?Various artists? előadásában:
Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok 2012/13 ősz (első fele)
KZ
Molekuláris nemesítés Bedő Zoltán 2012/09/13 14:15 CEST Az utóbbi 20 évben rengeteget fejlődött a transzgenetikus nemesítés, ma már 160 millió hektáron termesztenek ilyen növényeket. Transzgenetikus nemesítés általában a hagyományos módszerrel folytatódik. Legelterjedtebb a szelekciós (utódok közül kiválasztjuk a legjobbakat), de van mutációs nemesítés is (mutáció révén pozitív tulajdonságot mutathatnak az egyedek). 1950. és 1999. között a hagyományos nemesítéssel is háromszoros hozamot tudtak elérni búzával. Ekkorra viszont kimerültek a fejlődés lehetőségei. • Vegetativ módszerrel szaporítás • Öntermékenyülő és magterméssel szaporított növények • Idegentermékenyülő növények heterózis nemesítés Új feladatok:
Szezonális szélsőségek csökkentése Stresszrezisztencia növelése Energetikai célú növények nemesítése Víz- és nitrogénhasznosítás javítása
A produktivitás javítására először biotechnológiai eljárásokat próbáltak alkalmazni.
Szomaklonális (testi sejtekből) variabilitás: különböző kalluszokat állítottak elő a növény részeiből, pl. magból, hajtásból, gyökérből. Kalluszindukció mellett gyakran előállítottak sejtszuszpenziókat, amiket mutagén ágensekkel kezeltek, ebből nevelték fel a jó példányokat. Gametoklonális variabilitás: a meiózis során bekövetkező variabilitás, haploid gamétákat lehet szelektálni majd diploidizálni. Sokkal elegánsabb volt, viszont nehezebb is. Egy lépésben homozigóta állapotot lehet elérni, míg az előzőben több generációt kellett várni.
Kialakultak a molekuláris nemesítési módszerek, itt az új genotípusok előállításához DNStechnikákat használnak. A genotípusokat ismerve, ebből kiindulva célirányosan tudjuk változtatni azt, így létrehozva új fenotípusokat.
Molekuláris markerek segítségével történő szekció Növényi géntechnológia (a tárgy ezzel foglalkozik)
Gén: a DNS azon szakasza, amely egy vagy több fehérjekódját és annak megnyilvánulásához szükséges regulációs szekvenciákat tartalmazza. Genom: a sejtmagban található DNS szekvenciákat jelenti. Allél: gén előfordulási formái (virágszirom színe).
A molekuláris marker által segített szelekció előnyei:
Fenotípus, biokémiai és molekuláris markerek Egy tulajdonság megváltoztatására hatékony szelekció Környezeti befolyástól mentes (pl. beltartalmi tulajdonság esetén) Gén piramidálás (reziszteciagének egymásra építése, ha egy nem elég a védettséghez) BC felgyorsítása a rekurrens szülői tulajdonság szelektálására Patogén ritka előfordulása esetén
Géntechnológia: a növényi sejtmagban és sejtorganellumokban (mitokondrium, plasztiszok) meglévő genetikai program megváltoztatása molekuláris genetikai módszerekkel. Géntechológia módszere: Genetikai transzformáció: idegen származású DNS bevitele a növényi genomba hagyományos szexuális út kikerülésével, modern génátviteli módszerek alkalmazásával. Transzgénikus vagy genetikailag módosított (GM) növény: a genomjába idegen származású gén bejuttatása géntechnológiai módszerrel, amely a genomba integrálódik, működik és öröklődik. Ezáltal a GM növények idegen származású fehérjét termelnek. Ciszgénikus növény: saját vagy rokon fajból származó gén bejuttatása géntechnológiai módszerrel, amely a genomba integrálódik, működik és öröklődik. (pl. búzába rozs gént) Génbeviteli módszerek
Agrobacterium tumefaciens közvetítésével létrehozott transzformáció - tumort indukáló plazmid (Ti) T-DNS-e átkerül a növényi sejtekbe, integrálódik a növényi sejtmag DNS-ébe - Ti plazmidok felhasználása a génátvitelben transzformációs vektorként
Direkt génbeviteli technikák - DNS bejuttatása protoplasztba kémiai vagy fizikai kezelésekkel (hősokk, PEG) - elektroporáció: elektromos impulzus révén DNS bejuttatása a protoplasztba - biolisztikus eljárással gén bejuttatása éretlen embrióba
Biolisztikus géntranszformáció: Nagy nyomású He-gázzal belövik a kalluszokba az aranyrészecskékkel körülvett vektort. Kell egy hasznos gén, egy promóter, ami segíti a gén kifejeződését és olyan donor növény, amit utána regenerálni is tudunk. Promóter: konstitutív (egész növényben kifejeződik), szelektív (hormon hatására) vagy induktív (vegyszerre vagy környezeti hatásra). Enhancer: gén kifejeződését fokozzák, növelik a promóter aktivitását.
Génbevitel után Kíváncsiak vagyunk arra, hogy melyik az a kallusz, ami tartalmazza a gént és melyik, ami nem. Ehhez szelekciós táptalajra helyezzük őket (herbicid, antibiotikum), vagy szelekciós,
vizuális markereket alkalmazunk, amik megszínezik az egyedeket (gus, GFP). Ezután jön a felnevelés, a regenerációs képesség erősen genotípus függő. Következő generációban hasadás lesz = heterogén állományunk lesz (van, amiben van TG, van, amiben nincs), így ismét szelektálásra van szükség. Lényeges szempont, hogy generációnként meg kell mérni, hogy a gén, amit beültettünk, az ugyanolyan mértékben kifejeződik-e, mint ahogy azt az első generációban megfigyeltünk? Fontos még megvizsgálni, hogy nincs-e mellékhatása a génnek, pl. nem okoz-e allergiát. Fejlődési rendellenesség fellépése esetén 3-4-szer vissza kell keresztezni az eredeti fogadó fajtával. Fontos megjegyezni, hogy nincs olyan GM-növény, amiben kifejezetten a termést fokozni lehet, mert ezek a beültetett gének „csak” rezisztenciát vagy minőségbeli változást okoznak, a termés mennyisége viszont poligénes tulajdonság, nem lehet egyszerűen módosítani.
Genetikai térképezés, génazonosítás Mészáros Klára 2012/09/20 14:15 CEST A növénynemesítés feladatai:
Hatékonyság és termésbiztonság növelése o Herbicidtolerancia kialakítása o Betegség-ellenállóság kialakítása o Abiotikus stressztoleracia (fagyállóság, szárazságtűrés) és környezeti adaptáció javítása (víz- és N-hasznosítás)
Funkcionális élelmiszer-alapanyag előállítására alkalmas növényfajta (egészségesebb)
Bioenergetikai célra alkalmas növények nemesítése (pl. kukorica több keményítővel)
Technológiai rendszerekre adaptált és/vagy nemesített fajták (gyógyszer alapanyagnak)
Mit kell tudnunk ahhoz, hogy a biotechnológia eszköztárához nyúlhassunk? Ismerni kell az adott tulajdonság fenotípusos megnyilvánulásában meghatározó szerepet játszó genetikai komponenseket, szabályozó mechanizmusokat, továbbá szükséges a biokémiai folyamatok megértése. Mire van ehhez szükség? Egyrészt megfelelő diagnosztikai módszerek kidolgozására, valamint fel kell tárni az adott fajban a természetes variabilitást és ehhez kapcsolódva a rokon és vad fajokban is. Ha ez meg van, akkor a hasznos géneket, és ezeknek a megfelelő allélját be kell építeni a nemesítési alapanyagokba. Marker szelekcióval nyomon követhetjük az utód populációban a kívánt génnek a jelenlétét, vagy pedig géntranszformációt alkalmazunk. Azok a tulajdonságokat, amelyek mértékegységgel nem, vagy csak nehezen mérhetők, kialakulásuk kevéssé függ a környezet hatásától, minőségi tulajdonságoknak nevezzük. Megnyilvánulásukat egy vagy néhány gén határozza meg. Pl: betegség ellenállóság.
