BioSMART Volume 4, Nomor 2 Halaman: 18-22
ISSN: 1411-321X Oktober 2002
Aktivitas Antioksidasi Polifenol Glikosida Hasil Reaksi Transglikosilasi Enzim CGTase dari Bacillus macerans Antioxidant activities of polyphenol glycosides of CGTase enzyme transglycosylation of Bacillus macerans
1
RINI HANDAYANI1 , MANSJUR HAWAB2, JOKO SULISTYO 1 Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi LIPI, Bogor 16002 2 Universitas Nusa Bangsa, Bogor Diterima: 7 Januari 2002. Disetujui: 30 April 2002
ABSTRACT A strain of indigenous microorganism produced a glucocyl transfer enzyme (cyclodextrin glucanotransferase, CGTase EC. 2.4.1.19) that catalyzes a reversible conversion of polysaccarides and polyphenolic compounds yielding polyphenol glucosides. Polyphenols, such as hydroquinone, pyrocathecol, resorcinol and catechin, are considered to have strong biological activities such as antioxidant. The transfer product (pyrocathecol glycoside) that was synthesized in the present of pyrocathecol-aglycone was determined using TLC. An Inhibitory effects of the pyrocathecol glycoside against bleaching of β-carotene by oxidation of linoleic acid was also examined. We observed that the polyphenol glycoside was suggested to possess antioxidative activity from the point of retaining the bleaching value of β-carotene at concentration 1mM, 2 mM and 4 mM. The result showed that pyrocathecol glycoside (1.40) was found to be even higher than of arbutin as authentic glycoside (0.96) and aglycone (pyrocathecol, 1.16), however, it was lower than of BHT (butylated hydroxy toluene, a commercial antioxidant product, 1.59). This result suggested that polyphenol glycoside possessed considerable antioxidative activity by trapping radicals, and this effect seem to be available for practical use. Key words: Bacillus macerans, cyclodextrin glucanotransferase (CGTase), enzymatic transglycosylation, pyrocathecol glycoside, antioxidant.
PENDAHULUAN Dewasa ini penambahan antioksidan pada berbagai produk kosmetik, farmasi maupun makanan merupakan cara paling efektif untuk mencegah terjadinya oksidasi lemak pada produk tersebut. Akan tetapi, masyarakat semakin khawatir bahwa penggunaan antioksidan akan menimbulkan efek toksik dan karsinogenik terhadap tubuh manusia, sebagaimana ditunjukkan Osawa et al., 1992 pada beberapa hasil penelitiannya. Umumnya antioksidan yang memberi efek negatif tersebut adalah antioksidan sintetik seperti butylated hydroxy anisole (BHA), butylated hydroxy toluene (BHT) dan propyl galate (PG), sehingga usaha untuk menemukan antioksidan alami yang berasal dari tumbuhan dianggap lebih baik daripada antioksidan sintetik khususnya bila ditinjau dari segi kesehatan. Jenis tumbuhan yang banyak dikonsumsi masyarakat sebagai obat tradisional pada umumnya mengandung senyawa flavonoid, antara lain polifenol. Sumber polifenol di alam dapat ditemukan pada tumbuhan dan mikroba, antara lain pada tanaman teh, jahe dan kunyit-kunyitan, sedangkan pada mikroba dapat ditemukan pada beberapa biakan bakteri. Akan tetapi senyawa polifenol bukanlah senyawa yang stabil terhadap
pengaruh oksidasi, cahaya dan perubahan kimia, sehingga apabila teroksidasi strukturnya menjadi berubah dan fungsinya sebagai bahan aktif menjadi berkurang bahkan hilang (Sulistyo et al., 2000). Salah satu usaha yang dapat dilakukan untuk meningkatkan kestabilan senyawa polifenol adalah dengan mengubahnya menjadi bentuk glikosida melalui reaksi transglikosilasi dengan bantuan enzim transferase, maupun sintesis secara kimiawi (Kometami et al., 1990). Akan tetapi sintesis secara kimiawi tidaklah mudah karena akan menghasilkan produk glikosida campuran dengan konfigurasi α- dan β- glikosida (Sulistyo et al., 2000). Penggunaan enzim dalam sintesis glikosida belum dikembangkan secara eksploratif, meskipun menjanjikan beberapa keunggulan dibandingkan metode kimiawi. Antara lain, biaya produksi yang rendah, metodenya mudah dan sederhana, juga enzim maupun mikrobanya dapat digunakan untuk sintesis oligosakarida, siklodekstrin, vitamin dan antibiotik (Nilson, 1988). Tujuan penelitian adalah untuk menguji aktivitas senyawa polifenol glikosida khususnya pirokatekol glikosida hasil reaksi transglikosilasi enzimatik sebagai senyawa antioksidan alternatif.
