Agronomická fakulta. Ústav výživy zvířat a pícninářství

Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav výživy zvířat a pícninářství

STUDIUM ÚČINKŮ MYKOTOXINŮ NA ZDRAVÍ A UŽITKOVOST PRASAT

BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

Brno 2009

Vedoucí bakalářské práce:

Vypracoval:

prof. MVDr. Ing. Petr Doležal, CSc.

Martin Přibilík

1

2

3

Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma “Studium účinků mykotoxinů na zdraví a užitkovost prasat“ vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu použité literatury. Souhlasím, aby byla práce uložena v knihovně Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům.

V Brně, dne ………………………………..

Podpis diplomanta …………………………

4

Poděkování: Rád bych poděkoval vedoucímu mé bakalářské práce prof. MVDr. Ing. Petru Doležalovi, CSc. za pomoc při zpracování této bakalářské práce. Zároveň děkuji firmám Alltech, Mikrop, Delacon za poskytnuté materiály k vypracování bakalářské práce.

5

Anotace: Tato Bakalářská práce se zabývá tématem: „Studium účinků mykotoxinů na zdraví a užitkovost prasat“. Úvodní část se zabývá faktory, které podmiňující růst a množení patogenních hub a podmínky tvorby mykotoxinů. Popisuje jejich působení v krmivech a vliv na jednotlivé orgány prasat. Hodnotí se zde vliv věku, pohlaví a plemene zvířat na rozsah zdravotní zátěže způsobované plísněmi a jejich sekundárními metabolity. Jsou zde rozebrány vlivy významných mykotoxinů na imunitní systém prasat a celkové zdraví zvířat. Uvádí popis současného řešení těchto problémů - možnosti použití sorbetů k vyvazování mykotoxinů z krmných diet prasat. Závěr přináší širší přehled účinků mykotoxinů na další hospodářská zvířata a popis citlivosti různých druhů zvířat na tuto zátěž.

Klíčová slova: mykotoxiny, prasata, prevence.

Annotation: This dissertation intents on the topic: „Study of mycotoxins influence on health and utility of pigs“. An introductory part concerns with factors conditioning the growth and multiplication of pathogenic fungus and conditions of mycotoxins production. It describes their effect on feeding and particular pigs’ organs. Influence of age, gender and animals’ kinds on range of health burden caused by fungus and their secondary metabolites is evaluated in the dissertation. Also influence of significant fungus on immune system of pigs and overall animals’ health is analyzed here. It mentions characterization of contemporary solution of these problems – possibility to use sorbets to cast off mycotoxins from feeding diets of pigs. Wider summary of mycotoxins influences on next livestock and description of various animals sensitivity on this burden take up conclusion of this dissertation.

Key words: mycotoxins, pigs, precaution.

6

OBSAH 1. ÚVOD

11

2. LITERÁRNÍ PŘEHLED

13

2.1. Faktory podmiňující růst a množení patogenních hub

13

2.2. Podmínky tvorby a charakteristiky mykotoxinů

14

2.3. Toxiny plísně Aspergillus

17

2.3.1. Aflatoxiny

18

2.3.2 Cyklopiazonová kyselina

19

2.3.3 Patulin

19

2.3.4 Gliotoxin

19

2.4. Toxiny plísně Penicillium

20

2.4.1 Ochratoxin

20

2.4.2. Citrinin

21

2.4.3. Roquefortin C

21

2.5. Toxiny plísně Fusarium

22

2.5.1. Trichotheceny

22

2.5.2. Fumonisiny

23

2.5.3. Zearalenon

24

2.6. Působení mykotoxinů na parenchymatózní orgány prasat

24

2.6.1. Aflatoxiny

24

2.6.2. Citrin

25

2.6.3. Fumonisiny

25

2.6.4. Ochratoxin

25

2.6.5. Deoxynivalenol

25

2.6.6. T-2 toxin (T2)

26

2.6.7. Zearalenon

26

2.6.8. Nivalenol

27

2.6.9. Strachybotryotoxin

27

2.6.10. Diacetoxyscirpenol (DAS)

27

2.7. Vliv mykotoxinu na zdravotní stav zvířat

28

2.8. Účinky mykotoxinů na imunitní systém prasat

29

2.8.1. Komplexita imunitní odezvy

29

2.8.2. Mykotoxiny a zánět

30

7

2.8.3. Mykotoxiny a humorální imunitní odezva

30

2.8.4. Mykotoxiny a buněčná imunitní odezva

31

2.9. Význam pro zdraví prasat

32

2.9.1. Účinek vakcinace

33

2.10. Ztráty v průběhu skladování obilí

34

2.11. Vliv skladovacích podmínek na poškození obilí houbami

35

2.12. Dýchací proces ve skladovaném obilí

36

2.13. Prevence růstu plísní

37

2.13.1. Opatření před sklizní

37

2.13.2 Opatření po sklizni

38

2.14. Dekontaminace mykotoxinů v krmivech 3. VLASTNÍ PRÁCE

39 43

3.1. Cíl práce

43

3.2. Materiál a metodika (nástin)

43

4. ZÁVĚR

44

5. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

45

6. PŘÍLOHY

58

8

Přehled tabulek Tabulka č. 1: Nejčastěji se vyskytující mykotoxiny v krmivech Tabulka č. 2: Citlivost některých druhů zvířat na mykotoxiny Tabulka č. 3: Toxické koncentrace některých mykotoxinů v krmivech Tabulka č. 4. Účinky aflatoxinu B1 na prasata Tabulka č. 5. Třídění a obecná charakteristika mykotoxikóz u hospodářských zvířat

9

Přehled Obrázků Obrázek č.1. Rektální vyhřeznutí příznačné pro toxicitu vyvolanou zearalenonem Obrázek č. 2. Výsledek nesprávného skladovaní pšenice Obrázek č. 3. Kukuřice napadená mykotoxiny Obrázek č. 4. Burské ořechy postiženy aflatoxinem Obrázek č. 5. Postižena prasata zearalenonem - anestrie, aborty, neonatální mortalita, zduření vulvy, vaginy a mléčné žlázy, výhřez rekta

10

1. ÚVOD Prase domácí (sus scrofa f. domestica) je domestikovaný druh vzniklý asi před 5000 lety př. n. l. z prasete divokého (sus scrofa), respektive z jeho poddruhů prasete divokého evropského (sus scrofa scrofa) a prasete páskovaného (sus scrofa vittatus). V současnosti se na světě chová asi 200 druhů prasete domácího, které se dělí podle původu (evropská, asijská a smíšená), tvaru uší (klapouchá, přímouchá), stupně prošlechtění (původní, primitivní, zušlechtěná a ušlechtilá) a užitkovosti (masná, kombinovaná). V České republice se chová zejména bílé ušlechtilé prase – Landrase a přeštická černostrakatá – Duroc a Hampshire. Chov prasat za posledních 50 let zaznamenal nebývalý vzestup. Příčinou je zvyšující se počet konzumentů masa a rychlá možnost uspokojit poptávku výrobou vepřového masa. V České republice je vepřové maso velmi oblíbené a spotřeba se pohybuje okolo 40 kg na osobu a rok. Vepřové maso zaujímá 1. místo v pořadí výroby a spotřeby masa a téměř polovina všech vypěstovaných zrnin je spotřebována na jeho produkci. Prasata jsou svým typem potravy a nároky na kvalitu krmiv přímým konkurentem člověka. Hlavní krmiva (obiloviny a sója) a živiny (proteiny, tuky a oleje) používaná pro krmení prasat, mohou s malými úpravami sloužit jako přímé zdroje i v potravě člověka. Z pohledu ochrany zdraví spotřebitele se v současnosti stává prioritou zajištění zdravotní nezávadnosti potravin. Bezpečnost potravního řetězce je ovlivňována řadou faktorů. Velká produkce masa a existence velkých chovů s sebou přináší zvýšené nároky na dodávky velkého množství krmiv a z toho plynoucí také rizika snížené kvality. Významně se proto v této oblasti uplatňuje biotechnologie výroby zemědělských produktů, zvláště pak v oblasti výroby krmiv s důrazem na jejich zdravotní a hygienická nezávadnost. Závažné riziko pro kvalitu krmiv, užitkovost zvířat a jejich zdraví, ale i pro bezpečnost potravin a zdraví lidí, představují plísně a mykotoxiny. Světová organizace „Food and Agriculture Organisation“ odhaduje, že 25 % světových zásob zrnin je ročně kontaminováno známými mykotoxiny a dá se předpokládat, že ještě větší množství může být znehodnoceno mykotoxiny dosud neidentifikovanými. Z těchto důvodů se klade stále větší důraz na potřebu studia těchto toxinů (jejich výskytu, stanovení podstaty toxicity, rozsahu zbytkových množství toxických látek v potravinách a stanovení jejich toxického potenciálu). Hlavním cílem je minimalizovat či eliminovat

11

rizika, která vyplývají pro člověka a zvířata z konzumace takto znehodnocených potravin a krmiv. Je nutné zdůraznit, že problematiku mykotoxinů je nutné řešit už na úrovni vlastních zemědělských produktů.

12

2. LITERÁRNÍ PŘEHLED

2.1. Faktory podmiňující růst a množení patogenních hub Plísně (mikroskopické vláknité houby, mikromycety) jsou jednobuněčné nebo mnohobuněčné organismy, které vytvářejí vláknité povlaky na povrchu různých substrátů nebo jimi prorůstají. Rozmnožují se rozrůstáním hyf (vláken) nebo sporami, které se v prostředí šíří větrem a hmyzem a mohou napadat rostliny během jejich růstu (Šilhánková, 1995). Plísně (houby) jsou pravidelnou součástí půdní biocenózy a plní nezbytnou úlohu v recyklaci živin z rozkládajícího se biologického materiálu. Nepříznivé počasí a nevhodné podmínky ošetřování umožní životaschopným sporám plísní klíčení, růst a pomnožení v krmivech přímo na poli (Suchý a Herzig, 2001). Plísně kontaminují zrniny a krmné plodiny v průběhu celého výrobního procesu, tj. pěstování, sklizně, transportu a zejména pak při skladování a konzervaci. Lze rozlišit dvě skupiny plísní: 1. Plísně polní jsou ty, které jsou přítomny v zrnu již před sklizní obilovin a vyžadují podmínky s vysokou vlhkostí (20 - 21 %). Patří sem rod Fusarium, Alternaria, Cladosporidium, Diplodia, Giberella a další. 2. Plísně skladištní jsou ty, které mohou produkovat

mykotoxiny v podmínkách

skladování. Vyžadují nižší vlkost než polní plísně (13 - 18 %) a obvykle nepředstavují žádné vážnější problémy před sklizní. Patří sem např. rod Aspergillus nebo Penicillium. Větrem roznášené spory mohou infikovat rostliny během jejich růstu, např. plísně rodu Fusarium napadají zárodečné tkáně semen rostlin. Poškození perikarpu, povrchové vrstvy obalu semen, např. kukuřice a dalších krmiv, způsobené hmyzem, stresem, příp. dalšími faktory (teplota, vlhkost, vegetační stadium a další) mohou usnadnit napadení plísněmi a tvorbu mykotoxinů. Jakmile se vytvoří vhodné podmínky pro klíčení jejich spor, dochází k růstu a množení plísně. Po počáteční infekci plísní omezuje tvorbu mykotoxinů nízký obsah vody a sacharidů v rostlině (Suchý a Herzig, 2001).

Kontaminace krmiv plísněmi je v některých geografických oblastech velmi vysoká: • u objemných krmiv i přes 90 % • u jadrných krmiv určených pro výživu telat a prasat do 90 % • u jadrných krmiv pro drůbež až 100 %.

13

Plísně rostou na značném množství zemědělských komodit, zahrnující obiloviny, luskoviny, olejniny, ovoce, zeleninu a řadu dalších plodin (Suchý a Herzig, 2001).

2.2. Podmínky a tvorby a charakteristiky mykotoxinů Pojem mykotoxiny představují vysoce stabilní toxické nízkomolekulární látky vytvářené několika druhy hub, které snadno osidlují úrodu na poli nebo po sklizni a tak představují potenciální hrozbu pro zdraví člověka i zvířat po pozření potravinových výrobků připravených z těchto komodit. Producenti mykotoxinů jsou živé rostoucí houby v krmivech. Jsou to vláknité sporulující

houby

produkující

sekundární

metabolity

–

mykotoxiny.

Část

vyprodukovaného mykotoxinu zůstává v mycéliu, větší část penetruje do substrátu. V substrátu mohou mykotoxiny dlouho perzistovat, i když houby zde již nejsou zachyceny (Suchý a Herzig, 2001). Mykotoxiny jsou důležitým důsledkem nárůstu hub. Houby ve skutečnosti produkují mykotoxiny v zátěžových podmínkách, jako jsou změny teploty, vlhkosti nebo přítomnosti vzduchu a samozřejmě za přítomnosti agresivních činidel. Tyto druhotné metabolity hub jsou klasifikovány v závislosti na počátečních bodech své produkce jako polypeptidy, terpeny, látky derivované z kyseliny šikimové a metabolity odvozené z aminokyselin. Jejich strukturální rozdílnost je odvozená z několika reakcí, včetně kondenzace, oxidace, redukce, alkylace a halogenace a několikanásobného větvení drah (Steyn, 1998). V současné době je známo přes 400 mykotoxinů, které jsou produkovány 200 – 300 druhy plísní (Müller a kol., 2000). U zvířat i lidí mohou mykotoxiny vést k poškození jater a ledvin (Suchý a Herzig, 2001). Kromě toho se některé mykotoxiny chovají jako neurotoxiny, zatímco jiné působí tak, že ruší syntézu buněčných proteinů a mají za následek zvýšenou citlivost kůže a extrémní imunodeficienci (nedostatečnou imunitu). Mezi nejvýznamnější patogenní plísně, produkující toxiny patří rody Aspergillus, Penicillium, Fusarium (Sweeny a Dobson, 1998). Mezi důležité mykotoxiny produkované druhy Aspergillus patří aflatoxin B1, B2, G1 a G2, ochratoxin A, sterigmatocystin a kyselina cyklopiazonová. Aflatoxiny jsou produkovány hlavně plísněmi A. flavus, A. parasiticus a A. nominus a jsou považovány za možné jaterní karcinogeny u různých druhů i u lidí. Zvířata nebo

14

ženy v období kojení, které konzumují potravu či stravu kontaminovanou aflatoxiny B1, B2, G1 a G2, mohou vylučovat v mléce aflatoxiny M1. Aflatoxiny jsou produkovány při teplotách pohybujících se od 12 do 40 °C (Koehler a kol., 1985) a pH od 3,5 do 8,0 (ICMSF, 1996) a vodní aktivitě (aw) okolo 0,99. Podle Gqaleniho a kol. (1997) může A. flavus také produkovat společně aflatoxin a kyselinu cyklopiazonovou při aw 0,996. Kromě toho ovlivňují produkci aflatoxinů i nutriční faktory, např. zdroje sacharidů a tuků, ale mechanismy, jimiž tyto faktory ovlivňují biosyntézu aflatoxinů, jsou zatím nejasné (Luchese a Harrigan, 1993). Kyselina cyklopiazonová je produkována hlavně plísní A. flavus a některými druhy Penicillium a způsobuje nekrózu gastrointestinálního traktu. Ochratoxin A je silným nefrotoxinem, teratogenem a karcinogenem. Je produkován plísní A. ochraceus a některými druhy Penicillium. Druhy Aspergillus mohou produkovat ochratoxiny při 12 - 37 °C a minimální pH 2,2 (Wheler a kol., 1991). Podle Adebaja a kol. (1994) může Aspergillus produkovat ochratoxin při vodní aktivitě nízké až 0,80. Ochratoxin může být také produkován druhem Penicillium při 4 °C a vodní aktivitě nízké až 0,86 (Sweeney a Dobson, 1998). Další toxin plísně Aspergillus je sterigmatocystin, který je prekursorem aflatoxinu a je produkován především plísní A. versicolor. Tento druh houby je méně tolerantní k nízkému pH a roste při vodní aktivitě 0,76 (ICMSF, 1996). Podle Pitta a Leistnera (1991) mohou druhy Penicillium produkovat 27 různých mykotoxinů, z nichž jsou nejdůležitější tři: • ochratoxin • patulin • citrinin. Ochratoxin může být produkován P. verrucosum v mírném podnebí, zatímco druhy Aspergillus jsou spojeny s produkcí ochratoxinu v teplejší podnebí. Patulin má nepříznivé neurologické a gastrointestinální účinky a je produkován ovocným patogenem, P. expansum, které může růst při teplotách od -2 do +35 °C. Produkce patulinu vyžaduje minimální vodní aktivitu 0,95 (Damoglou a Campbell, 1986). Citrinin je nefrotoxin a je vytvářen hlavně P. citrinum, P. expansum a P. verrucosum. Citrinin je produkován při teplotách pohybujících se od 15 do 37 °C, ale optimální teplota je 30 °C (Pitt, 1997).

