ÉLELMISZERIPARI BIOTECHNOLÓGIÁK Genetikailag módosított organizmusok kimutatása és meghatározása élelmiszerekben Tárgyszavak: élelmiszer; szabályozás; GMO; kimutatás. Az USA-ban az 1999-ben kukoricával, gyapottal és szójababbal bevetett területek több mint 40, 50, ill. 45%-án a növények genetikailag módosított változatát termesztették, a szupermarketek élelmiszer-kínálatának pedig legalább 60%-a tartalmaz „genetikailag módosított szervezetet” (genetically modified organism, GMO). Az érdekelt ágazatok intenzív PR-programjainak köszönhetően az amerikai fogyasztók általában nem idegenkednek az új ételektől, szemben a világ más részeire jellemző bizalmatlansággal, sőt élénk, olykor szervezett visszautasítással. Az egészségügyi fenntartások mellett felmerültek a szellemi tulajdonjog problémái és a nem transzgénikus vetőmagok GMO-fertőződésének lehetősége is. Mindez arra késztette az EU illetékeseit, hogy egyrészt korlátozzák a GMO-tartalmú élelmiszerek importját, másrészt előírják ezek hagyományos árutól megkülönböztető megjelölését, a jelöletleneknél csupán 1%-os GMOtartalmat megengedve. Ugyanígy járt el a nem EU-tag Svájc és Norvégia is. Az USA legújabb szabályozása nem teszi kötelezővé a jelölést (címkézést), csak azt, hogy a GMO-tartalmú élelmiszer forgalmazásának szándékát a tervezett piaci megjelenés előtt legalább 120 nappal be kell jelenteni az illetékes szövetségi szintű hatóságnál (Food and Drug Administration, FDA). A nemzetközileg elfogadott 2000. évi „Biológiai-biztonsági jegyzőkönyv” (Cartagena Biosafety Protocol), amely a GMO-k országhatárokat keresztező szállítását szabályozza, megengedi a kormányoknak a határátlépés megtiltását, ha felmerül a „fertőzöttség” gyanúja. A GMO-vizsgálati módszerek típusai, mintavétel, referenciaanyagok Mindezen fenntartások, teljes vagy részleges tilalmak a kormányok, az élelmiszer-termelők, -feldolgozók és -forgalmazók számára egyaránt nélkülözhetetlenné teszik a GMO-k mennyiségi meghatározására alkalmas laboratóriumi módszereket.
Ezek a módszerek a terményben és az élelmiszerben a genetikai módosításként – beültetett DNS vagy – az általa kódolt új fehérje jelenlétének kimutatására vagy mennyiségi meghatározására alkalmasak. A vizsgálati anyagok gyakran inhomogén volta miatt kényes probléma – mind a minta mérete és reprezentativitása, – mind a mintavétel módja, így voltaképpen minden GMO-vizsgálati minta a módszer érzékenysége, megbízhatósága és költsége közötti optimálás (bizonyos kompromisszumok) eredménye. Ezért ez esetben különösen kívánatos volna a nemzetközi egyeztetés, pl. az USA Codex Alimentarius Bizottságának irányításával. Az elemző módszerek és laboratóriumok hitelesítéséhez a pozitív, ill. negatív eredményt igazoló referencia-anyagokra van szükség. E célra – ismert GMO-tartalmú, stabil gabonamagvak, – a génexpresszió folytán termelődött fehérjék és – a módosított DNS egyaránt megfelelnek. Olykor használnak – genom- és plazmid-DNS-t is. A fehérjekimutatással ellentétben, amely könnyen viszonyítható egyetlen standard-hez, a DNS-alapú módszereket jobb több pozitív kontroll kombinálásával elvégezni. A referencia-anyagok beszerzését jelenleg megnehezítik a szellemi tulajdonnal összefüggő jogi és financiális gondok. Ilyen anyagok szójából, kukoricából korlátozott számban rendelhetők a Referencia-anyagok és -mérések Intézetétől (Geel, Belgium). Fehérjealapú vizsgálati módszerek Komplex mátrixba ágyazott fehérjék minőségi és mennyiségi meghatározására egyaránt kiválóan