Gene rearrangements pasien limfoma folikular Indonesia
Amaylia Oehadian ,* Naoki Koide,** Pandji Irani Fianza,* Trinugroho Heri Fadjari,* Rachmat Sumantri,* Iman Supandiman,* & Takashi Yokochi**
*Sub Divisi Hematologi Onkologi Medik , Bagian Penyakit Dalam Fakultas Kedokteran Universitas Padjadjaran , Rumah Sakit Hasan Sadikin, Bandung, Indonesia. **Department of Microbiology and Immunology and Research Center for Infectious Disease, Aichi Medical University School of Medicine, Nagakute, Aichi 480-1195, Japan
ABSTRAK Tujuan : Gene rearrangements mempunyai peranan penting dalam pengelolaan limfoma. Kami meneliti rearrangements B-cell leukaemia/lymphoma 2 (BCL2), BCL6 dan Paired homeobox 5 (PAX5) gen pada pasien-pasien limfoma folikular Indonesia. Metode: Gene rearrangements diperiksa dengan berbagai metode polymerase chain reaction (PCR) menggunakan 24 sampel DNA dari darah perifer. Hasil : BCL2 rearrangement ditemukan pada 58 % ( 14 dari 24 pasien), 8 pada mbr (major breakpoint region), 2 pada mcr (minor cluster region) dan 4 pada icr (intermediate cluster region). Tidak didapatkan rearrangement pada gen BCL6 dan PAX5. Terdapat perbedaan bermakna dalam keterlibatan limpa antara pasien dengan dan tanpa
BCL-2
rearrangement ( 50 % vs 11%, p=0.04). Terdapat korelasi antara BCL-2 rearrangement dan keterlibatan limpa (OR=9) dan anemia (OR=2.3). Kesimpulan : Frekwensi BCL2 rearrangement pada limfoma folikular di Indonesia lebih tinggi dibandingkan dengan laporan pada daerah Asia lainnya. (58 % vs 48 % ). Metoda pemeriksaan dengan menggunakan DNA dari darah perifer dapat berguna dalam diagnosis molekular limfoma folikular.
Kata-kata kunci : Gene rearrangements, BCL2, BCL6, PAX5, limfoma folikular .
PENDAHULUAN Diagnostik molekuler limfoma diperlukan untuk konfirmasi diagnostik, evaluasi prognostik secara akurat dan sebagai petanda minimal residual disease (MRD). Abnormalitas genetik limfoma maligna sering tidak mudah terdeteksi dengan analisis kariotipe, sehingga diperlukan test diagnostik molekuler. Polymerase chain reaction (PCR)
1
telah banyak menggantikan metode Southern blot test. PCR hanya memerlukan sedikit DNA, relatif cepat dan dapat mendeteksi adanya abnormalitas dalam jumlah kecil.1 Rearrangement B-cell leukaemia/lymphoma 2 (BCL2) yang disebabkan translokasi gen BCL2 pada kromosom 18q21 ke lokus gen immunoglobulin heavy chain (IgH) pada 14q32
(t(14;18)(q32;q21)) ditemukan pada in 85 % limfoma folikular (LF). Sebagai
akibatnya, gen BCL2 berada dalam pengaruh kontrol IgH E enchancer yang menyebabkan ekspresi berlebihan protein BCL2 yang bersifat anti apoptosis. Hal ini menyebabkan supresi apoptosis yang diduga merupakan tahap awal transformasi maligna yang memfasilitasi akumulasi lesi genetik lebih lanjut . Proses ini selanjutnya menyebabkan tidak terkontrolnya proliferasi sel dan terjadinya progresifitas menjadi LF. 2,3 Frekwensi translokasi BCL2 pada LF bervariasi pada setiap tempat, di Asia ( Jepang dan Hongkong) 48 %, Eropa 55 % dan Amerika Serikat 79 %.4 Rearrangements atau mutasi
lainnya diperlukan dalam terjadinya LF, seperti
translokasi gen myc, Paired homeobox 5 (PAX5) dan BCL6 atau inaktivasi p53 . Gen BCL6 pada 3q27 menghasilkan protein yang berperan dalam regulasi dan diferensiasi sel limfosit B pada sentrum germinativum. Sebagai akibat translokasi
