ANALGETICKÉ ÚÈINKY KAPSAICINU: TISÍCE LET NEPOZNANÝ MECHANIZMUS

Pùvodní práce

ANALGETICKÉ ÚÈINKY KAPSAICINU: TISÍCE LET NEPOZNANÝ MECHANIZMUS ANALGESIC EFFECTS OF CAPSAICIN: THOUSANDS YEARS UNDETERMINED MECHANISM KAROLINA TOUŠOVÁ1, JAN BENEDIKT1, ABDUL SAMAD1,2 LADISLAV VYKLICKÝ1, VIKTORIE VLACHOVÁ1 Fyziologický ústav AV ÈR Ústav fyzikální biologie, Jihoèeská univerzita v Èeských Budìjovicích a Laboratoø nároèných výpoèetních technik, Ústav systémové biologie a ekologie AV ÈR 1

2

SOUHRN Pozoruhodnými látkami, jejichž úèinek byl od nepamìti využíván k tišení bolestivých stavù, jsou vaniloidy, aktivní složky nìkterých silnì pálivých rostlin, jakými je pálivá paprika a sukulent Euphorbia resinifera. První písemné zmínky o využití vaniloidù se dochovaly již z poèátku našeho letopoètu, avšak dodnes pøesnì neznáme pøíèinu jejich analgetického úèinku. Cílem tohoto pøíspìvku je informovat o souèasných poznatcích, které byly dosud získány o mechanizmech antinociceptivního pùsobení vaniloidù na bunìèné a molekulární úrovni. Jsou pøedloženy tøi hypotézy, jež se analgetické úèinky topické aplikace vaniloidních látek pokoušejí vysvìtlit jako dùsledek desenzitizace vaniloidního receptoru TRPV1. Za nejlépe prokázaný mechanizmus desenzitizace závislé na vtoku Ca2+ do buòky je považována aktivace kalcium-dependentní fosfatázy 2B (kalcineurin), která defosforyluje TRPV1, èímž se výraznì sníží jeho citlivost vùèi algogenùm. Druhá hypotéza byla vytvoøena na základì experimentálnì prokázané strukturální interakce TRPV1 receptoru s kalmodulinem, který hraje významnou roli v metabolizmu intracelulárního Ca2+. Tøetí hypotéza pøedpokládá, že aktivace TRPV1 iontového kanálu vede v dùsledku vtoku Ca2+ do buòky ke snížení hladiny membránového lipidu fostatidylinozitolu-4,5-bisfosfátu (PIP2); resyntéza PIP2 je pak nutnou podmínkou pro návrat TRPV1 z desenzitizovaného stavu. Klíèová slova: nocicepce, vaniloidní receptor, kapsaicin, modulace, desenzitizace

SUMMARY Since time immemorial, people have used the effects of pungent compounds such as resiniferatoxin and capsaicin for the treatment of various painful disorders. Although the first written records on vanilloids and their therapeutic use in pain management go back thousands of years, until now, the precise mechanisms of their analgesic action remain unclear. The aim of this article is to provide an overview of the current status of research on antinociceptive effects of capsaicin at the cellular and molecular level. The most recent combination of electrophysiological data with known structural information has now indicated possible mechanisms by which acute topical application of capsaicin could result in the Ca2+-dependent desensitization of the transient receptor potential vanilloid receptor-1 (TRPV1); this provides for some exciting and testable hypotheses, which will allow yet more clarification in this area: 1. Among the Ca2+-activated enzymes that are believed to play pivotal roles in TRPV1 desensitization is the Ca2+/calmodulin-dependent phosphatase 2B, calcineurin, which dephosphorylates TRPV1 receptors. 2. The second hypothesis proposes that TRPV1 Ca2+-dependent desensitization is mediated by calmodulin which interacts with TRPV1 at amino- and carboxyl-terminal regions. 3. The third hypothesis is based on the finding the activation of TRPV1 results in potent depletion of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2), presumably due to the Ca2+ influx, and that PIP2 is required to recover the activity of the channel after desensitization. Key words: nociception, vanilloid receptor, capsaicin, modulation, desensitization

