Állatkísérletek az Orvostudományban Életjelenségek speciális vizsgáló módszerei Dr. Kaszaki József
Sebészeti Műtéttani Intézet SZTE ÁOK graduális oktatás 2013 -2014 / 1
Mitől függ a perctérfogat? Szívfrekvencia
Előterhelés (Preload)
Utóterhelés (Afterload)
CVP Kontraktilitás dP/dTmax
Perifériás érellenállás SVR
1. A perctérfogatból számolható további paraméterek
Oxigén szállítás (DO2) Oxigén fogyasztás (VO2) Feltétel: Az artériás és vénás oxigén szaturáció meghatározása
Oxigénnel telített hemoglobin százalékos aránya a vérben
70-80 %
95-100 %
Periféria
Oxygen szállítás (DO2) DO2 : a keringés által szállított oxygén mennyiség Összetevői: ■ Oxygén tartalom a. Hemoglobin (Hb) b. Szaturáció (SO2); a teljesen szaturált hemoglobin 1.38 ml oxygént szállít (per gram) ■ Perctérfogat (C.O.) DO2 [ml/min] = CO x [(1,38 x Hb x SaO2) + (0,003 x paO2)]
Oxigén fogyasztás = perctérfogat x (artériás – vénás oxigén tartalom) Oxigén szállítás (delivery; DO2)
Oxigén fogyasztás (consumption; VO2)
Body/Organs VO2 [ml/min] = CO x 1,38 x Hb x (SaO2-SvO2) Ha a Hgb, CO és az A/V szaturáció ismert, a VO2 kiszámítható anélkül, hogy a PO2 értéket ismernénk (oldott O2 = általában a teljes O2 tartalom < 0.3 Vol%-a):
2. Kis vérköri nyomás monitorozás Pulmonális artéria nyomás
Pulmonary artery
Pulmonális artéria katéterezés – Swan Ganz katéterrel
Sárga: PA nyomás Kék: CVP és injektálás Fehér: termisztor kábel Piros: katétervég ballon felfújás
A Swan Ganz katéter pozíciója a jobb szívfélben
Artéria pulmonális nyomás és az ék (wedge) nyomás görbéje
Pulmonalis kapilláris éknyomás: Hemodinamikailag a bal kamra preloadjára utal, de a mérése körüli bizonytalanságok és a számos befolyásoló tényező miatt a volumenstátus megítélésére csak fenntartásokkal alkalmazható
3. A véráramlás mérése Elektromágneses áramlásmérés Ultrahangos flowmérés Laser-Doppler flowmérés
Lokális véráramlás mérés Transonic ultrahangos véráramlás mérő készülék és perivaszkuláris áramlás érzékelő szenzorok.
Lokális véráramlás mérés
4. A gasztrointesztinális (GI) traktus vizsgáló módszerei
A bélidegrendszer szerveződése Myentericus plexus Körkörös izomréteg
Submucosus plexus Hosszanti izomréteg
Nyálkahártya Muscularis mucosae
Az GI traktus szekretoros, abszorpciós és motilitási funkcióinak szabályozásáért és összehangolásáért felelős struktúra a bélidegrendszer. A bélidegrendszert több kisebb, nem ganglionált, és két nagyobb, ganglionált plexus építi fel. Ezek a nyálkahártya és a körkörös izomréteg között elhelyezkedő submucosus plexus (Meissner-plexus), valamint a körkörös és hosszanti izomrétegek között található myentericus plexus (Auerbach-plexus). A bélidegrendszer önálló reflexívekkel rendelkezik, s a központi idegrendszertől való nagyfokú függetlenség jellemzi. Furness, The Enteric Nervous System, 2008. nyomán
4.1. A tápcsatorna simaizomzat elektromos aktivitása Lassú hullám Spikes
A GI kontrakciók ritmusát a simaizom membránban képződő potenciál változás, a lassú hullámok (slow waves) frekvenciája határozza meg, amelyek nem tekinthetők akciós potenciálnak.