© 2002 Jurusan Biologi FMIPA UNS Surakarta
HANDAYANI, dkk. – Aktivitas Antioksidasi Bacillus macerans
BAHAN DAN METODE Ekstraksi enzim CGTase Biakan mikroba yang digunakan untuk memproduksi enzim CGTase adalah Bacillus macerans. Biakan hasil isolasi sebelumnya ditumbuhkan pada media nutrient agar (NA) selama 24 jam, kemudian diinokulasikan pada media produksi yang mengandung 2% pati terlarut (Sigma, Co.), 0,5% pepton, 0,1% K2HPO4, 0,05% NaCl, 0,05% MgSO4, 0,01% FeSO4, 0,0001% ZnSO4, 0,0001% MnSO4, dan 0,0001%CuSO4 pada buffer Na-fosfat 0,01 M pH 6,5. Media digoyang selama 5 hari pada suhu ruang, selanjutnya larutan disentrifus pada kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C dan supernatannya digunakan sebagai sumber enzim CGTase (Sulistyo et al., 1999). Uji aktivitas enzimatik CGTase Larutan enzim CGTase sebanyak 0,05 ml dan 0,45 ml larutan buffer Na-fosfat 0,05 M, pH 6,5 yang mengandung 0,5% pati terlarut, diinkubasikan pada suhu 40°C selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 1,0 ml HCI 0,5 N, kemudian ditambahkan 2,5 ml 0,05% larutan KI mengandung 0,005% I2, kemudian campuran dibiarkan bereaksi selama 20 menit. Selanjutnya absorbansi diukur pada panjang gelombang 660 nm dengan spektrofotometer UV/VIS Perkin Elmer Lambda-3b. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim CGTase diuji pada pH 5,5-9,0, sedangkan pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim diuji pada suhu 35-70°C. Satu unit aktivitas enzim dinyatakan sebagai sejumlah enzim yang dapat menurunkan unit absorbansi sebanyak 0,5 pada panjang gelombang 660 nm. Uji aktivitas transglikosilasi Campuran reaksi (2 ml) dalam buffer Na-fosfat 0,01 M pH 6,0 mengandung 5% pati terlarut dan akseptor ( 2,5% hidrokinon, 2,5 % resorsinol, 2,5% pirokatekol dan 0,5% katekin), diinkubasikan pada suhu 40°C, selama 24 jam. Adanya produk reaksi transfer diuji menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Standar otentik yang digunakan terdiri dari maltosa, glukosa, α-dimetil glukosida dan arbutin masing-masing dalam buffer fosfat pH 6,5. Plat KLT dikembangkan dengan larutan n-propanol 85%, kemudian dikeringkan pada suhu 120°C selama 1 jam, kemudian disemprot dengan larutan H2SO4 20% dalam metanol, selanjutnya plat KLT dipanaskan dalam oven pada suhu 150°C selama 5-10 menit. Nilai Rf produk ditentukan berdasarkan perbandingan antara jarak spot produk yang terbentuk dengan jarak pelarut yang digunakan. Untuk meningkatkan rendemen polifenol glikosida sebagai produk transfer, ke dalam campuran reaksi ditambahkan 0,005% α-amiloglukosidase dan diinkubasi pada suhu 40°C selama 30-60 menit. Sintesis polifenol glikosida Campuran reaksi (100 ml) mengandung 5g pati terlarut, 3g pirokatekol, 50 ml larutan enzim dan 50 ml buffer Nafosfat 0,05 M, diinkubasikan pada pH dan suhu optimum selama 24 jam. Produk transfer yang dihasilkan diekstraksi dengan eter sebanyak 100 ml dan lapisan air yang
19
mengandung produk transfer dipekatkan dengan cara evaporasi hingga mencapai 20 ml. Pemurnian produk transfer Kolom kromatografi diisi dengan matriks oktadesil silika (ODS) yang telah direndam dalam metanol (1:5), kemudian disetarakan dengan metanol sebanyak tiga kali bed volume dan selanjutnya dengan asam format 1% dalam akuades sebanyak tiga kali bed volume. Sampel yang telah dipekatkan dimasukkan ke dalam kolom ODS dan disetarakan kembali dengan akuades mengandung asam format 1%, dilanjutkan dengan metanol bertingkat (090%). Fraksi hasil elusi ditampung dan dianalisis menggunakan KLT. Fraksi yang menunjukkan