Úvod Úèinek alkaloidù obsažených v nìkterých pálivých rostlinách byl od nepamìti využíván k tišení bolestivých stavù u lidí. Pálivá paprika a èerný pepø jsou tradiènì používány k ochucení potravin, ale jejich úèinek pøi léèbì bolesti a kožních vyrážek byl zøejmì znám již Mayùm a Aztékùm. Aèkoliv aktivní složka obsažená v pálivé paprice byla poprvé izolována a pojmenována kapsaicinem v roce 1846 (Thresh), tuto látku strukturálnì pøíbuznou vanilinu se podaøilo syntetizovat až o 84 let pozdìji. Zatímco lidé v oblastech pøedkolumbovské Ameriky k léèbì bolesti odedávna využívali úèinky kapsaicinu, na opaèném konci svìta, zásluhou arabských obchodníkù, byl v lidovém léèitelství intenzivnì využíván latex získávaný ze sukulentu Euphorbia resinifera, rostliny pocházející BOLEST 2/2007

z horských oblastí Maroka (obr. 1A). Písemné záznamy o léèivých úèincích latexu Euphorbium se dochovaly z doby vlády mauretánského krále Juby II. (*kolem 50 pø. n. l. – †23 n. l.), který získal vzdìlání na dvoøe øímského císaøe Augusta. Jeho spis Περι οπου (O latexu) je považován za první farmakologickou monografii. Chemická podstata silnì pálivého až toxického úèinku substance Euphorbium byla objevena až v roce 1975, kdy byl izolován diterpenoid resiniferatoxin, jehož struktura obsahující homovanilylovou skupinu (3-methoxy-4-hydroxybenzyl) byla podobnì jako kapsaicin zaøazena mezi vaniloidy (obr. 1A). Zásadním prùlomem v historii poznání pøíèiny antinociceptivního pùsobení vaniloidù bylo zjištìní, že tyto látky specificky aktivují pouze nemyelinizovaná vlákna skupiny C 19

Pùvodní práce Obr. 1: Chemické aktivátory vaniloidního receptoru TRPV1. (A) Sbìr latexu z rostliny euphorbium. Ilustrace z arabské verze prvního dochovaného herbáøe léèivých rostlin sestaveného øeckým lékaøem Dioskoridem (1. století našeho letopoètu). Jeho pìtisvazkové dílo „De Materia Medica“ (O léèivých látkách) bylo pøeloženo do arabštiny a do perštiny a o nìkolik století pozdìji bylo používáno muslimskými vìdci, kteøí v tomto smìru ovlivnili nìkteré významné západoevropské univerzity. Vpravo, struktura exogenních vaniloidù – kapsaicin (Capsicum sp.), resiniferatoxin (Euphorbia poisonii). Vanilylová skupina je zakroužkována. (B) Látky, které aktivují TRPV1 receptor, ale neobsahují vanilylovou skupinu: piperin (Piper nigrum), kafr (Cinnamonum camphora), omega-3-mastné kyseliny – DHA, dokosahexaenová kyselina (patøí mezi esenciální mastné kyseliny obsažené v rybím tuku). (C) Endogenní vaniloidy: bioaktivní lipid anandamid, N-arachidonoyldopamin (NADA) obsahující katecholovou skupinu podobnou homovanilylové skupinì kapsacinu a alifatický lipofilní øetìzec a 12-(S)-hydro-peroxyeikosatetraenová kyselina (12-(S)-HPETE), jež vzniká z arachidonové kyseliny pùsobením lipoxygenáz.

a slabì myelinizovaná vlákna skupiny A (nociceptory), která vedou informaci o bolestivém dráždìní do míchy. Pøi prvním kontaktu s periferním zakonèením nociceptorù vyvolávají vaniloidní látky intenzivní depolarizaci membrány a následný vznik akèních potenciálù, jejichž úèinek je znám každému, kdo okusil pálivé papriky. Pøi opakované nebo déletrvající expozici nociceptorù tìmto látkám dochází k pronikavé inhibici jejich aktivace a tím k oslabení schopnosti vést bolestivé podnìty a uvolòovat neuropeptidy s významnými prozánìtlivými a proapoptotickými úèinky (bradykinin, CGRP, substance P, neurokinin A, prostaglandin E2). Z tìchto poznatkù bylo zøejmé, že vaniloidní látky mají schopnost pùsobit zcela unikátní selektivní analgezii, jež je omezena na neurony s nociceptivní charakteristikou. Za další dùležitý mezník v historii výzkumu antinociceptivního pùsobení vanilodních látek je považována molekulární identifikace vaniloidního receptoru, jenž zprostøedkovává selektivní pùsobení vaniloidních látek na nociceptorech 20