alkalmasak az immunvizsgálatok. A szükséges mennyiségtől, a detektáló rendszer specifikusságától, a vizsgálat megengedett időtartamától és költségétől függően használandók – igen specifikus monoklonális vagy – érzékenyebb poliklonális antitestek. A növényi szövetek tipikus GMO-koncentrációját (>10 µg/g) alapul véve, az immunvizsgálat 1% nagyságrendű GMO-t tud jelezni módosított fehérje formájában. Immunvizsgálatokat szilárd fázishoz kötött antitesttel két formában végeznek: – az egyikben a detektáló és a kimutatandó anyag versenyez a befogó antitesthez való kötődésért,
– a kettős („szendvics”-) próbában detektáló és a befogó antitest a közéjük zárt kimutatandó anyaggal szendvicset képez. A Monsanto Roundup Ready márkanevű transzgénikus szójaváltozatának vizsgálatára alkalmazták – az ún. western blot módszert és – az ELISA (enzimhez kötött immunszorbens próbát). Az új szójabab (Roundup Ready soybean, RRS) nem érzékeny a glifozát nevű gyomirtóra és egy Agrobacterium alfaj CP4-törzsében található, az 5-enol-piruvil-sikimát-3-foszfát-szintáz (EPSPS) enzimet kódoló gént tartalmazza. Western blot A western blot próbával nagy specifikussággal lehet megállapítani, hogy egy mintában a vizsgálandó fehérje koncentrációja kisebb vagy nagyobb-e egy adott értéknél. A különösen oldhatatlan fehérjék elemzésére alkalmas módszer inkább tudományos, mint rutin vizsgálatokra vált be, és a célfehérje nátrium-dodecilszulfát-poliakrilamid gélben történő elektroforézisén alapszik. Az elektroforézis nitrocellulóz membránra juttatja a fehérjét, ahol immunoglobulint megkötő helyeit szárított zsírtalan tej blokkolja. Az antitesttel felkutatott és megkötött speciális helyeket végül megjelölik színezékkel vagy szekunder immunológiai reagenssel. A western blot módszerrel elérhető kimutatási határ sült tésztában 1%, magvakban 0,25%. ELISA-módszer Az ELISA-módszer eszközei antitesttel bevont lemez, csík vagy cső. Alkalmas nagy volumenű, emellett nagy érzékenységű laboratóriumi vizsgálatok elvégzésére. A 90 perces lemezes vizsgálat eredményét: a minta koncentrációját optikai lemezen lehet leolvasni. Az EPSPS-t transzgénikus szójababban szintén 0,25%-ig, készítményekben 1%-ig lehet kimutatni. Az antitestbevonatú csővel terepen végezhetők 15-30 perces kvalitatív vizsgálatok. Az ELISA-vizsgálathoz szilárd hordozófelületként mágneses részecskék is használhatók. A részecskéket bevonják a befogó antitesttel, és a reakció tesztcsőben megy végbe. A megkötött reakciópartnereket mágnes segítségével különítik el az oldatban maradtaktól. Ennek a módszernek a előnye a részecskék szabad mozgásának és egyenlő méretének tulajdonítható pontosság, valamint a kombinálás lehetősége immunvizsgálati tömegspektrometriával és az antitestnek a célmolekulához való kötődését megfigyelő bioérzékelőkkel. A GMO-vizsgálatokhoz való egységes és szabályozott alkalmazás megkívánja az ELISA- és DNS-alapú módszerek optimálását és hitelesítését. Az igen különböző anyagú élelmiszerek esetében az optimálás tényezői:
– a paraméterválasztás (pl. a tesztkészlet minősége, módosított fehérjék választott vizsgálati módszere, inkubálás időtartama), – a küszöbérték, vagyis a pozitív és negatív eredmény közötti határ megválasztása, – a kereskedelmi forgalomban levő és a „házi használatú” tesztkészletek összehasonlítása, valamint – a munkakörnyezet (a laboratórium vizsgálati gyakorlata esetleges fertőzési lehetőségek a környezet vagy a vizsgálandó személyzet oldaláról). A hitelesítésben szerepet játszó tényezők: – az extrahálás hatékonysága, – az eredmények pontossága – két szoros eredmény megkülönböztetésének képessége, – érzékenység, kimutathatósági határ, – specifikusság, – reprodukálhatóság, – a kimutatás megbízhatósága. A legcélszerűbb referenciaként a vizsgálandó anyaghoz hasonló, ismert GMO-koncentrációjú mátrixot használni. 13 EU-állam és Svájc 38 laboratóriumának részvételével 2000-ben hitelesítő vizsgálatot végeztek az ELISA-módszer pontosságának ellenőrzése céljából. Ehhez szójalisztben RRS-nek a CP4-EPSPS-fehérje elleni monoklonális antitesttel és poliklonális antitesttel történő kimutatását választották. Az élelmiszerjellegű referenciaanyag 1,25% GMO-t tartalmazott. Az eredmények a vizsgálati mintában egységesen 0,35% körüli GMOkoncentrációt mutattak ki. Az ELISA-módszer a legjobb választás egy speciális GMO szűrővizsgálatára nyersanyagokban, félig feldolgozott élelmiszerekben és feldolgozott komponensekben, viszont a PCR-módszereknél kevésbé érzékeny több öszszetevőjű készételek vizsgálatára, különösen, ha alacsony a kimutathatósági határ. DNS-alapú vizsgálati módszerek Jóllehet a fehérjealapú vizsgálatok viszonylag egyszerűek és hatékonyak, néhány genetikailag módosított élelmiszerben a génexpresszió nem produkál kimutatható mennyiségű fehérjét. Ilyenkor használható a DNSkimutatás, amely a DNS kettős spiráljának két szála közti komplementaritáson és azon alapszik, hogy a spirál a szekvenciára jellemző módon hibridizálódik. A beültetett DNS különböző elemei – promoterszakasz, szerkezeti gén, a génfunkciót leállító szakasz – kimutathatók – southern blot- és – PCR-elemzéssel.
Southern blot A southern blot eljárás szerint az izolált DNS-mintát nitrocellulóz vagy nylon membránon rögzítik, a GMO-ra specifikus, kettős szál jelölésű nukleinsavval reagáltatják, és a hibridizálódást radiográfiás, fluorometriás úton vagy kemilumineszcenciával detektálják. A mintákat kezdetben 32P-vel jelölték, de utóbb áttértek a DNS nem radioaktív, de hasonló érzékenységű dioxigenines vagy biotinos jelölésére, amellyel ráadásul 24-ről 1 órára rövidült a vizsgálat ideje. Egy 2001. évi közlemény a southern blot elvén két közeli infravörösben fluoreszkáló színezék használatáról számol be, amelyek 5 perces reakcióval közvetlenül kötődnek a DNS-hez. A színezék jelét két detektor egyidejűleg észleli. Kvalitatív PCR A PCR-módszer szintén a DNS-polimeráz specifikusságát használja fel olyan speciális DNS-szakszok megsokszorozására, amelyek egy több szekvenciát tartalmazó keverékben kis számban találhatók. Ezek elektroforézissel vagy nagy teljesítőképességű folyadékkromatográfiával választhatók ki. PCR-rel különféle élelmiszereket (búzát, kukoricát, rizst, burgonyát, paradicsomot) elemeztek. A vizsgálat mennyiségét korlátozó lépése a DNS kivonása és tisztítása. Az extrahálás elterjedt módszerei: – az élelmiszerminta inkubálása egy detergens: cetil-trimetil-ammóniumbromid (CTAB) jelenlétében és – DNS megkötése szilikongyantán. Az extrahálás során túlhevítés, alacsony pH (élelmiszergyártás közben gyakori) elősegíti a DNS degradálódását. Az élelmiszer-komponensek – fehérjék, zsírok, szénhidrátok – gátolhatják a DNS-polimerázt, ami azért figyelemre méltó, mert a sikeres PCR-elemzéshez minimálisan 400 bp (Mrd bázispár) DNS-átlagméret szükséges. Az EU-országokban kapható GMO-k többsége tartalmazza három genetikai elem valamelyikét: – a karfiol-mozaikvírus, CAMV 355 promoterét és – a nopalinszintáz (NOS-) terminátor vagy – a kanamicin-rezisztencia