A mértékegységgel mérhető tulajdonságok, amelyek kialakulásában a környezet hatása jelentős szerepet játszik: mennyiségi tulajdonságok. Kifejeződésük általában sok gén kölcsönhatásának eredménye pl: termőképesség. A génazonosítás főbb módszerei: Marker kapcsoltsági térképek o Kétszülős térképező populációk o Széles genetikai bázist képviselő fajtakör Jelölt gén megközelítése o o o
o
Genom pozíciófüggő stratégiák: pozicionális klónozás, deléciós vonalak Összehasonlító genomikai stratégiák: modell növények Mesterséges genetikai variáció (indukált mutációs populációk): valahol elrontják a genomot és utána keresik, hogy ez milyen fenotípussal kapcsolódik össze) Géncsapdázás: T-DNS, transzpozon (beépítenek egy riportergént promótert nélkül, ha olyan pozícióba épül be, ahol előtte egy működő promóter van, akkor ez a riportergén el kezd működni, mert ugyanabba a leolvasási keretbe kerül)
Génexpressziós mintázatok elemzése o Differential Display o DNS microarray, DNS chip Mi kell a marker kapcsoltsági térképekhez? Térképező populáció: Két homozigóta szülő keresztezéséből származó utódok a térképező populáció, amelynek minden egyedéről meghatározható, hogy a szülőktől milyen kombinációt örökölt két vizsgált allélpárra, P vagy R típust. Ennek ismeretében a rekombináció gyakorisága meghatározható akár közvetlenül (r=R/P+R), akár LOD számítással. Ezt az r (rekombinációs gyakoriság) értéket genetikai térképezésre használhatjuk. Először ki kell választanunk a megfelelő szülői partnereket, ezt egyrészről tehetjük úgy, hogy két nagyon különböző szülőt választunk, akiknek a keresztezéséből, valószínűleg egy nagyon variábilis utódpopuláció lesz. De ha speciális célokra szeretnénk alkalmazni ezt a térképezési populációt, mondjuk, egy betegséggel szembeni rezisztenciagént szeretnék térképezni, ebben az esetben egy olyan szülőt választunk, ami fogékony a betegségre szemben és egy olyat, ami ellenálló és így biztos, hogy ezek kombinációja lehetőséget ad a betegségért felelős kromoszóma-régiók térképezésére, ugyanis egy térképező populációban mindig csak a különbségeket tudjuk kimutatni, tehát csak azt, ami a két szülőben különbség.
Vannak hasadó F2 populációk, ezek előnye, hogy dominanciaviszonyokat tudunk vizsgálni, nagy hátránya viszont, hogy nem ismételhetők a kísérletek. Homozigóta populációkat szívesebben használnak genetikai térképezésben. Egyéb speciális populációkat is elő lehet állítani, a populáció egyedei csak egy kromoszómában különböznek, ez azért jó, mert így csak ennek a kromoszómának a hatását tudjuk vizsgálni az adott tulajdonságra. Nagyon fontos a populáció mérete is; minél pontosabb térképezést akarunk készíteni, annál nagyobb populációmérettel kell dolgoznunk, kalászosoknál min. 90-100 vonal kell, de 3-5000 is kellhet a pontosabbhoz. Pollenizolálás: egyszeres, haploid apai kromoszómakészlet, szövettenyésztéssel haploid növényt regenerálunk, ez pedig rediploidizálódik: ez végbe mehet árpánál spontán, búzánál pedig kolhicinkezeléssel, így ezek a növények is homozigóták lesznek. Emiatt a genetikai és a fenotípusos vizsgálatokat korlátlanul ismételhetjük. Molekuláris marker technikák: Genetikai jellemzés markerekkel történik, amik láthatóvá teszik a különbségeket. A morfológiai és a biokémiai markerekre jellemző, hogy számuk korlátozott, és megnyilvánulásukat a környezet befolyásolják, hiszen mind fenotípusos jellemzői a növényeknek. A környezeten kívül még a fejlődési állapottól is függ a kifejeződésük, ennek ellenére elég elterjedtek.
Oregoni árpa: eltérő színű, méretű, alakú kalászok
A másik csoportja a kódoló régióhoz kötött markereknek, a biokémiai markerek, ezek nem mások, mint az izoenzimek, vagyis az egyes alenzimeknek az alléltípusai, ezekkel is az a baj, hogy korlátozott a számuk, nincs akármennyi izoenzim és a kimutatásuk is eléggé nehézkes, speciális festéssel lehet őket láthatóvá tenni. A molekuláris markereknek óriási előnye, hogy velük a DNS közvetlenül vizsgálható, ezért a megnyilvánulásukat nem befolyásolja a környezet. A számuk gyakorlatilag korlátlan, mivel az egész genomban fellelhető szekvenciákhoz kapcsolhatók. Kodomináns öröklődésűek, tehát a heterozigóták is kimutathatók vele, gyakori az előfordulásuk, viszonylag egyenletesen fedik le a genomot, könnyű a hozzáférhetőségük, reprodukálhatóságuk is nagyon jó.