(Caterina et al., 1997). Na základì molekulární struktury byl vaniloidní receptor zaøazen do biologicky významné skupiny tzv. transdukèních iontových kanálù (tzv. TRP kanálù, transient receptor potential channels). Aktivace tìchto iontových kanálù umožòuje pøevod (transdukci) vnìjších podnìtù (teplo, chlad, tlak, svìtlo) na depolarizaci bunìèné membrány, a tím vzniká elektrická signalizace, jež je vedena do centrálního nervového systému. Typická struktura TRP receptorù je tvoøena šesti transmembránovými segmenty (S1-S6), jednou kratší hydrofobní klièkou mezi S5 a S6 a cytoplazmaticky orientovanými N- i C-konci. Iontové kanály TRP jsou tvoøeny ètyømi podjednotkami, pøièemž hydrofobní klièky se podílejí na vytvoøení centrálního póru. Selektivní filtr iontových kanálù je podle typu receptoru propustný pro monovalentní a/nebo divalentní kationty. Vaniloidní receptor TRPV1 je protein, jehož primární strukturu vytváøí 838 aminokyselin o molekulové hmotnosti 95 kDa. Primární sekvence je vysoce konzervovaná, napø. mezi lidským TRPV1 receptorem a jeho králièím, morèecím, krysím a myším ortologem je 86–87% identita a kuøecí ortolog je identický z 68 % (Hayes et al., 2000). Pøestože mnoho cenných informací o funkèních vlastnostech receptoru aktivovaném vaniloidními látkami bylo získáno na neuronech izolovaných z ganglií zadních koøenù míšních, zásadní poznatky o struktuøe, funkci a fyziologické úloze byly objeveny až po izolaci genu TRPV1 receptoru a jeho transfekci do nedráždivých bunìk, jako jsou napø. oocyty drápatky (Xenopus laevis), nebo buòky izolované z ledvin lidských embryí (HEK293) pìstované v podmínkách tkáòových kultur (Caterina et al., 1997). Výhoda takového heterologního expresního systému spoèívá pøedevším v tom, že vlastnosti receptoru lze ovlivòovat na úrovni cDNA a studovat je nezávisle na ostatních iontových kanálech, které jinak ovlivòují èinnost receptoru v nervových buòkách. Fyziologický význam získaných výsledkù je poté ovìøován na experimentálních modelech primárních senzorických neuronù, vyšetøením elektrické aktivity v míšních øízcích a studiem nocicepènì motivovaného chování experimentálních zvíøat (viz pøehledný èlánek Nilius et al., 2007). Kapsaicin jako léèebný prostøedek. Hledání úèinných agonistù a antagonistù TRPV1 receptoru Kapsaicin v podobì náplasti nebo krému (0,025–0,075 %) je tradiènì podáván pøi léèení nìkterých typù neuropatické bolesti, jako jsou napø. postherpetická neuralgie, diabetická neuritida, osteoartritida a neuralgie po zranìní periferních nervù. Pøi aplikaci kapsaicinu dochází k zarudnutí kùže a lehkému edému, jež lze experimentálnì pozorovat i pøi antidromním dráždìní kožních nervù. V mnoha pøípadech (33–67 %) je nežádoucím jevem provázejícím podání kapsaicinu nejen poèáteèní, ale i dlouhodobì pøítomná palèivá bolest, kvùli které je nutno léèbu ukonèit. Tato skuteènost vedla ke zdokonalení pøístupù využívajících kombinaci kapsaicinu s jinými látkami, jako napøíklad glyceryl trinitrátem, který pùsobí protizánìtlivì a snižuje bolest vyvolanou kapsaicinem (Sawynok, 2003). Výzkum se rovnìž zamìøil na možné využití jiných látek s podobnou chemickou strukturou, které buï vùbec nevyvolávají u èlovìka bolest (skutigeral), nebo oproti kapsaicinu mají rychlejší kinetiku aktivace/desenzitizace TRPV1 receptoru (piperin). Se BOLEST 2/2007