marker gén. Ezek természetes módon is előfordulnak néhány növényben és talajbaktériumban, így a PCR-teszttel hamis pozitív eredményt adhatnak. Ezért minden pozitív eredmény esetében termékspecifikus PCR-viszgálatot kell végezni, amilyet számos élelmiszerre kidolgoztak. A kimutatási határ a cél-DNSre 20 pg és 10 ng között, a GMO tömegének 0,0001 és 1%-a között változik. A kvalitatív PCR nemzetközi hitelesítési vizsgálatát ezúttal 1998-ban 29 laboratóriumban végezték el, a GM szójababból származó 35S promoter és a
NOS-terminátor kimutatásával szójababban, kukoricában és feldolgozott élelmiszerekben. A 2% RRS-t tartalmazó minták mindegyikét minden laboratórium azonosította, ezenkívül hibátlanul azonosították CaMV 35S promoter elemzése alapján a 0,5%-nyi transzgénikus szóját. A NOS-terminátor vizsgálata nem ilyen megbízható, 3-7 hamisan negatív eredményt adott. Egy Svájcban 1999ben a fenti két genetikai elem kimutatásával végzett hasonló körvizsgálat az egyes laboratóriumok eredményei közötti tízszeres különbségekkel végződött. A GeneScan Europe (Bremen, Németország) 2001-ben ismertetett, 5321300105 katalógusszámmal szereplő, élelmiszer-készítményekben GMOk összetett PCR-rel történő kimutatására alkalmas tesztkészlete („GMO Chip: test kit for the detection of GMOs in food products”) specifikusan detektálja növényfajok és genetikai módosítási jegyek szekvenciáit. A mintából kiválasztott és megtisztított DNS speciális szakaszait két PCR-reakcióval megsokszorozzák, a reakcióterméket összekeverik, majd exonukleáz hozzáadásával egyszálas DNS-t készítenek. Ezután a mintát hibridizáló pufferrel vegyítve, a csipre terítik. Ekkor a csiphez kovalensen kötött cDNS-mintákkal hibridizálódó, megsokszorozott szakaszokat megjelölik Cy5 fluoreszkáló színezékkel és Biodetect 654 biocsip-olvasóval elemzik őket. A GMO Chip Kit kimutatási határa kb. 250 másolat a PCR minden DNS-célszekvenciájában. Kvantitatív végpont – PCR Mivel az EU-ban előírt élelmiszer-címkézés alapja a megengedett GMOtartalom, feltétlenül szükség van mennyiségi PCR-módszerre, amihez egy belső DNS-standard-et együtt kell megsokszorozni a cél-DNS-sel. Ilyen a svájci kutatók által 1998-ban publikált kvantitatív-kompetitív (QC-) PCR módszer, amelynek lépései: – az említett együttes sokszorozás közös reakciócsőben, – a termékek szétválasztása pl. elektroforézissel, – a gél elemzése denzitometriásan (sűrűség alapján), – a standard és a cél-DNS arányának becslése regresszióelemzéssel. Az ekvivalenciapontban a belső standard és a cél-DNS induló koncentrációja egyenlő, vagyis a regressziós egyenes meredeksége 1, a regressziós együttható >0,99. A QC-PCR-módszerben a standard és a cél-DNS közötti verseny következtében csökken az érzékenység, ennek ellenére a svájci közlés szerint megengedi 0,1% GMO-DNS kimutatását, és ez az arány az új, 1997. évi Európai Élelmiszer Szabályzat határértéke alatt marad. A QC-PCR hitelesítésére 12 európai laboratórium vállalkozott. A GMOkat tartalmazó kódolt mintákat kétszer vizsgálták és összehasonlították őket 0,5 és 2% RRS-tartalmú külső standard mintával. A hat RRS-tartalmú minta 246 meghatározása között nem volt hibás negatív eredmény, a kontroll negatív mintában pedig nem mutattak ki tévesen RRS-t. A laboratóriumok eredményei között kisebb volt a különbség, mint a kvalitatív PCR vizsgálat alkalmával,