A hibridizációs módszerek voltak az elsők (80-as évek). Ezek közül a legelterjedtebb az RFLP, ez a módszer a DNS molekula restrikciós endonukleázzal történő emésztésén és Southern-hibridizáción alapul. A hasító helyeken történt pont mutáció (SNP) vagy inszerció és deléció (INDEL) okozta különbségek mutathatók ki. A restrikciós endonukleázok bakteriális enzimek, nagyon specifikusak az adott DNS-szekvenciára; egy 4-10 bázispár hosszúságú kötőhelyet detektálnak, de ha már két nukleotid különbség van, akkor nem ismeri fel és nem jön létre a hasítás. Lépések: a vad típusú és az ismeretlen DNS hasítása restrikciós endonukleázokkal (ha a mutáció a restrikciós hasítóhelyen volt, akkor ott az enzim nem képes hasítani) a mintát gélre vinni, elektromos erőtérben megfuttatni blottolás membránra hibridizáció – általában radioaktív próbával Autoradiográfia Előnye: Nem szükséges a templát DNS szekvenciájának ismerete. A heterozigóták megkülönböztetését biztosító kodomináns módszer. Megbízható, jól ismételhető. Hátránya: Egyes fajokban a restrikciós hasítóhelyek megfelelő szintű polimorfizmusának hiánya. Nagy mennyiségű DNS-t igényel, Southern-hibridizációhoz jelölt próba szükséges. Hosszadalmas és költséges. A hibridizációs módszereket elég gyorsan kiszorították a PCR-ek, amelyek sokkal könnyedebb, gyorsabb módszerek, kis mennyiségű DNS-t igényel, nem kell jelölt próbát alkalmazni
PCR szakaszai
Az ismeretlen kromoszómális elhelyezkedésű primerek voltak az első, ezek közül is a RAPD-k (Randomly Amplified Polymorphic DNA). Viszonylag rövid, 10bp nagyságú primerek, ezért nagyon sok helyre bekötődnek a genomba és nagyon nagyfokú polimorfizmust adnak, viszont a módszer reprodukálhatósága nem olyan jó. CAPS: monomorf marker, úgy teszszük polimorffá, hogy endonukleázzal emésztjük. AFLP: A genomi DNS restrikciós emésztésén és a fragmantumok szelektív PCR amplifikációján alapul. Sok fragmentumot eredményez, domináns markereket eredményez, lókusz-specifikus markerek fejlesztése nehéz. Az ismert kromoszómális elhelyezkedésű primerek közül az SSR (Simple Sequence Repeat)-markerek a legelterjedtebbek. Azon alapszik, hogy vannak olyan fajok, amelyek akár 10-90%-ban monoton ismétlődő nukleotid motívumokat tartalmaznak (AC, AG, TA…). A
határszekvenciákra tervezett primerekkel hossz-polimorfizmus mutatható ki. Jól használható genotipizálásra, ujjlenyomat meghatározásra. EST (Expressed Sequence Tag), csak működő génekhez kapcsolódik. Egyre elterjedtebb az SNP-markerek alkalmazása (Single nucleotide polymorphism). A növénynemesítésben és a genetikában az egyik alapvető cél, hogy a tulajdonságokat meghatározó gének kromoszómális lokalizációját, és egymáshoz viszonyított sorrendjüket meg tudjuk határozni. A géntérképezés során a gének egymástól való távolságát, a genomban való viszonylagos elhelyezkedésüket határozzuk meg anélkül, hogy valóban megszekvenálnánk a DNS-t. Ezt oly módon érik el, hogy az együtt öröklődő tulajdonságok (koszegregáció) gyakoriságát figyelik, tehát a Mendeli független öröklődéstől való eltérést, ebből következtetnek a gének egymástól való távolságára a kromoszómán. Amint készen áll a térkép, képesek vagyunk egy ismert gén vagy marker alapján megmondani egy másik gén helyét a genomban. Molekuláris rekombináció: DNS törése és újraegyesülése. Genetikai rekombináció: új (nem-szülői) allélkombinációk létrejötte, mely a meiózis profázisában történő nem testvér kromatidák közötti molekuláris rekombináció eredménye (crossing over). Minél ritkábban fordulnak a rekombináns gaméták, annál erősebben kapcsoltak a tulajdonságok. Egy testcross (recesszív szülővel keresztezzük vissza az F1-et) megmutatja az F1 szülőben keletkező 4-féle gaméta arányait, mert a tester szülő mindig ab-t ad. Térképtávolság: r = rekombináns utódok gyakorisága rekombináns gaméták száma/ összes gaméta d = térkép távolság Kis távolságok (10 cM) esetén d=r A gének közötti, rekombinációs gyakoriság felhasználásával számolható a térképtávolság. Mértékegysége a centimorgan (cM). Egy cM távolság van két gén között, ahol a gaméták 1%-a rekombináns, vagyis a szülőitől eltérő kombinációt hordoz. Távoli géneknél előfordulhat, hogy több crossing-over is létre jött, ez torzítja a térképtávolságokat, ezért térképfüggvényeket használunk: Morgan-fv.: rövid távolságra igaz, d=r Haldane-fv: figyelembe veszi a kettős rekombinációt, és azt mondja, hogy az egymás melletti rekombinációknak a bekövetkezése nem befolyásolja az előfordulásuk valószínűségét. A programok általában ezt használják. Kosambi-fv: Két egymás mellett előforduló rekombináció hatással van a bekövetkezésük valószínűségére. Számítógépes térképező programok: Legelterjedtebbek: MapMaker, GMendel, JoinMap: LOD-dal kapott r (rekombinációs) gyakoriságokat (megfelelő lötyögéssel) a térképező programok a legvalószínűbb géntérké-
pekké rakják össze. Először megadjuk azokat a lókuszokat, amelyeknek ismert a helye, és amelyekhez a többi markereknek az elhelyezkedését szeretnénk hasonlítani. Második lépésben a program megvizsgálja, hogy milyen markerek kapcsoltak. Utána hármas csoportokat alakít ki, és ezeken belül megállapítja a legvalószínűbb sorrendeket, majd a csoportokat öszszekapcsolja és megadja a markerek sorrendjét a kromoszóma tetejétől indulva, és az egymáshoz viszonyított távolságát. Marker kapcsoltsági térképek alkalmazási területei: Összehasonlító térképezés: fajon belül különböző populációk között, rokon fajok között. Genomszerveződés: makro és mikro kolinearitás, intergénikus és génklaszter szakaszok azonosítása.
kromoszóma-átrendeződések,
Fizikai térképeknél megabázis a mértékegység: 1 cM = 1 Mb = 106 bázis QTL azonosítás a teljes marker kapcsoltsági térképre kiterjed, a markerek közötti intervallumokat vizsgál. Az adott QTL hatásának nagyságát a LOD (likelihood ratio) értékkel jellemezzük. LOD= lg (QTL csúcs jelenlétének valószínűsége/annak, hogy nincs QTL hatás) A QTL-elemzésnél nagyon fontos pont a fenotípusos vizsgálatok, hogy megtaláljuk, hogy az adott tulajdonságért felelős gének hol helyezkednek el. Időigényes és kemény munka hetekig ápolgatni és méregetni a növényeket.