A GI SIMAIZOM MOTOROS AKTIVITÁSA 1. Izom kontrakció csak akciós potenciál (AP) megjelenésekor történik 2. Az AP (sorozat) gyakoriságát a lassú hullámok frekvenciája szabja meg 3. A kontrakciók ereje az AP sorozat frekvenciájától függ
GI motilitás monitorozás I. A bélizomzat kontrakciók mérése nyúlásmérő bélyeg (strain gauge) szenzorral
V. jugularis Infúzió
Strain gauge szenzor
Computer
GI motilitás monitorozás I. A bélizomzat kontrakciók mérése nyúlásmérő bélyeg (strain gauge) szenzorral FSG-02 Force/displacement transducer for implantable
Original recording of colon motility in rat V 6
4
2
0
-2
-4
-6 0
200
400
600
800
sec
1000
1200
1400
GI motilitás monitorozás II. Elektro-Miográfia (EMG) A bélizomzat elektromos aktivitásának mérése extracellularis szenzorral
V. jugularis Infúzió
Extracellular sensor
Computer
Ag/AgCl extracellularis szenzor
Szenzor típusok testfelszíni miográfiás szenzor
bélfalba implantált szenzor
Kísérleti elrendezés bélfalba implantált szenzor (1 vagy 2 pár elektródával)
testfelszíni miográfiás szenzor
Elektrointesztinográfia
Mérés éber állaton. A szenzort a nyakon ejtett nyíláson át vezetjük ki, melyet az állat nem tud lerágni.
A jel:
esemény Felvétel: 0,01 – 0,5 Hz
Gyomor Vastagbél
Vékonybél
PS: power spectrum, MA2 MA: a PS-hez tarozó legnagyobb magasság érték
Vékonybél spektrumok egy bélischaemia-reperfúziós állatból
Görbe alatti területek összehasonlítása AUC - bevarrt 350 300 250 Sham-op
200
IR 150
IR+Met
100 50 0 baseline
Ischemia1
Ischemia2
Reperfuzio1
Reperfuzio2
4.2. Az intesztinális permeábilitás vizsgáló módszerei • Gravimetriás analízis
• Kapilláris permeabilitás • Epitheliális permeabilitás Gravimetria szövet mintavétel; Nedves-súly mérése Szárítás súlyállandóságig, majd száraz-súly mérés Nedves / Száraz súly = ödéma becslése
Vasculáris/kapilláris permeabilitás Meghatározása: Evans kék (EB) festékkel, amely a plazma fehérjékhez kötődik Intravénás befecskendezés Permeábilitás fokozódás esetén, a festék-fehérje komplex a szövetekbe jut; A komplex kimosása az erekből; A festék extrahálása a szövetből, formamid-dal; Evans kék spektrofotometriás meghatározása a vérből és a szövetből; Permeabilitási index = EB szövet EB plazma
Vascular permeability index 1
1
* **x * x
Saline Bile HCl+bile
1
HCl
*
0
0
0
0
* P<0.05 0
Intact region of the esophagus
Treated region of the esophagus Fig. 2
Epitheliális permeabilitás “lumen - plazma” irányú permeábilitás változás mérése Na-fluoreszcein (NaFL) clearence módszerrel • 5 mg/ml NaFL beadása a vizsgálandó GI lumenbe; • Vénás vérminta vétel 10 percenként (a minta tárolása sötétben); • A NaFL koncentráció meghatározása spektroflurométerrel (ex: 455 nm, em: 515 nm);
-1
Plasma-Na fluorescein/lumen-Na fluorescein kg x 10 10
8
*
x
*x
*
*x
x
HCl+bile
6
*x
Bile
4
*x *
2
x
*x *x
x
*x
*x
*x x
*x
*x HCl * Saline
0
“lumen - plazma” NaFl clearence = plazma NaFL / lumen NaFL
4
180
190
200
210
Time (min) Fig. 3
220
230
240
5. Képalkotó vizsgáló módszerek a mikrokeringés in vivo monitorozására
A mikrokeringés fiziológiája • • • •
Arteriolák, kapillárisok, venulák hálózata (érátmérő <100 μm) Legfőbb szerepe az oxigén átadása a szöveteknek Struktúrája, funkciója nem egységes – szervenként eltérő Központi szerepet játszik a véralvadási, immunológiai folyamatokban
• A mikrokeringést meghatározó tényezők: – Beáramlási nyomás (driving pressure) – Az arteriolák tónusa és átmérője – Hemorheológiai paraméterek (viszkozitás) Együttvéve: kapillárisok nyitottsága (patency)
• A mikroperfúzió szabályozása: – Miogén (erő-mechanikai hatások) – Metabolikus (O2, CO2, laktát, H+) – Neurohumorális (NO, endothelin, katekolaminok, stb.)