BCL6 , tidak terjadi
down-
regulation fisiologik gen BCL6 yang akan menghambat diferensiasi limfosit. Mutasi pada gen BCL6 merupakan mutasi yang paling sering ditemukan pada diffuse large B-cell lymphomas. Pada LF, juga terdapat translokasi BCL6 dengan frekwensi yang lebih rendah.4 Gen PAX5 mengkode faktor transkripsi B-cell-specific activator protein (BSAP) yang merupakan regulator pertumbuhan dan diferensiasi sel limfosit B. Rearrangenennt PAX5 menyebabkan perpindahan posisi PAX5 ke gen IgH : t(9;14)(p13;q32).5,6 Translokasi ini dilaporkan pada limfoma limfoplasmasitoid. Tingginya kadar BSAP juga ditemukan pada limfoma sel besar dan beberapa LF. Hal ini merupakan akibat deregulasi ekspresi gen dan menunjukkan kemungkinan terlibatnya PAX5 pada keganasan sel B tertentu.7 Monoklonalitas IgH gene rearrangement telah digunakan untuk membedakan sel B maligna dengan sel B normal . Secara khusus, complementarity determining regions (CDRs ) pada variable region gen IgH mengkode antigen binding site yang unik untuk setiap klon sel B .CDR III pada CDRs merupakan petanda klonal bagi setiap sel B.8,9,10 Pada penelitian sebelumnya, kami melaporkan metode baru yang sensitif dengan menggunakan seminested PCR dan analisis heterodupleks untuk mendeteksi monoklonalitas IgH rearrangement pada DNA lekosit darah perifer pasien LF. Metode ini dapat mendeteksi 1 sel ganas dalam 10.000 sel mononuklear normal pada darah perifer. Dengan menggunakan metode ini kami menemukan sel limfoma yang bersirkulasi pada 79% ( 19 dari 24 ) pasien limfoma.11 Sepanjang yang kami ketahui, belum ada laporan mengenai rearrangements gen pada LF di Indonesia . Kami melaporkan rearrangement gen BCL2, BCL6 dan PAX5
2
dengan menggunakan sampel DNA darah perifer yang sama dengan penelitian yang terdahulu. 11
BAHAN DAN METODE Pasien Dua puluh empat pasien dengan gambaran histologi LF yang berobat di Sub Bagian Hematologi dan Medikal Onkologi Bagian Penyakit Dalam, Rumah Sakit Hasan Sadikin Bandung, antara bulan Agustus sampai November 2003 diikutsetakan dalam penelitian. Penelitian ini dilaksanakan sesuai dengan prinsip Deklarasi Helsinki dan telah mendapat persetujuan Komite Etik Rumah Sakit Hasan Sadikin. Karakteristik klinik pasien dapat dilihat pada tabel 1. Tabel 1. Karakteristik klinik 24 pasien LF Karakteristik klinik
n
%
Laki-laki
18
75
Perempuan
6
25
I
3
13
II
2
8
III
11
46
IV
8
33
Ya
18
75
Tidak
6
25
Ya
8
33
Tidak
16
67
Ya
7
29
Tidak
17
71
10
42
Lekopeni (lekosit < 4 x 10 /L)
3
13
Thrombositopeni (Thr < 150 x 109/L)
1
4
Jenis kelamin
Stadium klinis Ann Arbor
Simptom B
Keterlibatan limpa
Keterlibatan ekstranodal
Abnormalitas hematologi Anemi (Hb < 12 gr/L) 9
3
Ekstraksi DNA Untuk isolasi DNA, dilakukan ekstraksi genom DNA dengan berat molekul tinggi menggunakan metode salting out dari lekosit darah perifer dengan antikoagulan heparin.12 Ekstraksi DNA dilakukan di Bagian Patologi Klinik , Rumah Sakit Hasan Sadikin , Bandung.
Amplifikasi PCR PCR dilakukan dengan iCycler Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) di Department of Microbiology and Immunology, Aichi Medical University School of Medicine, Nagakute, Aichi, Jepang. Sintesa oligonucleotide primers dilakukan oleh Rikaken Co., Nagoya, Jepang. Primer sequences dapat dilihat pada tabel 2.
