Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin
Kultivační metody v mikrobiologii potravin Bakalářská práce
Vedoucí práce:
Vypracovala:
Ing. Jaroslav Záhora, CSc.
Gabriela Hastíková
Brno 2008
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Kultivační metody v mikrobiologii potravin vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana AF MZLU v Brně.
dne...................................................... podpis ................................................
Poděkování Děkuji vedoucímu mé bakalářské práce, Ing. Jaroslavu Záhorovi CSc. za odborné rady a vedení, dále Ing. Blance Kvasničkové za její čas a ochotu nejen při zpracování praktické části a rodině za podporu a trpělivost během studia.
ABSTRAKT Následky otravy jídlem způsobené požitím kontaminovanované potraviny mohou být obrovské. To je hlavní důvod proč je hygienický dohled tak extrémně důležitý pro bezpečnou výrobu potravin. Klasické mikrobiologické metody zaberou minimálně čtyři až sedm dní než se prokáže přítomnost zjišťovaných mikroorganismů. Pro získání rychlejšího výsledku jsou neustále vyvíjeny alternativní moderní metody. Tato práce se zabývá popisem jak klasických, tak moderních kultivačních metod využívaných v mikrobiologii potravin především k detekci patogenních mikroorganismů. Praktický pokus je založen na zjišťování vlivu různých teplot kultivačních půd na kultivaci mikroorganismů. Pokus byl prováděn na vzorcích zeleninových šťáv. Ze zjištěných údajů jednoznačně vyplývá, že vývoj nových mikrobiologických technik na zjišťování mikroorganismu jde velmi rychle kupředu, jelikož jsou kladeny stále větší nároky na kvalitu, nezávadnost a hygienický standard potravin.
Klíčová slova: kultivace, mikroorganismy, kontaminace, zeleninové šťávy, potraviny
ABSTRACT The consequences of food poisoning caused by the consumption of contaminated food can be dangerous. That is why hygiene monitoring is such an extremely important component of safe food production. Classical microbiological methods requiresminimum of 4 to 7 days to detect the presence of micro-organism. For faster results, alternative methods are being developed and continously improved. This work is about classical and modern microbiology methods used in food microbiology mainly for improving pathogenic microbs. Practical experiment is about probe a differences of using different temperatures of culture media. For this experiment we used vegetable juices. We found out that developing of new modern microbiological methods has been going very quick beacause we still have bigger requirements on good quality and hygienic standard of food.
Keywords: cultivation, microorganisms, contamination, vegetable juices, foodstuff
OBSAH 1 ÚVOD 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Mikrobiální kontaminace potravin 2.1.1 Rekontaminace potravin patogenními mikroorganismy 2.2 Kažení potravin působením mikroorganismů 2.2.1 Faktory ovlivňující mikrobiální kažení potravin 2.3 Identifikace mikroorganismů důležitých v potravinářství 2.3.1 Bakterie 2.3.1.1 Výskyt a význam bakterií 2.3.1.2 Bakterie účastnící se na kažení potravin 2.3.2 Kvasinky 2.3.2.1Výskyt a význam kvasinek 2.3.3 Plísně 2.3.3.1 Výskyt a význam plísní 2.3.3.2 Kvasinky a plísně účastnící se na kažení potravin 2.4 Charakteristika metod využívaných v mikrobiologii potravin 2.4.1 Klasické kultivační metody 2.4.1.1 Kvalitativní metody 2.4.1.2 Kvantitativní metody 2.4.2 Rychlé metody 2.5 Postup při stanovení mikroorganismů v potravinách 2.5.1 Odběr vzorků potravin pro rozbor v laboratoři 2.5.2 Kultivační média pro mikrobiologické zkoušky 2.5.3 Inkubace vzorku 2.5.4 Růst bakterií na živných půdách a jeho hodnocení 2.5.4.1 Růst v tekutých půdách 2.5.4.2 Charakter růstu na šikmém agaru 2.5.4.3 Charakter růstu podél vpichu do agarové půdy 2.5.5 Identifikace mikroorganismů pomocí kultivačních metod 2.5.6 Patogenní mikroorganismy vyvolávající alimetární onemocnění 2.6 Moderní kultivační metody 3 CÍLE PRÁCE 4 METODIKA 4.1 Analyzovaný materiál 4.1.1 Normy pro stanovení jednotlivých skupin mikroorganismů 4.1.2 Příprava vzorků a ředění 4.2 Příprava kultivačních půd 4.2.1 Složení a příprava použitých půd 4.3 Inkubace a určení počtu kolonií 5 VÝSLEDKY A DISKUZE 6 ZÁVĚR 7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY 8 PŘÍLOHY
5 7 7 8 9 10 11 11 11 12 14 14 15 16 16 17 17 17 19 19 20 20 21 22 23 24 24 25 25 26 26 27 28 28 28 28 29 29 29 33 35 36 37
1.
ÚVOD V současné době, kdy je ve vyspělých zemích nejen dostatek potravin, ale tyto
jsou k mání v nesmírně širokém sortimentu, tvrdé konkurenční prostředí tlačí na výrobce potravin, aby zvyšovali jakost svých výrobků. Informovanost spotřebitelů stále roste a s tím i jejich požadavky na potraviny. Už nestačí, aby potravina pouze nasytila. Od „jakostní potraviny“ je požadováno, aby splňovala celou škálu dalších funkcí (požadavky týkající se senzoriky, výživové hodnoty, způsobu a velikosti balení, trvanlivosti, aj.), aby byla dostupná v každé době, na každém místě a za atraktivní cenu a aby označování a propagace byly v souladu se skutečností. Za naprostou samozřejmost považuje spotřebitel zdravotní nezávadnost potravinářských výrobků a vyžaduje v tomto směru od výrobců a od státu určité záruky. Výrobci samozřejmě mají povinnost ručit za to, že jejich výrobky jsou zdravotně nezávadné. Spotřebiteli však nestačí vědomí, že poškodí-li potravina jeho zdraví (a spotřebiteli se podaří prokázat, která potravina to způsobila), bude výrobce potrestán. Za účelem větší bezpečnosti spotřebitelů každý vyspělý stát stále zpřísňuje legislativu a má zorganizován systém dozoru nad potravinami. Zdravotní nezávadnost („bezpečnost“) potravin a její protiklad (rizikovost) je v současné době jedním z hlavních problémů potravinářské výroby. Bezpečné jsou potraviny, které neobsahují patogenní nebo podmíněně patogenní organismy ani cizorodé, zdraví škodlivé nebo toxické látky. K zabezpečení potravin před těmito škodlivými faktory je zapotřebí rozsáhlý systém preventivních opatření, který začíná v prvovýrobě, probíhá přes výrobu a distribuční síť až do podniků společného stravování a domácností spotřebitele. Mikrobiologické metody k průkazu patogenních mikroorganismů v potravinách jsou pouze jednou z komponent systému preventivních opatření, avšak klíčovou, protože jedině jejich pomocí lze přítomnost patogenních mikroorganismů v potravině nebo v prostředí zjistit: proto verifikují činnost všech ostatních opatření. Jsou však i jednou z limitujících složek systému prevence, vzhledem k jejich vlastním omezeným možnostem detekce. Tato omezení mohou být způsobena nepravidelným rozdělením mikroorganismů v mnoha typech potravin, přítomností mikroorganismů poškozených manipulacemi s potravinami nebo technologickými procesy při výrobě potravin a konečně trváním rozboru, tj. časem potřebným k získání výsledků.
Samozřejmě existují ještě další důvody, proč patogenní mikroorganismy mohou být přítomny i v mikrobiologicky kontrolovaných potravinách, ty však nesouvisejí bezprostředně s omezeními, která vyplývají z metod samotných. Jediný způsob, jak získat absolutní jistotu, že potravina neobsahuje patogenní mikroorganismy, by byl zkoušet všechny produkty bezprostředně před konzumací. To ovšem není možné, vyšetření je třeba omezit na reálnou část produktu. Proto byly vypracovány přejímací plány, které umožňují statisticky odhadnout reprezentativnost počtu odebraných vzorků pro pravděpodobnost záchytu patogenů ve vzorku. Vychází se z předpokladu rovnoměrného rozdělení zjišťovaných mikroorganismů ve výrobku, avšak i v tomto případě závisí pravděpodobnost záchytu patogenů mj. od poměru objemu analyzovaných vzorků k objemu kontrolované dávky. Existuje určité riziko falešně negativních výsledků, které se zvyšuje i nerovnoměrným rozložením mikroorganismů ve výrobku, jenž je pro mnohé potravinářské suroviny i výrobky charakteristické. Vyšetřovaná potravina pak obsahuje patogenní mikroorganismy, ačkoli výsledky rozboru byly negativní. Jiný koncept kontroly patogenů v potravinách spočívá v zavedení systému HACCP, který slouží k vytváření podmínek pro dobrou výrobní praxi pomocí kritických kontrolních bodů (CCP). Znalost kritických bodů jednak umožňuje zavést opatření k odstranění rizika kontaminace, jednak je možno ještě zabránit kontaminaci finálního výrobku, pokud došlo ke kontaminaci už během výrobního procesu. (Jičínská, Havlová, 1996). V posledních letech se používají k průkazu patogenních mikrobů v potravinách a ve výrobním prostředí tři typy metod: klasické kultivační metody, rychlé metody a epidemiologické metody. Tyto tři kategorie metod se používají k různým účelům a v různých situacích, takže se metody z různých kategorií vzájemně nezastupují, nýbrž doplňují.