15

Zatímco Aspergillus a Penicillium jsou velmi důležitými producenty mykotoxinů, na celosvětovém základě jsou ekonomicky nejvýznamnější houby Fusarium. Tyto houby převládají na úrodě před sklizní a mohou produkovat řadu různých mykotoxinů, z nichž nejdůležitější jsou trichotheceny, fumonisiny, zearalenon, moniliformin a kyselina fusariová (D'Mello a Macdonald, 1997). Populace fusarií v zemědělství může být velmi vysoká a zahrnuje saprofyty, které rozrušují zbytky rostlin v půdě, i patogeny, které způsobují hnilobu, vadnutí a jiná onemocnění rostlin (CAST, 2003). Mykotoxiny fusarií bývají tradičně spojovány s obilninami zemí s mírným klimatem, protože tyto houby vyžadují poněkud nižší teploty pro růst i produkci mykotoxinu než je tomu u aflatogenních druhů Aspergillus (D'Mello a Macdonald, 1997). Druhy Fusarium mohou přežívat ve zbytcích kukuřice, které jsou pravděpodobně nejdůležitější zdrojem inokula pro infikování zrna. Tyto houby mohou být spojeny s každou částí kukuřice (rostliny); a je běžný 50 – 100 % výskyt infekce zrn, z nichž většina není viditelně poškozená (CAST, 2003). Tato skutečnost může vysvětlovat přítomnost mykotoxinů v normálních zrnech. Kromě toho se spory vytvořené před sklizní dostanou do skladovacích prostorů s kukuřicí a začnou se množit. Přesto ukázaly analýzy zrna se slupkou vyšší hladiny fumonisinů u viditelně plesnivé kukuřice než u kukuřice dobré kvality (Shephard a kol., 1996). Zdá se, že fumonisiny převládají v obilovinách pěstovaných v subtropických a tropických oblastech vzhledem k dlouhé a teplé růstové sezóně (Henry a Wyatt, 1993). Podle Placinta a kol. (1999) mohou být fumonisiny produkovány plísní F. moniliforme současně s moniliforme a fusarinem C. Optimální růstová teplota a pH pro produkci fumonisinů plísní F. moniliforme na kukuřičné kultuře nastala do 7 týdnů při 25 °C a pH v rozmezí od 3 do 9,5 (Jay, 2000). Fumonisiny vznikají kondenzací aminokyseliny alaninu s meziproduktem derivovaným z acetátu (CAST, 2003). Trichotheceny zahrnují více než 100 různých chemických struktur, které jsou rozděleny na typy A a B. Mezi trichotheceny typu A patří toxin T-2, toxin HT-2, neosolaniol a diacetoxyscripenol (DAS), zatímco trichotheceny typu B zahrnují deoxynivalenol (DON), nivalenol a fusarenon-X. Syntéza těchto dvou typů trichothecenů se zdá být charakteristická pro určité druhy

Fusarium.

Například

produkce

trichothecenů

typu

A

převažuje

u F. sporotrichioides a možná u F. poae, zatímco syntéza trichothecenů typu B nastává především u F. culmorum a F. graminearum (D'Mello a Macdonald, 1997). Obecně

16

začíná biosyntéza trichothecenů tvorbou seskviterpenu trichodienu, který je pak okysličen, esterifikován a cyklizován za tvorby velké skupiny seskviterpenových epoxidů (CAST, 2003). Zearalenon je produkován řadou druhů Fusarium a struktura tohoto toxinu naznačuje biosyntézu cestou acetát polynalonátu, která vede ke kondenzaci acetátových jednotek do polyketidu, který vyžaduje relativně malou změnu, aby dokončil přeměnu na zearalenon (Shier, 1998). Maximální produkce tohoto toxinu in vitro nastala po 40 dnech inkubace izolátu F. graminearum, při aw 0,97, a teplotě 28 °C po dobu dvou týdnů, následované inkubací při 12 °C (Jímenez a kol. 1996). Kyselina fusariová je pravděpodobně nejrozšířenějším mykotoxinem produkovaným kmeny rodu Fusarium a podle Bacona a kol. (1996) může sloužit jako indikátor kontaminace plísní Fusarium v potravinách i obilí. Kromě toho kyselina fusariová působí synergisticky s jinými fusariotoxiny. Je také důležité poznamenat, že byla identifikována genetika biosyntézy mykotoxinů. V současnosti jsou popisovány mnohé geny související s produkcí mykotoxinů, včetně aflatoxinu (Mahanti a kol., 1996), fumonisinu (Desjardins a kol., 1996) a trichothecenů (McCormick a kol., 1996). Tyto objevy budou velice důležité pro lepší pochopení biosyntetických cest mykotoxinů a při hledání způsobů kontroly nad produkcí mykotoxinů.

2.3. Toxiny plísně Aspergillus Plísně Aspergillus mohou napadat celou řadu krmivářských a potravinářských komodit, včetně kukuřice, obilovin, sojových bobů, ořechů a olejnatých semen. Určité kmeny Aspergillus, např. A. oryzea, se v Asii už po staletí používají při fermentaci a konzervaci potravin (např. sojových produktů). Normálně se plísně Aspergillus nacházejí v tropických a subtropických oblastech, protože optimální růst plísně a produkce příslušného toxinu vyžaduje průměrné teploty nad 24 °C. Nejvýznamnější

toxiny

produkované

a A. Parasiticus) jsou aflatoxiny.

17

plísní

Aspergillus

(A.

FLavus

2.3.1. Aflatoxiny Aflatoxiny jsou mykotoxiny odvozené od difuranokumarinového skeletu, jsou produkované toxigenními kmeny Aspergillus flavus (asi 35 % kmenů produkuje aflatoxiny řady B), A. parasiticus (téměř 100 % kmenů je schopno produkovat aflatoxiny řady B1, B2 a G1, G2, které jsou pojmenovány a identifikovány podle své fluorescence (modrá nebo zelená) v přítomnosti ultrafialového světla. Aflatoxin B1, nejtoxičtější aflatoxin, byl identifikován jako příčinný činitel mykotoxikózy "turkey-X" (Blount, 1961). Aflatoxin B1 realizuje svou toxicitu po metabolické aktivaci tkáňových oxygenáz, především enzymů CYP450, jejichž exprese probíhá především v játrech a v plicích. Tato biotransformace vede k tvorbě reaktivních epoxidů, jejichž exo-epoxidy se pohotově vážou na makromolekuly, jako jsou proteiny a DNA, čímž způsobují (jaterní) buněčnou toxicitu a poškození DNA. Reaktivní epoxidy mohou být dále metabolizovány glutathion S-transferázami, což vede k deaktivaci a exkreci (Gorelick, 1990, Masey a kol., 1995). Specifická schopnost druhu a orgánu metabolizovat, aktivovat a deaktivovat Aflatoxin B1, vysvětluje povahu symptomu specifickou pro orgán (např. hepatotoxicita) a rozdíly mezi druhy v citlivosti na vystavení činnosti aflatoxinů. Klinické symptomy akutní intoxikace zahrnují hepatocelulární nekrózu a lipidózu okolo centrálních žil, hyperplazii žlučovodu, ikterus (žloutenku), hemorrhagické onemocnění (koagulopatii), úbytek hmotnosti a anorexii (Miller a Wilson, 1994). U monogastrických zvířat jsou tyto symptomy pozorovány hlavně po pozření krmiva obsahujícího hladiny přes 1000 mg/kg, ale mezi druhy byly pozorovány značné rozdíly v toleranci Aflatoxinem B1 v závislosti na věku, pohlaví a stavu zvířete. Trvalé vystavení mírným koncentracím Aflatoxinem B1 vede ke zvýšení jaterních enzymů, poškození jaterní funkce včetně ikteru a hypoproteinázy a následují obecné symptomy, např. zhoršený růst, omezená konverze krmiva a hrubá srst nebo narušené opeření. Nespecifické znaky působení aflatoxinů zahrnují imunosupresi vedoucí ke zvýšené náchylnosti k infekčním nemocem, jako je salmonelóza, kandidóza, kokcidióza a jaterní motolice (Bondy a Pestka, 2000).

18

2.3.2. Cyklopiazonová kyselina Aflatoxigenní houby často produkují odlišnou biosyntetickou cestou kyselinu cyklopiazonovou (CPA) a společný výskyt aflatoxinu a CPA se může lišit, od 51 % ve vzorcích kukuřice po 90 % ve vzorcích burských oříšků, ve kterých byla CPA nalezena v množství až 10 mg/kg (Gqualeni a kol., 1996; Martins a Martins, 1999). CPA je kyselina indol tetramová, která byla původně klasifikována jako neurotoxin (Steyn a Vleggaar, 1985). Studium způsobu činnosti CPA ukazuje na inhibiční účinek na kalcium ATP-ázu (adenosin trifosfázu) v sarkoplazmatickém retikulu svalových buněk, což by vysvětlovalo klinické symptomy, jako je slabost, ztráta koordinace a letargie. CPA může vytvářet rezidua v poživatelných tkáních zvířat, avšak naměřené koncentrace se zdají příliš nízké na to, aby představovaly výrazné riziko pro spotřebitele. Avšak v zátěžových podmínkách bývá CPA spojována s narušenou kvalitou vepřového masa (Byrem a kol., 1999a; Byrem a kol., 1999b).

2.3.3. Patulin Další typické toxiny plísně Aspergillus jsou patulin, produkovaný plísní Aspergillus calvatus (ale také druhy Penicillium) a gliotoxin vytvářený plísní Apergillus fumigatus. Intoxikace patulinem byla hlášena jako následek krmení dobytka sladovými produkty z pivovarů (Lopez Diaz a Flannigan 1997). Klinické příznaky zahrnují ztrátu koordinace, paralýzu a degeneraci neuronů mozkové kůry a dokonce smrt. Předmětem stanovení zůstává, zda jsou tyto symptomy přisuzovány pouze patulinu. Patulin je často nalézán jako kontaminant v jablečných džusech a rajčatových výrobcích určených pro konzumaci člověkem (Beretta a kol., 2000).

2.3.4. Gliotoxin Bylo zjištěno, že Gliotoxin, derivát piperizinu, je v systémech in vitro silným imunosupresivním činidlem a v klinické toxikologii je mu věnována zvýšená pozornost (Belkacemi a kol., 1999). Je známo, že Aspergillus fumigatus, pocházející z okolního prostředí, napadá zvířecí (i lidské) tkáně, např. plíce a gastrointestinální či močový trakt. Po invazi může dojít k produkci toxinů přímo v místě infekce (známé jako endomykotoxikóza), což pak vede k vysoké koncentraci toxinů v tkáních (Richard a kol.,

19

1996), následované dýchacími potížemi drůbeže a pozdním potratům u dobytka (Jensen a kol., 1991).

2.4. Toxiny plísně Penicillium Penicilia jsou typické skladovací plísně napadající krmivářské komodity ve stadiu po sklizni. Výjimku z tohoto pravidla tvoří kmeny penicilií produkující ochratoxin A, které se nacházejí na ovsu a ječmeni před sklizní. Druhy penicilií mají společnou preferenci komodit bohatých na proteiny a substráty s nízkým pH. Tato vlastnost je lidmi široce využívána při fermentaci mléčných výrobků ve výrobě sýrů s modrou plísní a měkkých sýrů (Penicilium camemberti, Penicillium roqueforti). Toxiny penicilií, včetně CPA, verruculogenu, roquefortinů a penitemů pocházejí přímo z metabolismu houbových aminokyselin (Steyn a Vleggaar, 1985). Mohou obsahovat postranní řetězce funkčních aminokyselin; např. u ochratoxinu A je postranní řetězec fenylalaninu připojen na molekulu isokumarinu. Biosyntetický původ toxinu penicilin může vysvětlovat řadu jejich typických rysů: lehkost, s jakou se vážou na proteiny, afinitu k buněčným enzymům a jejich antibakteriální činnost (penicilin váže protein v bakterii) i jejich dlouhý biologický poločas rozkladu způsobený vazbou na tkáňové a sérové proteiny savčích druhů.

2.4.1. Ochratoxin Nejdůležitější toxin penicilií, který se nachází v krmivářských komoditách, je ochratoxin A, představující nejběžnějšího toxického reprezentanta z řady toxinů s podobnou strukturou. Touto skupinou jsou sekundární metabolity různých druhů penicilií, včetně P. aurantiogriseum, P. freii, P. tricolor P. verrucosum, P. viridicatum, a P. polonicum. Jejich výskyt v krmivářských komoditách, obzvlášť obilninách (Mills a kol., 1995). Ochratoxin A má afinitu na ledviny (nefrotoxikóza) tím, že vyvolává tabulární poškození a fibrózu, následované narušením funkce ledvin. Tyto symptomy byly popsány u prasat (prasečí nefropatie) a ledviny jsou hlavním cílovým orgánem toxického působení také u jiných monogastrických druhů. Patologické změny ledvin se vyvíjejí po dlouhotrvajícím (více než několikatýdenním) vystavení koncentracím v krmivu přesahujícím 200 mg/kg (Krogh, 1978).

20

Klinické symptomy mohou být mírné, např. polyurie, polydipsie (patologická žíznivost), zhoršený růst a konverze krmiva a často zůstává nedetekována až do porážky, kdy je působení mykotoxinů prozrazeno bledými a ztvrdlými ledvinami. Mezi jiné účinky, způsobené ochratoxinem A, patří narušená koagulace, leukopenie, imunosuprese, teratogenita a indukce tumorů v močovém traktu (Marquart a Frohlich, 1992; IPCS, 2001). K výskytu ochratoxikózy v terénu dochází u prasat a drůbeže, protože přežvýkavci dokážou tento toxin rozkládat.