Možné pøíèiny analgetického pùsobení kapsaicinu Za hlavní mechanizmus analgetického pùsobení kapsaicinu byla dlouho považována interference aktivity nociceptivních neuronù podráždìných kapsaicinem s aktivitou vyvolanou pøíèinným bolestivým stavem. Pozdìjší studie však prokázaly, že antinociceptivní pùsobení kapsaicinu je dùsledkem øady bunìèných procesù, ke kterým dochází prostøednictvím aktivace vaniloidních TRPV1 receptorù: vstup vápníku kationtovými kanály do buòky mùže mít neurotoxické až apoptotické úèinky, zpùsobit zmìnu funkce rùzných receptorù a souèasnì vést k aktivaci bunìèných enzymù (Hail, 2003). Nedostateènì rychlý transport Ca2+ z nitra buòky vede k degeneraci periferních zakonèení aferentních vláken, které nativnì exprimují TRPV1 a fyziologicky pøedstavují primární polymodální nociceptory. Histologicky byly skuteènì prokázány degenerativní zmìny v plexech nejslabších vláken kožních nervù u lidí, jimž byl kapsaicin opakovanì topicky aplikován po dlouhou dobu (nìkolik týdnù). Je prokázáno, že aplikace kapsaicinu snižuje výlev neuropøenašeèù (glutamátu a neuropeptidù) na centrálních zakonèeních primárních aferentních neuronù. V dùsledku dlouhodobého pùsobení kapsaicinu (> 6 h) navíc dochází nejen ke snížení exprese samotných TRPV1 receptorù, ale také neuropeptidù substance P a CGRP (calcitonin-gene related peptide). Naproti tomu je zvýšena exprese neuropeptidù inhibujících nociceptivní BOLEST 2/2007

vstup na centrálních zakonèeních jako jsou galanin, vazoaktivní intestinální polypeptid a cholecystokinin. V tìchto procesech hraje významnou úlohu nervový rùstový faktor NGF (pro pøehled viz Appendino et al., 1997). Kapsaicin, který je silnì lipofilní látkou, navíc významnì ovlivòuje strukturu a fluiditu plazmatické membrány a nìkteré jeho apoptogenní a nekrotické úèinky mohou být nezávislé na aktivaci TRPV1 receptorù (Lundbaek et al., 2005). Akutní desenzitizace TRPV1 receptoru mùže být jedním z hlavních mechanizmù analgetických úèinkù kapsaicinu Aktivace TRPV1 receptorù kapsaicinem vede k otevøení iontových kanálù, pøièemž procházející ionty vápníku jsou pøíèinou témìø bezprostøedního snížení jejich aktivity (obr. 2). Opakovaná nebo déletrvající aplikace kapsaicinu zpùsobí další snížení odpovìdi. Tato schopnost TRPV1 iontových kanálù regulovat svou aktivitu zpùsobem závisejícím právì na míøe vlastní aktivace, je nazývána mechanizmem akutní desenzitizace a zatím existují jen více nebo ménì provìøené hypotézy o možných pøíèinách tohoto dìje. Pøedpokládá se, že v dùsledku prùchodu vápníku iontovým kanálem dochází k jeho konformaèní zmìnì, jejímž dùsledkem je uzavøení kanálu. Mechanizmy akutní desenzitizace TRPV1 receptoru jsou v souèasné dobì intenzivnì studovány na molekulární úrovni, protože právì tento dìj mùže být jednou z hlavních pøíèin analgetických úèinkù topické aplikace kapsaicinu.

Obr. 2: Desenzitizace TRPV1 receptoru je závislá na pøítomnosti vápníku v extracelulárním prostøedí. Membránové proudy snímané elektrofyziologickou technikou „patch clamp“ z HEK293T bunìk transfekovaných receptorem TRPV1. Kapsaicin (A) a piperin (B) v koncentracích blízkých maximální úèinné koncentraci (1 μM pro kapsaicin a 30 μM pro piperin) aktivuje TRPV1 receptory, které desenzitizují v pøítomnosti vápníku (2mM). Porovnáním dvou po sobì následujících proudových odpovìdí zaznamenaných v pøítomnosti vápníku v intervalu 20 s (1 a 2) je zøejmé snížení amplitudy zpùsobené desenzitizací TRPV1 receptorù. Z porovnání normalizovaných odpovìdí 1 a 2 (ve vloženém obrázku pod záznamem Aa) je patrné znaèné zpomalení aktivaèní kinetiky receptorù v dùsledku desenzitizace. (b) Desenzitizované receptory je možné v pøítomnosti vápníku plnì reaktivovat vyššími koncentracemi agonisty (30 μM pro kapsaicin a 100 μM pro piperin).