2.
LITERÁRNÍ PŘEHLED
2.1
Mikrobiální kontaminace potravin Kontaminace znamená výskyt jakýchkoliv nežádoucích nebo škodlivých částic
v potravině nebo v prostředí určeném ke zpracování potravin. Potraviny mohou být kontaminovány už před dodáním do organizace nebo v organizaci následkem špatných hygienických postupů (Sprenger, 2003). Mikroorganismy asociované s potravinami je možno v prvním přiblížení zjednodušeně rozdělit do dvou skupin: •
mikroorganismy způsobující kažení potravin;
•
mikroorganismy vyvolávající alimentární onemocnění. Hygienicky a zdravotně významné mikroorganismy lze v daném kontextu
detailněji rozdělit na následující skupiny. 1. Patogenní mikroorganismy vyvolávají v makroorganismu (člověk, zvíře) téměř vždy onemocnění (Shigella). 2. Podmíněně patogenní mikroorganismy vyvolávají onemocnění jen za určitých podmínek. Např. při oslabení organismu nebo u citlivějších jedinců. Příkladem je onemocnění vyvolané druhem Escheria coli u kojenců. 3. Toxinogenní mikroorganismy, které mohou vyvolat onemocnění působením toxinů produkovaných mikrobiální buňkou. 4. Indikátorové mikroorganismy, jejichž přítomnost v potravinách signalizuje hygienické nedostatky při jejich výrobě. Např. koliformní mikroorganismy indikují fekální znečištění produktu, přítomnost enterokoků může signalizovat nedodržení předepsané teploty při tepelném ošetření dané potraviny. 5. Hnilobné bakterie rozkládají bílkoviny na zapáchající produkty, jako je např. sirovodík, indol, některé aminy (Proteus). 6. Slizotvorné mikroorganismy způsobující slizovatění původně pevných potravin (Alcaligenes viscolactis) (Komprda, 2004). Bakteriální kontaminace je nejvýznamnější, neboť často končí zničením značného množství potravin a neakceptovaletelným počtem alimentárních nákaz. Zdroje bakterií způsobujících otravu z potravin v potravinářských provozech jsou následující: •
pracovníci a návštěvy.
•
syrové potraviny jako drůbež, maso, vejce, mléko, ryby, měkkýši, korýši a voda pokud je kontaminovaná splašky nebo zvířecími výkaly. Zelenina a ovoce mohou být kontaminovány hnojem nebo znečištěnou vodou, která se používala k jejich zavlažování.
•
hmyz, hlodavci, ptáci.
•
vnější prostředí (půda, prach). Někdy dochází k přenosu škodlivých bakterií přímo ze zdroje na vysoce rizikové
potraviny. Bakterie se vzhledem k tomu, že jsou obvykle nehybné a zdroje se nedostávají do přímého kontaktu s potravinou, spoléhají na jiné způsoby, jež jim umožní transfer k potravině. Tyto jiné způsoby jsou známy jako tzv. vehikula a hlavní z nich jsou: •
ruce.
•
oblečení a zařízení.
•
povrchy přicházející do kontaktu s rukama.
•
povrchy přicházející do kontaktu s potravinou (Sprenger, 2003).
2.1.1 Rekontaminace potravin patogenními mikroorganismy Rekontaminace je přenos patogenních mikrobů z kontaminovaných potravin (většinou syrových) na jiné potraviny, a to buď přímo, nebo nepřímo. Je to nejčastější příčina alimentárních otrav, kterým však lze snadno zabránit. Patogenní mikroorganismy se mohou vyskytovat prakticky všude, tedy i na syrových potravinách, které musí být tepelně zpracovány, např. na mase, drůbeži, vejcích a zelenině. Při řádném tepelném ošetření dojde k inaktivaci nežádoucích mikrobů, takže tyto potraviny pak nepředstavují žádný problém. Nebezpečí rekontaminace však představuje přímý styk syrových potravin s potravinami určenými k přímé spotřebě, jako jsou sýry, obložené chlebíčky apod. K rekontaminaci může například docházet v chladničce, jestliže šťáva ze syrového masa nebo drůbeže odkapává na hotové pokrmy uložené níže. Existuje však mnohem více možností rekontaminace. Neumyté ruce, utěrky, prkénka na krájení nebo kuchyňské nádobí, které přišlo do styku se syrovými potravinami, představují značné riziko. Naštěstí jsou však k dispozici jednoduchá
opatření
k zabránění
rekontaminace
(http://www.eufic.org/article/cs/food-safety-
quality/food-contaminants/artid/rekontaminace-potravin-patogennimimikroorganismu/).
2.2
Kažení potravin působením mikroorganismů Kažení obvykle začíná působením aerobních a fakultativně anaerobních
mikroorganismů a fakultativních anaerobů. Když se spotřebuje kyslík, začnou svou činnost anaerobní organismy. Plísně a kvasinky mají tendenci ovlivnit kažení potravin teprve tehdy, když nejsou vhodné podmínky pro růst bakterií. Známky kažení potravin se projeví změnou barvy, změnou pachu a chuti, objeví se sliz a změny ve struktuře potraviny (Sprenger, 2003). Potraviny mají aktivní enzymatické systémy způsobující ustavičné změny složení potravin. Změny mohou nastat nejen v chemických a fyzikálně chemických, ale i v biologických, výživových a smyslových vlastnostech. Rozsah a druh reakcí, které probíhají během skladování a zpracování potravin závisí na dané potravině (jejím chemickém složení) a na podmínkách během zpracování působením fyzikálních faktorů (teplo, mechanické poškození, vlhkost, světlo, vzdušný kyslík aj.), chemických činidel a mikroorganismů. Nepříznivým důsledkem bývá: - snížení výživové hodnoty potraviny - snížení senzorické hodnoty potraviny - některé reakce mohou negativně ovlivňovat i hygienicko-toxikologickou hodnotu potravin, neboť vznikají produkty s nežádoucím biologickým účinkem (Vítová, 2004). Kažení potravin je možno definovat jako jakoukoli změnu, která způsobí, že daný produkt je nepřijatelný pro lidskou spotřebu. Zhodnocení stupně kažení potraviny je vždy, přímo nebo nepřímo, vztaženo k senzorickému posouzení. Tento postup je ovšem subjektivní a správné a statisticky vyhodnotitelné senzorické zhodnocení je vždy dosti nákladné. Biochemická nebo mikrobiologická analýza je objektivnější a méně nákladná. Význam kažení potravin je zřejmý ze skutečnosti, že pouze vlivem samotné mikrobiální aktivity je zničena čtvrtina celkové světové produkce potravin.
Je nutné si uvědomit, že kažení potravin je komplexní proces, na kterém se účastní nejen mikrobiální, ale též biochemické aktivity samotného substrátu (potraviny) (Komprda, 2004).
2.2.1
Faktory ovlivňující mikrobiální kažení potravin Kažení potraviny je výsledkem mikrobiální aktivity mnoha různých druhů
mikroorganismů. Růst a množení těchto mikroorganismů, a tedy konečná zkáza potraviny, závisí dále na vnitřních charakteristikách potraviny a způsobu jejího zpracování a skladování. Tyto různé parametry se vzájemně ovlivňují a celkový důsledek jejich kombinovaného působení je zpravidla vždy vyšší, než výsledek působení každého z jednotlivých parametrů. (Komprda, 2004) Faktory, které mohou ovlivnit kažení potravin, jsou tedy následující. 1. Vnitřní charakteristiky produktu (potraviny). Sem patří fyzikální vlastnosti a chemická struktura potraviny: -
aktivita vody;
-
koncentrace vodíkových iontů (pH);
-
redox potenciál;
-
dostupnost jednotlivých živin pro různé druhy mikroorganismů;
-
přítomnost přirozených antimikrobních látek v potravině
2. Způsoby zpracování a konzervace potravin. Různé fyzikální, resp. chemické způsoby ošetření potravin mají za následek změny ve výše uvedených vnitřních charakteristikách potravin. Tím je samozřejmě následně ovlivněna asociovaná mikroflóra. 3. Vnější parametry jsou faktory prostředí, ve kterém je potravina skladována: -
teplota;
-
vlhkost;
-
složení atmosféry: O2, N2, CO2;
-
přístup světla;
-
obalový materiál.
4. Jako tzv. implicitní parametry jsou označovány faktory vzájemného ovlivňování asociovaných mikroorganismů. Toto ovlivňování může být buď synergické (zesilující účinek souhlasně orientovaného působení), nebo antagonické (protikladné působení). Synergické ovlivňování se projevuje:
a) produkcí nebo zvýšením dostupnosti esenciálních živin působením určité skupiny
mikroorganismů,
což
následně
umožní
rozvoj
jiných
mikroorganismů, které by jinak nebyly schopny růstu; b) změnou hodnot pH, redox potenciálu, resp. vodní aktivity (působením některých
mikroorganismů),
čímž
je
umožněn
rozvoj
těch
mikroorganismů, které jsou méně tolerantní k extrémnějším hodnotám uvedených parametrů. Antagonické procesy zahrnují kompetici o esenciální živiny, změny hodnot pH nebo redox potenciálu, resp. tvorbu antimikrobních látek (např. bakteriocinů), což může negativně ovlivnit přežívání nebo růst jiných skupin mikroorganismů. 5. Další
důležitý
fenomén
zasluhující
pozornost
při
ochraně
potravin
před mikrobiálním kažením je homeostáza daného mikroorganismu. Při narušení homeostázy (vnitřní rovnováhy) mikroorganismu, např. konzervačním postupem, se mikroorganismus nemůže množit, setrvává v lag-fázi nebo dokonce hyne, dokud tuto homeostázu neobnoví (Komprda, 2004).