2.4.2. Citrinin Druhý nefrotoxin, často produkovaný stejnými druhy penicilií, je citrinin, který je strukturou podobný ochratoxinu A, ale chybí mu postranní aminokyselinový řetězec. Citrinin není tak dobře prozkoumán, ale v průběhu zkoušení s krmením drůbeže se zjistilo, že podporuje ochratoxin A při indukci poškození ledvin (Braunberg a kol., 1994).

2.4.3. Roquefortin C Dalším důležitým toxinem penicilií je P. roquefortin (Boysen a kol., 2000), Toxin P. roquefortin a kyselina penicilanová se nacházejí především v silážových produktech, protože se P. roqueforti dokáže přizpůsobit podmínkám s nízkým pH (Müller a Amend, 1997). Mohou však vyvolat nepříznivé účinky kvůli své známé antimikrobiální činnosti, vedoucí k dysbakterióze. Obzvlášť citlivá je mikro flóra bachoru a narušená syntéza mastných kyselin, která může vést ke ketóze, resp. zvyšuje riziko vzniku subklinických mastitid u dojnic (Hochsteiner a kol., 2000). Kromě toho antibiotická činnost toxinů P. roquefortin ovlivňuje mikro flóru bachoru, což vede k ruminální dysbakterióze, která se projevuje u postiženého dobytka, hlavně dojnic, jako syndrom "vyčerpání". Narušená funkce bachoru je doprovázena sníženou schopností degradovat ostatní mykotoxiny. Některé toxiny P. roquefortin byly klasifikovány jako tremorgenní mykotoxiny, doprovázející celou řadu mykotoxinů sdílejících část indolu, např. penitremy, skupina verruculoge-fumitremorgenů a aflatremy (Steyn, 1985). Experimentální vyšetření laboratorních zvířat tyto tremorgenní účinky prokázalo, zvlášť po parenterální injekci čištěných toxinů. Zdá se, že jejich neurotoxicita souvisí s interakcemi s iontovými kanálky s receptorem GABA a iontovými kanálky sodíku, jak

21

prokazují studie s penitremem A (Breton a kol., 1998; Knaus a kol., 1994). Penitrem A už byl dříve diskutován jako příčinný agent svalového třesu ovcí i jiných intoxikací (McLeay a kol., 1999).

2.5. Toxiny plísně Fusarium Na severní polokouli jsou druhy Fusarium nejběžnějšími plísněmi, napadajícími obilí a kukuřici a jsou označovány jako fytopatogeny, snižující výtěžek i kvalitu úrody. Protože produkují mykotoxiny, ví se o nich, že poškozují zdraví a produktivitu zvířete. V současnosti je identifikováno více než 100 toxinů fusarií, z nichž byly jako hlavní zdroj kontaminace identifikovány trichotheceny, fumonisiny a zearalenon (Nelson a kol., 1994).

2.5.1. Trichotheceny Trichotheceny, produkované především F. graminearum a F. sporotrichoides, obsahují skupinu toxinů, sdílející trichothecenovou strukturu s 12, 13-epoxidovou složkou, což vysvětluje jejich okamžitou toxicitu (Smith, 1992). Trichotheceny skupiny A, např. toxin T-2 a deoxyskripenol (DAS), jsou dermatotoxiny způsobující nekrotické léze po kožním nebo slizničním kontaktu (Wu a kol., 1997). U prasat byly popsány kožní léze vyvolané zaprášeným krmivem obsahujícím toxin T-2 a nekrotické léze horní části gastrointestinálního traktu byly pozorovány u kuřat krmených krmivem obsahujícím toxin T-2 a DAS. V důsledku toho je omezen příjem krmiva (a tudíž i hmotnostní přírůstek a konverze krmiva), což může obratem snížit plodnost (Brake a kol., 1999; Brake a kol., 2000). Trichotheceny jsou rychle absorbovány z gastrointestinálního traktu a intenzivně metabolizovány v játrech, což vede k částečné deepoxidaci. Avšak epoxidy unikající z jaterního metabolismu ovlivňují základní buněčné funkce, jako je syntéza bílkovin a syntéza DNA, a tím i replikaci buněk. Obecná zánětlivá odezva vyvolaná toxinem T-2 je doprovázená pancytopenií, protože buněčné dozrávání mateřských buněk je ztíženo, což vede ke klinickým příznakům leukopenie a anemie. Gastrointestinální léze, zpomalení růstu a zvýšená náchylnost k infekčním onemocněním jsou hlavními problémy pozorovanými po vystavení vlivu trichothecenů.

22

Tolerance toxinu T-2 v krmivu se mezi zvířecími druhy značně liší a diskutuje se o prahových hodnotách pohybujících se od 100 do 500 ppb. Deoxynivalenol (DON, vomitoxin) je hlavním zástupcem skupiny trichothecenů B, do níž patří DON, nivalenol a kyselina fusariová (Rotter a kol., 1996). Ve srovnání s toxinem T-2 je méně agresivní, ale i tak způsobuje po orálním pozření podráždění a zánětlivé reakce v gastrointestinálním traktu. Po absorpci se DON dostává k area postrema v mozku kde, jak se zdá, spouští dopaminergické receptory, což vede ke zvracení - kvůli tomuto farmakologického působení dostal jméno vomitoxin. Zvracení je však pozorováno pouze u prasat při dávkách překračujících 12 ppm, zatímco v praktických podmínkách je běžněji pozorováno přechodné odmítání krmiva a snížená výkonnost. DON vede ke sníženému hmotnostnímu přírůstku u všech monogastrických zvířecích druhů, pokud koncentrace v krmivu překračují 1 mg/kg. Tento snížený hmotnostní přírůstek může být částečně vysvětlen počátečním odmítáním krmiva, ale zdá se, že je taky následkem narušeného transportu živin skrz zanícenou střevní sliznici. Po dlouhodobém působení je u myší i prasat pozorován typický nárůst IgA v lymfatickém systému souvisejícím se střevy. Následuje zvýšená cirkulace IgA a ukládání IgA na glomerulárních membránách v ledvinách, připomínající patologické nálezy autoimunitní glomerulonefritidy (Rotter a kol., 1996). Nedávné údaje o mechanismech činnosti DON přesvědčivě ukazují, že pozorované zvýšení citlivosti postižených zvířat k infekčním nemocem (včetně mnoha virových infekcí) nejspíše odráží zánětlivou odezvu. Bylo zjištěno, že DON indukuje expresi cytokinů, které pak vedou k narušení vrozené i adaptivní imunitní odezvy (Kinser a kol., 2004; Pestka a kol., 2004).

2.5.2. Fumonisiny Fumonisiny (polyhydroxyalkylaminy) představují skupinu alespoň 6 odlišných toxinů

fusárií

produkovaných

plísní

F.

verticillioides

(známou

dříve

jako

F. moniliforme), které byly identifikovány mnohem později než jiné mykotoxiny vzhledem ke své neobvyklé chemické struktuře, jež blízce připomíná sfingolipidy savčích buněčných membrán. Základní mechanismus činnosti fumonisinů, z nichž je nejtoxičtější fumonisin B1 (FB1), je jejich schopnost inhibovat enzym ceramid synthetázu, N-acetyl transferázu katalyzující syntézu komplexních sfingolipidů. Následně se intracelulární koncentrace volného sfingagninu a sfingosinu zvýší na toxickou úroveň (Riley a kol., 1996). Zvýšený

23

poměr močového sfingagninu : sfingosinu tak může sloužit jako diagnostický indikátor vystavení činnosti fumonisinů. I přes znalost principu biochemických účinků vyvolaných fumonisiny je třeba objasnit různorodost klinických intoxikací u různých zvířecích druhů (Diaz a Boermans, 1994). U prasat je projevem intoxikace fumonisiny plicní edém (PPE - porcine pulmonary oedema - prasečí plicní edém), který, jak se zdá, souvisí spíše se srdeční dysfunkcí než se specifickým narušením plicní endoteliální funkce a plicní zánětlivé odezvy (Smith a kol., 2000). Kromě toho se u prasat vystavených chronickému vlivu vyvíjí jaterní hyperplazie se zvýšeným množstvím enzymů v séru a degradace pankreatických acinárních buněk. Zatímco velcí přežvýkavci reagují na experimentální dávky fumonisinů pouze mírnými jaterními symptomy (Baker a Rottinghaus, 1999).

2.5.3. Zearalenon Mnoho druhů fusarií, např. Fusarium graminearum a Fusarium culmorum, které jsou schopné produkovat trichotheceny a fumonisiny, produkuje taky zearalenon (ZEN, ZEA, toxin F-2) (Kuiper-Goodman a kol., 1987). ZEN se vyskytuje na celém světě, především v kukuřici. ZEN je lakton kyseliny resorcyklické a je ligandem pro receptory estrogenů v různých cílových tkáních. Vazebná schopnost k těmto receptorům je značně nižší než u 17-ß-estradiol a liší se u mateřského mykotoxinu a jeho metabolických derivátů, protože ß-zearalenon (ß-ZOL) je několikrát aktivnější než mateřská sloučenina (Olsen a Kiessling, 1983, Malekinejad a kol., 2004a).

2.6. Působení mykotoxinů na parenchymatózní orgány prasat Působením mykotoxinů na orgány prasat likvidují hlavně játra a ledviny a to ve velkém. Mohou způsobovat nervové poruchy, zvyšovat riziko vzniku nádorů či způsobovat sterilitu (Suchý a Herzig, 2001)

2.6.1. Aflatoxiny Způsobují u prasat ztučnění jater. Aflatoxiny jsou známy především díky svému toxickému účinku na játra a ledviny. Játra uhynulých zvířat jsou zvětšená, vykazují

24

známky

nekrotických

změn.

Ovlivňují

metabolismus

tuků

a

proteosyntézu

(Suchý a Herzig, 2001)

2.6.2. Citrin Poškozuje především ledviny, u prasat má zřejmý neurotoxický a imunotoxický účinek, u březích může nepříznivě ovlivnit vývoj plodu. (Müller a kol., 2000).

2.6.3. Fumonisiny Zejména fumonisin B1 vyvolávají u prasat plicní edém (PPE). Prasnice u nichž jsou jako důsledek příjmu kontaminovaného krmiva nejčastěji popsána závažná onemocnění typu leukoencefalomalácie (smrtelné onemocnění postihující mozek, játra a ledviny, projevuje se svalovým třesem, poruchami koordinace pohybů, vrávoravou chůzí, natažením nohou a krku až celkovým ochrnutím). Byla popsána netečnost, oslepnutí (Müller a kol., 2000).

2.6.4. Ochratoxin Ochratoxin A snižuje užitkovost a vyvolává poškození ledvin, způsobuje poškození cytoplasmatických organel, zvláště u epiteliálních buněk (Radostits a kol., 1997). Zasahuje do tří hlavních oblastí funkcí – glukoneogeneze, transportních systémů mitochondrií a proteosyntézy. Známé jsou imunotoxické, genotoxické, teratogenní a karcinogenní účinky (Bendale a kol., 1985; Betina, 1990; Hong a kol., 2000). Při ochratoxikóze dochází k výraznému podráždění sliznice trávicího ústrojí a k rozvoji akutní gastroenteritidy. Resorbované mykotoxiny vyvolávají toxickou nefropatii (poškození ledvin), která je provázena nechutenstvím, depresí, průjmy, horečkou, žíznivostí a častým a vydatným močením a postupnou dehydratací organismu (Neumann a kol., 1989; Kalač a Míka, 1997). Poškození ledvin prasat ochratoxinem - “nefropatie prasat“ je charakteristické a bývá zjišťováno při prohlídce na jatkách.. Ledviny jsou zvětšené a bledé s nerovným povrchem a fibrózou korové vrstvy. Renální tubuly jsou degenerativně změněny a následně dochází k poruchám jejich funkce. Patologické změny mohou být patrné také na játrech. (Jacobsen a kol., 1993). Ochratoxin A snižuje imunitu, zhoršuje kvalitu semene u kanců a předpokládá se, že způsobuje odumření plodů. Snižuje množství

25

protilátek v krvi, postihuje krevní srážlivost na všech úrovních a omezuje růst a vývoj prasat.

2.6.5. Deoxynivalenol (vomitoxin-DON) Vomitoxin je silné centrální emetikum. Vyvolává zvracení, akutní průjmy, poruchy koordinace pohybů, hemoragie na sliznicích a aborty u březích samic či náhlý úhyn. (Williams a kol., 1988).

2.6.6. T-2 toxin (T2) T-2 toxin vyvolává nekrotické léze na rypáku. Aplikace T-2 toxinu na kůži prasat způsobuje její zduření a změnu barvy s následným odlupováním. U zvířat vyvolává imunosupresi (Müller a kol., 2000). U prasat způsobuje nejčastěji poruchy reprodukce, zhoršené zabřezávání, potraty, málo početné vrhy. Toxikóza je příznačná poruchami dýchání, akutními záněty žaludku a střev a krvavými průjmy. Dále způsobuje leukopenii, atrofii, lymfatických uzlin, brzlíku a sleziny (Bauer, 1988; Osweiler, 2000). Má protisrážlivý účinek a je „embryo toxický“, prasnice ho vylučují mlékem a je proto velmi škodlivý pro selata.

2.6.7. Zearalenon Zearalenon je nesteroidní estrogenní mykotoxin (mykoestrogen), který vzhledem ke struktuře podobné estradiolu aktivuje estrogenní receptory ve tkáních pohlavních orgánů. Estrogenní účinky zearalenonu se mohou projevovat velkmi prudce probíhajícími vulvovaginitidami. Největší účinky má zearalenon na prasničky ve stáří 6 až 7 měsíců. Edematózní zvětšení vulvy může být 3 až 4násobné ve srovnání s normálním stavem. Dochází k řídkému katarálnímu výtoku z vulvy, často s výhřezen pochvy (až ve 30 % případů), zvětšuje se velikost a hmostnost ovarií. Také uterus je výrazně zvětšen, neboť dochází k proliferaci sliznice a svaloviny (uterotrofní účinky). V pozdější fázi dochází k atrofii ovarií a u některých zvířat k výhřezu rekta (Gedek, 1984; Osweiler, 2000). Příznačným projevem intoxikace zearalenonem bývá vymizení říje nebo naopak déle trvající říje, pseudogravidita v důsledku perzistence žlutých tělísek na ovariích,

26

snížená plodnost, raná embryonální mortalita, malformace plodů, menší vrhy a nižší hmotnost selat, vysoká neonatální mortalita a paréza pánevních končetin. Toxin inhibuje uvolňování folikuly stimulujícího hormonu (FSH) a tím růst ovariálních folikulů (Osweiler, 2000), u březích prasnic snižuje hladiny progesteronu v krevním séru. Aplikace progesteronu však netlumí estrogenní účinky zearalenonu. Mortalita zvířat může být vysoká v důsledku toho, že se vyvine sekundární cystitida, urémie a septikémie. Při vysokých koncentracích zearalenonu přechází tento mykotoxin do mléka prasnic v množství, dostatečném pro vyvolání klinických příznaků (zvětšení vulvy) u sajících selat. U předpubertálních kanců se po vystavení vlivu ZEN objevuje zvětšení předkožky a mladí kanci mívají snížený sexuální pud a nižší koncentrace testosteronu v plazmě společně se sníženou spermatogenezí. Klinické příznaky se tak liší podle věku, pohlaví a délky vystavení vlivu mykotoxinu. U předpubertálních prasnic jsou tak nízké hladiny, jako je 0,06 mg/kg tělesné hmotnosti, spojeny s klinickým propuknutím výskytu hyperestrogenizace, zatímco dospělá zvířata mohou tolerovat množství v krmivu až 200 400 ppb (JECFA, 2000). Nestejnorodost v definování toxických hladin může být rovněž přisouzena osudu ZEN v těle, kde je metabolizován na více estrogenní ß-ZEN (Miles a kol., 1996).