spot tunggal serta memiliki nilai Rf sama dengan standar arbutin dikumpulkan dan di uji aktivitasnya sebagai senyawa antioksidan. Uji aktivitas antioksidasi Aktivitas antioksidasi diuji menggunakan campuran βkaroten dan asam linoleat. Larutan β-karoten disiapkan dengan melarutkan 2,0 mg β-karoten dalam 10 ml kloroform. Dari larutan tersebut dipipet sebanyak 1 ml ke dalam erlenmeyer 100 ml, lalu diuapkan sampai kering pada suhu 40°C. Selanjutnya ditambahkan berturut-turut 0,02 ml asam linoleat, 0,184 ml tween-80 dan 50 ml akuades yang sudah diaerasi, kemudian diaduk sampai terbentuk emulsi. Segera setelah terbentuk emulsi, dipipet masing-masing 5 ml emulsi tersebut ke dalam tiap tabung yang sudah diisi dengan antioksidan pada berbagai konsentrasi. Nilai absorbansi pada 0 menit dan pada setiap selang 30 menit setelah inkubasi pada suhu 50°C dibaca pada λ 470 nm. Nilai aktivitas antioksidasi dinyatakan sebagai nilai faktor protektif (FP) yang dihitung berdasarkan perbandingan nilai absorbansi sampel dengan absorbansi kontrol selama 30 menit inkubasi (Andarwulan et al., 1999). HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil uji aktivitas enzim CGTase Bacillus macerans merupakan bakteri penghasil enzim CGTase yang secara ektraseluler disekresikan ke luar sel dan berfungsi untuk menghidrolisis senyawa yang kompleks menjadi senyawa yang lebih sederhana, sehingga dapat dimanfaatkan oleh mikroorganisme tersebut. Agar enzim yang dihasilkan memiliki aktivitas, baik aktivitas hidrolitik maupun aktivitas transglikosilasi dalam mentransfer gugus glukosil dari donor ke akseptor, sebanyak 2% pati terlarut ditambahkan sebagai substrat yang berfungsi sebagai bahan penginduksi untuk memproduksi enzim CGTase. Kemampuan enzim dalam menghidrolisis pati diuji dengan penambahan KI dalam I2 sehingga terbentuk larutan yang berwarna biru. Intensitas warna biru sebanding dengan konsentrasi pati yang tidak terhidrolisis, sehingga apabila semakin banyak pati yang terhidrolisis maka warna biru akan memudar. Hasil uji pengaruh suhu dan pH terhadap aktivitas enzim menunjukkan bahwa aktivitas
20
BioSMART Vol. 4, No. 2, Oktober 2002, hal. 18-22
cenderung larut dalam air dan sering bergabung dengan gula glukosida, serta 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 memiliki gugus OH dan tidak bersifat 5 15,0 sebagai substrat analog bagi substrat enzim Aktivitas enzim Aktivitas enzim yang dapat menghambat aktivitas enzim 4 CGTase. Beberapa akseptor polifenol yang 10,0 diuji antara lain pirokatekol, katekin, 3 resorsinol dan hidrokinon. Untuk menguji terjadinya reaksi 2 transglikosilasi, campuran reaksi dianalisis 5,0 menggunakan KLT. Sebagai fase diam 1 digunakan silika yang bersifat polar, sedangkan fase geraknya adalah larutan pengembang berupa propanol dan air. 0,0 0 Senyawa nonpolar akan terbawa oleh fase 30 35 40 45 50 55 60 65 70 gerak sehingga nilai Rfnya menjadi besar, Suhu Inkubasi (ºC) sedangkan senyawa yang bersifat polar akan tertahan dengan nilai Rf yang rendah. Senyawa yang banyak memiliki gugus Gambar 1. Pengaruh suhu dan pH terhadap aktivitas enzim CGTase dari B. hidroksil akan bersifat polar, sehingga nilai macerans. Rfnya akan lebih rendah. Nilai Rf produk merupakan perbandingan antara jarak spot produk yang terbentuk dibagi jarak pelarut. Berdasarkan uji KLT, pirokatekol dapat menghasilkan spot produk transfer secara paling nyata sebagaimana ditunjukkan pada AR Gambar 2. Hasil uji menggunakan CGTase dari B. macerans menunjukkan bahwa AR MG selain akseptor pirokatekol, produk