2.2
Identifikace mikroorganismů důležitých v potravinářství
V běžné praxi jsou v kvalitativním mikrobiologickém rozboru potravin důležité jen mikroorganismy, které se rozhodující mírou podílejí na kažení potravin a surovin a mikroorganismy důležité z hlediska zdravotní nezávadnosti potravin (Betina, 1988).
2.2.1
Bakterie Při identifikaci bakterií se určují základní morfologické, kultivační, fyziologické,
biochemické a jiné vlastnosti určité kultury. Na základě zjištěných vlastností se bakterie zařaďuje – klasifikuje se do příslušného rodu a druhu. Při identifikaci se musí vycházet z čisté kultury, pro kterou je nutné znát její základní požadavky na výživu a kultivaci (např. druh a konzistenci média, pH, vztah ke kyslíku, optimální teplotu kultivace) (Betina, 1988).
2.2.1.1
Výskyt a význam bakterií Činnost nežádoucích bakterií má v potravinářském i kvasném průmyslu
mimořádně vysoký negativní dopad. Je to způsobeno především jejich obrovskou rychlostí rozmnožování a intenzitou metabolismu, která jim umožňuje za vhodného pH, teploty a dostatečného množství vody rozložit, a tedy úplně znehodnotit značné množství substrátu (Šilhánková, 1995). Bakterie jsou ale také mikroorganismy s pozitivní rolí jako výrobní prostředky při výrobě fermentovaných potravin, mikroorganismy s negativním účinkem při kažení potravin (nežádoucí kvašení, plesnivění, hnití), přitom mohou vznikat látky ohrožující zdraví člověka. Zjednodušeně řečeno v jedné potravině je daný mikroorganismus nezbytný a žádoucí a v druhé je naopak nežádoucí a může se podílet na kažení potraviny(http://www.mendelu.org/upload//mikra%25206.doc+ka%C5%BEen%C3%A D+potravin&hl=cs&ct=clnk&cd=16&gl=cz). Mimořádně vysoká rychlost rozmnožování bakterií jim umožňuje za vhodného pH
(tj. kolem neutrálního bodu) a vhodné vodní aktivity prostředí úplně vytlačit
kvasinky
a plísně, které se rozmnožují mnohem pomaleji. U potravin a surovin
složených převážně z bílkovin (např. masa a polotovarů z něj) dochází činností proteolytických bakterií k hlubokému rozkladu bílkovin za vzniku silně páchnoucích látek a často i toxických zplodin. Potraviny o vhodném pH, obsahující vedle dostatečného množství vody také značné množství sacharidů (např. mléko, polévky, omáčky, pudingy apod.), poskytují možnost rychlého pomnožení kyselinotvorným bakteriím, které brzdí, nebo dokonce znemožní činnost hnilobných bakterií rozkládajících bílkoviny. Některé bakterie napadají také lipidy potravin, a to za vzniku nežádoucích mastných kyselin a páchnoucích oxidačních skupin. Kromě hlubokého rozkladu potravin způsobují některé bakterie již velmi brzy vznik nepříjemné chuti nebo cizí vůně, nápadného nepřirozeného zbarvení apod. (Šilhánková, 1995).
2.2.1.2
Bakterie účastnící se kažení potravin Nejrychlejší a nejvíce patrné je kažení potravin bohatých na bílkoviny (maso,
drůbež, ryby, mléko). Tyto potraviny jsou živinově bohaté, mají neutrální nebo jen slabě kyselé pH a vysoký obsah vlhkosti (Komprda, 2004). Změny vnějších podmínek skladování (např. chlazení) jsou jediným způsobem, jak kažení zbrzdit.
Specifické bakterie podílející se na kažení potravin rozdělujeme do čtyř skupin: gram-negativní tyčinky, gram-pozitivní sporulující bakterie, laktátové bakterie, ostatní gram-pozitivní bakterie.
1.
Gram-negativní tyčinky.
Nejběžnějšími mikroorganismy kazící potraviny jsou pseudomonády (Pseudomonas spp.), zvláště u aerobně skladovaných potravin s vysokým obsahem vlhkosti a přibližně neutrálním pH: tzv. červené maso, ryby, drůbež, mléko a některé mléčné produkty. Některé gram-negativní tyčinky mohou růst i při nízkých teplotách (Aeromonas, Vibrio) a přispívají ke kažení např. chlazeného masa, nakládaného masa, drůbeže, ryb, resp. mléka a mléčných produktů. Rod Vibrio je halofilní (rostoucí při vyšších koncentracích solí), je tedy aktivní při kažení mořských ryb nebo nakládaného masa. Při teplotách nad 10°C se uplatňují enterobakterie (příslušníci čeledi Enterobacteriaceae)
a
převládají
nad
pseudomonádami.
Kažení
potravin
je charakterizováno produkcí plynu, kyselin, slizu, hlenu, hořké chuti a změnami vůně. Přítomnost enterobakterií je také indikátorem fekální kontaminace, nesprávného opracování, sekundární kontaminace po opracování potraviny. 2.
Gram-pozitivní sporulující bakterie.
Tyto bakterie (rody Bacillus a Clostridium) jsou významné obzvláště u potravin, které byly podrobeny tepelnému ošetření (pasteraci). Rostou mnohem pomaleji, než gramnegativní bakterie, ty však jsou obvykle tepelným procesem eliminovány, takže bacily nebo klostridie se mohou nerušeně množit. Bacillus cereus může růst i při nízkých (chladírenských) teplotách, účastní se na kažení mléka. Klostridie jsou naopak aktivní při poněkud vyšších teplotách, způsobují tzv. pozdní duření tvrdých sýrů během jejich zrání. 3.
Laktátové bakterie.
Laktátové bakterie tvoří fermentací sacharidů kyselinu mléčnou, slizové látky a CO2. tyto bakterie rostou při chladírenských teplotách pomalu, při aerobních podmínkách nad nimi dominují pseudomonády. Na druhé straně jsou označovány za hlavní mikroorganismy kažení vakuově baleného masa. Účastní se též na kažení nakládaných a fermentovaných masných výrobků.
Nejvýznamnějšími rody jsou v uvedeném kontextu Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc a Pediococcus. 4.
Ostatní gram-pozitivní bakterie.
Brocothrix thermosphacta nabývá na významu nárůstem používání balení potravin v modifikované atmosféře, resp. vakuově balených potravin. Zde se může stát dominantní mikroflórou. Rod Micrococcus je schopen růstu v přítomnosti soli, je často zodpovědný za kažení nakládaných masných výrobků. Mnoho kmenů této bakterie je schopno přežívat pasterační teploty a následně kazit takto ošetřené produkty (Komprda, 2004). Z toxinogenních bakterií se anaerobní druhy (tj. Clostridium botulinum a Clostridium perfringens) uplatňují tam, kde panují alespoň místně anaerobní podmínky. Některé druhy salmonel se přenášejí také i výkaly zvířat (savců i ptáků) nebo jejich vejci. Pro vážné důsledky, které tyto toxinogenní bakterie způsobují, je třeba jim v potravinářství věnovat vysokou pozornost, podobně jako ostatním patogenním bakteriím přenášeným potravinami (tj. původcům tuberkulózy, tyfu, úplavice a cholery) (Šilhánková, 1995).
2.2.2
Kvasinky Kvasinky jsou jednobuněčné houbové mikroorganismy. Netvoří plodnice, množí
se zejména nepohlavně a je pro ně charakteristický způsob dělení buněk, takzvané pučení. Mohou se množit i sexuálně tvorbou vřecek. Netvoří žádné pravé myceliální struktury, pouze pseudomycelium, které se podobá koloniím jednobuněčných organismů. Používají se například při výrobě vína, piva nebo chleba. Využívá se jejich schopnosti kvašení (http://cs.wikipedia.org/wiki/Kvasinky). Kromě senzorického znehodnocení produktů jsou významné kvasinky patogenní, a to hlavně z důvodu velmi obtížné léčitelnosti jimi vyvolaného onemocnění (Šilhánková, 1995).