Tabel 2. Oligonucleotide primers sequence untuk PCR Primer
Nucleotide sequence 5’>3’
Kepustakaan
s-MBR
GAGAGTTGCTTTACGTGGCC
2
s-mcr
CGCTTGACTCCTTTACGTGC
2
s-icr
TCGTTCTCAGTAAGTGAGAGTGC
2
s-JH
ACCTGAGGAGACGGTGACC
2
vExon3up
CAACGATGCCTACTTTGCCACCC
2
vExon3low ATCCCGTACATGACGTCACAGCG
2
BCL6/02
CAATCCCATCGGCTCCAAGGTTAGTGTGTGCATGT
13
BCL6/04
TTCATACGACCCCAGACATGGAATCACTCTTTAGA
13
KIS/01
AAGTTGTCCTGGGCTTGGGGTCTAAGTTTATCCTT
13
C/01
TGCTGCTGATGTCAGAGTTGTTCTTGTATTTCCAG
13
C/01
AAGATGGTGATGGTCGTCCACAGCCCGTCCAG
13
C/02
AGGGCACGGTCACCACGCTGCTGAGGGAGTAGAGT
13
C/01
TCGTGTAGTGCTTCACGTGGCATGTCACGGACTTG
13
C/01
CCAGGCAGCCCAGAGTCACGGAGGTGGCATTGGAG
13
GCGTCAGGGTGCTGCTGAGGCTGTAGGTGCTGTCC
13
TGGCCGCGTACTTGTTGTTGCTTTGTTTGGAGGGT
13
C/01 C/02
4
Rearrangement BCL2 : PCR untuk rearrangement BCL2 dilakukan dengan menggunakan 0.5 unit Taq polimerase (Ex TagTM, Takara Bio Inc, Otsu, Jepang) dalam 20 l campuran yang terdiri dari 2 l 10x Ex TagTM bufer, 1.6 l campuran dNTP (masing-masing 2.5 mM ), 1.0 M primer dan 1 g DNA template. Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen BCL-2 adalah s- Major Breakpoint Region (s-MBR) , s- Minor Cluster Region (s-mcr ) and s-Intermediate Cluster Region (s-icr) sebagai forward primers dan s-JH sebagai backward primer. Kondisi PCR yang digunakan adalah : untuk MBR: denaturasi inisial 98oC selama 3 menit; 30 siklus terdiri dari
10 detik pada
98oC, 30 detik pada 61oC, 30 detik pada at 72oC; untuk mcr: denaturasi inisial 98oC selama 3 menit; 30 siklus terdiri dari 10 detik pada 98oC, 30 detik pada 58oC, 1 menit pada 72oC; untuk icr : denaturasi inisial 98oC selama 3 menit; 30 siklus terdiri dari 10 detik pada 98oC, 30 detik pada 58oC, 30 detik pada 72oC. Untuk kontrol reaksi PCR, digunakan vExon3up dan vExon3low primers (house keeping gene).2
Rearrangement BCL6 dan PAX5: Long distance PCR (LD-PCR) untuk rearrangement gen BCL6 dan PAX5 dilakukan dengan menggunakan 2.5 unit LA Tag polimerase (TaKaRa LA TagTM) dalam 50 l campuran yang mengandung 5 l 10x LA PCRTM Bufer II (Mg2+ free), 5 l 25 mM MgCl2, 8 l campuran dNTP (masing-masing 2.5 M ), 1.0 M primer dan 1 g DNA template. Dilakukan evaluasi rearrangement gen BCL6 pada 7 lokasi dengan menggunakan kombinasi primers : BCL6/04-C/03, BCL6/04-C/01, BCL6/04-C/02, BCL6/04-C/01, BCL6/04C/01, BCL6/02-C/01 dan BCL6/02-C/02.13 Rearrangement gen PAX5 dievaluasi pada 5 lokasi dengan menggunakan kombinasi primers: KIS/01-C/03, KIS/01-C/01, KIS/01-C/02, KIS/01-C/01, and KIS/01- C/01.13 Kondisi PCR untuk mendeteksi kedua rearrangement adalah : denaturasi inisial pada 94 oC selama 2 menit ; 5 siklus yang terdiri dari 20 detik pada 98 oC, 20 menit pada 72 oC; 5 siklus yang terdiri dari 20 detik pada 98 oC, 20 menit pada 70 oC; 4 siklus yang terdiri dari 20 detik pada 98 oC, 20 menit pada 68 oC; 16 siklus yang terdiri dari 20 menit pada 98 oC, 20 menit pada 68 oC dengan 00.15 auto-segmen extension; 1 siklus 10 menit pada 72 oC.13
Analisis statistik Karakteristik klinik dan hasil pemeriksaan molekular ditabulasi dan dibandingkan dengan menggunakan test Fisher Exact . Korelasi antara keduanya dievaluasi dengan odd rasio.