transfer yang diperoleh dari akseptor polifenol G-1 MG lainnya, selain dapat menghasilkan G-1 G-2 senyawa polifenol glikosida, juga menghasilkan produk sampingan berupa G-2 polifenol biosida, polifenol triosida, serta glukosa sebagai produk hidrolisis. Untuk meningkatkan rendemen polifenol glikosida sebagai produk transfer dapat dilakukan dengan menambahkan enzim α-amiloglikosidase, sehingga terjadi S Pk Rs Kt Hk S S Pk Rs Kt Hk S pemutusan rantai panjang α-1,4-glukosidik A B yang diikuti dengan pembentukan rantai pendek α-1,4- glukosidik secara lebih Gambar 2. Kromatogram KLT produk reaksi transglikosilasi biakan B. macerans banyak seperti ditunjukkan pada Gambar sebelum penambahan amiloglukosidase (A) dan setelah penambahan 2B. Hal tersebut dapat dilihat dari amiloglukosidase (B). S: standar, G-2: maltosa, G-1: glukosa, MG: metil αbertambah tebalnya spot produk transfer glukosida, AR: arbutin, Pk: pirokatekol, Rs: resorsinol, Kt: katekin, Hk: pada plat KLT, sehingga konsentrasi hidrokinon. produk transfer menjadi semakin tinggi dengan nilai Rf yang terlihat sedikit lebih rendah. optimum CGTase dari B. macerans adalah pada suhu 40°C Tingginya konsentrasi produk transfer akan lebih (2,94 Unit/menit/ml) dan pada pH 6,0 (11,61 Unit/ memudahkan proses pemisahan dan pemurnian menit/ml)(Gambar 1). Enzim CGTase akan bekerja pada menggunakan kolom kromatografi. Hasil pengujian kondisi pH dan suhu optimum, tetapi enzim ini akan transglikosilasi enzimatik dengan CGTase menunjukkan kehilangan aktivitasnya akibat panas. Berdasarkan uji yang bahwa B. macerans memiliki spesifisitas yang tinggi pada dilakukan diketahui bahwa aktivitas enzim akan menurun akseptor pirokatekol. Selain itu, enzim CGTase dari B. dengan meningkatnya suhu. macerans juga memiliki kemampuan reaksi transfer pada kondisi alamiah suhu dan pH inkubasi, sehingga enzim Hasil uji reaksi transglikosilasi CGTase dari B. macerans dapat digunakan untuk Akseptor yang digunakan dalam reaksi transglikosilasi mensintesis polifenol glikosida pada skala yang diperbesar. berasal dari senyawa polifenol karena senyawa ini
Aktivitas Enzimatik (U/ml)
Aktivitas Enzimatik (U/ml)
pH Inkubasi
HANDAYANI, dkk. – Aktivitas Antioksidasi Bacillus macerans
21
Absorbansi (470 nm)
Absorbansi (470 nm)
Sintesis dan pemisahan polifenol glikosida Waktu pemucatan warna kuning dari β-karoten Pemisahan campuran antara produk transfer dan produk menunjukkan tinggi rendahnya aktivitas suatu antioksidan. hidrolitik dapat dilakukan dengan cara ekstraksi sampel Semakin lama waktu yang diperlukan untuk pemucatan dengan dietil eter pada perbandingan 1:1, sehingga residu maka kualitas antioksidan makin baik. Dalam pengujiannya akseptor pirokatekol yang tidak termanfaatkan dapat terpisah. Produk transfer hasil sintesis dapat 0,60 dipisahkan dari komponen lainnya dengan Kontrol Pirokatekol-glikosida melewatkan campuran reaksi Pirokatekol-aglikon Arbutin (glikosida) BHT (komersial) pada kolom kromatografi yang berisi matriks 0,40 ODS. Prinsip pemisahan adalah berdasarkan pada perbedaan polaritas dan kelarutan senyawa yang akan dipisahkan. Matrik ODS bersifat non polar, sehingga memerlukan eluen yang bersifat 0,20 polar. Senyawa yang polaritasnya tinggi (hasil hidrolisis) akan keluar terlebih dulu, sedangkan produk transfer dengan kepolaran yang lebih 0,00 rendah akan keluar kemudian dan residu pirokatekol dengan kepolaran yang paling 0 30 60 90 120 rendah. Waktu Inkubasi (menit) Gambar 3 menunjukkan bahwa spot produk Gambar 4. Pengaruh senyawa polifenol (konsentrasi 1 