2.6.8. Nivalenol Způsobuje u prasat snížení počtu slezinových buněk (Dohnal, 2007).

2.6.9. Strachybotryotoxin Způsobuje poškození jater a ledvin, vředy na sliznicích dutiny nosní a ústní, dochází k nechutenství, hypersalivaci (Illek, 2007).

2.6.10. Diacetoxyscirpenol (DAS) Vyvolává tvorbu nekrotických ložisek a krvácenin v kůži, dutině ústní, střevech a ledvinách, způsobuje nechutenství, zvracení, letargii, krvavé průjmy a následnou neschopnost pohybu (Kummer a kol., 2001).

27

2.7. Vliv mykotoxinu na zdravotní stav zvířat Vzhledem k tomu, že mykotoxiny jsou mimořádně stabilní organické látky a jejich toxicita nebývá běžnou úpravou krmiv podstatně snížena, mohou se už při relativně slabém zaplísnění substrátu (méně než 1 tisíc spor v 1 gramu) tvořit dostatečná množství mykotoxinů pro vyvolání poruch zdravotního stavu zvířat. V závislosti na přítomném mykotoxinu se intoxikace projevují alergickými reakcemi, poruchami reprodukce, poruchami funkcí orgánů imunitního systému a zvýšenou mortalitou. Vzhledem

ke

specifickým

účinkům

můžeme

hovořit

o

mykotoxinech

gastrointestinálních, hepato-, nefro-, neuro-, kardio-, imuno-, či dermatotoxických. Rozhodujícími faktory pro celkový toxický účinek mykotoxinů, tak jak je známo z obecné toxikologie, je: • druh mykotoxinu • přijatá dávka mykotoxinu (chronická nebo akutní mykotoxikóza) • kombinace dvou či více mykotoxinů vyskytujících se v krmivu současně, což není neobvyklé, může působit toxičtěji než jednotlivé mykotoxiny v důsledku jejich synergismu. • délka zkrmování • podstatnou roli sehrává věk, pohlaví a druh exponovaných živočichů. • fyziologickým stavem - vyčerpání, gravidita • patologický stav - nemoc (Kaláč a Míka, 1997).

U zvířat i člověka mohou mykotoxiny vyvolat intoxikace s akutním nebo chronickým průběhem. Akutní mykotoxikózy, které vznikají po použití vyšších dávek mykotoxinů, což způsobuje specifický a klinicky zjevný akutní syndrom onemocnění nebo smrt (např. akutní hepatitida při aflatoxikóze). Vyvolávají destrukci jater (degenerace), ledvin, poškození oběhového systému a CNS. Uplatňuje se hepatotoxický účinek (tuková degenerace hepatocytů, nekrózy, cirhóza). Chronické mykotoxikózy, které se vyskytují při opakovaném příjmu středních a nízkých množství toxinů, mají subklinický průběh a tím vesměs unikají pozornosti. Projevují se sníženou užitkovostí – zpomalený růst, snížená laktace a snáška, poruchami

28

imunitního systému a rozmnožování a zhoršenou tržní jakostí živočišných produktů. (Suchý a Herzig 2001). Citlivost některých druhů zvířat na mykotoxiny (jsou uvedeny v Tabulce č. 2). Toxické koncentrace některých mykotoxinů v krmivech (jsou uvedeny v Tabulce č. 3)

2.8. Účinky mykotoxinů na imunitní systém prasat Konzumace malého množství houbových toxinů může vést k narušení imunity a snížené odolnosti proti infekčním nemocem. Veterinární klinici už dlouho uznávají, že u dobytka konzumujícího mykotoxiny v množstvích nižších, než aby způsobily přímou toxicitu, dochází k potlačení imunity (Richard a kol., 1978). Modulace imunity vyvolaná mykotoxiny je významná z několika důvodů. Je možné, že změněné imunitní funkce mohou mechanicky přispívat k symptomům určitých zvířecích mykotoxikóz, jež u dobytka způsobují predispozici pro vznik infekčních nemocí a snižují užitkovost. Z pohledu zdraví lidí může větší výskyt infekčních nemocí zvířat vést také ke zvýšenému přenosu toxinů či patogenů ze zvířete na člověka anebo k vyšším koncentracím antibiotik v mase nebo mléce v důsledku léčby zvířete. Požití nebo inhalace mykotoxinů lidmi také přispívá k onemocněním spojeným s imunitní dysfukcí nebo zvýšenou náchylností k původcům infekce. Citlivost imunitního systému k imunosupresi způsobené mykotoxiny pramení ze zranitelnosti neustále se množících a dělících buněk, které se podílejí na činnostech souvisejících s imunitou a regulují komunikaci mezi buněčnými a humorálními složkami. Imunosuprese vyvolaná mykotoxiny bývá pozorována jako snížená aktivita lymfocytů T nebo B, potlačená produkce protilátek a narušené funkce efektorů makrofágů/neutrofilů.

2.8.1. Komplexita imunitní odezvy U prasat, podobně jako u všech savců, je imunitní odezva hlavním obranným mechanismem proti mikrobiálním patogenům nebo proti jakémukoli narušení integrity organismu (popálení, pořezání atd.). Imunitní odezvy se účastní dva různé mechanismy: • zánětlivá odezva • imunitní odezva související s pamětí (“získaná imunita“).

29

Zánět je nespecifická odezva, ke které dochází velice rychle a která vede k aktivaci fagocytů (makrofágy a neutrofily). Aktivované fagocyty vylučují cytokiny (účastnící se aktivace jiných buněk), metabolity kyseliny arachidonové (prostaglandiny a leukotrieny) a aktivní metabolity kyslíku a dusíku (H2O2, O2-, NO a jiné). Získané imunitní odezvy se účastní lymfocyty. Dochází k nim po opakovaném kontaktu s cizorodým materiálem (antigenem) a je pro ni charakteristická rychlá a specifická odezva. Na této odezvě se podílejí dva typy buněk: • Lymfocyty B, které vylučují protilátky a dávají podnět k humorální imunitní Odezvě. • Lymfocyty T, které se účastní imunitní odezvy zprostředkované buňkami tak, že vyvíjejí cytotoxickou činnost a produkují cytokininy. Dvě různé podskupiny lymfocytů (Th 1 a Th 2) jsou odlišeny cytokiny, které produkují. Tyto podskupiny orientují imunitní odezvu směrem k buněčné nebo humorální imunitní odezvě. Ukázalo se, že dominance odezvy Th 1 nebo Th 2 má zvláštní význam pro odezvu na mnohé patogeny (Sher a kol., 1992). Imunitní odezva je vysoce komplexní mechanismus, kdy buňky vzájemně reagují, aby dosáhly požadovaného účinku. Příklady uvedené níže ukážou, že mykotoxiny mohou působit na všechny typy imunitních buněk a při různé hladině imunitní odezvy.

2.8.2. Mykotoxiny a zánět Několik zpráv ukazuje, že mykotoxiny, např. aflatoxin, ochratoxin, patulin nebo fumonisin, jsou schopny ovlivnit zánětlivou odezvu. Mohou přímo ovlivňovat životnost fagocytů (mikrofágů a neutrofilů), nebo mohou narušit činnost sekrečních funkcí těchto buněk. (jsou uvedeny v Tabulce č. 4.) uvedená níže popisují dopad mykotoxinů na různé fyziologické a imunologické systémy.

2.8.3. Mykotoxiny a humorální imunitní odezva Bylo zjištěno, že mnoho mykotoxinů ovlivňuje humorální imunitu (Oswald a Comera, 1998; Bondy a Pestka, 2000). Zvláštní pozornost je věnována účinku deoxynivalenolu (DON), nazývanému vomitoxin, na syntézu protilátek. Zvýšení produkce IgA vyvolané DON může být zprostředkováno lymfocyty T (Warner a kol., 1994) a makrofágy (Yan a kol., 1997), především nadměrnou indukcí

30

cytokinových genů, např. IL-2 a IL-6 (Yan a kol., 1997). Specifický mechanismus pro nadměrnou indukci cytokinů mykotoxiny není dostatečně pochopen, ale může zahrnovat zvýšenou stabilitu cytokinové mRNA a jiné transkripční mechanismy (Bondy a Pestka, 2000). U prasat prokázalo několik výzkumných pracovníků nárůst IgA v séru zvířat dostávajících krmivo kontaminované DON (Bergsjo a kol., 1993; Grosjean a kol., 2002; Swamy a kol., 2002). Při těchto pokusech však nebyly dietou ovlivněny hladiny IgG v séru (Grosjean a kol., 2002; Swamy a kol., 2002) ani hladiny exprese několika cytokinů (IL-6, IL-10, IFN- a TNF- ) (Grosjean a kol., 2002).

2.8.4. Mykotoxiny a buněčná imunitní odezva Imunomodulační vlastnosti mykotoxinů byly nejvíce zkoumány u aflatoxinů. Nejvýznamnější účinek aflatoxinu je orientován na imunitu na buněčné úrovni. Vyvolání účinků na humorální imunitu vyžaduje vyšší koncentrace toxinu a účinky nejsou u různých druhů stejné (Pier, 1992). Snaha vyhodnotit účinek aflatoxinů na buněčnou imunitní odezvu u prasat vedla ke konfliktním výsledkům. Několik vědeckých prací prokázalo snížení stimulace lymfocytů mitogeny u zvířat dostávajících krmivo kontaminované od 280 do 2500 ppb aflatoxinu (Miller a kol., 1981; Harvey a kol., 1995; Van Heughten a kol., 1994). Naopak jiní výzkumní pracovníci nepozorovali žádné potlačení lymfo-proliferační odezvy na mitogeny u prasat dostávajících krmivo kontaminované 500 až 800 ppb aflatoxinu (Panangala a kol., 1986; Silvoltti a kol., 1995). Podávání nižších dávek tohoto mykotoxinu (140 až 280 ppb) rovněž nevedlo ke vzniku jakýchkoli účinků aflatoxinu na expresi regulačních cytokinů produkovaných buď podskupinami lymfocytů Th1(IL-2) nebo Th 2 (IL-4) v krevních vzorcích stimulovaných PHA (Marin a kol., 2002). Nedávné výsledky naznačují, že obzvlášť vyvíjející se selata mohou být k tomuto toxinu citlivá (Silvotti a kol., 1997). Po vystavení prasnic 800 ppb aflatoxinu B1 nebo G1 v průběhu březosti a laktace mohou být skutečně mykotoxiny detekovány v mléce v množství až 500 ppt. Vede to k funkčním změnám imunokompetentních buněk T u selat. Jejich lymfo-proliferační odezva na mitogeny byla omezená a monocytické makrofágy nebyly schopny účinně produkovat anionty hyperoxidů po oxidační stimulaci (Silvotti a kol., 1997).

31

2.9. Význam pro zdraví prasat Náchylnost k infekčním nemocem: Ukázalo se, že rozsáhlé imunosupresivní účinky mykotoxinů na buněčnou i humorální imunitní odezvu prokázaly snížení odolnosti hostitelského organismu k infekčním nemocem. Prokázalo se to nejen u myší (Tai a Pestka, 1998; Vidal, 1990), ale i u králíků (Niyo a kol., 1988b) a kuřat (Bekesi a kol., 1997; Boochuvit a kol., 1975). U prasat vedla zvýšená konzumace krmiva kontaminovaného aflatoxinem ke zvýšení závažnosti infekce erysipelas, jak ukazuje analýza makroskopických lézí provedená po experimentálně vyvolané zátěži (Cysewski a kol., 1978; Stoev a kol., 2000) později prokázali, že konzumace krmiva kontaminovaného OTA zvyšuje náchylnost k infekčním onemocněním prasat. Při tomto experimentu se Salmonela objevila spontánně u všech selat dostávajících dietu kontaminovanou 3 ppm OTA a u jedné třetiny zvířat dostávajících dietu kontaminovanou 1 ppm toxinu. Naproti tomu nebylo postiženo žádné zvíře ze skupiny krmené kontrolní dietou. Při dalším experimentu byla zvířata očkována proti hemorrhagickému průjmu působenému S. choleraesuis. V tomto případě vedla mykotoxinová

kontaminace

ke

spontánním

infekcím

bakteriemi

Serpulina

hyodysenteriae a Cymphylobacter coli (Stoev a kol., 2000). Je známo, že je mykotoxin FB1 predispozičním faktorem infekčních onemocnění (Fournout a kol., 2000; Oswald a kol., 2003). Bylo provedeno zkoušení, při kterém odstavená selata dostávala denně 0,5 mg/kg (tělesné váhy) FB1 ve formě surového extraktu nebo čištěného toxinu po dobu sedmi dnů. Poslední den krmení toxinem byla prasata orálně naočkována extra intestinální E.coli související s extra intestinální infekcí a po 24 hodinách byla zvířata utracena. Výsledky ukázaly, že orální podání FB1 výrazně zvýšilo osídlení tenkého i tlustého střeva naočkovaným kmenem E. coli (Fournout a kol., 2000; Oswald a kol., 2003). Tato zvýšená náchylnost souvisela se sníženým kódováním mRNA pro IL-8 v ileu prasat krmených fumonisinem B1. Kromě toho ukázaly in vitro údaje o prasečí epiteliální střevní buněčné linii a dále ukázaly, že FB1 snižuje syntézu IL-8. tyto experimenty ukázaly, že fumonisin B1 blokuje množení buněk a dělení prasečích epiteliálních střevních buněk a narušuje jejich schopnost vytvářet monovrstvu (Bouhet a kol., 2004). Na základě těchto zjištění je možno vyslovit hypotézu, že: 1. fumonisin B1 snižuje aktivaci zánětlivých buněk ve střevě tím, že snižuje hladiny IL-8.