KERINGÉSI SHOCK „NO-REFLOW” jelenség
HIPOXIA
MIKROKERINGÉSI ELÉGTEENSÉG
ISCHAEMIA
REOXIGENIZÁCIÓ REPERFÚZIÓ
Mikrokeringés diszfunkció
Endothel Diszfunkció
Vörösvértestek
Barrier, Koaguláció, Regulációs zavar
Deformabilitás, Aggregáció O2 transport zavar
Koaguláció Endogén antikoagulánsok ↓ Mikrovaszkuláris trombózis
Autoregulácios diszfunkció Mikrocirkulációs shunt Oxigén ellátás-igény mismatch Hypoxia
Leukocita aktiváció Adhézió, Cytokinek, ROS
Celluláris Distress Mitochondrium diszfunkció Apoptózis
Szervi elégtelenség
A mikroperfúzió monitorozásának eszközei és jellegzetességei
A mikrocirkuláció monitorozása Áramlás Lézer Doppler áramlásmérő Perfúzió, Áramlási sebesség
Áramlás
OPS/SDF képalkotás
Mikrogyöngy technikák
NIRS
Fluorescence quencing microscopy
MRI
Oxigenizáció, Áramlás
Oxigén tenzió
Oxigenizáció, Perfúzió
Orthogonális Polarizációs Spectrális képalkotás ”OPS”
Groner W. Nature Med (1999) 5:1209-1212
„Sidestream Dark Field” „SDF”: az OPS továbbfejlesztett verziója
Ince C (2005) Crit Care 9:S13-S19
Hol alkalmazható? Csak vékony, epithel réteggel fedett struktúrák esetén alkalmazható, amelyek átvilágításához elegendő a szövet mélyéről visszaérkező depolarizált fény - amely hátulról világítja meg a felszín alatti struktúrákat. 1. Ideális, nem invazív alkalmazási terület: a sublinguális régió
A szublingualis mikrocirkuláció klinikai jelentősége
Sublinguális vs intesztinális tonometria Sublinguális tonometria vs OPS videomikroszkópia Pentobarbital anaesthesia
OPS mikrokeringés vizsgálat
Sublingualis tonométer Artériás kanül Intestinalis tonométer
CVP katéter
Transzpulmonális perctérfogat mérés Vérnyomás szenzor
A nyelv alatti mucosa mikrokeringése kontroll állapotban
A nyelv alatti mucosa mikrokeringése shockos állapotban
A szublingualis mikrocirkuláció klinikai jelentősége Azok a szeptikus páciensek, akiknél a szublinguális mikroperfúzió csökkenése kismértékű (22 %-os) volt, felépültek a súlyos kórállapotból, ellentétben azokkal, akiknél ez a csökkenés jelentős (44 %-os) volt.
Sakr et al. Crit Care Med (2004) 32:1825-1831
A mikrocirkulációs dysfunkció volt az egyetlen és szenzitiv tényező a végkimenetel előrejelzésében.