21

Pùvodní práce

stejným cílem jsou testovány novì syntetizované vaniloidní látky (napø. olvanil a nuvanil) a øada specifických antagonistù TRPV1 receptoru získaná metodami kombinatorické chemie (Rami et al., 2004). Kromì kapsaicinu a resiniferatoxinu patøí mezi pøírodní aktivátory TRPV1 receptoru také piperin, pálivá složka pepøe (Piper nigrum), a kafr získávaný extrakcí z rostliny Cinnamonum camphora (obr. 1B). Výtažky z tìchto rostlin jsou topicky ve formì balzámù a mastí empiricky využívány pro léèbu rùzných bolestivých stavù, ale teprve nedávno bylo dokázáno, že jejich úèinek souvisí s aktivací vaniloidního receptoru (McNamara et al., 2005; Xu et al., 2005). Piperin je látka strukturálnì podobná kapsaicinu a zøejmì se váže na stejné vazebné místo. Úèinek kafru je na pøítomnosti vazebného místa pro kapsaicin nezávislý a pravdìpodobnì aktivuje TRPV1 receptor prostøednictvím jiného vazebného místa. Mezi endogenní vaniloidy aktivující TRPV1 receptor byly zaøazeny tøi skupiny látek, které vznikají metabolizmem kyseliny arachidonové (obr. 1C). Do první skupiny patøí anandamid, endokannabinoid vznikající štìpením N-arachidonoylfostatidylethanolaminu fosfolipázou D. K druhé skupinì patøí N-arachidonoyldopamin (NADA), jehož biosyntetická cesta zùstává zatím neznámá. Další skupinou látek jsou produkty pùsobení lipoxygenázy na kyselinu arachidonovou, tj. kyselina 12-(S)-hydroperoxyeikosatetraenová a 15-(S)-hydroperoxyeikosatetraenová (Van Der Stelt et al., 2004). Jedním z nejnovìjších poznatkù je zjištìní, že také omega-3-polynenasycené mastné kyseliny, ve fyziologických koncentracích 1–10 μM, jako dokosahexaenová kyselina (DHA) (obr. 1B), linolenová (LNA) a eikosapentaenová (EPA) kyselina pøímo aktivují TRPV1. Autoøi práce naznaèují, že pro léèení bolesti je z této skupiny látek nejvhodnìjší LNA, obsažená napø. v lnìném oleji (Matta et al., 2007).

Pùvodní práce

Mnohonásobné zesílení nebo naopak zeslabení signálu na úrovni periferních zakonèení primárních nociceptorù, ale také divergence nebo konvergence úèinkù, jsou zpravidla zprostøedkovány zaøazením G proteinù a druhých poslù do signalizaèních drah. Hlavním bunìèným mechanizmem, jenž se podílí na déletrvajících zmìnách citlivosti nociceptorù k bolestivým podnìtùm (modulaci, senzitizaci/desenzitizaci), je fosforylace proteinù. Tato reverzibilní kovalentní modifikace proteinù je zprostøedkována proteinkinázami, nitrobunìènými enzymy, které pøi své aktivaci odeberou z molekuly adenozintrifosfátu (ATP) jeden fosfát a esterovou vazbou jej pøipojí na hydroxylovou skupinu postranního øetìzce specifických aminokyselinových zbytkù cílového proteinu: serinu, threoninu nebo tyrozinu. Negativní náboj fosfátové skupiny zpùsobí zmìnu bílkovinné struktury komplexu iontového kanálu a ovlivnìní jeho aktivity. Proteiny jsou zpìtnì defosforylovány pùsobením fosfatáz. Mezi nejlépe prostudované mechanizmy, o jejichž souvislosti s desenzitizací TRPV1 receptoru není pochyb, patøí procesy fosforylace/defosforylace zprostøedkované proteinkinázou A (PKA), proteinkinázou C (PKC) a Ca2+/kalmodulin-dependentní kinázou II (CaMKII). Metodami molekulární biologie se podaøilo identifikovat øadu kritických fosforylaèních míst, jež se uplatòují v alosterické modulaci TRPV1 receptoru (obr. 3) a mohou být pøíèinou snížené citlivosti nociceptorù pøi opakované nebo dlouhodobé aplikaci kapsaicinu (Docherty et al., 1996; Koplas et al., 1997; Tominaga et al., 2005). Jiná hypotéza vysvìtlující vznik desenzitizace na molekulární úrovni se opírá o souèasné poznatky o strukturální

