Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Környezettudományi Centrum
Anaerob fermentált szennyvíziszap biokémiai jellemzése enzimaktivitás vizsgálatokkal Készítette: Vaszkó Virág Környezettudomány szakos hallgató
Témavezetı: Kardos Levente tanársegéd Budapesti Corvinus Egyetem Kertészettudományi Kar Talajtan és Vízgazdálkodás Tanszék
Belsı konzulens: Dr. Barkács Katalin adjunktus Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Analitikai Kémiai Tanszék
2009. június 19.
Problémafelvetés, célkitőzés • Fosszilis energiahordozók (kıszén, kıolaj, földgáz) használata ma még meghatározók az energiaellátásban • Hatásaik veszélyesek a földi környezetre: CO2 → üvegházhatás ⇒ globális éghajlatváltozás SO2 → savas esık kıolaj → szállításkor olajszennyezés • Környezetkímélı megoldás → megújuló energiaforrások (vízenergia, napenergia, ár-apály, geotermikus energia, biogáz, biomassza, szélenergia) használata • A biogáz energiatartalma nagy, így az „energiaválságban” kitőnıen alkalmazható elektromos és hıenergiaként • Anaerob rothasztás folyamatának vizsgálata enzimaktivitás mérésekkel 2009.06.19.
2
A biogáz és képzıdése • Szerves anyagok baktériumok által történı anaerob rothasztása során keletkezik. • Összetétele: metán (~70 %), szén-dioxid (~30 %), kénhidrogén (H2S), ammónia (NH3) és egyéb gázok • Biogáz elıállítható: kommunális hulladékból, szennyvíziszapból, mezıgazdasági termékekbıl (növényi, állati), élelmiszeripari melléktermékekbıl. • A biogáz felhasználása: meleg víz, generátor ⇒ elektromos energia, hıforrás (közvetlen elégetés gázkazánokban), motorüzemanyag (CO2 eltávolítása után). • Szennyvíziszap anaerob fermentációjából nagy mennyiségő biogáz nyerhetı → szennyvíztelepek helybeni és lakossági energiaellátás
2009.06.19.
3
A lebontást meghatározó legfontosabb tényezık • • • • • •
Szubsztrát összetétel Szubsztrát terhelés Hımérséklet (mezofil: ~ 35ºC, termofil: ~ 55ºC) Oltóanyagban lévı mikroorganizmusok faja, száma Toxikus anyagok Üzemeltetési körülmények (tartózkodási idı, keveredés, tartály kialakítás)
2009.06.19.
4
Az anaerob lebontás •
3 lépcsıre bontható: 1. lépcsı: a hidrolízis – a savtermelı baktériumok extracelluláris enzimjei végzik (vízoldható vegyületek keletkeznek) 2. lépcsı: • acidogenezis folyamata - a hidrolízis végtermékei ecetsavvá és nagyobb molekulatömegő zsírsavakká alakulnak (ecetsav (CH3COOH), propionsav (C2H5COOH), tejsav (C3H6O3), vajsav (C3H7COOH) , CO2, H2, stb. képzıdik • acetogenezis folyamata - az elızı lépések intermedierjei (propionsav, vajsav stb.) ecetsavvá alakulnak 3. lépcsı: metánképzıdés folyamata - elızı folyamatok köztitermékeibıl, metanogén baktériumok által metán (CH4) és szén-dioxid (CO2) • Az iszaprothasztás gyakorlatában kevert reaktorokat alkalmaznak
2009.06.19.
5
Az anaerob lebontás vázlata Nyers iszap szénhidrátok
proteinek
zsírok
monoszacharidok
peptidek,aminosavak
glicerin, zsírsavak Baktériumszintézis
propionsav, vajsav, alkoholok, stb.
H2, CO2, ecetsav
NH4+, H2S, stb.
Biogáz Baktériumszintézis 2009.06.19.
H2, CO2, ecetsav
~70% CH4, ~30% CO2 Baktériumszintézis
6
Szennyvíztelepi vizsgálatok A folyamatokat ellenırzı paraméterekkel és enzimaktivitás vizsgálatokkal lehet nyomon követni: • Klasszikus ellenırzı paraméterek: • száraz- és szerves anyag (MSZ 318/3-79), • pH (MSZ 318/4-79), • illósav (Standard Methods 16th Edition,1985.), • lúgosság (Standard Methods 16th Edition,1985.), • gázösszetétel (MSZ 5313 – 57). • Enzimaktivitás mérések: • dehidrogenáz (MSZ-08-1721/3-86), • proteáz (Thiel, P.G. és Hattingh W.H.J, 1967.), • lipáz (Vorderwülbecke, T. et al., 1992.), • celluláz (Hofmann, 1955.). 2009.06.19.
7
Üzemi anaerob fermentorok (FCSM Zrt. Délpesti Szennyvíztisztító Telep)
2009.06.19.