Példa: Egy 28cM-es távolságot vizsgálunk: kb. 4. sortól megjelenik a QTL-hatás (csillagok jelzik). Az R2 megmutatja, hogy az adott régió a fenotípusos variancia - jelen esetben - 38%áért felelős. Pozicionális klónozás: Alapja: Szükséges, hogy a QTL hatást 1 cM-nál kisebb marker intervallumhoz köthessük, hogyha ez megvan, akkor azon a régión egy finomtérképezést hajtunk végre, nagy populáció méret bevonásával (3-5000), besűrítve markerekkel. Azonosítani kell
azokat a rekombináns egyedeket, ahol az adott hatás és marker közt rekombinációt találunk, és azokat fenotípusosan kell jellemeznünk. A következő lépésben a BAC klóntárhoz kell viszszanyúlnunk: in silico térképezéssel keresnek ismert génszekvenciát más fajokból. Összehasonlító genomikai stratégiák Modell növényeket használnak, amik kis és ismert genomú, egyszerű növények (lúdfű, rizs…). A búza viszont hatalmas genomú, rengeteg ismétlődő szakasszal. Mit vizsgálnak? Ortológ lókusz: Különböző fajokban ugyanabból az ősi lókuszból származó hasonló szekvenciájú és funkciójú géneket hordozó lókusz. Paralóg lókusz: Ősi lókusz duplikációjából származó lókusz, egy génből több kópia is létrejöhetett. Szinténia: Két különböző fajban a gének és markerek hasonló sorrendje. Mikroszinténia: Szekvencia szintű szinténia. A homológ szekvenciájú gének hasonló sorrendje, szekvenciája és orientációja a genomban. Ennek a vizsgálatnak is vannak korlátai: Szerkezeti homológia ellenére se biztos, hogy a gének működése megegyezik. Mutáció A mutáció az örökítő anyag spontán, maradandó megváltozása, amelynek során új tulajdonság keletkezik. A Hugo De Vries által a múlt század elején bevezetett fogalmat ma szűkebb értelemben a génen belüli bázissorrend-változásra vonatkoztatjuk. Tágabb értelemben mutációnak tekinthető a kromoszóma-szerkezetben, ill. a kromoszómák számában bekövetkezett minden változás, ideértve a poliploidiát is. A génmutációk (pontmutációk) egy gén bázissorrendjének változását jelentik. Ennek hatása ritkán jelenik meg azonnal a fenotípusban, csak ha domináns a mutáció. Bázis csere (tranzício, transzverzió) Keret eltolódás (Frameshift) Hatásuk: same sence: azonos aminosav. missense: aminosav csere. nonsense: stop kodon kialakulása Kromoszóma-mutáció: A kromoszóma egyes részei változnak meg. Ez lehet szerkezeti változás, például a kromoszómák törlődése (deléció), karok megfordulása (inverzió) kicserélődése (transzlokáció), megduplázódása (duplikáció). Másrészt lehet számbeli, melyen belül megkülönböztetünk poliploidiát (kromoszómagarnitúra a normális egész számú többszöröse) és aneuploidiát (csak egy kromoszómánál van eltérés). Mutagenezis
kémiai (EMS, ENU, DEB, HNO2): pontmutációt besugárzás (R, a-g, gyors neutron, UV): kromoszómatöréseket inszerció [T-DNS és/v. (retro)transzpozon]: funkcióvesztett mutációt idéz elő kimérikus (RNS-DNS) oligonukleotidok géncsendesítés (antiszensz, RNSi): RNS interferencia miatt nincs fehérje szintézis
Tilling: Létre kell hozni egy mutáns populációt, aztán ennek a genomját jellemezni kell, majd a fenotípus és a genotípus kapcsolatát kell értékelni. Lényege, hogy a pontmutációt szenvedett DNS a PCR melegítésének hatására szétválik, majd amikor lassan visszahűl, akkor valószínűleg nem a párjával kapcsolódik össze, hanem vadtípussal. A bázis csere miatt heteroduplexek jönnek létre, amikben egy buborék/hurok van. Az elegyet megemésztjük a zeller Cel1 enzimjével, ami specifikusan elvágja a DNS-t, ott ahol párosodási hiba van, így már méret szerint is el tudjuk választani. EcoTILLING: Természetes mutációk feltárása. Felhasználása:
allél(sorozatok) azonosítása (funkc. genomika, SNP) többszörös mutánsok azonosítása HTP szelekció (MAS, GAS, SAS …) pedigrévizsgálat rokonsági körök igazolása (kukorica) (fejlődés)rendszertan genetikai térképezés (génizolálás)
LD térképezés, asszociációs vizsgálatok Karsai Ildikó 2012/09/27 14:15 CEST Hagyományos kétszülős térképező populációk hátrányai: Előállításuk idő- és munkaigényes Szűkebb mértékű polimorfizmus Lókuszonként csak két allél hatásának vizsgálatára van mód A két szülő közti hasonlóság korlátozza az egyes gének azonosítási lehetőségeit QTL (Quantitative trait locus) térképezés pontossága változó Adott populációban azonosított QTL csúcshoz szorosan kapcsolt marker nem polimorf a nemesítési anyagban Gén (allél) kölcsönhatások vizsgálata limitált Széles genetikai bázisú fajtakör - asszociációs genetika: Nincs szükség a genetikai populáció kifejlesztésére A tesztelt populáció képviselheti a vadfajok (sokkal nagyobb diverzitás), tájfajták és vagy a nemesítés számára releváns fajták széles körét Diverz és nagyméretű populációk (100-200) vizsgálata a gének detektálásának valószínűségét fokozza
Adott gén természetes allél variációi, és azok fenotípusos hatása könnyebben azonosítható „Történelmi” rekombinációk hasznosítása (evolúció – adott környezetben folytatott nemesítés) – nagyobb felbontású géntérképezést tesz lehetővé Régebbi fenotípusos vizsgálatok eredményei is felhasználhatók
Valós marker – tulajdonság asszociáció azonosításának esélye függ: • Az alkalmazott molekuláris marker típustól (kodomináns, bialléles) • A populációban lévő LD kialakulásának módjától és az LD mértékétől • A populáció genomi sajátosságaitól • A populáció mérettől és a szerkezetétől • Alkalmazott statiszikai modelltől • A vizsgált tulajdonság genetikai szabályozásának komplexitásától LD: linkage disequilibrium = kapcsoltsági egyensúlytalanság. Szőke magas anyukának és barna alacsony apukának, szőke magas gyereke születik, akkor ez a két tulajdonság kapcsolt. Mérték meghatározása: r2: két marker lókusz közti kor-
reláció négyzete, rekombinációs és mutációs események összegzése. Az átlókhoz közel szoros, de látni olyan szignifikáns összefüggéseket is, amelyek nem egymáshoz közel álló markerek között vannak. r2 vs távolság: Ahol 0.1 r2 alá ér a görbe az jelöli azt a távolságot, aminél nagyobbra már nincs kapcsolat a két marker között. LD értékét növelő tényezők – – – – – –
Öntermékenyülés Genetikai izoláció Strukturált populáció Rokonság Kis méretű kiinduló populáció Alacsony rekombinációs gyakoriság
LD értékét csökkentő tényezők – – –
Idegen megtermékenyülés Rekombináció és mutáció nagy gyakorisága Ismétlődő mutációk
Vad fajokban gyorsan megszűnik az LD, mert nagyon variábilisak. Emiatt sok marker kell a vizsgálatokhoz, viszont jelentősen megnő a térképezés felbontóképessége, míg a termesztett árpához kevesebb kell, de csökken a felbontóképesség.
A populáció genomi sajátosságaitól: Kromoszómák közt eltérő (pl. árpa), egyiken 10, másikon 2 cM távolság az ahol már a markerek nem álltak szignifikáns kapcsolatban. Őszi vs. tavaszi árpa: más kromoszómákon vannak az életformát meghatározó gének: amin a fagyállóság van, az az őszi árpa kromoszómáján 15 cM-es (sokkal nagyobb LD csökkenés), a tavaszin csak 2-es. A populáció mérettől és a szerkezetétől: Fel lehet rajzolni ilyen struktúrát, ezzel el lehet kerülni a fals összefüggések megállapítását.
Alkalmazott statiszikai modelltől: • Egyszerű marker+tulajdonság asszociáció (naiv modell) • Általános lineáris modell (GLM) • Kevert lineáris modell – MLM+Kinship mátrix; MLMK • Kevert lineáris modell + populáció struktúra – MLMK + Q mátrix A vizsgált tulajdonság genetikai szabályozásának komplexitásától: Egyszerűbb tulajdonságok (pl.: lisztharmat-rezisztencia) vizsgálata könnyebb, míg mennyiségi tulajdonságoké, amit több kis gén határoz meg, az nehezebb.