32

2. Tento toxin zvyšuje translokaci bakterií skrze epitel tím, že ovlivňuje proliferaci a integritu epiteliální buněčné monovrstvy. Oba jevy se mohou podílet na zvýšené náchylnosti zvířat ke střevním infekcím

2.9.1. Účinek vakcinace Imunita získaná prostřednictvím vakcinace je po použití mykotoxinů narušena také. AFB1 ruší vývoj získané imunity u prasat po vakcinaci proti erysipelas (Cysewski a kol., 1978). Při tomto experimentu byla prasata, krmena buď normální dietou nebo dietou kontaminovanou aflatoxiny, vakcinována bakterií erysipelas a o 21 dnů později vystavena zátěži v podobě virulentního kmene Erysipelothrix rhusiopathiae (Cysewski a kol., 1978). Ve skupině 6 prasat dostávajících normální dietu mohla být po vakcinaci a vystavení zátěži polovina považována za imunní a dvě byla částečně imunní. Oproti tomu ve skupině prasat dostávajících aflatoxin nebylo žádné ze zvířat plně imunní a pouze jedno bylo imunní částečně. To naznačuje, že konzumace aflatoxinu interferuje s vývojem získané imunity (Cysewski a kol., 1978). Nedávno se prokázalo, že konzumace nízkých dávek fumonisinu B1 snižuje specifickou odezvu protilátek zvýšenou během vakcinace (Taranu a kol., 2003). Delší vystavení (28 dnů) krmivu kontaminovanému 8 ppm fumonisinu B1 skutečně nevede k modifikaci sérových koncentrací tří imunoglobulinových podskupin (IgG, IgA a IgM), ale významně snižuje specifickou odezvu protilátek na modelový antigen. In vitro analýza prasečích lymfocytů odhaluje, že tento toxin inhibuje proliferaci buněk (Gouze a Oswald, 2001) a mění produkci cytokinů (Taranu a kol., 2003). Fumonisin B1 zvyšuje syntézu IFN-gama a cytokinu Th1 zúčastněného v imunitní odezvě na buněčné úrovni a snižuje syntézu IL-4 a cytokinu Th2 zúčastněného v odezvě humorální. Tyto změny jak v množení lymfocytů tak produkci cytokinů mohou vysvětlovat neúspěch vakcinace, který jsme pozorovali in vivo (viz. Obrázek č. 1). Proto může vést přítomnost nízkých dávek mykotoxinů v krmivu k selhání imunity získané z vakcíny a může vést ke vzniku onemocnění dokonce i u vakcinovaných zvířat. Tyto reakce mají pro živočišnou produkci značné následky, protože se při prevenci onemocnění spoléháme na účinný vakcinační program (Pier, 1992). Výsledky zkoušení jasně ukazují, že několik mykotoxinů mění imunitou zprostředkované aktivity u prasat. Imunosuprese vyvolaná mykotoxinem může navíc

33

vést ke snížené odolnosti hostitelského organismu k infekčním nemocem a snižuje účinnost vakcinace. Některé úvahy však nebyly brány v potaz. Za prvé se mohou vyskytnout přirozené směsi mykotoxinů, které mohou měnit imunitu aditivním nebo synergistickým způsobem, což bylo popsáno u aflatoxinu a toxinu T-2 (Pier, 1992) nebo deoxynivalenolu a kyseliny fusariové (Smith, 1992). Za druhé, nutriční účinky související s odmítáním potravy mohou také přispívat k pozorovaným změnám. A nakonec, zatímco je předmětem většiny zkoumání systemická imunita, je velice pravděpodobné, že mykotoxiny mají největší účinek na mukózní lymfoidní tkáň (především střevní a průduškovou), než jsou absorbovány a následně metabolizovány. Další zkoumání imunitních účinků vdechovaných mykotoxinů bude tedy předmětem zájmu z důvodu rizika pro prostředí vyvolaného obilným prachem nebo dodávkou vzduchu kontaminovaného plísněmi.

2.10. Ztráty v průběhu skladování obilí V minulosti byly ztráty ve skladovaném obilí přisuzovány činnosti hmyzu. Do roku 1950 už byly za hlavní příčinu zničení považovány skladové houby. První fáze růstu plísně není pozorovatelná prostým okem, ale vede k velkým ztrátám způsobeným fyzickým poškozením zrna, ztrátou nutriční hodnoty a produkcí houbových toxinů. Houby mohou ovlivnit barvu, zápach a obsah tuku zrna. Přirozeně žlutá barva se může změnit v bílou, růžovou nebo zelenou v závislosti na druhu houby (Qasem a Christensen, 1958). Obilí zasažené plísněmi má často charakteristický zatuchlý zápach. Útok hub je zrychlen snížením specifické hmotnosti obilí. Růst plísní významně snižuje obsah sušiny v obilí; obilí zasažené houbami může mít poloviční hmotnost než je hmotnost nekontaminovaného obilí (Lazzari, 1993; Krabbe a kol., 1994). Krabbe a kol. (1994) uvedli ztrátu 4 % sušiny u obilí skladovaného při 18% vlhkosti po dobu 30 dní a ztráty 8 % po 60 dnech skladování.

34

2.11.

Vliv skladovacích podmínek na poškození obilí houbami

Interakce mezi teplotou, koncentracemi O2 a CO2 a obsahem vlhkosti určují rozsah osídlení plísněmi (Tuite, 1994). Obecně potřebuje většina hub alespoň 1 - 2 % kyslíku. Plíseň Fusarium verticillioides (moniliforme) je výjimkou a je schopna růst v prostředí s 60 % CO2 a méně než 0.5 % O2 (Tuite, 1994). Houby rostou obvykle při teplotách mezi 20 a 30 °C. Je důležité si uvědomit, že pokud je obilí vystaveno při sklizni vysoké teplotě, může si tuto teplotu uchovat po několik dní či týdnů po sklizni, pokud není skladovací prostor vybaven chladicím zařízením. Ve skladovacích prostorách rostou houby běžně při vlhkosti 13 - 18 %. Avšak v materiálu s vyšším obsahem oleje (burské ořechy) se může růst hub objevit již při vlhkosti 7 % (Muschen a Frank, 1994). Někdy používané postupy s úmyslem omezení růstu hub ve skutečnosti zvyšují možnost infekce. Klasickým případem je postup sušení obilí za vysokých teplot, které vede k praskání ochranného pelikulu zrn a tím i otevření cesty k invazi plísně do otevřeného endospermu. Je známo, že plísně využívají intergranulární vodní páru jako zdroj vlhkosti v silu. Její koncentrace je určena rovnováhou mezi volnou vodou v zrnu a vodní párou, která je bezprostředně obklopuje. Koncentrace intergranulární vody se popisuje buď výrazy: rovnovážná relativní vlhkost ERM (Equilibrium Relative Humidity) nebo vodní aktivita (aw). Tlak vodní páry v zrnu aw (vodní aktivita) = ─────────────

(při stejné teplotě a tlaku)

Tlak páry čisté vody

ERM je vodní aktivita vyjádřená v procentech. Při dané vlhkosti je vodní aktivita u různých druhů obilí jiná a liší se tak i rychlost a typ růstu plísní. Průchod vody ze zrna do vodní fáze je podporován zvýšením teploty. V důsledku toho bude za daného obsahu vlhkosti vodní aktivita a tím i náchylnost k růstu plísní narůstat se zvyšující se teplotou. V praktických situacích je skladovací prostor běžně vystaven slunci, což zvyšuje teplotu uvnitř nádrže a teplo se šíří sdílením (konvencí) do obilné hmoty. Může to vést k přesunu vody do chladnějších míst nádrže. Když se vodní

35

pára přesune z teplejšího místa do chladnějšího, kondenzuje a může lokálně zvýšit obsah vlhkosti uvnitř nádrže a tím vytvořit „horké ložisko”. V tomto ložisku začnou snadno růst plísně (Cruz, 1995). V této situaci, přesto že je celkový obsah vlhkosti v kontejneru např. okolo 12 %, může být v některých místech nádrže okolo 18 % a tím se stává vhodným prostředím pro růst plísně. Konečně také hmyz a roztoči významně přispívají k růstu plísní tím, že fyzicky poškozují obilí, čímž poskytují možnost plísním k napadení jejich otevřeného endospermu. Metabolická činnost hmyzu i roztočů vede rovněž ke zvýšení obsahu vlhkosti i teploty infikovaného obilí, čímž vznikají příznivé podmínky pro rozvoj hub. Hmyz a roztoči také přenášejí spory plísní a jejich exkrementy jsou dalším substrátem pro růst plísní.

2.12. Dýchací proces ve skladovaném obilí Po sklizni je zrno stále živým organismem a pokračuje metabolický proces dýchání. V přítomnosti O2 (aerobní podmínky) dochází při dýchání k oxidaci uhlovodíků a tuků za současné produkce CO2, vody a energie ve formě tepla (Puzzi, 1986). Pokud je přerušen přístup kyslíku k obilí, dochází k anaerobnímu metabolismu. Konečnými produkty anaerobní aktivity jsou plynný CO2 a organické sloučeniny, např. kyselina octová. Tento proces se nazývá fermentace (Puzzi, 1986). Intenzita dýchacího procesu závisí na teplotě a vlhkosti obilí. Růst teploty může zvýšit rychlost dýchání dvakrát až třikrát. Dychání ale ustává, jakmile vysoká teplota zničí enzymy, které jsou k dýchání potřebné (Puzzi, 1986). V obilí může dojít k nárůstu teploty (až 55 – 75 °C) vlivem termofilních bakterií, což může vésti k samovznícení obilí. Na druhou stranu, pokud je skladované obilí příliš suché (např. obsah vlhkosti 11 – 13 %), dýchání se výrazně zpomaluje. Dokonce i za nízkých teplot, pokud je úroveň vlhkosti vysoká, se může objevit růst plísní. Z tohoto důvodu u obilí s vysokým obsahem vlhkosti není uchovávání v chladu nejúčinnější metodou pro omezení růstu hub. Ve vlhkém zrnu jsou nejdůležitějším faktorem zvýšeného dýchání samotné houby. Tyto houby mohou přeměnit zrno z živého organismu na pouhý substrát pro produkci CO2, vody a tepla. Zvýšené dýchání a zahřívání je spojeno se zničením zrní. Proto je množství CO2 v obilné mase důležitým indikátorem intenzity dýchacího procesu.

36

2.13.

Prevence růstu plísní

Růst plísní v obilninách na poli i ve skladovaném zrní působí nutriční i hmotnostní ztráty a může souviset i s produkcí mykotoxinů, které mohou být vysoce toxické pro zvířata i lidi (možný výskyt mykotoxinů v krmivech je uveden v Tabulce č. 1). Ekonomický dopad růstu plísní v krmivech na živočišnou produkci může být nedozírný. Preventivní kontrola je tedy nezbytná pro udržení vysoké nutriční hodnoty obilovin a zamezení kontaminace krmiva mykotoxiny.

2.13.1. Opatření před sklizní Doržováním agronomických postupů, které zlepší celkovou kvalitu úrody, lze snížit (ale ne vyloučit) kontaminaci mykotoxiny před sklizní. Například použitím germplasmy odolné proti hmyzu, nebo modifikované kukuřice (Bt kukuřice) se významně sníží hladina fumonisinů. Postřikem burských ořechů můžeme zabranit kontaminaci buráků aflatoxiny. Optimalizace manažerských postupů pro kontrolu nad mykotoxiny není však vždy možná - ať už z důvodů vysokých nákladů nebo z důvodů geografické polohy či povahy produkčního systému (Cleveland a kol., 2003). V oblastech, kde je problém s obilnými plísněmi i mykotoxiny, by měly být pěstovány křížené rostliny (hybridy), které jsou méně náchylné k napadení plísněmi. K správné volbě příslušných hybridů, je třeba identifikovat převládající plísňové patogeny. Po vysetí obilnin je v rámci správné výrobní praxe nezbytné minimalizovat zátěž rostlin. Běžnými zátěžovými podmínkami souvisejícími s růstem obilních plísní jsou např. vysoká vlhkost uprostřed či na konci vegetace, následující po suchém začátku této sezóny. Dalšími stresujícími vlivy jsou foliární choroby, poškození hmyzem, špatná výživa rostlin, hustota porostu atd. Další strategií, která se ukázuje jako velice slibná při snižování kontaminace úrody mykotoxiny, je použití kmenů plísní, které neprodukují mykotoxiny (atoxigenní kmeny). Současné strategie biologické kontroly spoléhají na schopnost atoxigenních kmenů konkurenčně vyloučit producenty mykotoxinů ze zemědělského prostředí (Cleveland a kol., 2003).

37

2.13.2. Opatření po sklizni Veškerá skladovací zařízení by měla být pravidelně monitorována s cílem odhalit výskyt obilných plísní. Obilné plísně se jen zřídka objevují stejnoměrně v celém skladovacím prostoru a zcela běžný je vývoj v tzv. „žhavých místech”. Monitorování vyžaduje systematický vzorkovací plán, který bere v úvahu jedinečnou charakteristiku provedení skladovacího zařízení. Je nutné se zaměřit na všechna místa skladovacího prostoru, aby se zabránilo růstu plísní. Vzhledem k tomu, že může dojít k pomnožení plísní kdekoli, včetně skladovacích zásobníků, šrotovníků, míchacích zařízení, zásobníků na krmné směsi, ale také krmících zařízení pro zvířata, je vhodné sledovat skladovací teplotu a vlhkostní podmínky a zásobníky i vybavení často čistit. Cílem je odstranit staré zrní a zbytky, které by mohly poskytnout houbám vhodné prostředí. Z důvodu minimalizace možnosti růstu obilných plísní a produkce mykotoxinů by měl být obsah vlhkosti v obilí snížen pod 15 % do 48 hodin po sklizni. V mnohých skladovacích zařízeních, hlavně ve velkokapacitních elevátorech, to může být obtížné. Nesmírně důležitá je proto cirkulace vzduchu v celém skladovacím zásobníku. Manipulace s obilím před sklizní i po ní by měla být navržena tak, aby minimalizovala mechanické poškození. Většina plísňových patogenů přímo proniká rostlinnými tkáněmi, způsobuje mechanické poškození, což usnadňuje infikování a další přenos během dopravy i skladování. Podobně jako mechanické poškození i poškození hmyzem umožňuje další cestu vstupu pro plísňové patogeny, usnadňuje infekci a šíření skrze celou masu obilí. Některé druhy hmyzu také působí jako přenašeč obilných plísňových patogenů. Účinný plán kontroly nad výskytem hmyzu během růstové sezóny i během období po sklizni (dopravy a skladování) obilí může omezit kontaminaci plísněmi i mykotoxiny. Používání fungicidních přípravků je běžným postupem a může být velice účinné pro snížení růstu plísní a následných ztrát obilí i produkce mykotoxinů. Je však třeba zdůraznit, že pokud už plíseň obilí poškodila nebo vyprodukovala mykotoxiny, je účinnost tohoto postupu omezená. Avšak v některých situacích může být inhibitor plísní užitečný pro kontrolu nad plísněmi od doby aplikace (Leeson a Summers, 1991).

38

2.14. Dekontaminace mykotoxinů v krmivech Pro omezení nepříznivých účinků mykotoxinů na zdraví člověka a zvířat, produkci či k jejich prevenci, se používají různé postupy. V živočišné výrobě je nejvíce použivanou metodou přídavek mykotoxinových adsorbentů do krmiva. Domněnka, že adsorbenty adsorbují všechny mykotoxiny v krmivu, je mylná. Když je krmivo pozřeno a následně tráveno v gastrointestinálním traktu (GIT), uvolňují se mykotoxiny z matrice krmiva. Uvolněné mykotoxiny jsou transportovány přes střevní epitel, dostávají se do krevního řečiště a jsou přenášeny do různých orgánů, kde způsobují jejich buněčné selhání. Pokud je v krmivu použit mykotoxinový adsorbent, adsorbuje mykotoxiny uvolněné v GIT a ty jsou pak bezpečně vyloučeny v exkrementech, čímž se zabrání jejich přenosu do cílových orgánů. Čistým účinkem je snížení dávky adsorbovatelného toxinu na koncentraci, která nepůsobí nepříznivě na užitkovost zvířete.