2.2.2.1
Výskyt a význam kvasinek Prvořadý význam mají dnes kvasinky v kvasném průmyslu při výrobě lihu, piva,
vína, pekařského droždí a také některých mléčných nápojů. V krmivářském průmyslu nabývají význam krmné směsi z kvasnic. Doposud jsou poměrně málo využívány pro potravinářské účely jako zdroj bílkovin a jiných biologicky cenných látek. Mají bohatý obsah dobře stravitelných bílkovin (kolem 40%), cukrů a zejména komplexu
vitamínu B, což platí zvláště pro pivovarské kvasinky. Ty se využívají i při léčbě nervových onemocnění, při zánětlivých kožních chorobách, při poruchách zažívacího traktu a jaterních chorobách (http://cs.wikipedia.org/wiki/Kvasinky). Rozmnožování kvasinek je podmíněno jejich fyziologickými vlastnostmi, tj. potřebou cukru, odolností ke kyselému prostředí, u některých druhů také tolerancí k vysokému osmotickému tlaku, a je omezeno jejich neschopností štěpit bílkoviny. Proto se nepomnožují ve větší míře na mase a jiném bílkovinném materiálu. Negativně se uplatňují patogenní kvasinky (hlavně Candida albicans, Cryptococcus neoformans, rody Filobasidiella a Malassezia a některé druhy rodu Trichosporon).
Většinou
tyto
kvasinky
způsobují
vážná
onemocnění
pouze
u oslabených jedinců nebo při poškození imunitního systému. Přesto však mohou tato onemocnění končit smrtí (Šilhánková, 1995).
2.2.3
Plísně Termín plíseň představuje nesystematické označení pro skupinu hub, které
pokrývají povrch substrátu jemným bílým nebo barevným myceliem. Mezi plísně zahrnujeme fykomycety (pravé plísně) s rody Absidia, Mucor (plíseň hlavičková) a Rhizopus, vřeckaté houby (mj. s rody Bysochlamys a Neurospora) a Fungi imperfecti (houby nedokonalé) s rody Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Fusarium, Penicillium, Scopulariopsis, Sporotrichum, Stachobotrys a Trichothecium. Plísně jsou většinou saprofytické, mohou být užitečné (produkují-li antibiotika, organické kyseliny, příp. enzymy v průmyslovém měřítku) nebo škodlivé (působící mykózy lidí i zvířat, tvořící mykotoxiny, rozkládající potraviny a krmivo, kazící dřevo, kůži, textilie aj.) (http://cs.wikipedia.org/wiki/Pl%C3%ADse%C5%88). Jsou přítomny v ovzduší, půdě, vodě, na povrchu živých a odumřelých organismů, na různých předmětech, krmivech apod. Hojný výskyt spor plísní ve vzduchu je umožněn obsahem barviv chránících je před nepříznivými účinky ultrafialového záření. Pro růst a rozmnožování vyžadují plísně přísně aerobní podmínky, dovedou se však značně přizpůsobit extrémnímu pH a vodní aktivitě prostředí. Kromě senzorického znehodnocení produktů jsou některé plísně nebezpečné pro schopnost produkovat mykotoxiny. Přítomnost mykotoxinů v potravinách se sleduje
z důvodu jejich toxických účinků na ledviny, játra, a imunitní systém živočichů, včetně člověka (Šilhánková, 1995).
2.2.3.1
Výskyt a význam plísní Význam plísní je dán jejich fyziologickými vlastnostmi. Nenáročnost plísní
způsobuje, že napadají i vlhké zdi, optiku přístrojů uložených ve vlhku apod. Plísně jsou schopny se rozmnožovat také za poměrně nízké vodní aktivitě prostředí, a proto přednostně napadají povrch džemů, marmelád, chleba i různého pečiva, případně i navlhlé suroviny, jako mouku, skladované obilí, mák, sóju, arašídy apod. Řada plísní se může v napadených potravinách nebo jejich surovinách rozvíjet ještě při 15 % obsahu vody, zatímco většina bakterií a kvasinek potřebuje pro svůj rozvoj alespoň 30 % vody. Rozvoj plísní na vlhké mouce, obilí apod. se projevuje zatuchlým pachem, který z napadeného materiálu již nelze odstranit. Napadený materiál pak již není vhodný pro přípravu potravin. Schopnost rozmnožovat se i za velmi nízkého pH umožňuje plísním uplatnit se i tam, kde většina bakterií již není schopna metabolismu (např. na kyselém ovoci, ovocných šťávách, džemech a marmeládách). Některé plísně rostou i za velmi nízké teploty (dokonce i při -10 °C) a způsobují ztráty při dlouhodobém skladování potravin a jejich surovin i za chladu (např. masa, másla, vajec). Mimořádně vysoký negativní význam mají plísně z hlediska tvorby mykotoxinů. Některé plísně jsou patogenní pro člověka nebo zvířata, jiné vyvolávají alergické reakce u citlivých jedinců. Některé druhy jsou fytopatogenní. Pozitivní význam mají plísně (kromě průmyslové produkce enzymů) jako producenti antibiotik a organických kyselin (citronové, fumarové, itakonové, glukonové a šťavelové) a při provádění specifických oxidací složitých chemických sloučenin při výrobě léků. Mimořádně významná je činnost plísní při aerobních postupech čištění odpadních vod (Šilhánková, 2002).
2.2.3.2
Kvasinky a plísně účastnící se kažení potravin Tyto
mikroorganismy
jsou
v prostředí
široce
rozšířeny,
nacházejí
se na rostlinách, živočišných produktech, v půdě, ve vodě, hmyzu. Tato skutečnost může být vysvětlena tím, že uvedené mikroorganismy jsou schopny utilizovat i takové substráty (včetně sacharidů, proteinů a lipidů) jako pektiny nebo organické kyseliny. Kromě toho tolerují nízké pH, nízkou aktivitu vody, nízkou teplotu a přítomnost konzervačních látek.
V poslední době bývají uvedenými mikroorganismy kontaminovány např. čerstvé mořské produkty, balená masa, lahůdkové saláty nebo čerstvá zelenina. Kažení potravin kvasinkami a plísněmi se projevuje produkcí slizových látek, kyselin (fermentací sacharidů), plynu, alkoholu, změnami chuti a vůně, pigmentací povrchu potravin. Kromě senzoricky postřehnutelných změn produkuje mnoho druhů plísní hygienicky a zdravotně závažné toxiny (Komprda, 2004).
2.3
Charakteristika metod využívaných v mikrobiologii potravin
2.2.4
Klasické kultivační metody Používají se ke kontrolním (úředním) rozborům, jejichž účelem je rozhodnout
o přípustnosti poživatiny pro lidskou nebo živočišnou konzumaci, k vystavování garančních
osvědčení
jakosti
v tuzemských
i
mezinárodních
dodavatelsko-
odběratelských vztazích, k rozborům potravin, u kterých je podezření, že způsobily alimentární onemocnění, k mikrobiologické kontrole výrobního zařízení a prostředí. Některé
klasické
kultivační
metody
k průkazu
epidemiologicky
důležitých
mikroorganismů, ve formě českých i mezinárodních norem (také označované jako Standardní metody), jsou úředně platné metodiky mikrobiologických potravinářských rozborů předepsané k provádění shora uvedených typů rozborů (Jičínská, Havlová, 1996).
2.2.4.1
Kvalitativní metody Jsou to metody průkazu přítomnosti či nepřítomnosti zjišťovaného mikroba
v určitém, metodou předepsaném množství vzorku. Skládají se z těchto operací: Resuscitace. Účelem resuscitace je obnovení životaschopnosti poškozených patogenních mikrobů ve vzorku, které byly poškozeny technologickými stresy během zpracování potraviny. Poškozené mikroorganismy projevují zvýšenou citlivost k inhibičním látkám v selektivních médiích. Podmínky resuscitace mají být takové, aby neumožňovaly aktivní růst mikroorganismu, nýbrž jen procesy potřebné k reparaci poškozených buněčných funkcí. Lehčí poškození („metabolické“) spočívá v inaktivaci enzymů, těžší („strukturní“)
ve zlomech řetězců DNA nebo v narušení buněčné membrány. Vzhledem k různým typům a stupni poškození různých druhů mikrobů způsobených různými stresy, nemusí být resuscitační metoda, používaná pro určitý druh patogenů v určitém výrobku vhodná pro jiné patogeny v jiném výrobku. Proto jsou resuscitační postupy často rozdílné a specifické pro určitý organismus nebo výrobek. Všeobecně se však resuscitace považuje za nezbytný krok. K resuscitaci metabolicky poškozených buněk jsou vhodná nutričně bohatá média, naopak pro strukturně poškozené buňky se k resuscitaci volí nutričně chudá média a suboptimální teploty kultivace. Pomnožení
v selektivním
médiu,
jehož
účelem
je
získat
patogenní
mikroorganismy v množství potřebném pro další operace. Patogeny jsou obvykle ve vzorku přítomny v nízkém počtu nebo ve smíšené populaci s velkými počty doprovodné mikroflóry. Selektivní média obsahují přísady, které by měly inhibovat pouze růst očekávaných nepatogenních druhů, k nimž je však selektovaný patogen rezistentní (např. žlučové soli v selektivních půdách pro různé druhy enterobakterií). Kultivace na selektivně-diagnostických tuhých médiích. Účelem je získat jednotlivé dobře izolované kolonie prokazovaného mikroba, které vykazují některé jeho typické vlastnosti (morfologické, biochemické, sérologické) – tzv. „charakteristické kolonie“ a poskytnout mikrobiální materiál z kolonií k identifikačním testům. Pravděpodobnost záchytu je téměř vždy větší, jestliže se kultivace provádí souběžně na nejméně dvou selektivních a selektivně-diagnostických médiích. Na plotnách se mohou vedle typických kolonií mikroba vykultivovat i kolonie atypické, které se svými vlastnostmi liší od charakteristických kolonií. U mnoha druhů patogenů se nejčastěji vyskytují atypické R-kolonie (rough), které jsou drsné, kohezivní, často mívají i atypické sérologické vlastnosti, a M (mukoidní), oba typy často společně s S (smooth) typickými hladkými koloniemi. Kmeny, které jeví fázovou nebo antigenní variaci tvoří dva typy kolonií, O (opaque; neprůsvitné, hutné, vypouklé) a T (transparent; průsvitné, ploché). Potvrzení (konfirmace), identifikace. Potvrzením se stanoví příslušnost vyizolovaného mikroorganismu k určité taxonomické skupině: rodu, druhu, biotopu (biovaru). Materiál k provedení testů se většinou odebírá přímo z charakteristických kolonií. Pro toxikologické testy se přeočkovává do média, které stimuluje tvorbu toxinu. Případné odchylky od charakteristických vlastností zjišťovaného patogena během izolace a identifikace zachycených kmenů se posuzují pomocí tzv. srovnávacích
kmenů, které se kultivují a testují s každou analyzovanou sérií vzorků. Jako pozitivní srovnávací kmeny se používají sbírkové kmeny, které dávají charakteristické kolonie a výsledky všech potvrzovacích testů typické pro prokazovaného patogena podle jeho taxonomického zařazení. Pro větší standardnost výsledků a srovnatelnost mezi jednotlivými laboratořemi doporučují normy (ČSN, IDF, ISO) přednostně používat komerční média a testovací identifikační sady (Jičínská, Havlová, 1996).