Génexpressziós vizsgálatok Kocsy Gábor 2012/09/27 15:20 CEST Eukarióta génkifejeződés: Az RNS polimeráz II szintetizálja eukarióta sejtekben a mRNS-eket, amiknek a sejtmagban előforduló formáit elsődleges transzkripteknek nevezzük. Az elsődleges transzkriptek összessége a sejtmagban alkotja az ún. heterogén nukleáris RNS-t (hn-RNS). Ezek átlagos mérete 7000 nukleotid körül van, viszont az egyes láncok hossza nagyon különböző és erre utal a heterogén jelző. Az eukarióta sejtekben a mRNSek, tehát az RNS polimeráz II transzkriptjei, mindkét végükön (5’ és 3’ a végükön egyaránt) módosítottak, és ez jelzi a sejt számára, hogy ezeket az RNS-eket fehérjébe kell fordítani. Az eukarióta gének tehát mozaikosak, kódoló szakaszok (exon) és nem-kódoló szakaszok (intron) váltakozásából állnak. Az exon tehát a DNS azon szakasza, aminek másolata az mRNS-ben megmarad, és transzlációt követően megjelenik a fehérjében is. Ezzel szemben az intron az a DNS szakasz, aminek másolata az mRNS-ből az RNS érés során kihasad. Az intronok felfedezése végül magyarázatot ad a hnRNS-ek régóta ismert rejtélyére. A fehérjék átlagosan 300-400 aminosavból állnak, ami 900-1200 nukleotidból álló RNS-nek felel meg. A hnRNS-ek tehát feltűnően hosszúak az általuk kódolt fehérjékhez képest. Az is ismert volt, hogy a hnRNS-ek néhány perc alatt a 7000 nukleotidos méretükről 1500 nukleotid méretre csökkennek anélkül, hogy elvesztenék 5’ és 3’ módosításaikat. Az intronok felfedezése magyarázatot adott a hnRNS-ek misztikus voltára. Az elsődleges (primer) transzkriptek a gének gazdaságtalan kópiái, amik exonból és intronból állnak és ezek összessége alkotja a hnRNS-t, aminek átlagos hossza az intronok miatt jelentősen nagyobb, mint azt a fehérjék aminosav tartalma alapján várni lehetne. Az intronok azonban az RNS érés folyamata során kivágódnak az mRNS-ekből, mielőtt az kijutna a sejtmagból és ez magyarázza az mRNS-ek átlagos méretének drámai csökkenését. A citoplazmába kijutó mRNS egy része átíródik fehérjévé, ezek poszttranszlációs módosítása is lehetséges, más része különböző szabályozó mechanizmusokon át inaktiválódik (géncsendesítés). Promóterek A transzkripció cisz elemei, a DNS-molekula szabályozó szakaszai, amelyekhez az RNS polimeráz enzimek és a transzkripciós faktorok kapcsolódnak. Promóterek típusai Csoportosíthatjuk elhelyezkedésük, működésük szerint.
Konstitutív promóter: nem szabályozott promóter, amely a hozzátartozó gén folyamatos átírását biztosítja, állandó nem-specifikus génexpressziót eredményezve. Állandóan kifejeződnek. Indukálható vagy induktív promóter: környezeti tényezők hatására aktiválódó promóterek. Csak egy adott fejlődési szakaszban vagy egy adott környezeti hatásra fejeződnek
Indukálható promóterek működésére példa Promóter régió, ami előtt, transzkripciós iniciációs komplex, amely a transzkirpció kezdeténél játszik szerepet; transzaktivátor. A tetraciklin receptor hozzákapcsolódik a promóter régióhoz, akkor nem történik meg az átírás, ha a tetraciklin receptorhoz tetraciklin kapcsolódik, akkor ez a komplex leválik és a transzkripciós iniciációs komplex odakötődik és kifejeződik a gén. A génkifejeződés szabályozása géncsendesítéssel Először petúniában írták le. Az antocianin-szintézisben szerepet játszó kalkon-szintáz génjét fejeztették ki fokozott mértékben a virág színének sötétítése céljából. Az eredmény pigmenthiány lett (mozaikos virág) a koszupresszió jelensége miatt. A mozaikos virágszín oka, hogy ha egy bizonyos gén termékeit nagyon nagy mértékben vannak jelen, akkor a szervezet védekezésképen tett szabályozáson keresztül azt elnyomja, és előfordulhat, hogy még az adott működésnél is kisebb lesz a működése, mint ebben az esetben. A géncsendesítés kis RNS-eken alapuló mechanizmusa Hátterében rövid (21-24 nukleotid hosszúság), nem kódoló RNS-ek állhatnak. Két csoportjuk az ábrán: si-RNS, mi-RNS.
Si-RNS képződés: Kettős szálú RNS képződik, ezt egy specifikus endoribonukleáz felismeri, és kis darabokra hasítja, si-RNS duplex jön létre, amely hozzákapcsolódik egy fehérjekomplexhez (RNA-induced silencing complex), ATP segítségével aktiválódik, majd az si-RNS-eknek megfelelően felismeri a megfelelő célszekvenciákat, hozzákapcsolódik és a jelölt mRNS darabokra hasítódik, nem fog már átíródni, fehérje képződni. Másik lehetőség a géncsendesítésre mi-RNSeken keresztül történik: tükörkép ismétlődések saját magukkal kapcsolódnak, így hurkos képződmények alakulnak kis, ezek hasításával létre jönnek a kis RNSek, amik fehérjekomplexhez kapcsolódnak. Kis RNS–fehérjekomplex hozzákapcsolódik a cél mRNS-hez és megakadályozza a fehérje képződést. Előző esetben az RNS tényleges feldarabolódás történt, itt pedig a cél RNS-nek az inaktiválódása.
Különböző környezeti hatások és fejlődési folyamatok is befolyásolhatják a gének kifejeződését. Ezt érzékelik az élő szervezetek különböző receptorok segítségével, majd a felfogott jelet egy jelátviteli rendszeren keresztül elvezetik a célhatás helyére, a jel eredményeképp megváltozhat a génexpresszió: részben regulátor gének, amelyek transzkripciós faktorokat kódolnak, részben struktúrgének kifejeződését változtatja meg. A génexpresszió változásának eredményeképpen anyagcsere-változások következnek be, ez vissza is hat a génkifejeződésre. A kép a promóter szabályozó elemeihez kapcsolódó transzaktivátorok különböző csoportjait mutatja be. Ha pl. környezet hatására hozzákapcsolódik a transzaktivátor, akkor indukció történik, olyan is bekövetkezhet, hogy a cisz-elemet a transzaktivátor módosítja például, foszforilálással aktiválja, vagy receptor molekula esetében a receptornak a lebontása aktiválhatja a gén kifejeződését.
Génkifejeződés kivonatokban: Northern-blot: mRNS mennyiségi mérésre alkalmas módszer, mely információt ad a méretről és a szekvenciáról. Időigényes, régebben használták inkább.
RNS-izolálás
elválasztás agarózgélen
átvitel nylon-membránra
hibridizáció jelölő próbával
RT-PCR: Gyors.