8
A szennyvíztelepen alkalmazott enzimaktivitás vizsgálatok Dehidrogenáz enzimaktivitás meghatározása • A dehidrogenáz aktivitás összaktivitás jellemzı paraméter, a hidrogén átvitelét katalizálja a redukált hidrogén donorról az oxidált hidrogén akceptor szubsztrátra. • Mesterséges hidrogén akceptor: 2,3,5-trifenil-tetrazóliumklorid (TTC) → az enzim által katalizált folyamat eredményeképpen vörös színő trifenil-formazánná (TF) redukálódik ⇒ mennyisége a színreakció után spektrofotometriásan mérhetı. • A mérés elve: rothasztott szennyvíziszap + telített NaHCO3 (puffer) + TTC-oldat (szubsztrát) → inkubálás 1 órán keresztül 37 ºC-on ⇒ a biokémiai folyamat leállítása etanollal → szőrés ⇒ abszorbancia mérése 485 nm-en etanollal szemben. 2009.06.19.
9
Dehidrogenáz enzimaktivitás mérése során alkalmazott változtatások Mérések során változtatott paraméterek: • Iszapminta térfogata: 0,5, 1,0, 2,0 ml (szárazanyag-tartalom: ~30-50 g/kg) • Inkubálás hımérséklete: szobahımérséklet, 37, 45 és 55 ºC Mérési eredmények: • Iszaptérfogat: 1,0 ml • Ideális inkubálási hımérséklet: 37 ºC → az inkubálás hımérséklete függ az anaerob rothasztás körülményeitıl (mezofil vagy termofil) • Kevésbé volt érzékeny a mérési körülmények változtatására.
2009.06.19.
10
mg Formazán/g sz.a.iszap*h
A Formazán-koncentráció változása 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0
10
20
30
40
50
60
Hımérséklet
2009.06.19.
11
A szennyvíztelepen alkalmazott enzimaktivitás vizsgálatok Proteáz enzimaktivitás meghatározása • A proteázok a fehérjékben található peptidkötések hidrolízise révén bontják le a fehérjéket kisebb peptidekre, majd aminosavakra. • A mérés elve: rothasztott szennyvíziszap + kazein-oldat (szubsztrát) → minták: 1/3 rész iszapminta + 1/3 rész szubsztrát + 1/3 rész desztillált víz ⇒ inkubálás 1 órán kersztül szobahımérsékleten → reakció leállítása triklórecetsavval → szőrés → lúgosítás → szőrés → hígított Folin-reagens hozzáadása után abszorbancia mérése 660 nm-en a vak mintával szemben (kék színő oldat)
2009.06.19.
12
Proteáz enzimaktivitás mérése során alkalmazott változtatások Mérések során változtatott paraméterek: • Iszapminta térfogata: elıször 1,0, 2,0 és 4,0 ml, késıbb 0,5, 1,0 és 2,0 ml, végül csak 1,0 és 2,0 ml • Inkubálás hımérséklete: szobahımérsékletrıl 37 ºC-ra • Inkubálás leállítása triklórecetsavval: 10 %-os helyett 15 és 20 %-os alkalmazása • Töményebb NaOH-oldat: 0,5 M helyett 1,0, 1,5 és 2,0 Mos oldatok • Szőrés: vákuumszőrés (pórusátmérı: 0,45 µm) • Folin-reagens hozzáadásával kialakuló kék szín idıfüggése
2009.06.19.
13
Mérési eredmények • Mintatérfogatok: 1,0 és 2,0 ml → megbízhatóbb adatok • Ideális inkubálási hımérséklet: 37 ºC → nagyobb biológiai aktivitás, azaz nagyobb enzimaktivitás értékek • A reakció leállításához 15 %-os triklórecetsav-oldat • Lúgosításhoz 1,0 M-os NaOH-oldat • Folin-reagens hozzáadása után 15 perc várakozás a kialakuló kék szín stabilizálódásához
2009.06.19.
14
Folin-reagens idıbeli stabilitásának kialakulása Abszorbancia
Minta 0
5 perc 10 perc
15perc 25perc 30perc 35perc
vak1
0,621
0,641
0,648
0,643
0,641
0,639
0,642
vak2
0,686
0,724
0,740
0,728
0,728
0,727
0,725
1
0,793
0,796
0,802
0,798
0,790
0,785
0,783
2
0,712
0,711
0,714
0,706
0,700
0,695
0,693
3
0,770
0,774
0,774
0,771
0,771
0,763
0,759
2009.06.19.
15
Összefoglalás • Dehidrogenáz: viszonylag homogén eredmények • Proteáz: különbözı mintákban eltérı eredmények, a reakciók érzékenyen reagáltak a változtatott paraméterekre ⇒ további elemzések szükségesek • Laboratóriumban és üzemi gyakorlatban egyaránt fontos a mérési módszerek további fejlesztése, egyszerősítése, tökéletesítése (dehidrogenáz, proteáz, celluláz, lipáz)
2009.06.19.
16
Köszönöm a figyelmet!
2009.06.19.
17