2.2.4.2
Kvantitativní metody Při očekávaném počtu stanoveného mikroorganismu ve vzorku větším než
100/ml nebo 1000/g se stanovení provádí počítáním kolonií. Očkuje se na selektivně diagnostická média přímo z (tekutého) vzorku, základního ředění nebo dalších ředění. Při nižších počtech se stanovení provádí v tekutých selektivních médiích metodou MPN,
nebo počítáním kolonií po zkoncentrování zjišťovaného mikroba ve
vzorku centrifugací, membránovou filtrací nebo imunomagnetickou separací. Tomuto druhému způsobu se dává přednost, protože MPN je méně přesná a neumožňuje použití resuscitace (Jičínská, Havlová, 1996).
2.2.5
Rychlé metody Klasické
kultivační
metody
k průkazu
patogenních
mikroorganismů
v potravinách vyžadují dobu 7 až 10 dní. Požadavky potravinářské praxe na rychlé získávání informací o výskytu patogenních mikroorganismů v potravinách vedly k vývoji rychlých metod. Výhodou rychlých metod je především rychlé získání negativních
výsledků,
tj.
zjištění
nepřítomnosti
příslušného
patogenního
mikroorganismu ve vzorku. Pozitivní výsledky vyžadují obvykle další vyšetření vzorku klasickou metodou (Jičínská, Havlová, 1996).
2.3
Postup při stanovení mikroorganismů v potravinách
2.5.1 Odběr vzorků potravin pro rozbor v laboratoři Mezi základní pomůcky pro odběr vzorků patří opalovací pistole nebo roztok ethanolu, teploměr, naběračka, pinzeta, nůž, lžíce nebo lopatka, špachtle, vzorkovnice,
sáčky, fólie, chladicí box. Pomůcky pro odběr vzorků musí být sterilní (Burdychová, Sládková, 2007). Podle výsledků senzorického zkoušení (s výjimkou chuti) se odebírané vzorky rozdělí na materiál: nejevící pozorovatelné odchylky, výrobky podezřelé a výrobky zkažené. Je třeba ctít specifika odběru vzorků kusových, tekutých, resp. sypkých (Komprda, 2003). Při odběru vzorků se nejdříve zjistí označení šarže podle údajů uvedených na obale potraviny určené pro spotřebitele nebo přepravním obalu a dokladů vztahujících se k výrobku. Dále se ověří hmotnost nebo objem šarže nebo počet jednotek v šarži nebo kontrolované jednotce a druh a velikost obalů a jejich označení. Nejpozději před započetím odběru vzorku se stanoví postup odběru vzorků, nebo pokud je již stanoven, se postup odběru vzorku upřesní. Dále se stanoví požadované druhy zkoušek, přejímací plán, celková hmotnost nebo objem vzorků potřebných k provedení všech požadovaných kontrol a laboratorních zkoušek kombinací rozsahu odběru vzorků a druhů zkoušek a celkový potřebný počet balení nebo dílčích vzorků, které se odeberou. Vzorek se odebírá z každé kontrolované šarže, aby byl reprezentativní vždy pro celou šarži, z každé stejnorodé části šarže se odebírají vzorky samostatně. K mikrobiologickému zkoušení se odebírají jednotlivé vzorky. Zmrazené potraviny se nesmí při odběru rozmrazit. Pokud je odebraný vzorek tvořen jedním nebo více dílčími vzorky, dílčí vzorek se odebere z náhodně zvoleného místa v šarži; není-li to možné, odebere se z náhodně zvoleného místa v přístupné části šarže. Velikost dílčího vzorku se stanoví jako podíl mezi požadovanou velikostí souhrnného nebo laboratorního vzorku a stanoveného počtu odebíraných jednotek. Z balených potravin se dílčí vzorky v požadovaném množství odeberou bez porušení obalu určeného pro spotřebitele, z nebalených potravin s porušením vnějšího obalu. V případě, že se potravina nachází současně ve více obalech, zejména v jakémkoliv vnějším obalu, použije se přepravní obal, ve druhém stupni sekundární vzorek, kterým je skupinové balení odebrané z přepravního obalu, v dalších stupních obdobně tak, aby v posledním stupni byl odebrán dílčí vzorek z balení určeného pro spotřebitele. Ke každému vzorku nebo sérii vzorků zasílaných k laboratornímu vyšetření je vystavena objednávka laboratorního vyšetření (Burdychová, Sládková, 2007).
2.5.2 Kultivační média pro mikrobiologické zkoušky Kultivace organismů je prováděna na kultivačních médiích. Účelem kultivace je získání čisté kultury mikroba z vyšetřovaného vzorku. Požadavky na živiny jsou u různých mikroorganismů velice rozdílné, proto existuje celá široká škála různých kultivačních médií, která se od sebe navzájem výrazně odlišují. Kromě optimálního zastoupení jednotlivých komponent musí kultivační média pro úspěšnou kultivaci splňovat ještě další podmínky. Rozhodující je dostatečná vlhkost, vhodná teplota, optimální hodnota pH, vhodné aerobní či anaerobní podmínky, dostatečná pufrovací schopnost, potřebný osmotický tlak apod. (Burdychová, Sládková, 2007). Živná média se mohou klasifikovat na základě různých hledisek. Podle konzistence rozlišujeme kapalné média, které se používají jako rozmnožovací, tuhé půdy, na kterých mikroorganismy rostou v izolovaných koloniích, tuhé a sypké média. Podle původu a přípravy se rozdělují na přirozené (vhodné jsou na krátce trvající kultivaci určitého mikroorganismu, nebo na izolaci z přírodních zdrojů), polysyntetické (kromě chemicky definovaných sloučenin obsahují odvary, maceráty, výluhy nebo hydrolyzáty některých přírodních materiálů jako zdroj vitamínů a aminokyselin, např. kvasničný extrakt) a syntetické (chemicky definované, připravené jako směs organických a anorganických sloučenin) (Betina, 1988).
Podle účelu použití se půdy dělí: •
transportní
půdy
–
kultivační
půdy
určené
k zachování
a
udržení
životaschopnosti mikroorganismů po dobu mezi odběrem vzorku a jeho laboratorním zpracováním. •
konzervační
půdy –
kultivační
půdy určené k zachování
a
udržení
životaschopnosti mikroorganismů po delší časový úsek, chrání mikroorganismy před nepříznivými vlivy, které se mohou vyskytnout v průběhu dlouhodobé úchovy, a po skončení úchovy zajišťuje jejich reparaci. •
resuscitační půdy – kultivační půdy umožňující stresovaným a poškozeným mikroorganismům reparaci a schopnost obvyklého růstu, aniž by nutně podporovala jejich množení.
•
pomnožovaní půdy – převážně tekuté kultivační půdy, které svým složením poskytují zvláště vhodné podmínky pro pomnožení mikroorganismů.
•
selektivní půdy – pomnožovaní půdy, které podporují množení určitých mikroorganismů, zatímco částečně nebo zcela inhibují růst mikroorganismů jiných (např. půda podle Rappaporta a Vassiliadise).
•
neselektivní pomnožovací půdy – pomnožovaní půdy, které podporují růst většiny mikroorganismů (např. živný bujón).
•
izolační půdy – tuhé nebo polotuhé kultivační půdy podporující růst mikroorganismů
•
selektivní izolační půdy – izolační půdy, které podporují růst určitých mikroorganismů, zatímco inhibují růst mikroorganismů jiných.
•
neselektivní izolační půdy – izolační půdy sestavené tak, aby nepůsobily žádnou selektivní inhibici mikroorganismů (např. živný agar).