Mikrocirkulációs paraméterek változása a tüdő alveolusaiban • Vietnámi törpesertések (átlagos testtömeg: 23±3 kg) • Altatás: ketamin-xilazin indukció im., propofol fenntartó iv. • Mesterséges lélegeztetés Endotracheális tubus Centrális vénás nyomás Pulzoximéte r
Jobb felső lebeny OPS mikrokeringés vizsgálat
Artériás vérnyomás szenzor
PEEP hatása az oxigenizációra Atelektázia megszűnése - intrapulm. shunt Parciális oxigén nyomás (PaO2) Artériás oxigén szaturáció (SaO2) N=6 Thoracotomia
PEEP = 10
PEEP = 15 PEEP = 5
PEEP = 5 0.perc
15. perc
30. perc
45. perc
= mikrokeringés felvétel
Kevés adat ismert a PEEP okozta mikrocirkulációs változásokról a tüdőben
Artériás oxigén szaturáció és parciális nyomás Artériás oxigén parciális nyomása (Hgmm)
Artériás oxigén szaturáció (%)
100
*
100
*
90
*
*
98
* 80
96
70
94
60
PEEP= 15
PEEP= 15 PEEP= 10
PEEP= 10 92
PEEP= 5
PEEP= 5 0
15
30
Idő (perc)
45
50
PEEP= 5
PEEP= 5 0
15
30
45
Idő (perc)
Az ábrán a medián, a 25. és a 75. percentilist tüntettük fel; * p<0.05 Friedman és Dunn próbával
TÜDŐ MIKROKERINGÉS (OPS) PEEP 5 vízcm
Tüdő mikrokeringés → PEEP 15 vízcm
Tüdő mikrokeringés → PEEP 5 vízcm
Alveolus terület Alveoláris terület (μm2) 1100
*
1000 900 800 700 600 PEEP= 15 500
PEEP= 10 PEEP= 5
PEEP= 5 0
15
30
45
Idő (perc)
Az ábrán a medián, a 25. és a 75. percentilist tüntettük fel; * p<0.05 Friedman és Dunn próbával
Alveolus kapillárisok perfúziós rátája Alveolus perfúziós ráta
0,7
*
*
0,6
0,5
0,4
PEEP= 15 PEEP= 10
0,3
PEEP= 5
PEEP= 5 0
15
30
45
Idő (perc)
Az ábrán a medián, a 25. és a 75. percentilist tüntettük fel; * p<0.05 Friedman és Dunn próbával
Áramlási sebesség az alveoláris és perialveoláris kapillárisokban Perialveoláris vvt sebesség (μm s-1)
Alveolus vvt sebesség (μm s-1) 550
*
600
*
550
500
*
500
450
450 400
400
350
PEEP= 15
350
PEEP= 15
PEEP= 10
PEEP= 10 300
PEEP= 5
PEEP= 5 0
15
30
300
45
Idő (perc)
PEEP= 5
PEEP= 5 0
15
30
45
Idő (perc)
A PEEP emelése után az alveoláris és perialveoláris perfúzió eltérő dinamikájú növekedése eredményezi az artériás oxigén tenzió és szaturáció fokozódását.
A mikrokeringés és a makrokeringés kapcsolata Normál állapotban a mikrokeringés relatíve független a globális hemodinamikai változásoktól. DE mikrocirkulációs elváltozások mutathatók ki elfogadhatónak tekintett szisztémás hemodinamikai célértékek esetén is; A keringési elégtelenség megszüntetését célzó terápiás beavatkozás esetén, a mikrokeringés reakciója gyakran eltér annak globális hatásától → jellemző példája az un. „no-reflow” jelenség
Gasztrointesztinális mikrokeringés – a keringés redisztributio áldozata keringési shockban
Artériás Középnyomás
Hgmm 150
120
90 zselatin hidroxietil-keményítő dextrán
60
Vérzéses shock
30 0
30
60
Volumen resuscitatio 90 120 Idő (perc)
150
180
210
240
* P<0.05 vs kontroll érték (0 perc)
A volumen reszuszcitáció végpontja: a kontroll MAP 75%-ának elérése, max. 50 ml/kg kolloid infúzió;
Vörösvértest Áramlási Sebesség a Villusokban μm/s 800 700 600 500
*
*#
*
400
* * Vérzéses shock
300 200 0
*
30
*#
Zselatin Hidroxietil-keményítő (Voluven) Dexrán (Rheomacrodex) Volumen resuscitatio
60
90 120 150 180 210 240 idő (perc) P<0.05 vs konroll érték (0 perc) # P<0.05 vs Voluven csoport
Kaszaki J, Wolfárd A, Szalay L, Boros M: Pathophysiology of ischemia-reperfusion injury. Transplant Proc 38:826-828, 2006.
OPS
A mikrokeringés speciális sajátossága: a heterogenitás Károsodott mikrocirkuláció esetén – a mikrokeringési reakciók NEM egységes természetüek, és mértékük, kiterjedésük sem hasonló. A károsodás gyakori megnyilvánulása, a perfúzió heterogenitásának fokozódása. Az oszcilláló mikroperfúzió (flowmotion) a lokális oxigenizáció változást indukál (Tsai AG and Intaglietta M, Int J Microcirc Clin Exp (1991) 12:75-88).