s azt is a minta elégtelen homogenizálása okozta. A QC-PCR kalibrálását a továbbiakban a kereskedelemben kapható tanúsított referencia-anyaggal lehet elvégezni. Kvantitatív valósidejű PCR A valósidejű kvantitatív PCR abból indul ki, hogy jóllehet a PCR-termékek képződése elméletileg exponenciális, a valóságban 40–60 ciklus után elér egy egyenletes szintet a reakciótermékek korlátozó hatása miatt. Ezeket a hagyományos PCR a reakcióprofil egyetlen pontján méri. A DNS-koncentráció egy korlátozott értéke fölött arányosság állapítható meg a DNS és PCRtermékek koncentrációja között (1. ábra), ami a mennyiségi mérés csökkent pontosságával jár együtt. Empirikusan azonban a valósidejű PCR-reakcióban, a DNS-koncentráció az exponenciális PCR-fázisban arányosnak bizonyul a PCR-ciklusok számával. Ha tehát ismert egy mintára az exponenciális növekedése folyamán ugyanazon pont eléréséhez szükséges ciklusok száma (1/c ábra), akkor meghatározható annak kezdeti DNS- (ezáltal GMO-) tartalma. (1/d ábra).
(a)
(b)
A B
10
C
a GMO-k %-a a mintában
5
D 10
100
2
0
1
0,1
0,01
E
a PCR-ciklusok száma G
F
A
B
0,0 0
C
1
0,1 D
E
0,01 F
25 a PCR-ciklusok száma
1
10
B
G 0,01
a PCR-ciklus száma
0,1
10
C
0,1
100
GMO%
a GMO-k %-a a mintában 100
D
F
4
(d) 1,0
E
8
50
(c) PCR-termékek
12
0
25
0
PCR-termékek
PCR-termékek
15
50
F 15
E D
25
C B
15 0,01
0,1
1. ábra Különbség a hagyományos PCR (a, b) és a valósidejű PCR (c, d) között
1 10 GMO%
100
Számos kereskedelmi forgalomban levő valósidejű PCR-hőciklizáló automatizálja az elemzést, ciklusról-ciklusra kísérve a reakciókinetikát és lehetővé téve a vizsgált szakasz koncentrációjának kiszámítását. Németországban egy 2000. évi beszámoló szerint a fenti eljárásnak 179 élelmiszer-készítményben (köztük diétás és bébiételekben, tésztafélékben, zsiradékokban, desszertekben) vizsgálták RRS jelenlétét. A módszer általában elég érzékenynek bizonyult, ennek ellenére a megsokszorozható szójaDNS-t nem mutatta ki zsírokban, olajokban és fűszerekben. Más minták közül viszont nyolcban 1% körüli genetikailag módosított RRS-t is sikerült kimutatni. Határhígításos PCR-módszer Az ún. határhígítás módszerének alapja – a PCR optimálása egy endogén kontrollgén megsokszorozása útján a végső vízszintes PCR-szakaszból „minden-vagy-semmi” elven, valamint – az a feltevés, hogy a reakcióelegyben egy vagy több célanyag (pl. GMO) pozitív eredményt ad. Mennyiségi meghatározáshoz a vizsgálandó anyagból hígítássorozatot kell készíteni. A hígítás határán, ahol negatív és pozitív végpontok is vannak, a jelen levő célpontok számát a negatívak arányából Poisson-féle statisztikával lehet kiszámítani. Meghatározás közeli infravörös (NIR-) spektroszkópiával A NIR-spektroszkópiát a gabonakereskedelemben kiterjedten használják az áru nedvesség-, fehérje-, keményítő-, olaj- és rosttartalmának roncsolásmentes meghatározására. Újabban kipróbálták hagyományos szója és RRS megkülönböztetésére. A szemek áramlása közben 8000 mintáról három Infratec 1220 berendezéssel felvett spektrumok 93%-ban helyesen különböztették meg a „természetes” terményt a transzgénikustól. A módszer nem igényel előkészítést, alig 1 perc alatt elvégezhető, ennél fogva olcsó is. Hátránya viszont, hogy nem azonosít vegyületeket, tehát kalibrálásra van szükség nagy adatbázis alapján, mégpedig minden felmerülő GMO-ra. Emellett a NIR nem mutatja ki a DNS vagy egyedi fehérjék megváltozását, csupán nagyobb szerkezeti változásokra reagál, amilyen pl. az új DNS hatására végbemegy a magok cellulózában és ligninjében. Az élelmiszerekben a génmódosított szervezetek kimutatására itt leírt módszerek az 1. táblázatban találhatók.