RNS-izolálás
cDNS (másolat DNS) készítése reverz transzkripcióval (RT)
DNS-felszaporítás PCR-rel
fluoreszcensen jelölt termék folyamatos detektálása a reakció közben adatelemzés a beépített programmal
Array-módszer: sorrendet jelent; a hibridizációhoz használt cDNS vagy oligonukleotid szekvenciákat sorokba rendezve viszik fel valamilyen hordozóra Transzkriptom-elemzés: az mRNS-ek és a nem kódoló RNS-ek összeségének egyidejű elemzése Felhasználás: gének kiválasztására, az eredményeket meg kell erősíteni (RT-PCR). Méret szerint: macroarray – hordozó 8 × 12 cm-es Nylon-membrán, 30-40 g RNS szükséges hozzá, 10-15000 gén expressziójának egyidejű vizsgálatára alkalmas, radioaktív jelölés microarray – hordozó tárgylemez, 1-2 g RNS szükséges hozzá, 40-50000 gén expressziójának egyidejű vizsgálatára alkalmas, fluoreszcens jelölés Felvitt nukleotidszekvencia szerint: cDNS-array – baktériumokban klónozott, PCR-rel felszaporított, 400-500 nukleotidnyi EST (expressed sequenced tag – szekvenált 400-500 nukleotid hosszú cDNS, melyeket cDNS- könyvtárakból határoznak meg) szekvenciákat visznek fel, kevésbé specifikus oligonukleotid-array – adatbázisok szekvenciái alapján 50-60 nukleotidnyi oligonukleotidokat szintetizálnak és visznek fel Időigény: RNS-izolálás, cDNS-szintézis, hibridizáció, fényképezés – 2-3 hét (technikai munka) adatelemzés – minimum 2-3 hónap (háttérkorrekció, normalizálás…) Azokat a gének szokták tekinteni egy adott hatásra válaszolónak, ahol a kifejeződés legalább kétszeresére nő, vagy felére csökken. Rendszerbiológia:
Géntranszformáció, transzgénikus növények előállítása Mészáros Klára 2012/10/04 14:15 CEST Genetikai transzformáció: idegen származású DNS bevitele a növényi genomba hagyományos szexuális út kikerülésével, modern génátviteli módszerek alkalmazásával. Transzgénikus vagy genetikailag módosított (GM) növény: a genomjába idegen származású gén bejuttatása géntechnológiai módszerrel, amely a genomba integrálódik, működik és öröklődik. Ezáltal a GM növények idegen származású fehérjét termelnek. Ha a géntechnológiával bevitt gén ugyanabból a fajból származik, mint a módosított növény, akkor ciszgénikus növényről beszélünk. Közvetlen (direkt) transzformáció
Kémiai hatásra
Elektromosság vagy ultrahang hatására
Mechanikai hatás
PEG - polietilén-glikol kezelés
A lipidmembrán instabillá válik
A szomszédos protoplasztok fúzionálhatnak
Az instabil lipidmembrán pólusokon jut be a DNS a protoplasztba
Hátrány, hogy a protoplasztokból történő növényregeneráció korlátozott
PEG mérgezés, életképesség csökkenés
Génbevitel liposzómákkal Liposzóma: membránnal határolt vezikuluum. Kívül foszfolipid, belül vízben oldott molekulák, DNS. Előállítás: apoláris oldószerből felületre párolt lipidfilmet vizes oldattal feloldjuk és diszpergáljuk rázással Liposzóma fúzionál a célsejttel. A membránok összeolvadnak, megtörténik a géntranszfer. Szárított embriók DNS oldatban történő rázatása A száraz növényi szövetek membránjának fiziko-kémiai tulajdonságai erősen megváltoznak a kiszáradás folyamán, így a DNS óriásmolekulák megfelelő gyakorisággal bejuthatnak a sejtekbe, áztatással
Pillangós és gombafajok embrióin próbálták ki a módszert
Tranziens génexpresszió kiváltására alkalmas
Elektroporáció: Elektromos impulzusokkal a sejtek DNS-felvétele fokozható. Rövid, megfelelő erősségű elektromos erőtér tranziens lyukakat eredményez a membránban. Protoplaszt, intakt növényi sejt, éretlen embrió. Egyszerű, gyors, olcsó, de hatékonysága alacsony. Elektrofúzió: Váltóáramú elektromos térben a protoplasztok dipólusként viselkednek, és láncszerűen összetapadnak, nagyfeszültségű egyenáram hatására a protoplasztok összeolvadnak, és ezt követi a magok fúziója (ezek DNS-tartalma keveredik). A fúziós gyakoriság nagy és a fúziós termékek életképesek. Nincsenek mérgezési tünetek, mint a PEG-nél. Ultrahanggal történő génbevitel: Szonikáció: A protoplaszt sejteket 20 kHz ultrahang hatásának teszik ki, a megfelelő génkonstrukciót tartalmazó plazmid jelenlétében, oldatban. A túlélő protoplasztok életképesek és nagy regenerációs kapacitással rendelkeznek, DMSO hatására a regenerációs képesség még tovább nő és a tranziens génexpresszió is nő. Előnye, hogy egyszerűbb módszer, mint a PEG vagy az elektroporáció Mechanikai úton történő génbevitel Transzformáció szilikon karbid tűk felhasználásával: Intakt növényi sejtek használhatók kiindulásként. A sejteket DNS-tartalmú folyékony táptalajban rázatják szilikon-karbid tűkkel együtt. A szilikon karbid tűk mikroméretű injekciós tűkként működnek áthatolnak a sejtfalon és sejtmembránon és ily módon bejuttatják a rájuk tapadt DNS-t a sejtbe Előny: egyszerű, olcsó. Hátrány: sejtek károsodása, regenerációs hatékonyság alacsonyabb Mikroinjektálás: A DNS oldat közvetlen beinjektálása a protoplasztba vagy a sejtmagba. A műveletet mikroszkóp alatt, mikromanipulátorral végzik: manipulátor egyik karja rögzíti a protoplasztot, a másik beinjektálja a DNS oldatot (2 pl) adagoló szivattyú segítségével áthatolva a sejthártyán Biolisztikus transzformáció: A leghatékonyabb, legelterjedtebb módszer. A bevinni kívánt DNS-t 0.5-2 mikorméter átmérőjű arany- vagy volfrámszemcsékre visszük fel és ezeket a mikrokarriek molekulákat nagynyomású hélium vagy nitrogén gázzal belőjük a célszövetbe. Egy műanyag lemezre szárítjuk rá a mikrokarriereket, amikor a gáz hozzáér, akkor tulajdonképpen lelöki az alatta levő rácsra, a lemez ottmarad, a szemcsék viszont tovább repülnek. A nyomásszabályozásért a hasadótárcsa felel, ezt éri el először a gáz. Előny: valamennyi növénynél alkalmazható.