mM) pada penurunan transfer terkandung pada fraksi no 90-135. Spot kecepatan pemucatan β-karoten oleh asam linoleat. tunggal yang dihasilkan menunjukkan bahwa produk transfer sudah terpisah dengan baik. Produk yang dihasilkan ini selanjutnya dapat diuji aktivitasnya sebagai antioksidan. Nilai Rf 0,80 dari produk transfer sama dengan Rf standar arbutin (0,78), sedangkan nilai Rf standar αdimetil glukosida adalah 0,68, glukosa (0,58) dan 0,60 maltosa (0,47). Konsentrasi produk transfer yang diperoleh (46498,11) ppm, ditentukan dengan 0,40 metode Dubois menggunakan arbutin sebagai standar. Kontrol Pirokatekol-aglikon BHT (komersial)
0,20
Pirokatekol-glikosida Arbutin (glikosida)
0,00 0
30
60
90
120
Waktu Inkubasi (menit)
AR
PT
Gambar 5. Pengaruh senyawa polifenol (konsentrasi 2 mM) pada penurunan kecepatan pemucatan β-karoten oleh asam linoleat.
MG G-1
S
Fraksi No. 90-135
Gambar 3. Hasil pemurnian polifenol glikosida dengan kolom kromatografi ODS.
Absorbansi (470 nm)
1,20
G-2
Kontrol Pirokatekol-aglikon BHT (komersial)
0,80
0,40
0,00 0
Aktivitas antioksidasi Aktivitas antioksidan diuji menggunakan sistem campuran β-karoten dan asam linoleat.
Pirokatekol-glikosida Arbutin (glikosida)
30
60
90
120
Waktu Inkubasi (menit) Gambar 6. Pengaruh senyawa polifenol (konsentrasi 4 mM) pada penurunan kecepatan pemucatan β-karoten oleh asam linoleat.
22
BioSMART Vol. 4, No. 2, Oktober 2002, hal. 18-22
digunakan kontrol sebagai pembanding. Asam linoleat berfungsi sebagai penangkap radikal bebas yang akan menyerang β-karoten sehingga terjadi pemucatan warna. Senyawa penangkap radikal bebas akan melindungi βkaroten dari serangan radikal bebas, sehingga waktu pemucatannya akan lebih lama. Hasil penghitungan faktor protektif (Fp) dinyatakan sebagai aktivitas antioksidan. Nilai Fp diperoleh dari perbandingan nilai absorbansi sampel dibandingkan nilai absorbansi kontrol selama 30 menit waktu inkubasi. Nilai Fp senyawa pada berbagai konsentrasi dilakukan terhadap senyawa pirokatekol glikosida hasil sintesis (PG), pirokatekol (P), arbutin (A) dan butylated hydroxy toluene (BHT) sebagai senyawa antioksidan sintetik. Grafik hasil uji disajikan pada pada Gambar 4, 5 dan 6. Pirokatekol glikosida sebagai senyawa antioksidan alternatif menunjukkan aktivitas antioksidasi yang lebih besar dibanding pirokatekol aglikon maupun dibanding arbutin sebagai produk polifenol glikosida komersial, akan tetapi aktivitasnya lebih rendah dibanding BHT (antioksidasi komersial). Namun demikian sebagai senyawa sintesis enzimatik, pirokatekol glikosida memiliki aspek keamanan lebih baik terhadap kesehatan manusia dan lingkungan. Senyawa BHT sebagai bahan sintetik kimia yang sering digunakan sebagai antioksidan, memiliki nilai faktor korektif paling tinggi dibandingkan pirokatekol-α-glikosida, pirokatekol dan arbutin. Hasil tersebut menunjukkan bahwa BHT merupakan senyawa yang efektif dalam menangkap senyawa radikal bebas penyebab kerusakan pada lemak dan minyak, akan tetapi BHT bersifat sangat toksik dan karsinogenik, sehingga senyawa ini mulai ditinggalkan. Oleh karena itu peluang senyawa polifenol glikosida sebagai senyawa antioksidan alternatif semakin besar, meskipun memerlukan teknik khusus untuk meningkatkan kestabilannya. KESIMPULAN Polifenol glikosida dapat disintesis secara enzimatik dengan menggunakan enzim CGTase dari biakan B. macerans yang memiliki spesifitas pada akseptor polifenol khususnya pirokatekol. Pirokatekol glikosida sebagai produk transfer hasil sintesis menunjukkan aktivitasnya sebagai senyawa antioksidan.