•
diferenciační půdy – kultivační půdy, které umožňují testování jednoho nebo několika
charakteristických
fyziologických
či
biochemických
znaků
mikroorganismů pro účely jejich identifikace (např. půda s močovinou, Kliglerův agar). •
identifikační půdy – kultivační půdy sestavené tak, aby poskytovaly takovou specifickou identifikační reakci, která již nevyžaduje žádný další konfirmační test.
•
půdy s několika možnostmi použití – určité kultivační půdy mohou náležet do několika kategorií, například krevní agar je resuscitační půda, izolační půda, a diferenciační půda k průzkumu hemolýzy (Burdychová, Sládková, 2007).
2.5.3
Inkubace vzorku Optimální teploty jsou pro nejběžnější mikroorganismy zpravidla tyto:
•
pro psychrofilní mikroorganismy 20 - 22°C, pro psychrotrofní mikroorganismy 6,5°C
•
pro mezofilní mikroorganismy 30 - 37°C
•
pro termofilní mikroorganismy 50 - 55°C (i více, dle druhu bakterie)
•
pro většinu kvasinek 26 - 30°C
•
pro plísně 20 - 28°C
Optimální inkubační doby jsou ve většině případů: •
pro bakterie a kvasinky 24 – 48 hod
•
pro plísně 2 – 5 dní (i déle, dle druhu plísně)
Agarové plotny inkubujeme vždy převráceně, víčkem dolů, aby na povrch půdy nestékaly kondenzované páry. Na vlhkých půdách by totiž mikroorganismy vytvářely povlaky znemožňující odečítání kolonií. Aerobní mikroorganismy kultivujeme běžně na Petriho miskách, šikmých agarech nebo v nízkých vrstvách kapalin. Pro rychlé pomnožení aerobních mikroorganismů v biotechnologických aplikacích je třeba sycení kyslíkem. Možností je třepání na automatických třepačkách, aerace (přivádění stlačeného vzduchu trubkou ke dnu nádoby a jeho protlačování porézní destičkou) nebo aerační míchání ve fermentorech. Fakultativně anaerobní a mikroaerofilní mikroorganismy rostou v prostředí se sníženým obsahem kyslíku a se zvýšenou tenzí CO2. Očkujeme vpichem, rozmícháním do svislých agarů nebo do vysokých vrstev kapaliny o malém povrchu. Přidáváme redukující látky jako je thioglykolát sodný, kyselina askorbová, siřičitan nebo thiosíran sodný. Obligátně anaerobní mikroorganismy rostou jen v prostředí bez kyslíku a kyslík je pro ně jedem. Pro jejich kultivaci je potřeba, abychom odstranili z kultivačního prostředí kyslík nebo jiným způsobem snížili oxidoredukční potenciál (Burdychová, Sládková, 2007).
2.5.4 Růst bakterií na živných půdách a jeho hodnocení Hodnocení morfologie kolonií představuje důležitý diagnostický krok. Při posuzování bakteriálních kolonií narostlých na Petriho miskách si všímáme následujících znaků: •
velikosti – kolonie mohou být tečkovité nebo se jejich velikost vyjadřuje průměrem v mm
•
pigmentace – barva kolonie daná tvorbou pigmentu (např. Micrococcus luteus – žlutá, Micrococcus roseus – růžová) nebo změnou barevného indikátoru v živné půdě
•
tvaru – pravidelný, okrouhlý, nepravidelný, kořenovitý
•
okrajů – rovné, laločnaté, zvlněné, zubaté, výběžkaté, vláknité, vyvýšené
•
profilu – plochý, mírně vypouklý, vypouklý, výrazně vypouklý, pupkovitý
•
povrchu – lesklý, hladký, matný, drsný, zvrásnělý
•
transparence – průhledná, průsvitná, neprůsvitná
•
změny okolí – posuzujeme změnu barvy (produkce ve vodě rozpustných pigmentů, změna pH média – změna barvy indikátoru), na krevním agaru stupně hemolýzy erytrocytů
•
vrůstání do půdy
•
konzistence – mazlavá, máslovitá, drobivá, vosková, hlenovitá
•
zápachu – fekální, hnilobný, kyselý, nasládlý
2.5.4.1
Růst v tekutých půdách Do tekutých půd očkujeme materiál obsahující malé množství mikroorganismů.
Čisté kultury očkujeme do tekutých půd jen tehdy, chceme-li je pomnožit, porovnat způsob růstu nebo sledovat pohyb. Zpravidla nelze podle růstu v tekutých médiích rozlišovat jednotlivé mikrobiální druhy. V tekutých půdách si všímáme: •
povrchu – plísně tvoří kožovitý povlak (vláknitý nebo sametový), kvasinky křís (bílá zvrásněná krusta)
•
zákalu – může být difúzní (bakterie tvořící drobné tyčinky nebo koky), vločkovitý (některé druhy rodu Bacillus, Staphylococcus), v podobě sedliny (rod Lactobacillus, většina kvasinek) sedimentu – může být zrnitý, vločkovitý, hlenovitý, roztřepatelný, neroztřepatelný. Některé sedlinotvorné kvasinky tvoří po delší inkubaci kašovitou vrstvu (mázdra) nebo kašovitý prstenec podél stěn nádoby
•
vůně nebo zápachu – může být fekální, nasládlý, amoniakální, kvasničný
2.5.4.2 Charakter růstu na šikmém agaru Očkování na předsušený živný agar se provádí pomocí očkovací jehly. Po inkubaci (bakterie 24 – 48 hodin, kvasinky 2- 3 dny) hodnotíme: •
rychlost růstu – žádný růst, pomalý růst, středně rychlý růst, rychlý růst
•
tvar nátěru – rovný, stromečkovitý, bodovitý, výběžkovitý, difúzní, kořínkovitý
•
povrch nátěru – lesklý, matný
•
konzistenci – suchá, máslovitá, hlenovitá
•
barvu
2.5.4.3 Charakter růstu podél vpichu do agarové půdy Do živného média se naočkuje vpichem 24 hodin stará kultura a v jednodenních intervalech při inkubační teplotě 30 - 37°C se vyhodnocuje růst. Ten může být: •
spojitý
•
kartáčovitý
•
bodový
•
kořínkovitý (Burdychová, Sládková, 2007).
2.5.5 Identifikace mikroorganismů pomocí kultivačních metod Z potravinářského hlediska jsou významné patogenní mikroorganismy, které vyvolávají alimentární onemocnění a jejich výskyt je v potravinách nepřípustný (Betina, 1988). Alimentární nákazy jsou způsobeny požitím závadných potravin. Mohou nastat tato onemocnění: • průjmové onemocnění • žloutenka typu A (onemocnění špinavých rukou) • salmonelóza • nemoci způsobené červy – tasemnice, roupy • nemoci přenosné ze zvířat (http://www.ssss.cz/files/kpucebnice/p/pv/1/kazeni.htm).
2.5.6 Patogenní mikroorganismy vyvolávající alimentární onemocnění Alimentární nákazy (infekce) jsou způsobeny množením a metabolickou činností patogenních mikroorganismů v organismu, alimentární otravy (intoxikace) jsou způsobeny toxinem. Alimentární onemocnění jsou charakterisována především tím, že původce proniká do těla ústy potravou nebo vodou, pomnožuje se a udržuje v trávicím traktu a zpravidla se vylučuje stolicí (Vítová, 2004). Do skupiny patogenů vyvolávajících alimentární infekce patří bakterie rodu Salmonella a druhy Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes a Clostridium perfringens.
Intoxikace z potravin vznikají účinkem toxických metabolitů, které se tvoří činností bakterií v potravinách. Přítomnost mikroorganismu v potravině není příčinou vzniku onemocnění, rozhodujícím faktorem je přítomnost toxinů v potravině v době její konzumace. Mezi mikroorganismy způsobují intoxikace patří např. Bacillus cereus a Staphylococcus aureus (Burdychová, Sládková, 2007).
2.6
Moderní kultivační metody Moderní mikrobiologické metody zaznamenávají v současné době obrovský
rozvoj. Jedná se především o molekulárně - genetické metody, které umožňují určit mikroorganismus na základě jeho genetické informace. K tomu jsou využívány různé molekulárně – genetické techniky, z nichž nejvýznamnější je PCR (polymerázová řetězová reakce). Tyto metody jsou založeny na specifické komplementaci (hybridizaci) mezi hledaným úsekem jednovláknové nukleové kyseliny z lyzovaných buněk bakterie a sondou. Sondou rozumíme synteticky připravenou krátkou sekvenci nukleotidů komplementární k hledanému úseku. Tyto metody využívají pro specifickou detekci např. L. monocytogenes charakteristické sekvence jejího genomu. Nález takové sekvence
ve
zkoumaném
materiálu
indikuje
přítomnost
L.
monocytogenes.
Molekulárně-genetické metody jsou vysoce citlivé, v případě použití čistých bakteriálních kultur, ale při stanovení ve složitých matricích (např. v některých potravinách) se citlivost snižuje. Proto je často nezbytné mikroorganismy před vlastní analýzou separovat. Lze při tom využít jak metody fyzikálně-chemické (např. filtrace, extrakce), tak metody bioafinitní (např. imunochemické) (http://www.chemickelisty.cz/docs/full/2005_07_467-473.pdf). V oblasti modernizace klasických kultivačních metod se mnohé firmy zabývají především vývojem selektivních kultivačních půd, specifických pro danou bakterii. Tyto půdy většinou obsahují určité barvivo, tudíž je usnadněná především identifikace patogenních mikroorganismů obsažených v potravině – při výskytu barevných kolonií je lehce prokazatelná přítomnost patogena (www.noack.cz, www.merck.cz).