interakci TRPV1 receptoru s jinými intracelulárními proteiny, pøedevším kalmodulinu (CaM), který hraje významnou roli v metabolizmu intracelulárního Ca2+. CaM je nejhojnìjším nitrobunìèným proteinem, který se vyskytuje v koncentraci 1–10 μM. Pøibližnì jeho polovina je vázaná na jiné proteiny a druhá je volná. Protein je tvoøen 149 aminokyselinami, které vytváøejí dvì hlavice spojené øetìzcem. Na každé z hlavic jsou dvì receptorová místa pro vazbu Ca2+, takže každá molekula CaM mùže na sebe navázat až ètyøi Ca2+. Tím se CaM mùže stát vysoce pozitivním, což zvyšuje jeho afinitu k intracelulárním enzymùm, pøedevším kalcineurinu (fosfatáze 2B) a k Ca2+/kalmodulin dependentní kináze II (CaMKII), což jsou enzymy, jež øídí fosforylaci TRPV1 receptoru (obr. 3). Existují však dùkazy i o tom, že se CaM konstituènì (tj. bez navázaného Ca2+) váže též k pøesnì vymezeným doménám na obou cytoplazmatických terminálách TRPV1 receptoru (Numazaki et al., 2003; Rosenbaum et al., 2004). Tyto domény jsou v tìsné blízkosti pøedpokládaného vnitøního ústí kanálu, takže pøi membránovém proudu neseném Ca2+ a Na+ mùže dojít k navázání Ca2+ na CaM, èímž se vytvoøí pøekážka, která elektrostatickými silami brání prùtoku Ca2+ do nitra buòky. To se projeví rychlým poklesem membránového proudu, který je vyvolán kapsaicinem a jinými zpùsoby aktivace TRPV1, jako je nocicepèní horko (> 43 °C) nebo depolarizace. Desenzitizaci nelze vyvolat v nepøítomnosti extracelulárního Ca2+, kdy membránové proudy vyvolané kapsaicinem zùstávají o øád vyšší po celou dobu jeho aplikace. Desenzitizaci vyvolanou kapsaicinem je proto nutné považovat za primární projev zpìtnovazebných mechanizmù,

Obr. 3: Modulaèní dráhy uplatòující se v desenzitizaci vaniloidního receptoru TRPV1 na periferním zakonèení nociceptoru. Aktivita TRPV1 receptoru je významnì ovlivòována prostøednictvím signálních drah (upraveno dle Vlachová a Vyklický, 2006): 1) Fosforylace (P) vyvolaná aktivitou metabotropních receptorù spojených s G proteiny (Gq/i, Gq/11 a Gs) prostøednictvím enzymù adenylylcyklázy a fosfolipáz A2, Cγ, Cβ (PLA2, PLCγ, PLCβ). 2) Zvýšení intracelulární koncentrace vápníku v dùsledku aktivace iontových kanálù a výlevu z intracelulárních zdrojù (inozitol-1,4,5,-trisfosfát, IP3), metabolické procesy produkující endogenní agonisty TRPV1. 3) Hydrolýza fosfatidylinozitol-4,5-bisfosfátu (PIP2) vyvolaná aktivací receptoru pro nervový rùstový faktor (NGF) nebo aktivací receptorù spojených s Gq/11 proteiny za úèasti fosfolipázy C vede prostøednictvím diacylglycerolu (DAG) a DAG lipázy k produkci arachidonové kyseliny (AA), lipoxygenázových (LOX) a cyklooxygenázových (COX) produktù, které iontový kanál senzitizují, nebo pøímo aktivují (PGE2, prostaglandin E2, nebo 12-(S)-HPETE). PIP2 reguluje aktivitu TRPV1 receptoru zøejmì pøímou interakcí. Vyznaèena je fosforylace proteinkinázou Cε; PKCε), proteinkinázou A (PKA) a kinázou závislou na vazbì komplexu Ca2+/kalmodulin (CaMKII). Kalmodulin (CaM), jenž se váže na TRPV1 receptor, moduluje jeho aktivitu v závislosti na množství vápníku procházejícího iontovým kanálem. Podobnými, vzájemnì souvisejícími intracelulárními mechanizmy jsou regulovány napìśovì aktivované iontové kanály, napø. draslíkové, TTX-R sodíkové, vápníkové (L-Ca2+) a iontové kanály aktivované kyselým pH (ASIC).