DAFTAR PUSTAKA Andarwulan, N., D. Fardiaz, G.A. Wattimena, and K. Shetty. 1999. Antioxidant activity associated with lipid and phenolic mobilization during seed germination of Pangium edule Reinw. Journal of Agricultural and Food Chemistry 47 (8): 3158-3163. Cowan and Steels. 1981. Manual for the Identification of Bacteria. Second edition revised by S.T Cowan. Cambridge: University Press. Dinoto, A., J. Sulistyo, Y.S. Soeka, dan R. Handayani. 2000. Glikosida polifenol teh dan peluang pemanfaatannya sebagai senyawa bioaktif kosmetika. Prosiding Seminar Sehari Teh untuk Kesehatan. Gambung: Pusat Penelitian Teh dan Kina. Girindra, A. 1993. Biokimia 1. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama. Haraguchi, H., H. Ishikawa, K. Mizutani, Y. Tamura, and T. Kinoshita. 1998. Antioxidative and superoxide scavenging activities of retrachalcones in Glycyrrhiza inflata. Bioorganic and Medicinal Chemistry 6: 339-374. Jimenez, M. and F. Garcia-Carmona. 1999. Myciretin, an antioxidant flavonol, is a substrate of polyphenol oxidase. Journal of Science Food Agriculture 79: 1993-2000. Kometami, T., Y. Terada, T. Nishimura, T. Nakae, H. Takii,, and S. Okada. 1990. Transglycosylation to hesperidin by cyclodextrin glukanotransferase from an alkalophilic Bacillus species in alkaline pH and properties of hesperidin glycosides. Bioscience Biotechnology Biochemistry 58(11): 1990-1994. Kometami, T., Y. Terada, T. Nishimura, T. Nakae, H. Takii, and S. Okada. 1996. Acceptor specificity of cyclodextrin glucanotransferase from an alkalophilic Bacillus species and synthesis of glikosyl rhamnose. Bioscience Biotechnology Biochemistry 60(7): 1176-1178. Lehninger, A.L. 1993. Dasar-Dasar Biokimia. Terjemahan M. Thenawidjaja. Jakarta: Erlangga. Mori, S., S. Hirose, T. Oya, and S. Kitahata. 1994. Purification and properties of cyclodextrin glucanotransferase from Brevibacterium sp. No. 9605. Bioscience Biotechnology Biochemistry 58 (11): 19681972. Nakatani, N. 1992. Phenolic compounds in food and their effects on human health II, antioxidants and cancer Prevention. In M.T. Huang, C. T. Ho, and C. Y. Lee (eds.). Natural Antioxidants from Species. Washington: American Chemical Society. Nilson, K.G.I. 1988. Enzymatic synthesis of oligosaccharides. Trends in Biotechnology 6: 1118-1120. Osawa, T., H. Katsuzaki. H. Harigawa, and T. Shibamoto. 1992. A novel antioxidant isolated from young green barley leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry 40: 1135. Ranney, M. W. 1979. Antioxidant Recent Development. Noyes Data Co., USA Sulistyo, J., Y.S. Soeka dan A.K. Karim. 1998. Sintesis polifenol αglikosida oleh CGTase secara transglikosilasi. Jurnal Biologi Indonesia 2 (3): 150-161. Sulistyo, J. dan Y.S. Soeka. 1999. Bioproses Enzimatik dan Uji Hayati Polifenol Glikosida sebagai Senyawa Antimikroba dan Antimelanogenesis. Prosiding Seminar Nasional Kimia Bahan Alam. Jakarta: Universitas Indonesia-UNESCO. Surahadikusumah, E. 1989. Kimia Tumbuhan. Bogor: PAU-IPB. Winarno, F. G. 1989. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia.
HANDAYANI, dkk. – Aktivitas Antioksidasi Bacillus macerans
19
20
BioSMART Vol. 4, No. 2, Oktober 2002, hal. 18-22
HANDAYANI, dkk. – Aktivitas Antioksidasi Bacillus macerans
21
22
BioSMART Vol. 4, No. 2, Oktober 2002, hal. 18-22