5
HASIL
Translokasi gen BCL2 Translokasi gen BCL2 ditemukan pada 58 % (14/24) pasien. Lokasi breakpoint adalah MBR pada 33 % (8 /24), mcr 8% (2 /24) dan icr 17 % (4 /24) pasien. Gambar hasil PCR dapat dilihat pada gambar 1.
Gambar 1 . Hasil PCR rearrangement gen BCL2. Tanpa rearrangement (A), rearrangement BCL2 pada Major Breakpoint Region (MBR) (B), rearrangement BCL2 pada minor cluster region (mcr )(C) dan rearrangement BCL2 pada intermediate cluster region (icr) (D). M, 100 bp petanda ukuran DNA ; baris 1, house keeping gene; baris 2, MBR (180-275 bp); baris 3, mcr (580-630 bp); baris 4, icr (73-134 bp).
6
Perbandingan karakteristik klinik antara pasien dengan dan tanpa rearrangement BCL2 dapat dilihat pada tabel 3.
Tabel 3. Perbandingan karakteristik pasien berdasarkan rearrangement BCL2
Rearrangement BCL2 Karakteristik
(+)
Rearragement BCL2 (-)
n =14 Umur : rerata
P
n = 10
48.2 + 15.2 tahun
59 + 13.1 tahun
> 0.05
median
51 tahun
57 tahun
> 0.05
kisaran
16-66 tahun
40-78 tahun
Jenis kelamin : laki-laki
79 % (n=11)
70 % (n=7)
21 % (n=3)
30 % (n=3)
14 % (n=2)
10 % (n=1)
> 0.05
II
7 % (n=1)
10 % (n=1)
> 0.05
III
43 % (n=6)
50 % (n=5)
> 0.05
IV
36 % (n=5)
30 % (n=3)
> 0.05
Keterlibatan ekstranodal
21 % (n=3)
40 % (n=4)
> 0.05
Simptom B
71 % (n=10)
80 % (n=8)
> 0.05
Keterlibatan limpa
50 % (n=7)
10 % (n=1)
0.04
perempuan Stadium : I
> 0.05
Hematologi : -
anemi
50 % (n=7)
30 % (n=3)
> 0.05
-
leukopeni
21 % (n=3)
0 % (n=0)
> 0.05
-
trombositopeni
36 % (n=5)
10 % (n=1)
> 0.05
Rearrangement gen BCL6 dan PAX5 Rearrangement gen BCL6 dievaluasi pada 5 regio, rearrangement gen PAX5 dievaluasi pada 7 regio. Kami tidak menemukan adanya rearrangement gen BCL6 dan PAX5 pada semua sampel DNA.
DISKUSI Pada sebagian besar pasien LF, bahkan pada stadium dini mempunyai sel-sel dengan translokasi BCL2 dalam sirkulasi darah. Hal ini menjadi dasar untuk dapat melakukan identifikasi dan klasifikasi limfoma berdasarkan translokasi BCL2 pada sirkulasi darah tanpa
7
melakukan pemeriksaan langsung pada jaringan tumor. Kesesuain hasil pemeriksaan antara sumsum tulang/darah perifer dengan kelejar getah bening adalah sebsesar 94.2 %.