Při zjištění klinických příznaků, resp. patologicko-anatomických změn lze usoudit, že použité krmivo je mykotoxiny kontaminováno (Mabbett, 1999). Prasata projevují nechutenství, poruchy reprodukce, průjmy, zvracení, extrémní rozklad zažitiny, ale také změněné biochemické ukazatele krve. Na dekontaminaci krmiv lze pohlížet jen jako na proces řešící již vzniklou situaci, kdy jsou v krmivu mykotoxiny přítomny. Vzhledem k tomu, že neexistují, ani nelze v blízké budoucnosti počítat s tím, že by se našly stoprocentní metody prevence vzniku mykotoxinů v krmivech, je nutné se dekontaminačními metodami zabývat. Obdobně jako u preventivních metod je obtížné najít univerzální dekontaminační metody. Je to dáno obrovskou škálou mykotoxinů (dnes je známo více než 300 druhů), jejich různorodou chemickou strukturou, vysokou stabilitou vůči řadě fyzikálních, chemických i biologických faktorů.

K dekontaminaci krmiv jsou využívány: • metody fyzikálně chemické (např. vodný roztok chloridu vápenatého, čpavkování, aplikace kyseliny propionové, kombinace tepla a tlaku) • adsorbční efekt minerálních jílů, produktů stěn buněk kvasinek (může však docházet i k vyvázání důležitých složek krmiva) i degradace mykotoxinů za využití enzymů esterázy a epoxidázy, nebo kombinace minerálních jílů s enzymy.

39

Fyzikální způsoby dekontaminace mykotoxinů v krmivech. Většina mykotoxinů má velmi pevnou chemickou strukturu, která zajišťuje jejich velkou stabilitu, jak při působení vysokých teplot, tak při nízkých hodnotách pH. Mykotoxiny je možné rozložit horkem nebo kombinací tepla a tlaku. Senzibilita závisí na typu mykotoxinu, teplotě, době zahřátí a obsahu vody v krmivu (Suchý a Herzig, 2001). Základním opatřením musí být mechanické odstranění všech nečistot ve skladovacích prostorech a technologických linkách včetně zásobníků, čištění zrnin, odstranění malých, svraštělých zrn. Např. čištěním kukuřice se snížil celkový obsah toxinů až o 32 %. Některé mykotoxiny jako např. bezvodé aflatoxiny, trichothecenové toxiny (DON), zearalenon, ochratoxin A, patulin a kyselina penicilová jsou termostabilní. Naopak termolabilní jsou citrinin, který je zahřátím relativně snadno rozrušen a patulin. Proti tepelnému rozkladu patulinu působí vitamín C, který toxin tepelně stabilizuje i při sterilizačních teplotách (Suchý a Herzig, 2001). Ultrafialové a ionizující záření může být při destrukci některých mykotoxinů jako je např. aflatoxin efektivní, ale zároveň jsou destruovány i živiny krmiva.

Sorbenty jsou minerální látky schopné adsorbovat nebo vázat molekuly mykotoxinů, které potom nemohou být ze střeva absorbovány a stráveny. Používají se minerální sorbenty, jejichž povrch je nasycen molekulami vody, které přitahují polární funkční struktury mykotoxinů. Lze použít aktivované živočišné uhlí, syntetické zeolity a minerální jíly. Účinnost sorbetů závisí na řadě faktorů – adsorpční kapacitě, jejich molekulární struktuře, jejich čistotě, druhu mykotoxinu, apod. Nevýhodou těchto metod je, že podle typu a intenzity použitého fyzikálního faktoru dochází k různému stupni narušení živin a jejich absorpce, čímž se snižuje biologická hodnota krmiva (Suchý a Herzig, 2001). Novějším způsobem dekontaminace je použití krmných aditiv, která působí proti mykotoxinům in vivo. Některé minerální sloučeniny jsou schopny adsorbovat nebo vázat molekuly mykotoxinů. Adsorpce izoluje toxiny, omezuje jejich absorpci nebo trávení zvířetem. Uvedené vlastnosti mají aktivované živočišné uhlí, produkty stěn buněk kvasinek, syntetické zeolity a těžené minerální jíly, jako jsou bentonity a sepiolity. Jejich účinnost závisí na sorpční kapacitě jejich molekulární struktury, stejně jako na jejich čistotě a charakteristikách cíleného mykotoxinu. Hlinitokřemičitany působí proti

40

aflatoxinům, mohou být v omezeném měřítku účinné proti zearalenonu

a

B-trichothecenům jako je deoxynivalenol nebo nivalenol (Suchý a Herzig, 2001). Komerčně dostupná krmná aditiva spojují adsorpční efekt s enzymovou degradací, neboť se očekává detoxikace krmiva kontaminované řadou mykotoxinů. Používají se minerální adsorbenty, jejichž povrch je nasycen molekulami vody, které přitahují polární funkční struktury mykotoxinů. Takto izolované toxiny neprostupují do krve a vnitřního prostředí zvířete. V případě nedostatku polárních funkčních skupin zajistí jejich likvidaci enzymy. Enzym esteráza a epoxidáza štěpí funkční atomové skupiny od molekul mykotoxinů a zbytek molekuly se stává netoxickým, je tráven a vyloučen. Enzym esteráza například rozlomí laktonový kruh zearalenonu, zatímco enzym epoxidáza degraduje 12, 13- epoxy skupinu u trichothecenů (Suchý a Herzig, 2001).

Chemické způsoby dekontaminace mykotoxinů v krmivech. Snaha o dekontaminaci napadených zrnin je letitá, zahrnuje extrakci s použitím organických rozpouštědel, uplatnění vodných roztoků chloridu vápenatého nebo bikarbonátu sodného, horké vody se solí apod. Tato relativně ekonomická opatření mohou způsobit určité problémy ve výživě zvířat. Ošetření

amoniakem a

monomethylaminem a hydroxidem vápenatým může být efektivní za kontrolovaných podmínek. Mezi účinná a ekonomická opatření patří čpavkování, které rozkládá aflatoxiny (vznikají mutagenní produkty). Účinek ozonu byl prokázán na dekontaminaci aflatoxinu B1, kdy u kukuřice po 92 hodinách expozice O3 byl snížen jeho obsah o 95 % (Suchý a Herzig, 2001).

Biologické způsoby dekontaminace mykotoxinů v krmivech. Lze využit antagonistické mikroorganismy a jejich produkty, např. kvasinkové kultury (Saccharomyces cerevisce, pivní kvasinky), produkty buněčných stěn kvasinek (olygosacharidy zejména ze skupiny glukomananů), bakteriální kultury lactobacilů (Lactobacillus rhamnosus mají schopnost vázat aflatoxiny a trichotheceny). Obsah vlákniny v krmivu může částečně vázat např. zearalenon a T-2 toxin. Patulin se rozkládá při alkoholickém kvašení účinkem kvasinek rodu Saccharomycetes (Suchý a Herzig, 2001).

41

Použití enzymů. Novější postupy dekontaminace mykotoxinů představuje použití enzymů. Jsou dostupné enzymy na inaktivaci zearalenonu, trichothecenů zahrnující T-2 toxin, HT-2 toxin, DON, nivalenolu a diacetoxysci-penolu. Enzymy degradují toxin rozštěpením molekuly na neškodné metabolity. Komerčně dostupná aditiva mohou spojovat adsorpční efekt s enzymovou degradací. Přítomné enzymy – esterázy (schopné rozlomit laktonový kruh zearalenonu) a epoxidázy štěpící funkční atomové skupiny trichothecenů (Suchý a Herzig, 2001).

Podpora detoxikačních funkcí organismu zvířat. Pokud jsou mykotoxiny absorbovány drůbeží nebo jinými zvířaty neporušené, vstupují během trávení do krevního řečiště a mohou ovlivnit zdravotní stav. V játrech, která mykotoxiny detoxikují podobně jako další jedy, se uplatňují oxidoredukční reakce, založené na využití glutationu, který je částečně tvořen metionem a cysteinem. Jedním z účinků aflatoxinů je vyčerpání metabolických hladin metioninu, což může negativně ovlivnit zdraví zvířat a užitkovost. U brojlerů, při příjmu aflatoxinem kontaminovaných krmiv, se doporučuje mimořádný přísun metioninu o 30 - 40 % vyšší, než doporučují normy (NRC 2001).

Proti mykotoxinům lze využít ochranné účinky aplikace antioxidantů (vitamín A, vitamín E, kyselina askorbová, koenzym Q, selen, případně různé rostlinné extrakty) (Suchý a Herzig, 2001).

42

3. VLASTNÍ PRÁCE 3.1. Cíl práce Cílem bakalářské práce je zjistit vliv účinků mykotoxinů na zdraví a užitkovost prasat. Práce se zabývá problémovými faktory, které podmiňují růst a množení patogenních hub a podmínky pro tvorbu mykotoxinů v krmivech. Výsledkem je studium jejich působení v krmivech a jejich vliv na jednotlivé orgány prasat. Pozornost je věnována vlivu věku, pohlaví a plemene zvířat na rozsah zdravotní zátěže způsobované plísněmi a jejich sekundárními metabolity. Jsou analyzovány vlivy konkrétních významných mykotoxinů na imunitní systém prasat a celkové zdraví zvířat. Práce mimo jiné hodnotí také širší přehled účinků mykotoxinů na další hospodářská zvířata, popis citlivosti různých druhů zvířat na tuto zátěž a vliv na potravní řetězec. Výsledkem této práce je snaha popsat možnosti současných postupů a prevence při řešení těchto problémů.

3.2. Materiál a metodika (nástin) Za účelem posouzení vlivu účinků mykotoxinů na stav prasat budou popsány experimenty, ve kterých jsou analyzovány dopady krmných směsí s obsahem toxinů a jejich vliv na zdraví a užitkovost prasat.

43

4. ZÁVĚR Závěrem je možné konstatovat, že kontaminace krmiv mykotoxiny je celosvětově významným ekonomickým problémem pro chovatele a pro krmivářský průmysl. Přítomnost plísní a mykotoxinů snižuje kvalitu obilovin, krmiv a výnosy plodin. Při krmení s obsahem mykotoxinů dochází ke snížení přírůstků, zvýšení konverze živin a zhoršení zdravotního stavu zvířat. Zvláště mladá monogastrická zvířata citlivě reagují na obsah mykotoxinů v krmivech. Nákup zdravotně nezávadných obilovin je důležitým předpokladem pro výrobu kvalitních krmných směsí. Pro zachování zdraví a reprodukce zvířat je důležité zásadně nezkrmovat zaplísněná krmiva. Ačkoliv prevence by měla být primárním cílem, určité negativní vlivy prostředí během růstu a sklizně plodin nelze zcela ovlivnit. Dostupným prostředkem pro zlepšení je použití inhibitorů plísní a mykotoxinových adsorbentů. To by se mělo stát běžnou součástí krmného programu, neboť tyto přípravky jsou již dostupné v široké nabídce. U nabízených sorbetů je třeba vždy uvážit, do jaké míry jsou účinné proti danému mykotoxinu a jaký může být stupeň jejich nežádoucí vazby na některé živiny (vitamíny, aminokyseliny, mikroprvky). Zavedení výše uvedených postupů do běžné praxe pak významně ovlivní zdraví zvířat a s tím úzce související vliv na zdraví lidí.

Bakalářská práce byla zpracována s podporou Výzkumného záměru č. MŠM 6215648905 „ Biologické a technologické aspekty udržitelnosti řízených ekosystémů a jejich adaptace na změnu klimatu“ uděleného Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy České republiky.

44

5. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY Adebajo L. O., Bamgbelu O. A., and Olowu R. A (1994). Mould contamination and the influence of water activity and temperature on mycotoxin production by two Aspergilli in melon seed. Natrung, 38, p. 209-217.

Bacon, C. W., Porter J. K., Norred W. P., and Leslie J. F (1996). Production of fusaric acid by Fusarium species. Appl. Environ. Microbiol., 62, p. 4039-4043.

Baker, D. C. and Rottinghaus G. E (1999). Chronic experimental fumonisin intoxication of calves. Journal Veterinary Diagnostic Investigations, 11, p. 289-292.

Bekesi, L., Hornok S., Szigeti G., Dobos-Kovacs M., Szell Z. and Varga I (1997). Effect of F-2 and T-2 fusariotoxins on experimental Cryptosporidium bailey infection in chickens. Int. J. Parasitol., 27, p. 1531-1536.

Belkacemi, L., Barton, R. C., Hopwod, V., Evansm E. G. V (1999). Determination of optimum growth conditions for gliotoxin production by Aspergillus fumigatus and development of a novel method for gliotoxin detection. Medical Mycology, 37, p. 227-233.

Betina V.: Mykotoxíny, chémia, biológia, ekológia, Bratislava: Alfa (1990), 284 s. ISBN 80-05-00631-4.

Beretta, B., Gaiaschi A., Galli C. L. and Reagani P (2000). Patulin in apple-based foods: occurrence and safety evaluation. Food Additives Contaminants, 17, p. 399-406.

Bergamo, B., Langseth W., Nafstad I., Jansen J. H., Larsen H. J (1993). The effects of naturally deoxynivalenol-contaminated oats on the clinical condition, blood parameters, performance and carcass composition of growing pigs. Vet. Res. Commun., 17. p. 283-294.

Blount, W. P. (1961) Turkey "X" disease. Turkey, 9, p. 52.

45

Bouhet S., Hourcade E., Loiseau N., Fikri A., Martinez S., Roselli M., Galtier P., Mengheri E. and Oswald I. P (2004). The mycotoxin, fumonisin B1 alters the proliferation and the barrier function of porcine intestinal epithelial cells. Toxicol., Sci. 77, p. 165-171.

Boochuvit, B. Hamilton P. B and Burmeister H. R (1975). Interaction of T-2 toxin with Salmonella infection in chickens. Poult. Sci., 54, p. 1693-1696.

Bondy, G. S. and Pestka J. J (2000). Immunomodulation by fungal toxins. Journal Toxicology Environmental Health B, Critical Review, 3, p. 109-143.

Boysen, M. E., Jacobsson K. G. and Schnurer J (2000). Molecular identification of species from the Penicillium roqueforti group associated with spoiled animal feed. Applied and Environmental Mikrobiology, 66, p. 1523-1526.

Brake, J., Hamilton P. B. and Kittrell R. S (1999). Effects of the tricothecene mycotoxin diacetoxyscirpenol on fertility and hatchability of broiler breeders. Poultry Science, 78, p. 1690-1694.

Brake, J., Hamilton P. B. and Kittrell R. S (2000). Effects of the trichothecene mycotoxin diacetoxyscirpenol on feed consumption, body weight, and oral lesions of broiler breeders. Poultry Science, 79, p. 856-863.

Braunberg, R. C., Barton C. N., Gantt O. O. and Friedman L (1994). Interaction of citrinin and ochratoxin A. Natural Toxins, 2, p. 124-31.

Breton, P., Bizot J. C., Buee J. and De La Manche I (1998). Brain neurotoxicity of penitrem A: electrophysiological, behavioral and histopathological study. Toxicon, 36, p. 645-655.

Byrem, T. M., Booren A. M., Hill G. M., Chu F. S. and Strasburg G. M (1999a). The effect of cyclopiazonic acid on the development of pale, soft, and exudative pork from

46

pigs of defined malignant hyperthermia genotype. Journal Animal Science, 77, p. 166-172.