22

BOLEST 2/2007

Pùvodní práce Obr. 4: Molekulární struktura vaniloidního receptoru TRPV1. A) Podjednotka TRPV1 receptoru tvoøená šesti transmembránovými doménami. Vazebné místo pro kapsaicin je mezi 3. a 4. transmembránovou doménou. Na N-konci a na C-konci jsou vyznaèena fosforylaèní místa, seriny (S) a threoniny (T), pro proteinkinázy PKA (èerná koleèka), PKC (èervená koleèka), CaMKII (bílé hvìzdièky) a dvì vazebná místa pro kalmodulin (CaM). N-konec obsahuje tøi ankyrinové domény (Ank1-3). V proximální èásti C-konce je sekvence aminokyselinových zbytkù Ile, Trp, Lys, Leu, Gln, Arg, jež je charakteristická pro TRP receptory, tzv. TRP box. Prostøednictvím pozitivnì nabitých aminokyselinových zbytkù v této oblasti (K698 a R701, viz také zvìtšený obrázek TRP boxu v panelu B) mùže receptor interagovat s negativnì nabitými èástmi spodní lipidové vrstvy bunìèné membrány. B) Model molekulární struktury 5. a 6. transmembránové domény s cytoplazmatickým C-koncem vytvoøený na základì homologie TRPV1 receptoru s draslíkovým kanálem KcsA a FHIT proteinem (Vlachová et al., 2003). Znázornìny jsou moduly dvou protilehlých podjednotek. Oblast TRP boxu a vazebná doména pro kalmodulin na C-konci receptoru jsou zobrazeny ve zvìtšeném mìøítku. Šestá transmembránová doména spolu s èástí klièky spojující oba transmembránové segmenty vytváøí oblast póru iontového kanálu.

které se uplatòují v procesech, jež brání nadmìrnému nahromadìní Ca2+ uvnitø buòky, které by ve svých dùsledcích vedlo k bunìèné apoptóze (obr. 3). K návratu k pùvodnímu, tj. nedesenzitizovanému stavu TRPV1 receptoru mùže dojít až po pøeèerpání Ca2+ z intracelulárního do extracelulárního prostoru, které je zajišśováno pøedevším Ca2+-dependentní ATPázou (CaATP), jež pøenáší Ca2+ aktivním transportem v pomìru 1:1, tj. výmìnou 1 Ca2+ za 1 molekulu ATP. Pøi fyziologické koncentraci ATP pøibližnì 2 mM jde o proces velmi pomalý a takováto koncentrace je za experimentálních podmínek zpravidla nedostateèná k úplnému návratu. Dalším možným vysvìtlením jevu akutní desenzitizace vaniloidního TRPV1 receptoru je zmìna interakce C-konce kanálu s lipidy plazmatické membrány. Tato hypotéza se opírá o experimentální dùkaz, že návrat kanálu z desenzitizovaného do pùvodního stavu je spojen se syntézou membránového lipidu fostatidylinozitolu-4,5-bisfosfátu (PIP2). Bylo dokázáno, že k tomuto dìji je nutná vysoká intracelulární koncentrace ATP (4 mM) a že blokáda enzymù zajišśujících syntézu PIP2, èi zvýšení jeho hydrolýzy stimulací fosfolipázy C naopak tento dìj tlumí. Tyto nálezy naznaèují, že k depleci PIP2 dochází souèasnì s aktivací TRPV1 provázenou vtokem Ca2+ dovnitø buòky a že jeho doplnìní v membránì pùsobením enzymu fosfatidylinositol-4-kinázy urèuje návrat kanálu z desenzitizovaného stavu (Liu et al., 2005). Závìr Využití analgetických úèinkù kapsaicinu pøedstavuje alternativní léèbu bolesti v klinických pøípadech, kdy nesteroidní analgetika nejsou úèinná, anebo existují neúnosná BOLEST 2/2007

rizika vedlejších úèinkù, pøedevším zvýšené krvácivosti. Nové poznatky o molekulárních mechanizmech desenzitizace TRPV1 receptoru na primárních nociceptorech mohou pomoci objasnit nìkteré pøíèiny bolestivých stavù spojených s klinickým využitím kapsaicinu a obohatit náš arzenál prostøedkù k odstranìní rùzných forem bolesti, které ztratily svùj fyziologický význam a staly se utrpením. Práce byla podpoøena Grantovou agenturou Èeské republiky (305/06/0319), Grantem Ministerstva školství, mládeže a tìlovýchovy (1M0517, LC 554, LC06010, MSM6007665808) a Výzkumným projektem AV ÈR (AV0Z 50110509 a AV0Z60870520).