Podle způsobu použití se kultivační půdy dělí: •
kultivační půdy k přímému použití, kdy je kultivační půda dodávaná
v odpovídajících nádobkách (např. Petriho miskách nebo zkumavkách či v jiných nádobkách) ve formě vhodné k přímému použití •
kultivační půdy připravené z komerčně dodávaných dehydratovaných
půd, v tomto případě je kultivační půda dodávána v dehydratované formě, která není vhodná k bezprostřednímu použití (např. ve formě prášku, granulátu, nebo lyofilizovaného výrobku) a její rehydratací vznikne buď kompletní půda určená k přímému použití, nebo nekompletní půda, k níž se nestabilní složky (suplementy) přidají v době použití. Kultivační půda může být připravená také z jednotlivých složek v laboratoři. (Burdychová, Sládková, 2007). Další oblast, která je jistě ve značném rozvoji, jsou systémy tzv. mikrotestů, petrifilmů a systémů „ready to use“. Jedná se o komerčně vyráběné testy určené především k rychlému zjištění daného mikroorganismu v potravině, či ve výrobním nebo distribučním zařízení. •
Systém Petrifilm Petrifilm je alternativou ke konvenčním plotnovým metodám. Používá
dehydratovanou směs živin s želatinizačním činidlem ve formě filmu. Množství zpracovaných vzorků je asi dvojnásobné oproti konvenční plotnové metodě. (Komprda, 2003) Rychlé mikrobiologické testy - destičky pro přesnou kontrolu mikrobiologické kvality potravin nebo prostředí potravinářských provozů. Jedná se o médium přímo připravené k inokulaci vzorků. Destičky se skládají ze dvou vrstev filmů, které obsahují živná média, gel rozpustný ve studené vodě a speciální indikátor, který zvýrazní narostlé kolonie mikroorganismů na destičce. Natištěná mřížka usnadní počítání kolonií. (www.noack.cz) •
Rychlé detekční systémy
Jedná se o komerčně vyráběné systémy k rychlé identifikaci MO. Jsou přesné, spolehlivé a rychlé – výsledky rozborů jsou k dispozici většinou za 18 – 48 hodin, dle konkrétní aplikace. Přinášejí tak významné finanční výhody ve snížení skladových zásob a pracovního kapitálu. Rychlá detekce kontaminace navíc umožňuje rychlá nápravná
opatření
a
minimalizaci
(http://www.skatec.cz/mikrob.php?grp=BIO).
finančních
dopadů
této
situace
•
Živná média „ready to use“ (hotové k použití)
Rostoucí výskyt onemocnění z potravin a nemocí přenášených vodou vyžaduje pečlivé, efektivní, rychlé a spolehlivé monitorování. Proto společnosti vyvíjejí laterální testy, které jsou v zásadě mobilními minilaboratořemi. Díky těmto novým testům existuje nyní možnost rychle a spolehlivě potvrdit nepřítomnost důležitých patogenů v potravinách a ve vodě: E. coli O157, E. coli produkující verotoxin, Campylobacter, Listeria spp., Listeria monocytogenes, Salmonella, Legionella a Bacillus cereus. Produkty nabízejí všechny výhody tradičních testovacích metod; navíc jsou spolehlivé a praktické, především však podstatně rychlejší. (www.merck-chemicals.com). •
Otiskové stěry
Jedná se o otiskové metody ke kontrole hygieny povrchů (celkový počet mikroorganismů, enterobakterie, E. coli, koliformní, kvasinky a plísně, stafylokoky). Ponorné
proužky
pro
kontrolu
vody
a
tekutých
potravin
(celkový
počet
mikroorganismů) a pro kontrolu průmyslových kapalin (aerobní bakterie, kvasinky, plísně, sírany redukující anaerobní bakterie) (www.noack.cz).
3. CÍLE PRÁCE
Cílem této práce je charakterizovat klasické kultivační metody využívané v mikrobiologii potravin, popsat postupy stanovování mikroorganismů v potravinách a v neposlední řadě se také zabývat způsoby kontaminace potravin a možnostmi, jak této kontaminaci předejít. V další části se budu zabývat moderními kultivačními metodami, na jejichž vývoj je kladen vysoký nárok jak z hlediska výrobců, tak spotřebitelů, kteří vyžadují co nejkvalitnější a nejbezpečnější produkty. Experimentální část se zabývá vlivem různých metodických postupů při kultivaci zeleninových šťáv na různou vypovídací hodnotu zvolené metody.
4. METODIKA Kultivace mikroorganismů v závislosti na různých teplotách kultivačních půd.
4.1
Analyzovaný materiál K mikrobiologickým analýzám byly použity zeleninové šťávy – mrkvová šťáva
bez konzervace, 1 týden po uchovávání v lednici a brokolicová šťáva ošetřená vysokým tlakem testovaná 1 měsíc po otevření a uchovávání v lednici.
4.1.1 Normy pro stanovení jednotlivých skupin mikroorganismů Norma ČSN ISO 4833 (56 0083) upřesňuje pokyny pro stanovení CPM, pro stanovení počtu kvasinek a plísní je to norma ČSN ISO (560087), norma ČSN ISO 4832 (56 0085) upravuje pokyny pro stanovení koliformních bakterií. Tyto normy obsahují podstatu zkoušky, požadavky na kultivační půdy a ředící roztoky, nutné vybavení laboratoře a požadavky na přístroje a pomůcky, postup zkoušky a vyhodnocení výsledků.
4.1.2 Příprava vzorků a ředění Ze vzorků mrkvové a brokolicové šťávy byl odebrán 1 ml a doplněn ve zkumavce destilovanou vodou na celkový objem 10 ml. Poté následovalo desítkové ředění. Při analýze mrkvové šťávy to bylo u CPM to bylo na 10-5 a 10-6, u plísní a kvasinek na 10-4 a 10-3, u sporulujících mikrobů na 10-2 a 10-1, u koliformních bakterií taktéž na 10-2 a 10-1. U každého ředění byly provedeny 4 opakování stanovení. Teploty kultivačních půd použitých při stanovení mrkvové šťávy byly 38°C a 50°C. U analýz brokolicové šťávy bylo ředění následující: CPM 10-4 a 10-3, u plísní a kvasinek 10-3 a 10-2, u sporulujících mikrobů 10-3 a 10-2 a konečně u stanovení koliformních bakterií bylo ředění 10-1. Teploty kultivačních půd byly v případě brokolicové šťávy 38°C a 55°C. Řádně označené Petriho misky s naočkovaným inokulem byly zality odpovídající půdou při daných teplotách, poté se krouživými pohyby dosáhlo promíchání inokula s agarem.
Po ztuhnutí půdy byly misky obráceny dnem vzhůru, aby kondenzovaná tekutina neznemožňovala počítání narostlých kolonií. Poté byly připraveny k inkubaci a umístěny do termostatu. Po ukončení inkubace byly všechny misky vyhodnoceny počítáním kolonií, výsledky jsou uvedeny jako aritmetický průměr.
4.2
Příprava kultivačních půd Při stanovení počtu významných skupin mikroorganismů bylo použito
následujících živných půd: •
VRBL agar pro stanovení počtu koliformních bakterií
•
PCA (Plate Count Agar) pro stanovení CPM a sporulujících mikrobů
•
Chloramfenikol glukózový agar pro stanovení počtu kvasinek a plísní
4.2.1 Složení a příprava použitých půd
VRBL agar (selektivní agar s krystalovou violetí, neutrální červení, žlučí a laktózou) pro stanovení počtu koliformních bakterií -
pepton………………………………………………………………7,00 g
-
kvasniční extrat……………………………………………………..3,00 g
-
laktóza……………………………………………………………..10,00 g
-
žlučové soli…………………………………………………………1,50 g
-
chlorid sodný…………………………………………………….5,00 mg
-
neutrální červeň…………………………………………………30,00 mg
-
krystalová violeť………………………………………………….2,00 mg
-
agar……………………………………………………………..…12,00 g
Doplníme do 1000 ml destilovanou vodou, po rozpuštění složek upravíme pH na 7,4.
PCA (Plate Count Agar) pro stanovení celkového počtu mikroorganismů a sporulujících mikrobů -
trypton…………………………………………...……………….…5,00 g
-
kvasniční extrakt sušený……………………………………………2,50 g
-
glukóza……………………………………………………………..1,00 g
-
agar……………………………………………………………......12,00 g
Doplníme do 1000 ml destilovanou vodou, po rozpuštění složek upravíme pH na 7,0.
Chloramfenikol glukózový agar pro stanovení počtu kvasinek a plísní -
kvasniční extrakt…………………………………………..………..5,00 g
-
glukóza…………………………………………………….………20,00 g
-
chloramfenikol………………………………………………….…..0,10 g
-
agar………………………………………………………………..15,00 g
Doplníme do 1000 ml destilovanou vodou, po rozpuštění složek upravíme pH na 6,6.
