bakteri Lactobacillus casei ke dalam susu skim. Yogurt dibuat dengan menginokulasi bakteri Streptococcus thermophillus dan Lactobacillus bulgaricus ke dalam susu skim kemudian kefir dibuat dengan cara menginokulasi bakteri Streptococcus thermophillus, Lactobacillus bulgaricus dan yeast. Setelah proses inokulasi selesai, susu kemudian diinkubasi di dalam inkubator selama 6 jam pada suhu 39°C. Tahap kedua dimulai dengan

mempersiapkan sampel yang akan diuji. Yakult, yogurt, dan kefir dipreparasikan agar bisa diinjeksikan ke dalam perangkat HPLC. Sampel dimasukkan ke dalam venojek yang terlebih dahulu telah disterilkan. Kemudian ditutup rapat-rapat dan langsung dianalisis dengan menggunakan HPLC. Tahap ketiga adalah menginjeksikan sampel ke dalam perangkat HPLC. Sampel diuji dengan HPLC dengan menggunakan 3 jenis kolom yang berbeda, yaitu kolom ‘Aminex HPX-87H’, kolom ‘Waters Microporosyl Carbohydrate’, kolom CLC ODS. Dalam pembandingan hasil kromatogram dari 3 jenis kolom yang berbeda, penelitian dirancang sesuai rancangan acak lengkap dengan pola faktorial 3 x 3. Semua data yang didapat kemudian dianalisis secara kuantitatif dengan sidik ragam.

HASIL DAN PEMBAHASAN Data analisis karbohidrat yakult dengan menggunakan kolom ‘Aminex HPX-87H’, kolom ‘Waters Microporosyl Carbohydrate’, kolom CLC ODS dapat dilihat pada Tabel 1. Data pada Tabel 1 menunjukkan adanya perbedaan yang tidak nyata pada komposisi laktosa, glukosa dan galaktosa dengan menggunakan 3 jenis kolom yang berbeda. Walaupun data pada Tabel 1 menunjukkan adanya perbedaan yang tidak nyata, namun data yang tertinggi dicapai pada kolom dengan jenis ‘Aminex HPX-87H. Hal ini menunjukkan bahwa kolom jenis ‘Aminex HPX-87H’ adalah jenis kolom yang mampu mendeteksi kadar karbohidrat dengan lebih peka dibanding dengan jenis kolom lainnya. Penggunaan kolom Aminex untuk penentuan kadar karbohidrat adalah sangat tepat. Hal ini dikarenakan bahwa kolom Aminex merupakan kolom yang mampu mendeteksi dengan lebih peka dan mampu mendeteksi laktosa, glukosa, dan galaktosa secara terpisah (Biorad, 1998) Analisis karbohidrat dengan menggunakan perangkat kromatografi yang menggunakan jenis kolom berlainan, dapat menunjukkan hasil yang berbeda-beda. Hal ini dapat terjadi sebagai akibat adanya perbedaan kemampuan pemisahan antar masing-masing jenis kolom (Supelco, 1991).


29

Tabel 1. Analisis Karbohidrat Y akult dengan M enggunakan K olom CLC OD S, Kolom ‘Waters M icroporosyl Carbohydrate’, dan Kolom ‘Am inex HPX 87H’ M acam kolom W aters M icroporosyl Carbohidrate Rata-rata CLC OD S Rata-rata Aminex HPX 87H Rata-rata abc

Laktosa 4,18 4,10 4,09 4,12 a

K omposisi Yakult Glukosa 0,32 0,28 0,30 0,30 b

Galaktosa 0,06 0,04 0,05 0,05 c

3,99 4,00 4,00 4,00 a

0,29 0,28 0,28 0,28 b

0,02 0,04 0,05 0,04 c

4,25 4,19 4,19 4,21 a

0,42 0,39 0,38 0,40 b

0,07 0,05 0,06 0,06 c

Superskrip yang berbeda menunjukk an adanya perbeda an

Tabel 2. Analisis Karbohidrat Yogurt dengan M enggunakan Kolom CLC ODS, Kolom ‘Waters M icroporosyl Carbohydrate’, dan Kolom ‘Aminex HPX 87H’ M acam kolom Waters M icroporosyl Carbohidrate Rata-rata CLC ODS Rata-rata Aminex HPX 87H

Rata-rata abc

Laktosa 3,68 3,70 4,01 3,79 a

Komposisi yogurt Glukosa 0,34 0,30 0,31 0,32 b

Galaktosa 0,02 0,03 0,03 0,03 c

3,59 3,51 3,51 3,54 a

0,33 0,29 0,29 0,30 b

0,01 0,02 0,02 0,02 c

3,90 4,00 4,00 3,97 a

0,39 0,39 0,39 0,39 b

0,03 0,05 0,05 0,05 c

Superskrip yang berbeda menunjukkan adanya perbedaan

Tabel 3. Analisis Karbohidrat K efir dengan M enggunakan K olom CLC OD S, Kolom ‘Waters M icroporosyl Carbohydrate’, dan Kolom ‘Am inex HPX 87H’ M acam kolom ‘Waters M icroporosyl’ ‘Carbohydrate’ Rata-rata CLC OD S