Térben változó heterogenitás A funkcionális kapilláris denzitás meghatározása perfundált
nem-perfundált
Perfundált kapillárisok hossza terület
Mikrocirkulációs shunt: amikor a µpO2 kevesebb lesz, de a vénás pO2 változatlan marad
Sinaasappel et al. J Appl Physiol (1996) 81:2297-2303.
Időbeli heterogenitás Az áramlási mintázat változása a villusban • Kiindulási állapot: folyamatos áramlás • Vérzéses shock: oszcilláció • Újraélesztés: folyamatos áramlás / oszcilláció ≈ 700
RBCV (µm/sec)
Gyors áramlás v1
v1
v2
v2
v3
v3
vn
vn Lassú áramlás
≈ 100
t1
T1
t2
T2
t3
T3
tn
Tn
idő
Súlyozó faktor = az áramlási periódusok relatív időtartama A vörösvértest áramlási sebességének (RBCV) súlyozott számtani átlaga: A-RBCV =
v1t1 + V1T1+ v2t2 + V2T2+ … vntn + VnTn t1 + T1 + t2 + T2 + … tn + Tn
Szabó et al. Shock 21:320-329, 2004.
Térbeli heterogenitás A vörösvértest áramlási sebesség (RBCV) terület arányosan súlyozott átlaga
hypoperfundált terület (a: relative area 40%) (lower average RBCV) Normál perfúzió, magasabb RBCV értékek (A: relative area 60%) (higher average RBCV)
RBCV =
A(RBCV) + a (RBCV) A+a
RBCV = 0.6 RBCV + 0.4 RBCV
(A + a = 1)
Heterogenitás normál körülmények között, Lézer Doppler flow mérés Vasomotio (flowmotion) monitorozás a tesztiszben Termoregulációval összefüggő periodicitás
Vasomotio (flowmotion) monitorozás a bőrben
A leukocyta-endothelsejt interakció monitorozásának eszközei és jellegzetességei
Leukocyta-endothel sejt interakció
kapilláris lumen
interstitium
Rolling
érendothel
leukocyta
Adhézió
Transzmigráció
E-selectin P-selectin (+vérlemezke)
VCAM-1 ICAM-1 (intercellularis adhéziós molekula 1)
endothelialis PECAM-1
L-selectin
CD11a/CD18 CD11b/CD18
leukocyta PECAM-1
Fluoreszcens Fluoreszcens Intravitális Intravitális Videomikroszkópia Videomikroszkópia Videó-felvevő CCD-kamera Fényforrás
Objektív Tibia
MONITOR - gördülő leukocita - kitapadó leukocita -funkcionális kapilláris denzitás -Vvt áramlási sebesség
Kontraszt erősítés (fluoreszcens transz- és epi-illumináció)
Fluoreszcens markerek: Leukocyták
– Rhodamin 6G
Vörösvértestek
– FITC jelölés
Permeabilitás
– Na-fluorescein
IVM video: Periosteális perfúzió és leukocyta adhézió végtag ischaemiában
Mikrocirkulációs paraméterek változása máj ischaemia-reperfúzió során, patkány modellben
Kontroll mikroperfúzió a májban (NaFl) Fluoreszcens Intravitális Videomikroszkópia (IVM)
Máj mikroperfúzió reperfúzió alatt (Na Fl) Fluoreszcens Intravitális Videomikroszkópia (IVM)
Leukocyta-endothel sejt interakció normál májban (IVM)
Leukocyta-endothel sejt interakció reperfúzió alatt (IVM)
Mikrocirkuláció összegzés •
Az első, ami sérül, és az utolsó ami felépül.
•
A mikrocirkuláció károsodásának jele, a perfúzió heterogenitása, amely oxigén extrakciós deficitet eredményez;
•
A mikroperfúzió állapota meghatározhatja a végkimenetelt;
•
A mikrocirkuláció helyreállítása → terápiás végpont.
Microcirculation Recruitment Manoeuvres Ince C (2005) Critical Care 9:S13-S19 • Rendezni kell a kóros áramlási heterogenitást • Az a cél, hogy a nyissuk ki és tartsuk is nyitva a mikrokeringést a pumpafunkció támogatásával, vazopresszorok korlátozott használatával és megfelelő folyadék adásával
Köszönöm a figyelmet!