14
Translokasi BCL2 dilaporkan juga terjadi pada individu sehat. Meskipun demikian, bila hanya menggunakan 1 ug DNA, seperti yang kami gunakan pada penelitian ini, translokasi BCL2 dalam darah perifer hanya terdeteksi pada 6 % individu sehat.15 Frekwensi translokasi BCL2 pada individu sehati ini akan lebih rendah bila digunakan bahan pemeriksaan seluruh sel lekosit perifer dan bukan hanya sel limfosit B.14 Pada penelitian terdahulu, kami menemukan sel ganas yang bersirkulasi dengan mendeteksi monoklonalitas rearrangement IgH di CDRIII pada 79% (19 dari 24) DNA darah perifer pasien LF.11 Berdasarkan hal ini, kami melakukan penelitian lanjutan untuk mendeteksi rearrangements
gen dengan
menggunakan sampel DNA yang sama. Variasi geografi dalam translokasi BCL2 telah dirangkum berdasarkan 14 penelitian. Frekwensi translokasi BCL2 di Asia, Eropa dan Amerika Serikat adalah masing-masing 48 %, 55 % dan 79 %.4 Frekwensi translokasi BCL2 pada pasien LF Indonesia (58.3 %) tampaknya sedikit lebih tinggi dibandingkan daerah Asia lainnya , kira-kira sama dengan Eropa dan lebih rendah dibandingkan dengan Amerika Serikat. Perbedaan ini kemungkinan disebabkan karena dilakukannya pemeriksaan icr region breakpoint pada penelitian kami yang tidak dilakukan pada penelitian-penelitian sebelumnya . Oleh sebab itu, kami menemukan 4 pasien yang mempunyai BCL2 breakpoint di luar regio yang paling banyak ditemukan (MBR dan mcr). Hasil pemeriksaan lokasi breakpoint translokasi BCL2 pada penelitian ini dengan menggunakan DNA dari darah perifer hampir sama dengan penelitian terdahulu dengan menggunakan DNA dari jaringan tumor kelenjar getah bening. Perbandingan lokasi rearrangement BCL2 antara penelitian terdahulu dan penelitian kami adalah : MBR (32.2 % vs 33 %), mcr (3.4 % vs 8 %), dan icr (17 % vs 17 %).2 Hal ini menunjukkan bahwa sampel DNA dari darah perifer dapat digunakan untuk deteksi rearrangement BCL2 dengan hasil yang sebanding dengan sampel DNA dari jaringan tumor. Perbandingan antara penelitian terdahulu yang dilakukan Lopez Guilermo dkk dengan penelitian ini dalam memeriksa translokasi BCL2 mengunakan darah perifer adalah MBR (71 % vs 33 %), mcr (11 % vs 8 %), jumlah total translokasi 81 % vs 58 %.14 Penelitian terdahulu yang menggunakan darah perifer tidak memeriksa translokasi pada lokasi icr. Didapatkannya frekwensi translokasi BCL2 yang lebih rendah pada penelitian kami tampaknya disebabkan perbedaan lokasi geografi ( Amerika Serikat vs Indonesia/Asia). Dengan menggabungkan data dari penelitian kami sebelumnya dan data penelitian kami saat ini, kami mendapatkan 11 pasien dengan rearrangement IgH dan BCL2, 3 pasien dengan rearrangement BCL2 saja, 8 pasien dengan rearrangement IgH saja dan 2 pasien
8
tanpa rearrangement gen.
11
Sehingga dengan memeriksa IgH dan/atau BCL2 kami dapat
mendeteksi rearrangement gen pada 92 % (22 dari 24) pasien. Makna klinik rearrangement BCL2 pada LF masih kontroversial. Penelitian terdahulu hanya menemukan bahwa LF pasien dengan rearrangement BCL2 lebih muda dibandingkan dengan pasien tanpa rearrangement BCL2. Tidak terdapat perbedaan berdasarkan ada tidaknya rearrangement BCL2 dalam hal besarnya respon komplit, waktu terjadinya kegagalan terapi, kelangsungan hidup atau karakteristik klinis lainnya.
16
Pada
penelitian kami, pasien dengan rearrangement BCL2 cenderung lebih muda dibandingkan pasien tanpa rearrangement BCL2 (48 vs 59 tahun), tetapi tidak bermakna secara statistik. Kami menemukan adanya perbedaan bermakna dalam keterlibatan limpa antara pasien dengan dan tanpa rearrangement (50% vs 10%, p 0.04) ( tabel 3). Reararangement BCL-2 berkorelasi dengan keterlibatan limpa (OR 9) dan anemia (OR 2.3). Sampai saat ini belum diketahui bagaimana rearrangement BCL2 berkorelasi dengan abnormalitas-abnormalitas ini. Rearrangement gen PAX5 didapatkan pada kira-kira setengah kasus limfoma limfoplasmasitik , juga pada sebagian kecil limfoma marginal zone dan diffuse large B cell lymphoma. Rerrangement gen BCL6 ditemikan pada sepertiga kasus diffuse large B cell lymphomas, juga kadang-kadang ditemukan pada LF dan limfoma marginal zone.1 Pada penelitian ini, kami tidak menemukan adanya rearrangement gen PAX5 atau BCL6. Hal ini kemungkinan disebabkan karena perbedaan etnik, geografi atau adanya rearrangement gen lain yang berperan pada LF pasien Indonesia.