Rata-rata ‘Aminex HPX 87H’ Rata-rata abc

30

Laktosa 3,88 3,79 4,00 4,55 a

K omposisi kefir Glukosa 0,44 0,39 0,31 0,38 b

Galaktosa 0,10 0,09 0,11 0,10 c

3,99 4,01 4,01 4,00 a

0,33 0,28 0,29 0,30 b

0,09 0,12 0,12 0,11 c

4,00 4,00 4,09 4,03 a

0,39 0,39 0,38 0,39 b

0,11 0,09 0,09 0,10 c

Superskrip yang berbeda menunjukka n adanya perbeda an


Selanjutnya dijelaskan pula bahwa penentuan suatu senyawa akan terdeteksi dengan lebih baik jika menggunakan kolom yang sesuai. Ketiga kolom yang digunakan pada penelitian telah sesuai dengan tujuan pembuatan kolom yaitu diantaranya untuk mendeteksi adanya karbohidrat. Secara umum, pada Tabel 2 dan Tabel 3 dapat dilihat adanya perbedaan yang tidak nyata pada hasil analisis dengan menggunakan jenis kolom yang berbeda. Perbedaan yang tidak nyata tersebut, dapat terjadi sebagai akibat adanya perbedaan daya pisah masing-masing kolom yang digunakan (Supelco, 1991). Kolom 'Aminex HPX-87H' dalam mendeteksi karbohidrat, hasil analisis selalu mempunyai nilai yang sedikit lebih besar daripada kolom lainnya, walaupun secara statistik, perbedaan hasil tersebut tidak nyata. Hal ini dapat digunakan sebagai bukti bahwa kolom Aminex HPX-87H ternyata lebih peka dalam menganalisis senyawa karbohidrat. Pendapat tersebut diperkuat dengan pendapat Murti (2000) bahwa ternyata deteksi susu fermentasi bifidus dengan menggunakan kolom Aminex HPX87H, mampu mendeteksi dengan peka, terbukti dengan banyaknya puncak grafik yang terdeteksi. Variabel-variabel lain dalam perangkat kromatografi selain macam kolom, juga dapat berpengaruh pada hasil analisis. Variabel lain tersebut dapat berupa macam fase gerak, suhu kolom, macam fase diam (Biorad, 1998). KESIMPULAN Ketiga jenis kolom yang dipakai dalam penelitian, yaitu kolom Aminex HPX-87H 4,2 mm x 72 cm, kolom ‘Waters Microporosyl Carbohydrate’, kolom CLC ODS, mampu mendeteksi karbohidrat yakult, yogurt, dan kefir dengan baik. Perbedaan jenis kolom yang dipakai pada penelitian ternyata tidak memberikan pengaruh yang besar pada hasil analisis. Kolom ‘Aminex HPX-87H’ mampu mendeteksi karbohidrat pada ketiga jenis susu fermentasi sedikit lebih peka dibandingkan kolom lainnya. DAFTAR PUSTAKA

Biorad. 1998. Guide to Aminex HPLC Columns for Food and Beverage, Biotechnology, and BioOrganic Analysis. Hadiwiyoto. 1992. Teknik Uji Mutu Susu dan Hasil Olahannya. Liberty. Yogyakarta. Johnsons, E.L. dan Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Penerbit ITB. Bandung. Mannheim, Boehringer. 1987. Methods of Biochemical Analysis and Food Analysis using Test Combination. Boehringer Mannheim GmbH Biochemica. Jerman Murti, T.W. 2000. Biochemical Changes of Carbohydrates, organic acids, and volaile key compounds of Bifidus Milk. Journal of EAAP 51th Annual meeting Denhaag. Pirisino, J.F. 1983. High Performance Liquid Chromatographic Determination of Lactose, Glucose, and Galactose in Lactose-Reduced Milk. J. Food Sci. 48:742-743. Plaga, A., J. Stumpfel and H.P. Fiedler. 1989. Determination of Carbohydrates in Fermentation Processes by Hih Performance Liquid Chromatography. Appl. Microbiol. Biotechnol. 32:4549. Satrohamidjojo, Hardjono. 1991. Kromatografi. Penerbit Liberty. Yogyakarta. Sudarmadji, S., B. Haryono, dan Suhardji. 1989. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Liberty. Yogyakarta. Supelco. 1991. Capillary Selection Guide. Supelco Inc. Perancis. Toba, T., K.Arihara, and S.Adachi. 1980. Quantitative Changes in Sugar, Especially Oligosaccharides, During Fermentation and Storage of Yogurt. J. Dairy Sci. 66:17-19.


31

Toba, T., K.Arihara and S.Adachi. 1982. Quantitative Changes in Oligosaccarides during Fermentation and Storage of Yogurt Inoculated Simultaneusly with Starter Culture and β-Galactosidase Preparation. J. Dairy Sci. 12401245.

32


ANALISIS PERBEDAAN KOLOM PADA DETERMINASI KARBOHDRAT SUSU FERMENTASI DENGAN METODE HPLC

Recommend Documents