Összegzés – a GMO-címkézés EU-szabályozásának követési feltételei Először hitelesített kvalitatív PCR alapján el kell dönteni, hogy a vizsgálandó élelmiszerben van-e GMO, ha az eredmény negatív, akkor – a génexpresszió nyomán képződött fehérjére kell vizsgálni, ha az is negatív, akkor feltételezhető, hogy transzgénikus anyagok nem mutathatók ki. Amennyiben a kvalitatív PCR eredménye pozitív, a termék „nem engedélyezettnek” tekintendő és alá kell vetni – hitelesített mennyiségi (Q-) PCR-nek a GMO-tartalom meghatározására, ha ez meghalad egy kijelölt hatáértéket, akkor a termékre fel kell tenni a „nem engedélyezett GMO” jelzést, ha nem éri el, nem kell címkézni. A DNS-alapú módszerek használata (fehérjealapúak helyett) azért bizonytalan, mert a genetikai módosítással nyert élelmiszerek (pl. finomított olaj) nem mindig tartalmaznak elegendő DNS-t, emellett az élelmiszergyártás folyamatai, leginkább a hevítés, roncsolják a molekulát. A relatív, vagyis %-ban kifejezett GMO-tartalomról természetesen tudni kell, hogy az az összes, valamennyi forrásból származó DNS-re, vagy csak a vizsgált termék DNS-ére vonatkozik. 1. táblázat A genetikailag módosított élelmiszerekben rekombináns DNS termékeket specifikusan meghatározó módszerek jellemzése Tulajdonság
Fehérjealapúak western ELISA blot
southern blot
DNS-alapúak kvalitavalóstív PCR idejű PCR nehéz nehéz
QC-PCR és határhígítás nehéz
Alkalmazás egyszerűsége Speciális felszerelést igényel Érzékenység
nehéz
közepes
nehéz
igen
igen
igen
igen
igen
igen
nagy
nagy
közepes
nagy
nagy
Időtartam
2 nap
6 óra
2 nap
1 nap
150
30–90 perc 5
igen nagy 1,5 nap
150
250
350
450
nem
igen
nem
nem
igen
igen
nem
igen
nem
nem
nem
nem
kutatólabor
teszt
kutatólabor
teszt
teszt
teszt
Költség/minta, USD Kvantitatív eredményt ad Terepi vizsgálatra alkalmas Fő alkalmazás
(Dr. Boros Tiborné)
Ahmed, F. E.: Detection of genetically modified organisms in foods. = Trends in Biotechnology, 20. k. 5. sz. 2002. p. 215–233. Normile, D.: Asia gets a taste of genetic food fights. = Science, 289. k. 5483. sz. 2000. aug. 25. p. 1279–1281. Roseboro, K.: Standardizing GMO testing. = Food Processing, 61. k. 10. sz. 2000. p. 61–63.
EGYÉB IRODALOM Rodler I.: Hús és húsipari termékek biztonságának szerepe az élelmiszer-biztonság javításában I. = a Hús, 12. k. 2. sz. 2002. p. 92–96. Szabó M.: Élelmiszer-biztonság és egészség – hogyan tovább? = a Hús, 12. k. 2. sz. 2002. p. 97–100.