Půdy byly používány při dvou teplotách: 38°C a 50°C. Vliv těchto teplot na růst mikroorganismů je hlavním předmětem tohoto úkolu.
4.3
Inkubace a určení počtu kolonií Naočkované Petriho misky se inkubují v termostatu dle platných norem.
Pro stanovení celkového počtu bakterií a sporulujících mikroorganismů byly plotny inkubovány při teplotě 30°C po dobu 72 hodin. Po ukončení inkubace byly spočítány kolonie. Pro určení počtu koliformních bakterií byly plotny inkubovány při teplotě 37°C po dobu 24 hodin. Po uplynutí této doby byly kolonie spočítány. Stanovení počtu kvasinek a plísní probíhalo při teplotě 25°C po dobu 72 hodin. Poté byly vyskytující se kolonie spočítány. Výsledky jsou vyjádřeny jako aritmetické průměry ze čtyř stanovení v tabulce.
5. VÝSLEDKY Na vzorcích zeleninových šťáv byl proveden pokus založený na kultivaci mikroorganismů. V tomto pokusu byly použity kultivační živné půdy o dvou různých teplotách ( 38°C a 50°C ). U kultivace byly zvoleny dvě předem určené ředění uvedené v předchozím textu (4.1.2). Z výsledků obsažených v tabulce č. 5.1 je patrné, že u neošetřené mrkvové šťávy uchovávané v chladírenských podmínkách (3 °C) a testované týden po otevření nebyl pozorován vliv teploty kultivační půdy a žádný prokazatelný rozdíl mezi použití půdy s nižší, resp. vyšší teplotou není patrný. Z výsledků vyplývá, že kultivace mikroorganismů při vyšší teplotě kultivační půdy (v tomto případě 50°C) může mít mírný inaktivační účinek na zvýšení počtu mikroorganismů, což ovšem při pokusu na takto nízkém počtu vzorků nelze brát jako pravidlo.
Tab. 5.1
Mrkvová šťáva 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Počty MO ve vzorku mrkvové šťávy při různých teplotách kultivačních půd (CPM – Celkový počet mikroorganismů, Pl/Kv – Plísně/Kvasinky, Spor. – Sporulující mikroorganismy). Zobrazeny jsou průměrné hodnoty ze čtyř opakování. CPM 38°C 50°C 3,5 3,0 3,5 3,8
Pl/Kv 38°C 50°C 27,3 25,3 11,0 8,0 -
Spor. 38°C 50°C 398 270 144 128 -
E.coli 38°C 50°C 70 51 20 4 -
V tabulce č. 5.2 jsou shrnuty výsledky kultivace MO na vzorcích brokolicové šťávy ošetřené vysokým tlakem, testované 1 měsíc po otevření a uchovávání v lednici, teploty kultivačních půd byly v tomto případě 38°C a 55°C. Z výsledků v tabulce s výjimkou stanovení CPM při ředění 10-3 je patrné, že teplota kultivační půdy neměla žádný výrazný vliv na kultivaci MO brokolicové šťávy. Oproti mrkvové šťávě bylo patrné, že brokolicová byla ošetřena vysokým tlakem, což se projevilo výrazně nižším rozvojem MO i přesto, že byl vzorek skladován a testován více než 1 měsíc po otevření.
Tab. 5.2
Brokolicová šťáva 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Počty MO ve vzorku brokolicové šťávy při různých teplotách kultivačních půd. Zobrazeny jsou průměrné hodnoty ze čtyř opakování. CPM 38°C 55°C 2,0 32,0 2,0 1,0 -
Pl/Kv 38°C 55°C 1,0 0 0 1,0 -
Spor. 38°C 55°C 2,4 1,0 1,4 0 -
E.coli 38°C 55°C 0 0 -
6. ZÁVĚR
Mikroorganismy jsou stálým a trvalým nebezpečím ohrožujícím zdraví obyvatelstva a patří dle každoročních zpráv WHO k nejrizikovějším faktorům i ve srovnání s takovými civilizačními chorobami jako je rakovina a AIDS. Zavedení systému kritických kontrolních bodů (Hazard Analysis Critical Control Points − HACCP) systému do potravinářských technologií (v ČR pro výrobu povinné od 1. 1. 2000) vyvolalo tlak na urychlený vývoj metod pro rychlé a specifické stanovení sledovaných parametrů. V oblasti mikrobiologie se pozornost soustředila na potravní patogeny, jejichž stanovení klasickými kultivačními normovanými metodami trvá běžně 5−8 dní (dle náročnosti vyšetření). Z moderních metod, které mohou výrazně snížit dobu stanovení, jsou perspektivní imunochemické a molekulárně-genetické metody, které mají vysokou specificitu. Jejich využívání bylo ověřeno v řadě laboratoří a v současné době jsou ve fázi konečné přípravy návrhy norem založených na těchto stanoveních. Pro snadné a pohodlné používání těchto metod přímo ve výrobních závodech se firmy zabývající mikrobiální detekcí soustředily na přípravu komerčních souprav na principu molekulárně-genetickém nebo imunochemickém a dále na výrobu selektivních specifických
chromogenních
medií.
Vývoj
mikrobiologické
diagnostiky
jde
jednoznačně touto cestou. Dále byl proveden vlastní experiment týkající se zjištění vlivu různých teplot kultivačních půd na kultivaci mikroorganismů, díky kterému jsem si vyzkoušela klasické kultivační metody v praxi, včetně jejich vyhodnocení.
7. SEZNAM LITERATURY •
Betina, V. a kol. (1988): Mikrobiologické laboratórné metódy. Alfa Bratislava, 544s
•
Burdychová, R., Sládková, P. (2007): Mikrobiologická analýza potravin. MZLU Brno, 218s., ISBN 978-80-7375-116-6.
•
Benešová, L., Hrudková, A., Chýleová, L., Kobrová, M., Kopáčová, O., Kvasničková, A., Perlín, C.,Potravinářství ´94,
Ústav zemědělských a
potravinářských informací, Praha, 1996, 159str., ISBN 80-85120-53-4. •
Hianiková, M. (2007): Mikrobiologické hodnocení zeleninových výrobků. Diplomová práce, MZLU Brno.
•
Jay, J. M., Loessner, M. J., Golden, D. A. (2007): Modern Food mikrobiology. Springer USA, 790str., ISBN 0-387-23180-3.
•
Jičínská, E., Havlová, J.: Metody detekce patogenních mikroorganismů v potravinách, Ústav zemědělských a potravinářských informací, Praha, 1996, 115s., ISBN 80-85120-49-6.
•
Komprda, T. (2004): Obecná hygiena potravin. MZLU Brno, 145 s, ISBN 80-7157-757-x.
•
Komprda, T. (2003): Hygiena potravin – cvičení. MZLU Brno, 50 s., ISBN 80-7157-709-x
•
Kvasničková,
B.
(2005):
Využití
vysokých
tlaků
pro
likvidaci
mikroorganismů u ovocných a zeleninových šťáv. Diplomová práce, MZLU Brno.
•
Merck Mikrobiology Manual 12th Edition, 2007, Merck KGaA Germany, 688 s.
•
Sprenger,
R.
(2003):
Hygiena
potravin
pro
středně
pokročilé.
Highfield.co.uk Limited, 128 s., ISBN 1-904544-19-3 •
Suková, I. (1997): Systémy zjišťování jakosti a provádění kontroly v potravinářství. Ústav zemědělských a potravinářských informací, Praha, 88 s., ISBN 80-85120-65-8.
•
Šilhánková P. (2002): Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Academia, 363s., ISBN 80-200-1024-6
•
Vítová E. (2004): Hygiena potravin. VUT v Brně, 128 s., ISBN 80-2142680-2
http://www.chemicke-listy.cz/docs/full/2005_07_467-473.pdf http://www.lachema.cz/cz/blob/mlt-cj.pdf www.noack.cz http://www.answers.com/topic/food-microbiology?cat=technology www.merck.cz http://journals.uzpi.cz/web/index.html www.agral.cz http://www.skatec.cz/mikrob.php?grp=BIO http://www.ssss.cz/files/kpucebnice/p/pv/1/kazeni.htm www.wikipedie.org
8. SEZNAM PŘÍLOH 1.
Obr. 1. Chromogenní půda ke stanovení Bacillus cereus
2.
Obr. 2. Chromogenní půda ke stanovení E. coli
3.
Obr. 3. Chromogenní půda ke stanovení bakterií rodu Salmonella
4.
Obr. 4. Systém Petrifilm
5.
Obr. 5. Biochemické identifikační systémy Microgen
6.
Obr. 6. Přístrojové vybavení – PCR
7.
Obr. 7. Postup při stanovování pomocí PCR
8.
Obr. 8. Postup při stanovení pomocí rychlotestu – L´monotest
Obr. 1 Chromogenní půda ke stanovení Bacillus cereus
Obr. 2 Chromogenní půda ke stanovení E. coli
Obr. 3 Chromogenní půda ke stanovení bakterií rodu Salmonella
Obr. 4 Systém Petrifilm
Obr. 5 Biochemické identifikační systémy Microgen
Obr. 6 Přístrojové vybavení – PCR
Obr. 7 Postup při stanovování pomocí PCR
Obr. 8 Postup při stanovení pomocí rychlotestu – L´monotest