Közvetett transzformáció: Vírus, vagy baktérium közvetít. CaMV, karfiol mozaikvírus: Kettős szálú DNS vírus, hossza 8 kb, hátránya, hogy rövid kb. 1 kb DNS vihető át vele. A fertőzés vektorai a levéltetvek vagy mechanikus: a vírus megszúrja a növényt és bejuttatja a nyálát. Szűk a fertőzhető növények köre, betegségben el is pusztulnak. Gemini vírusok: Egyfonalas DNS vírusok, genomméret kb. 2.5 kb, nagy előnyük, hogy a beépítendő DNS mérete nem limitált a köpenyfehérje hiánya miatt. Fertőzés vektorai a levéltetvek, gazdaspecificitásuk széles. RNS-vírusok: A cDNS-re írodik át a bevitt RNS, és majd erről tud kifejeződni. Kicsi az esélye, hogy a bevitt gén integrálódik a genomba, ezért főleg akkor alkalmazzák, ha nem akarják, hogy örökítődjön a tulajdonság. Transzpozon vektorok: Ez a DNS-szekvencia képes ugrálni a genom mentén. Létezését először kukoricában mutatták ki. Két szomszédos inszerciós elem+közbeékelődött gén komplexe, mely bármely DNS lehet. Agrobacterium tumefaciens: Talajban élő Gram-negatív baktérium, sebzési helyeken gyökérgolyvásodást vagy hajszál-gyökeresedést okoz (crown gall). Gazdakörük rendkívül széles. Amikor egy növény megsérül, akkor bizonyos vegyületek szabadulnak fel, amik jelként szolgálnak az AB-nak, és így a növény felé vándorol, a felületén megapad és aktiválódik az a rendszere, aminek a segítségével az adott DNS-t átviszi a növénybe, méghozzá célzottan a sejtmagba. Sokáig nem tudták, hogy mi felelős az AB transzformációs képességéért, aztán kiderítették, hogy a tumefaciens egy Ti, a rhizogenes egy Ri plazmidot tartalmaz. Erre jellemző, hogy bizonyos géneket kódol, amiket át tud vinni a gazdaszervezetbe. Vannak olyan gének ezen a plazmidon, amik a fertőzésért felelősek, viszont megfigyelték, hogy transzformációkor ezek nem jutnak át. Vannak viszont olyan gének, amik az opinok termeléséért felelősek, ezek biztosítják a baktériumnak a tápanyagforrást, ezért termelteti a baktérium a növénynyel, ezek jutnak át a transzformációkor. Ezek meghatározott helyen helyezkednek el: vannak ún. határszekvenciák, az ezek közt elhelyezkedő gének azok, amik transzformációkor átjutnak a gazdaszervezetbe. Azok a gének, amelyek a plazmidon helyezkednek el, de nem jutnak át, azok a vir-gének. Azt is megfigyelték, hogy a határszekvenciák közt, amit egyébként T-DNSnek neveznek, elhelyezkedő gének nem szükségesek a transzformáció végbemeneteléhez, ezért hogyha ezeket a géneket kicseréljük olyan génekre, amiket mi be akarunk vinni a növénybe, akkor ez a rendszer ugyanúgy működik. Tehát, a génkonstrukciót úgy tudjuk előállítani, hogy a határszekvenciák közt kicseréljük a géneket, a plazmidon rajta vannak a vir-gének, mert ezek hiánya viszont ellehetetleníti a transzformációt. A növények sebzése szükséges, hogy az AB valamilyen jelet kapjon, és szükséges az is, hogy az AB közel legyen, és viszonylag gyorsan odaérjen.
Egyszikűekben a sebzés hatására sejtelhalás történik, így nem képződik elég szignál, ezért okozhat nehézséget transzformálásuk, ezért volt a biolitikus transzformáció az elsődleges módszer az egyszikűek esetében. Később rájöttek, hogy különböző mesterséges vegyületekkel, pl. acetosziringonnal ez a szignál kiváltható. Kemotaxis: A. tumefaciens számára vonzó vegyületek (kemoattraktant): egyes szerves savak (szukcinát, p-hidroxybenzoát), bizonyos aminosavak (valin, arginin), szénhidrátok (cukrok), oldható fenolok. chvE gén – cukor-kötő fehérjét kódol, mely a sejtmembránon található kemotaxis receptorokkal kölcsönhat, sérült sejt felismerésben játszik szerepet, aktiválja a vir-géneket. vir gének – a T (transzfer)-DNS szintézisében és növényi sejtbe való átvitelében játszanak szerepet, a Ti-plazmidon találhatók. Ez a folyamat szabályozott és függ attól, hogy a baktérium milyen érzékenyen reagál a növény sebzésre adott válaszára (fenolok, cukrok). chvEcukor komplex képződése és kölcsönhatása megváltoztatja a VirA konformációját. Alacsony fenol koncentráció esetén aktiválja a baktérium mozgását a növényi sejt irányába. VirA-VirG-kéttagú szabályozó rendszer: - VirA: Membránkötött kémiai receptort kódol. Érzékeli a növényi szignált, magas fenolkoncentráció esetén foszfokináz aktivitása lesz, melynek hatására egyik hisztidinjének foszfát csoportját átadja a VirG aszparát aminosavának, ezzel aktiválja. A VirG-transzkripciós faktor tartalmaz egy DNS és egy ATP kötő helyet is, saját promóterét írja át, aktiválja a szabályozó rendszert (virB,C,D,E,F,H és tzs) a promóter régió vir-box szekvenciájához történő kötődés révén. Ennek hatására a Ti-plazmid határszekvenciái közül kivágódik egy DNS-szál, amit ezek a fehérjék becsomagolnak, átviszik a növényi sejtbe és integrálják a genomba. A T-DNS szállítási folyamata azzal kezdődik, hogy a virD1 kitekeri a DNS-t és lehetővé teszi, hogy a virD2 elhasítsa az alsó szálat. A leszakadt szál kap egy virD2-sapkát, a virE pedig
becsomagolja a szálat, hogy megóvja a nukleázoktól. A szállításban a virB-gének játszanak szerepet: gyakorlatilag egy csatornát hoznak létre, amin át bejut a baktérium DNS-e a növényi sejtbe. A virD2 fehérjének a funkciója, hogy felismerje a sejtmag-szignálokat és irányítja az integrálódást is. Illegitim integráció: virD2 megtalálja a növényi DNS-en a sérüléseket, és hozzákapcsolja a T-szálat, először szekvencia-azonosságokat is keres, de végső soron teljesen pontosan hozzákapcsolja a növény 3’-végéhez a bakteriális DNS 5’-végét. A 3’-vége pedig vándorol a növényi DNS mentén és homológiákat keres, ahol viszonylag nagyot talál, ott párosodás jön létre, a növényi javító enzimek levágják a beépült DNS-t és elhasítják a növényi DNS eredeti szálát is, mert nem komplementer a párosodás. A hasítás után a javítórendszer kipótolja a hiányzó szakaszt, és így megtörténik a bakteriális DNS-beépülése. Biolisztikus A bejuttatott DNS-mennyiség nagy
A több kópia komplex átrendeződést, géncsendesítést okozhat
Agrobacterium Csak néhány T-DNS jut be
Alacsonyabb kópiaszámban történik a beépülés, növeli a génexpresszió valószínűségét, és kevesebb a szerkezeti átrendeződés
A beépülés helye véletlenszerű, gyakran inaktív A transzgén beépülése a transzkripciósan aktív kromoszómarégiókba integrálódik, és nem íródik régiókba preferáltan történik át. A belövés során fragmentálódik a DNS: nagy Nagy molekulatömegű DNS bevitele lehetővé molekulatömegű DNS nem juttatható be teszi egy lépésben több gén beépítését, mert védett formában jutnak át a növénybe.