SEZNAM ZKRATEK ATP CaATP CaM CaMKII PIP2 PKA, PKC TRP TRPV1

adenozintrifosfát Ca2+-dependentní ATPáza kalmodulin kalcium/kalmodulin-dependentní proteinkináza II fostatidylinozitol-4,5-bisfosfát proteinkináza A proteinkináza C transient receptor potential transient receptor potential vanilloid receptor-1, vaniloidní (kapsaicinový) receptor podtypu 1 23

Pùvodní práce

Literatura: 1. Appendino G, Szallasi A. Euphorbium: modern research on its active principle, resiniferatoxin, revives an ancient medicine. Life Sci 1997; 60: 681–696. 2. Caterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD, Julius D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature 1997; 389: 816–824. 3. Docherty RJ, Yeats JC, Bevan S, Boddeke HW. Inhibition of calcineurin inhibits the desensitization of capsaicin- evoked currents in cultured dorsal root ganglion neurones from adult rats. Pflugers Arch 1996; 431: 828–837. 4. Hail N, Jr. Mechanisms of vanilloid-induced apoptosis. Apoptosis 2003; 8: 251–262. 5. Hayes P, Meadows HJ, Gunthorpe MJ, Harries MH, Duckworth DM, Cairns W, Harrison DC, Clarke CE, Ellington K, Prinjha RK, Barton AJ, Medhurst AD, Smith GD, Topp S, Murdock P, Sanger GJ, Terrett J, Jenkins O, Benham CD, Randall AD, Gloger IS, Davis JB. Cloning and functional expression of a human orthologue of rat vanilloid receptor-1. Pain 2000; 88: 205–215. 6. Koplas PA, Rosenberg RL, Oxford GS. The role of calcium in the desensitization of capsaicin responses in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurosci 1997; 17: 3525–3537. 7. Liu B, Zhang C, Qin F. Functional recovery from desensitization of vanilloid receptor TRPV1 requires resynthesis of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. J Neurosci 2005; 25: 4835–4843. 8. Lundbaek JA, Birn P, Tape SE, Toombes GE, Sogaard R, Koeppe RE, 2nd, Gruner SM, Hansen AJ, Andersen OS. Capsaicin regulates voltagedependent sodium channels by altering lipid bilayer elasticity. Mol Pharmacol 2005; 68: 680–689.

12. Numazaki M, Tominaga T, Takeuchi K, Murayama N, Toyooka H, Tominaga M. Structural determinant of TRPV1 desensitization interacts with calmodulin. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100: 8002–8006. 13. Rami HK, Gunthorpe MJ. The therapeutic potential of TRPV1 (VR1) antagonists: clinical answers await. Drug Discov Today 2004; 1: 97–104. 14. Rosenbaum T, Gordon-Shaag A, Munari M, Gordon SE. Ca2+/calmodulin modulates TRPV1 activation by capsaicin. J Gen Physiol 2004; 123: 53–62. 15. Sawynok J. Topical and peripherally acting analgesics. Pharmacol Rev 2003; 55: 1–20. 16. Thresh LT. Isolation of capsaicin. Pharm J 1846; 6: 941. 17. Tominaga M, Tominaga T. Structure and function of TRPV1. Pflugers Arch 2005; 451: 143–150. 18. Van Der Stelt M, Di Marzo V. Endovanilloids. Putative endogenous ligands of transient receptor potential vanilloid 1 channels. Eur J Biochem 2004; 271: 1827–1834. 19. Vlachova V, Teisinger J, Sušánková K, Lyfenko A, Ettrich R, Vyklicky L. Functional role of C-terminal cytoplasmic tail of rat vanilloid receptor 1. J Neurosci 2003; 23: 1340–1350. 20. Vlachová V, Vyklický L. Bunìèné a molekulární mechanizmy nocicepce. In: Rokyta R, Kršiak M, Kozák J, eds. Bolest. Tigis, 2006; 42–57. 21. Xu H, Blair NT, Clapham DE. Camphor activates and strongly desensitizes the transient receptor potential vanilloid subtype 1 channel in a vanilloidindependent mechanism. J Neurosci 2005; 25: 8924–8937.

10. McNamara FN, Randall A, Gunthorpe MJ. Effects of piperine, the pungent component of black pepper, at the human vanilloid receptor (TRPV1). Br J Pharmacol 2005; 144: 781–790.

RNDr. Viktorie Vlachová, DrSc. Fyziologický ústav AV ÈR Vídeòská 1083, 142 20 Praha 4 tel.: +420 29644 2711 fax: +420 29644 2488 e-mail: [email protected]

11. Nilius B, Owsianik G, Voets T, Peters JA. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev 2007; 87: 165–217.

Pøišlo do redakce: 2. 4. 2007 Pøijato k publikaci: 15. 4. 2007

9. Matta JA, Miyares RL, Ahern GP. TRPV1 is a novel target for omega-3 polyunsaturated fatty acids. J Physiol 2007; 578: 397–411.

24

BOLEST 2/2007