Byrem, T. M., Pestka J. J., Chu F. S. and Strasburg G. M (1999b). Analysis and pharmacokinetics of cyclopiazonic acid in market weight pigs. Journal Animal Science, 77, p. 173-179.

CAST (Council for Agricultural Science and Technology 2003). Mycotoxins: Risks in plant, animal and human systems. Ames, Iowa, USA. Cleveland, T. E., Dowd P. F., Desjardins A. E., Deepak B. and Cotty P. J (2003). United States Department of Agriculture research on pre-harvest prevention of mycotoxins and mycotoxigenic fungi in US crops. Pest. Man. Sci., 59. p. 629-642.

Cleveland, T. E., Dowd P. F., Desjardins A. E., Deepak B. and Cotty P. J (2003). United States Department of Agriculture research on pre-harvest prevention of mycotoxins and mycotoxigenic fungi in US crops. Pest. Man. Sci., 59. p. 629-642.

Cruz, L. C. H (1995). Caracteriticas Gerais das Micotoxinas e Micotoxicoses. Reflexos na indútria avíola. Simpósio Internacional sobre Micotoxinas e Micotoxicoses em Aves. Anais, Curitiba, PR, p. 1-13.

Cysewski, S. J., Wood R. L., Pier A. C. and Baetz A. L (1978). Effects of aflatoxin on the development of acquired immunity to swine erysipelas. Anim. J. Vet. Res., 39. p. 445-448.

Damoglou, A. P. and Campbell D. S (1986). The effect of pH on the production of patulin in apple juice. Lett. Appl. Microbiol., p. 9-11.

Desjardins, A. E., Plattner R. D., and Proctor R. H (1996). Linkage among genes responsible for fumonisin biosynthesis in Giberella fugikuroi mating population. Appl. Environ. Microbiol., 62. p. 2571-2576.

47

Diaz, G. J. and Boermans, H. J (1994). Fumonisin toxicosis in domestic animals: a review. Veterinary and Human Toxikology, 36, p. 548-55.

D'Mello, J. P. F. and Macdonald, A. M. C (1997). Mycotoxins. Animal Feed Science and Technology, 69, p. 155-166.

Dohnal

V.:

Speciální

toxikologie,

(2007),

21s.

Dostupné

z WWW

http://<www.chemi.muni.cz/-vlasta/TOPOT2007-04osnova.pdf->. Dne 2.2.2009.

Fournout, S., Fairbrother J. M., Verneuil S., Le Bars P., Laffitte J., Le Bars J. and Oswald I. P (2000). Effets d'une intoxication orale par la fumonisine B1 sur la production intestinale de cytokines inflammatoires et la sensibilité des porcelets ŕ l'infection colibacillaire. Journées de la recherche porcine. Journées Rech. Porcine en France, 32. p. 33-37.

Gqaleni, N., Smith J. E., Lavcey J., and Gettinby G (1997). Effects of temperature, water aktivity and incubation time on production of aflatoxins and cyclopiazonic acid by an isolate of Aspergillus flavus in surface agar culture. Appl. Environ. Microbiol., 63, p. 1048-1053. Gqaleni, N., Smith J. E. and Lavcey J (1996). Co-production of aflatoxins and cyclopiazonic acidin isolates of Aspergillus flavus. Food Additives and Contaminants, 13, p. 677-685.

Gorelick N. J (1990). Risk assessment for aflatoxin: I. Metabolism of aflatoxin B1 by different species. Risk Analysis, 10, p. 539-559.

Gouze, M. E. and Oswald I. P (2001). Effets d'une mycotoxine inféodée au maďs, la fumonisine B1, sur les lymphocytes porcins. Journées Rech. Porcine en France, 33, p. 277-281.

Grosjean, F., Taranu I., Skiba F., Callu P. and Oswald I (2002). Comparaison de blés fusariés naturellement ŕ des blés sains dans l'alimentation du porcelet sevré. Journées Rech. Porcine, 34. p. 333-339.

48

Harvey, R. B., Kubena L. F., Elissade M. H., Corrier D. E. and Phillips T. D (1995). Influence of the antibiotics lincomycin and tylosin on aflatoxicosis when added to aflatoxin-contaminated diets of growing swine. J. Vet. Diagn. Invest., 7, p. 374-379.

Henry, M. H. and Watt R. D (1993). A review of fumonisin productin by Fusarium moniliforme and fumonisin toxicosis in animals. J. Appl. Poult. Res., 2. p. 188-192.

Hochsteiner, W., Schuh M., Luger K. and Baumgartner W (2000). Effect of mycotoxin contaminated feed on production parameters of dairy cows. Berliner Münchener Tierärztliche Wochenschrift, 113, p. 14-21.

Illek J.: Mykotoxikózy skotu, Krmivářství, 2007 č. 4, s.12-13. ICMSF (International Commission on Microbiological Specification for Food) 1996. Toxigenic fungi: Aspergillus. In: Microorganisms in Foods 5: Characteristics of Microbial Pathogens. Academic Press, London, p. 347-381.

Jay, J. M (2000). Modern Food Microbiology. An Aspen Publication, Maryland.

Jensen, H. E., Krogh, H. V., and Schonheyder (1991). Bovine mycotixic abortion - a comparative study if diagnostic methods. Journal Veterinary Medicine., B. 38, p. 33-40.

Jímenez, M., Mańez M. and Henandéz E (1996). Influence of water activity and temperature on the production of zearalenone in corn by three Fusarium species. Food Microbiol,. 29. p. 417-421.

KALAČ P., MÍKA V.: Přirozené škodlivé látky v rostlinných krmivech, 1. vyd. Praha: Ústav zemědělských a potravinářských informací, Praha 1997, 317 s.

Kinser, S., Jia Q., Li M., Laughter A., Cornwell P., Corton J. C., Pestka J (2004). Gene expression profiling in spleens of deoxynivalenol-exposed mice:immediate early genes as primary targets. J.Toxicol.Environ.Health, 67(18), p. 1423-1441.

49

Knaus, H. G., McManus O. B., Lee S. H., Schmalhofer W. A., Garcia Calvo M., Helms L. M., Sanchez M., Giangiacomo K., Reuben J. P., Smith A. B (1994). Tremorgenic indole alkaloids potently inhibit smooth muscle high-conductance calcium-activated potassium channels. Biochemistry, 33, p. 5819-5828.

Koehler, P. E., Beuchat L. R., and Chinnan M. S (1985). Influence of temperature and water activity on aflatoxin production by Aspergillus flavus in cowpea seeds and meal. J. Food Prot., 48, p. 1040-1043.

Krabbe, E. L., Penz A. M., Jr., Lazzari F. A, and Reginattov M. F (1994). Efeito da Umidade e do Acido Propiónico sobre as Características Bromatológicas e Microbiológicas de Grķos de Milho. Conferęncia APINCO de Cięncia e Tecnologia Avíola. Anais, Santos, SP, p. 180.

Krogh, P (1978). Causal association of mycotoxin nephropathy. Acta Pathologica et Microbiologica Sandonavia, 269, p. 1-28.

Kuiper-Goodman, T., Scott P. M. and Watanabe H (1987). Risk assessment of the mycotoxin zearalenone. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 7, p. 253-306.

Kummer V., Faldíková L., Herzig I., Lámíková A.: Účinky mykotoxinů na zdraví a reprodukci zvířat, diagnostika a prevence mykotoxikóz, Brno VÚVeL Brno 2001, 43 s.

Lazzari, F. A. (1993). Umidade, fungos e micotoxinas na qualidade de sementes, grķos e raŪıes. UFPR press.

Leeson, S. and Summers J. D (1991). In: Commercial Poultry Nutrition. University Books, Guelph, Ontario, Canada, p. 283.

Lopez Diaz, T. M. and Flannigan B (1997). Production of patulin and cytochalasin E by Aspergillus clavatus during malting of barley and wheat. International Journal Food Mikrobiology, 35, p. 129-136.

50

Luchese, R. H. and Harrigan W. F. (1993). Biosynthesis of aflatoxin - The role of nutritional factors. J. Appl. Bacteriol., 74, p. 5-14.

Mahanti, N., Bhatnagar D., Cary J. W., Joubran J., and Linz. J. E (1996). Structure and function of fas-IA, a gene encoding a putative fatty acid synthetase directly involved in aflatoxin biosynthesis in Aspergillus parasiticus. Appl. Environ. Microbiol., 62, p. 191-195.

Malekinejad, H., Maas-Bakker R. F. and Fink-Gremmels J. F (2004). Bioactivation of zearalenone by porcine hepatic biotransformation. PhD Thesis Utrecht University, Dec. 2004, article in press.

Martins, M. L. and Martins H. M (1999). Natural and in vitro coproduction of cyclopiazonic acid and aflatoxins. Journal Food Protection, 62, p. 292-294.

Marquardt, R. R. and Frohlich, A. A (1992). A review on recent advances in understanding ochratoxicosis. Journal Animal Science, 70, p. 3968-3988.

Marin, D. E., Taranu I., Bunaciu P. R., Pascale F., Tudor D. S., Avram N., Sarca M., Cureu I., Criste R. D., Suta V. and Oswald I. P (2002). Changes in performance, blood parameters, humoral and cellular immune response in weanling piglets exposed to low doses of Aflatoxin. J. Anim. Sci., 80, p. 250-1257.

Massey, T. E., Stewart, R. K., Daniels, J., Liu, L. (1995). Biochemical and molecular aspects of mammalian susceptibility to aflatoxin B1 carcinogenicity. Proceedings Society of. Experimental Biology and Medicíně, 208, p. 231-227.

Mccormick, S. P., Hohn T. M., and Desjardins A. E (1996). Isolation and characterization of tri 3, a gene encoding 15-O-acetyl-transferase from Fusarium sporotrichioides. Appl. Environ. Microbiol., 62, p. 353-359.

McLeay, L. M., Smith B. L. and Munday Finch S. C (1999). Tremorgenic mycotoxins paxilline, penitrem and lolitrem B, the non-tremorgenic 31-epilolitrem B and

51

electromyographic activity of the reticulum and rumen of sheep. Research Veterinary Science, 66, p. 119-127.

Miller, D. M. and Wilson, D. M (1994). Veterinary Diseases related to aflatoxins. in: Eaton, D.L.and Groopman J.D.(eds) The toxicology of aflatoxins., p. 347-364. Academic Press Inc. San Diego-New York.

Miller, D. M., Stuart B. P., Crowell W. A (1981). Experimental aflatoxicosis in swine: morphological and clinical pathological results. Can. J. Comp. Med., 45, p. 343-351.

Miles, C. O., Erasmuson A. F., Wilkins A. L., Towers N. R., Smith B. L., Garthwaite I., Scahill B. G. and Hansen R. P (1996). Ovine metabolism of zearalenone to alphazearalanol (zeranol). J. Agric. Food. Chem., 44, p. 3244-3250.

Mills, J. T., Seifert K. A., Frisvad J. C. and Abramson D (1995). Nephrotoxigenic Penicillium species occurring on farm-stored cereal grains in western Canada. Mycopathologia, 130, p. 23-28.

Muschen, H. and Frank K (1994). Mycotoxins in oilseeds and risks in animal production. In: Moulds, Mycotoxins and Food Preservatives in the Food Industry. Parsippany, New Jersey, BASF Corporation, p. 31-35.

Müller, G., Kielstein P., Rosner H., Berndt A., Heller M. and Kohler H (2000). Beeinflussen Mykotoxine die Immun-und

Abwehrreaktionen des Schweines?

Praktischer Tierarzt, 81, p. 932-940.

Müller, H. M. and Amend R (1997). Formation and disappearance of mycophenolic acid, patulin, penicillic acid and PR toxin in maize silage inoculated with Penicillium roqueforti. Archiv Tierernährung, 50, p. 213-225.

Nelson, P. E., Dignani, M. C., Anaissie, E. J (1994). Taxonomy, biology and clinical aspects of Fusarium species. Clinical Microbiology Reviews, 7, p. 479-504.

52

Niyo, K. A., Richard J. L., Niyo Y. and Tiffany L. H (1988b). Pathologic, hematologic, and serologic changes in rabbits given T-2 mycotoxin orally and exposed to aerosols of Aspergillus fumigatus conidia. Am. J. Vet. Res., 49, p. 2151-2160.

Olsen, M. and Kiessling, K.-H (1983). Species diefferences in zearalenone-reducing activity in subcellular fractions of liver from female domestic animals. Acta Pharmacologica. et Toxicologica., 52, p. 287-291.

Oswald, I.P. and C. Comera. (1998). Immunotoxicity of mycotoxins. Rev. Med. Vet., 149, p. 585-590.

Oswald I. P., Desautels C., Laffitte J., Fournout S., Pérčs S. Y., Odin M., Le Bars P., Le Bars J. and Fairbrother J. M (2003). The mycotoxin, fumonisin B1, increases intestinal colonization by pathogenic Escherichia coli in pigs. Appl. Env. Microbiol., 69: p. 5870-5874.

Osweiler G. D (2000). Mycotoxins. Contemporary issues of snímal health and productive. Vet. Clin. North Am. Food Anom. Pract., 16, p. 511-530.

Panangala, V. S., Giambrone J. J., Diener U. L., Davis N. D., Hoerr F. J., Mitra A., Schultz R. D. and Wilt G. R (1986). Effects of aflatoxin on the growth performance and immune responses of weanling swine. Am. J. Vet. Res., 47, p. 2062-2067.

Pestka, S., Krause C. D., Walter M. R (2004). Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunol Rev., 202, p. 8-32.

Pier, A. C (1992). Major biological consequences of aflatoxicosis in animal production. J. Anim. Sci., 70, p. 3964-3967.

Pitt, J. I (1997). Toxigenic Penicillium species. In: Food Microbiology, Fundamentals and Frontiers (Doyle M. P., Beuchat L. R., and Montville T. J., eds). ASM Press,Washington, DC, p. 406-418.

53

Placinta, C. M., D'mello J. P. F.

and Macdonald A. M. C (1999). A review of

worldwide contamination of cereal grains and animal feed with Fusarium mycotoxins. Anim. Feed Sci. Tech., 78, p. 21-37.

Puzzi, D. (1986). Abastecimento e armazenagem de grķos. Campinas, Instituto Campineiro de Ensino Agriola., p. 603.

Qasem, S. A. and Christensen M. (1958). Influence of moisture content, temperature and time on the deterioration of stored corn by fungi. Phytopath., 48, p. 544-549.

Richard, J. L., Dvorak, T. J., Ross, P. F (1996). Natural occurrence of gliotoxin in turkeys infected with Aspergillus fumigatus. Fresenius. Mycopathologica, 134, p. 167-170.

Richard, J., Thurston J. R. and Pier A.C (1978). Effect of mycotoxins on immunity. In: Toxins: animal, plants and microbial (P. Rosenberdg, ed) Pergamon press, New York, p. 801-817.

Riley, R. T., Wang, E., Schroeder, J. J., Smith, E. R., Plattner, R. D., Abbas, H., Yoo, H-S., Merrill, A. H (1996). Evidence for disruption of sphingolipid metabolism as a contributing factor in the toxicity and carcinogenicity of fumonisins. Natural Toxins, 4, p. 3-15.

Rotter, B. A., Prelusky D. B. and Pestka J. J (1996). Toxicology of deoxynivalenol (vomitoxin). Journal Toxicology Environmental Health, 48, p. 1-34.