KESIMPULAN Rearrangement gen BCL2 banyak ditemukan pada LF pasien Indonesia, sedikit lebih banyak dibandingkan daerah Asia lainnya. Pada penelitian ini tidak ditemukan rearrangement gen BCL6 dan PAX5. DNA dari darah perifer dapat digunakan sebagai alternatif bahan pemeriksaan untuk deteksi rearrangements gen.
9
DAFTAR PUSTAKA 1. Arber AA. Molecular diagnostic approach to non-Hodgkin’s lymphoma. J Mol Diag 2000;2:178-90. 2. Hegyi AA, Hochreutener B, Abdou MT, Hegyi I, Zimmermann MTD, Kurrer MO, et al. High frequency of t(14;18)-translocation breakpoints outside of major breakpoint and minor cluster regions in follicular lymphomas. Am J Pathol 2002;160:823-32. 3. Bohling SD, King TC, Wittwer CT, Johnson KSJE. Rapid simultaneous amplification and detection of the MBR/JH chromosomal translocation by fluorescence melting curve analysis. Am J Pathol 1999;154:97-103. 4. Biagi JJ, Seymour JF. Insights into the molecular pathogenesis of follicular lymphoma arising from analysis of geographic variation. Blood 2002;99:4265-75. 5. Ohno H, Ueda C, Akasaka T. The t(9;14)(p13;q32) translocation in B-cell nonHodgkin’s lymphoma. Leuk lymphoma 2000;36:435-45. 6. Hamada T, Yonetani N, Ueda C, Maesako Y, Akasaka H, Akasaka T , et al. Expression of the PAX5/BSAP transcription factor in haematological tumour cells and further molecular characterization of the t(9;14)(p13;q32) translocation in B-cell non-Hodgkin’s lymphoma. Br J Haematol 1998;102:691-700. 7. Krenacs L, Himmelmann AW, Mastinez LQ, Fest T, Riva A, Wellmann A , et al. Transcription factor B-cell specific
activator protein (BSAP) is differentially
expressed in B cells and in subsets of B-cell lymphomas. Blood 1998;92:1308-16. 8. Schwartz
RS.
Shattuck
lecture-Diversity
of
the
immune
repertoire
and
immunoregulation . N Engl J Med 2003;348:1017-26. 9. Voena C, Ladetto , Astolfi M, Provan D, Gribben JG, Boccadoro M, et al. A novel nested-PCR strategy for detection of rearranged immunoglobulin heavy -chain genes in B cell tumors. Leukemia 1997;11:1193-8. 10. Yamauchi A, Tomita Y, Miwa H, Sakamoto H, Sugiyama H, Aozasa K. Clonal evolution of gastric lymphoma of mucosa-associated lymphoid tissue type. Mod Pathol 2001;14:957-62. 11. Oehadian A, Koide N, Mu MM, Hassan F, Yoshida T, Yokochi T. Seminested polymerase chain reaction and heteroduplex analysis detects the monoclonality of IgH rearrangement in
follicular lymphoma patients with high sensitivity.
Haematologica 2005 ;90:272-3. 12. Kendall TL, Byerley DJ, Dean R.. Isolation of DNA from blood. Anal Biochem 1991;15:74-6. 13. Akasaka T, Akasaka H, Ohno H. Polymerase chain reaction amplification of long DNA targets: Application to analysis of chromosomal translocations in human B-cell tumors (Review). Int J Oncol 1998;12:113-21.
10
14. Guillermo AL, Cabanillas F, McDonnell TI, McLaughin P, Smith T, PughW, et al. Correlation of Bcl-2 rearrangement with clinical characteristics and outcome in indolent follicular lymphoma. Blood 1999;9:3081-7. 15. Dolken G, Illerhaus G, Hirt C, Mertelsmann R. BCL-2/JH rearrangements in circulating B cells of healthy blood donors and patients with non-malignant diseases. J Clin Oncol 1996;14:1333-44. 16. Montoto S, Guillermo AL, Colomer D, Esteve J, Bosch F, Ferber A, et al. Incidence and clinical significance of Bcl-2/IgH rearrangements in follicular lymphoma. Leuk Lymphoma 2003;44:71-6.
11
12