Vektorok: Definíció: Az a DNS szakasz vagy molekula, mely egy adott sejten belül képes replikálódni, pl.: növényi vírusok (kettős szálú, egyszálú, RNS vírus) baktériumok plazmidjai a leggyakrabban használt vektor. A plazmidok kicsi, cirkuláris DNS-molekulák, amelyeken egy másolatindító (origin of replication) szekvenciarészlet is be van építve. organelláris cirkuláris DNS Követelmények:
önállóan replikálódjon restrikciós enzim hasító hely antibiotikum-rezisztencia marker idegen gén beépítésére alkalmas riporter gén, promóter
A funkcionális génkonstrukciónak két alkotóelemmel kell rendelkeznie: Kódoló régió, mely egy információközvetítő molekula, az RNS átmásolásához (transzkripció) és adott esetben a fehérjék szintéziséhez (transzláció) szükséges információt tárolja. Azok a szabályozó DNS-szekvenciák képezik, melyek az RNS átírásának indítását, végrehajtását és befejezését, valamint az előállított RNS-molekula további szerkesztését irányítják. Ezek a szabályozó DNS-elemek (például a promóter és a terminátorrégiók) általában a kódoló régió startpontja (ATG) előtt és végpontja (TAA, TAG vagy TGA) után, vagy akár abba beékelődve (intronok) helyezkednek el. Promóterek fajtái:
konstitutív (folyamatosan működik)
szövet- vagy sejtspecifikus (pl. Bt kukoricában nem jelenik meg a fogyasztásra szánt magban)
indukálható (hő, kémiai anyag…)
egyedfejlődéstől függő. Növény regeneráció
A növény sejtje, szövetei differenciálódtak, egy meghatározott feladat elvégzésére módosultak. Növények esetében lehetséges a dedifferenciáció, az eredeti genetikai program törlése. Ezután újra létrejöhet a differenciálódás (redifferenciáció). Totipotencia: A soksejtű növény minden élő sejtje teljes értékű, totipotens, vagyis teljes génkészlettel, genetikai és biokémiai potenciállal rendelkezik, és megfelelő körülmények mellett képes lehet önálló fejlődésre. Így egy izolált sejtből regenerálható a teljes növény. Explantum: Az a növényi rész, izolátum, melyet táptalajra helyezünk fenntartás, növekedés és fejlődés céljából. Ebből csinálhatunk: Kallusz: A már nem osztódó, differenciált szövetből másodlagosan kialakult növényi osztódó szövet. A kalluszképződés megindulásában igen nagy szerepet játszanak a növényi hormonok. Szövettenyésztéskor az explantum szilárd táptalajra helyezésével és hormonkezelésével érik el a dedifferenciációt, így osztódáskor differenciálatlan parenchima sejtek jönnek létre. Sejtszuszpenzió: Embriogén kultúrából hozható létre, a sejtaggregátumok folyékony táptalajban történő diszperziójával, nagy regenerációs képesség, transzformációs kísérletekben gyakran alkalmazzák, mert meg tudjuk határozni, hogy melyik az az egy sejt ami transzformálódott.
Protoplaszt kultúra: A protoplaszt olyan sejtmembránnal határolt növényi sejt, melyek sejtfalát eltávolítottuk. Növények esetében az egyetlen regenerációs rendszer, mely egy sejtből indul ki. Az explantumokat leöntjük AB-szuszpenzióval, ún. együttenyésztés történik: 3 napig inkubáljuk őket. Amikor ennek vége, akkor riporter gének segítségével tudjuk kimutatni, hogy bejutott-e a génkonstrukciónk a célsejtbe. Riporter gének Riporter gének követelmények: Könnyen kimutatható érzékeny módszer, kvantifikálható, nem letális. Leggyakoribbak: • β-glükuronozidáz (gusA) • luciferáz (luc/lux) • green fluorescent protein(s) (gfp) •Antocianin: autopigmentáció GusA: β-glükuronozidáz glükóz-szubsztrátját adjuk a sejtekhez, inkubáljuk: dimerizáció > indigó vegyület. Hátrány: ha nagy mennyiségben van jelen a gus-gén, akkor a szomszédos sejtek is elszíneződnek. Letális, csak arra jó, hogy felmérjük az arányokat. Luciferáz: Szentjánosbogárból vonták ki, d-luciferin + ATP + O2 > oxiluciferin + fény…, ezt egy speciális kamerával tudjuk mérni. Előnye, hogy nem öli el a sejtet, tovább tenyészthető. Hátrány: drága a kamera. GFP: A fehérjének van egy spirális része, amit gerjeszteni tudunk, zölden fluoreszkál. Hátrány: bizonyos szövetekben, pl. búzamagban szintén vannak gerjeszthető fehérjék, amik erős hátteret adnak. Szelekció Szelekció: Amikor egy embriót transzformálunk, akkor csak néhány sejt transzformálódik, viszont ezeket nem tudjuk elválasztani a többi sejttől, ezért a génkonstrukcióba beleépítünk egy szelekciós gént is, ami lehetővé teszi a transzgénikus sejtek elválasztását a nemtranszgénikusoktól. Vannak antibiotikum vagy herbicid-rezisztenciát biztosító szelekciós gének, ilyen a bar-gén. Foszfinotricin (gyomirtó) kezelés után azok a növények, amelyek nem tartalmazzák ezt a rezisztenciagént, azok az ammónia felhalmozódás miatt elpusztulnak. A szelekció kb. 3 hétig tart, az első két hétben nincs különbség, aztán hirtelen elpusztulnak a nem-rezisztensek.
PCR RT-PCR: kvantifikálható, ez kell a kópiaszámmeghatározáshoz. A TG-növények kimutatásának legelterjedtebb módszere a TaqMan-próba (Thermus aquaticus Polymerase + PacMan): Van egy specifikus primerünk és van egy olyan próbánk, ami szekvencia-homológiát mutat a keresett génnel. Amikor megcsináljuk ezt az elegyet, akkor a primer bekötődik a megfelelő helyre és a próba is bekötődik a transzgénhez, ez azonban egy másik helyen van. A próba két festéket tartalmaz, az egyik az a riporter, a másik pedig elcsendesíti azt. Amikor a megindul a DNS-szintézis és a Taqpolimeráz eléri a próbát, akkor levágja róla a riporter festéket, ezt tudjuk detektálni.
Transzgénikus állatok előállítása és alkalmazása Gócza Elen 2012/10/11 14:15 CEST
Molekuláris markertechnikák Vida Gyula 2012/11/08 14:15 CET Markerrendszerek:
RFLP
PCR-alapú markerek o ismeretlen kromoszómális elhelyezkedésű: RAPD, AFLP o ismert kromoszómális elhelyezkedésű: helyspecifikus: SSR génnel kapcsolt: STS, SCAR, CAPS o génexpresszión alapuló markerek: EST, SNP, Tilling o HTP marker technikák (DArT, SNPWave)
Új generációs szekvenálás
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) A genomi DNS-ből származó restrikciós fragmentumok méretének összehasonlítása - kiváló minőségű DNS izolálása - emésztés restrikciós enzimekkel - elválasztás elektroforézissel - a fragmentumok membránra vitele - hibridizálás jelölt DNS próbával - előhívás