Shephard, G. S., Thiel, P. G. Stockenstrom, S. and Sydenham E. W (1996). Worldwide survey of fumonisin contamination of corn and corn-based products. J. Assoc. Off. Anal. Chem. Intl., 79, p. 671-687.

Sher, A., Gazzinelli R. T., Oswald I. P., Clerici M., Kulberg M., Pearce E. J., Berzofsky J. A., Mosmann T. R., James S. L., Morse H. C. and Shearer G. M (1992). Role of

54

T-cell derived cytokines in the down regulation of immune responses in parasitic and retroviral infection. Immunological Rev., 127, p. 183-204.

Shier, W. T. (1998). Estrogenic mycotoxins. Revue Med. Vet., 149, p. 599-604.

Silvotti, L., Di Lecce R., Bonomi A., Borghetti P., Perillo A., Piedimonte G., Corradi A. and Cabassi E (1995). In vitro responses of macrophages and lymphocytes of pigs fed with aflatoxin B1 and G1. Eur. J. Vet. Pathol., 1, p. 117-121.

Silvotti, L., Petterino C., Bonomi A. and Cabassi E (1997). Immunotoxicological effects on piglets of feeding sows diets containing aflatoxins. Vet. Rec., 141, p. 469-472.

Smith T. K (1992). Recent advances in the understanding of Fusarium trichothecene mycotoxicosis. Journal Animal Science, 70, p. 3989-3993.

Smith, J. E., Solomons, G., Lewis, C., Anderson, J. G (1995). Role of mycotoxins in human and animal nutrition and health. Natural Toxins 3, p. 187-192 and 221.

Smith, G. W., Constable P. D., Eppley R. M., Tumbleson M. E., Gumprecht L. A. and Haschek Hock W. M (2000). Purified fumonisin B1 decreases cardiovascular function but does not alter pulmonary capillary permeability in swine. Toxicology Science, 56, p. 240-249.

Suchý P, Herzig I; Plísně a mykotoxiny, Prevence jejich vzniku a dekontaminace v krmivech.

Vědecký

výbor

výživy

zvířat,

25s.

Dostupná

z WWW:<

http://www.vuzv.cz/old/vyziva/studie14.rtf:> Dne 25.1.2009.

Steyn, P. S. and Vleggaar R (1985). Tremorgenic mycotoxins. Fortschritte in der Chemie und Organischen Naturkunde, 48, p. 1-80.

Stoev, S. D., Goundasheva D., Mirtcheva T. and Mantle P. G (2000). Susceptibility to secondary bacterial infections in growing pigs as an early response in ochratoxicosis. Exp. Toxicol. Pathol., 52, p. 287-296.

55

Swamy, H. V. L. N., Smith T. K., MacDonald E. J., Boermans H. J. and Squires E. J (2002). Effects of feeding a blend of grains naturally contaminated with Fusarium mycotoxins on swine performance, brain regional neurochemistry, and serum chemistry and the efficacy of a polymeric glucomannan mycotoxin adsorbent. J. Anim. Sci., 80, p. 3257-3267.

Sweeney, M. J. and Dobson A. D (1998). Mycotoxin production by Aspergillus, Fusarium and Penicillium species. International Journal Food Mikrobiology, 43, p. 141-158.

Šilhánková L (1995) Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Victoria Publishing, Praha 1995. 361s.

Tai, J. H. and Pestka J. J (1988). Impaired murine resistance to Salmonella typhimurium following oral exposure to the trichothecene T-2 toxin. Food Chem. Toxicol., 26, p. 691-698.

Taranu, I., Marin D. E., Pascale F., Habean M., Heban V., Bailly J. D and Oswald I. P (2003). Effet d'une mycotoxine, la Fumonisine B1, sur la réponse immunitaire vaccinale chez le porcelet. Journées Rech. Porcine, 35, p. 451-458.

Tuite, J (1994). Epidemiology of moulds in grain. In: Moulds, Mycotoxins and Food Preservatives in the Food Industry. Parsippany, New Jersey, BASF Corporation, p. 5-8.

Van Heughten, E., Spears J. W., Coffey M. T., Kegley E. B. and Qureshi M. A (1994). The effect of methionine and aflatoxin on immune function in weanling pigs. J. Anim. Sci., 72, p. 658-664.

Vidal, D. R (1990). Propriétés immunosuppressives des mycotoxines du groupe des trichothéccnes. Bull. Inst. Pasteur., 88, p. 159-192.

56

Warner, R. L., Brooks K. and Pestka J. J (1994). In vitro effects of vomitoxin (deoxynivalenol) on T-cell interleukin production and IgA secretion. Food Chem. Toxicol., 32, p. 617-625.

Wheler, K. A., Hurdman B. F. and Pitt J. I (1991). Influence of pH on the growth of some toxigenic species of Aspergillus, Penicillium and Fusarium. Int. J. Food Microbiol., 55, p. 86-90.

WHO/FAO (World Health Organization/Food and Agriculture Organization) 2001. Ochratoxin A. In: "Safety Evaluation of Certain Mycotoxins in Food. Prepared by the Fifty-sixth meeting of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA)". WHO Food Additives series 47; FAO Food and Nutrition Paper 74, Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, Italy p. 281-415.

Wu, W., Cook M. E., Chu F. S., Buttles T., Hunger J. and Sutherland P (1997). Case study of bovine dermatitis caused by oat straw infected with Fusarium sporotrichioides. Veterinary Rekord, 140, p. 399-400.

Yan D., Zhou H. R., Brooks K. H., Pestka J. J (1997). Potential role for IL-5 and IL-6 in enhanced IgA secretion by Peyer's patch cells isolated from mice acutely exposed to vomitoxin. Toxikology, 122, p. 145-158.

57

6. PŘÍLOHY Tabulky

1-5

Obrázky

1-5

58

Tabulka č. 1: Nejčastěji se vyskytující mykotoxiny v krmivech (Feed International, 1996, may, p. 18)

Krmivo

Mykotoxin

Ječmen

Aflatoxin, DON, NIV, T-2 toxin, DAS, Zearalenon, Ochratoxin A, Sterigmatocystin, Citrinin, Viomellein, Zanthomegnin, Vioxanthin

Kukuřice

Aflatoxin, Zearalenon, DON, T-2 toxin, DAS, NIV, Butenolid, Moniliformin, Fumonisin, Kyselina secalonová, Citrioviridin

Oves

Aflatoxin, DON, T-2 toxin, NS, HT-2, Zearalenon, Ochratoxin A, Citrinin

Pšenice

Aflatoxin, DON, NIV, Zearalenon, Ochratoxin A, Sterigmatocystin, Citrinin, Ergot alkaloidy, Viomellein, Zanthomegnin, Vioxanthin

Soja

Aflatoxin

Tapioka

Aflatoxin, Zearalenon

Žito

Aflatoxin, DON, NIV, Zearalenon, Ochratoxin A, Citrinin, Ergot alkaloidy

Bavlníkový

ex. Aflatoxin

šrot Podzemnicový ex. Aflatoxin, Kyselina cyklopiazonová, Ochratoxin A, Citrinin, Zearalenon, šrot

Verruculotoxin

Sojový ex. šrot

Aflatoxin

Kukuřičné siláže

Patulin

Vojtěška

Aflatoxin, Zearalenon

konzervovaná Pšeničná sláma

Safratoxiny, Roridiny

Vysvětlení zkratek: DON – deoxynivalenol

NIV – nivalenol

DAS – diacetoxyscirpenol

NS – neosalaniol

Produkci mykotoxinů ovlivňuje: • teplota, vlhkost, alkalita. • přítomnost určitých stopových prvků (snižují výskyt hub). • přítomnost uhlíkatých a dusikatých sloučenin v dávce nebo v atmosféře.

59

Tabulka č. 2: Citlivost některých druhů zvířat na mykotoxiny (Devegonwda a kol., 1999)

Mykotoxin

Dojnice

Prasata

Koně

Drůbež

Aflatoxiny

+

+

+

++

Fumonisiny

+

+

++

+

Ochratoxiny

-

+

+

+

T-2 toxin

+

-

+

+

Deoxynivalenol

+

++

+

+

Zearalenon

+

++

+

+

- rezistence, + nižsí citlivost, ++ vyšší citlivost

Tabulka č. 3: Toxické koncentrace některých mykotoxinů v krmivech (Mabbett, 1999)

Aflatoxiny Fumonisiny

200 – 500 µg/kg 5 mg/kg pro nepřežvýkavce 100 mg/kg pro přežvykavce

Deoxynivalenol

2 – 10 mg/kg

T-2 toxin

100 µg/kg

Zearalenon

200 – 300 µg/kg

60

Tabulka č. 4. Účinky aflatoxinu B1 na prasata

Literatura

Účinky

Vystavení selat působení aflatoxinu in utero (v děloze) (skrze Silvotti et al., 1997 vystavení prasnic jeho působení) inhibovalo bakteriocidní oxidační rozvoj makrofágů derivovaných z monocytů. U selat prasnic, jimž byl podáván aflatoxin, byly rovněž inhibovány funkce neutrofilů, včetně motility a chemotaxe. Nízké dávky aflatoxinu (140 a 280 ppb) snížily prozánětlivou Marin et al., 2002 (IL-1 , TNF- ) a zvýšily protizánětlivou expresi cytokinové mRNA krvinkami stimulovanými PHA. In vitro vystavení alveolárních makrofágů prasnic snížilo Liu et al., 2002 životnost buněčných kultur a omezilo schopnost fagocytózy. Vyvolalo expresi proteinu tepelného šoku (72) souvisejícího s apoptózou.

61

Tabulka č. 5. Třídění a obecná charakteristika mykotoxikóz u hospodářských zvířat (Radostis a kol.,1997) Mykotoxin

Aflatoxiny

Plíseň

Aspergillus flavus a další

Onemocnění

aflatoxikóza

1. otrava citrininem

Citrinin

Ergotamin

Penicillinium citrinum a další

Claviceps purpurea

Paspalitremy

Patogeneze

urémie, deprese, poléhávání

občasná slepota,hypers 2. Ergotismus ensitivita (nervový) následovaná křečem těla

mozková ataxie

Druh zvířete

Substrát

slepota, chůze skladované hepatóza, jaterní dokola, křeče, obilí, mleté insuficience, prasata, ovce, pěna u tlamy, ořechy, arašídy, degenerace skot plesnivý chleba, úhyn během nervové tkáně 48 hodin plodiny na poli nefróza, často kombinace s Aspergillius ochraceus

exudativní 2. dermatitida se pyrexiepruritus- svěděním, neznámá hemoragický horečka, syndrom hemoragie sliznic kulhání, gangréna spasmus cév distálních částí způsobuje 1. končetin, nedostatečné ergotismusvask ocasu, špiček prokrvení ulární) uší, postižených neschopnost částí těla pohybovat ocasem

3. hypertermie

Claviceps paspali

Klinické příznaky

spasmus cév vyvolává snížené prokrvení mozku

hypertermie, snížené salivace, zásobování kůže poruchy krví snižuje dýchání výdej tepla poruchy koordinace pohybů

62

neznámá

prasata

skladované obili

skot mléčného typu

siláž

všechny druhy, ale běžné jen u skotu

skladované obilí, neposekaná tráva na pastvinách

skot

skladované obilí, neposekaná tráva na pastvinách

skot

skladované obilí, tráva na pastvinách

skot, ovce, koně

tráva na pastvinách napadená Paspalum ssp.

Ergovalin

snížení mléčné užitkovosti snížení nebo přírůstku, koncentrace 1.letní toxikóza hypertermie,hy prolaktinu v persalivace, krvi vyhledávání stínu Acremonium ztráta coenophialum pohyblivosti lokální ocasu,gangrén vazokonstrikce a distálních způsobuje kostřavová noha částí zhoršení končetin,špiče prokrvení k uší,konce končetin ocasu

Lolitremy

Acremonium lolii

Ochratoxiny

Aspergillus ochraceus

skot

nepokosené pastviny a semeno kostřavy

skot

nepokosené pastviny a semeno kostřavy

nervové poruchy při zneklidnění koordinace výrazná ztráta poruchy bez neposečená pastvina s vyvolávané koordinace,pa histologických všechny druhy zkrmováním dání,hypersenz změn nervové lolium perenne jílku itivita tkáně

nefropatie

průjem, žíznivost, polyurie

Phomposin

Phomopsis leptostromifo rmis, P.rossiana

lupinóza

žlotenka, u deprese, polehávání, fotosenzitivní dermatitida

Slaframin

Rhizoctonia leguminicola

slaframinová toxikóza

slzení, průjem, časté močení, hypersalivace

neznámá

skot

nepokosené pastviny (vojtěška, červený jetel)

obličejový ekzém

fotosenzitivní dermatitida, konjuktivida, stomatitida, nete-čnost, nechutenství, žloutenka

hepatitida, záněty a hyperplazie žlučovodů

nejvíce ovce a skot

podestýlka, převážně jílek

Sporidesmin

Pithomyces chartarum

nefróza, všechny druhy, skladované obilí imunosuprese zjm. prasata

hepatóza, myopatie kosterního svalstva

všechny druhy, plíseň na zjm. mokrém strništi přežvýkavci polupině

hypersenzitivit a, nekoordinovaná funkční nervová všechny druhy, nepokosené chůze, padání poruch zejména skot pastviny při hnaní nebo vyplašení horečka, průjem, nekrot. vředy a Makrocyklické agranulocytóza, hemoragie trichotheceny Stachybotrys stachybotryotox ústní a nosní suprese kostní plíseň na senu a všechny druhy (satratoxin, dřeně, atra ikóza sliznice, výtok slámě verrucarin, a krvácení z imunosuprese roridin) nosu, dermatitida v okolí očí a úst Penicillinium Nespecifikovan spp., Aspergillius é tremorgeny spp.

63

Nemakrocyklic ké trichotheceny (T-2 toxin, deoxynivalenol, diacetoxyscirpe nol

Zearalenon

zvracení, Fusarium odmítání sporotrichoid krmiva, imunosuprese, es, F.roseum, průjem, vředy hemarogický fuzariotoxikóza všechny druhy skladované obilí zánět střev, F culmorum, a hemoragie F.graminearu na sliznicích, ovarální cysty m poruchy reprodukce

Fusarium roseum, F.culmorum, Giberella zeae a další

estrogenní syndrom

poruchy plodnosti samců, anestrie, aborty, hyperestogeniza neonatální ce mortalita, zduření vulvy, vaginy a mléčné žlázy, výhřez rekta

64

prasata, skot

plesnivá kukuřice nebo ječmen

Obrázek 1. Rektální vyhřeznutí příznačné pro toxicitu vyvolanou zearalenonem (Swarmy)

65

Obrázek č. 2. Výsledek nesprávného skladovaní pšenice – postižena mykotoxinem (D. Tančinová).

66

Obrázek č. 3. Infikované zrno kukuřice - napadené mykotoxiny (E. Razzazi-Fazeli, Böhm C., Cichna-Markl M., Brenn-Struckhofova Z.).

67

Obrázek č. 4. Burské ořechy postiženy aflatoxinem (R. Chrom)

68

Obrázek č. 5. Postižena prasata zearalenon - anestrie, aborty, neonatální mortalita, zduření vulvy, vaginy a mléčné žlázy, výhřez errekta. (www.zoohraninvest.com/Mycoabsorb.htm)

69