Kód: EK-80
AFP ELISA készlet Az AFP ELISA készlet humán szérum alfa-fetoprotein (AFP) tartalmának direkt meghatározására szolgál. A készlet 96 meghatározásra elegendo reagenst tartalmaz, amellyel egyszeri standardizálás esetén két párhuzamossal mérve 42 minta AFP koncentrációja határozható meg, a 0–100 IU/ml mérési tartományban.
Tartalom
oldal
Bevezetés A mérés elve A készlet tartalma A készlet felhasználásához szükséges anyagok és eszközök A mérendo minták gyujtése és tárolása A reagensek elokészítése A meghatározás menete Az eredmények számítása Minoségi jellemzok Megjegyzések, tanácsok, hibaforrások Egyéb tudnivalók Biztonsági óvórendszabályok
IZOTÓP INTÉZET KFT, BUDAPEST
1 1 2 2 2 3 3 4 4 5 6 6
Bevezetés Az AFP (alfa-fetoprotein) egy kb. 65 kDa molekulatömegu glikoprotein, amelyet a magzati máj sejtjei választanak ki. Az anyai szérum AFP szintje folyamatosan emelkedik a terhesség 30. hetéig, majd ezután hirtelen lecsökken. Nyitott gerincuség (spina bifida) és placentális rendellenességek esetén az anyai szérum AFP koncentrációja erosen megnövekszik, míg a magzat kromoszómális elváltozása (pl. Down-szindróma) csökkent AFP szinttel társul. Máj karcinóma, here és petefészek teratokarcinómák esetében nagyon gyakran megemelkedik a szérum AFP koncentrációja (>200 IU/ml), míg gyomor, tüdo, prosztata stb. tumoroknál ritkábban. A szérum AFP koncentráció növekedését eredményezhetik egyéb megbetegedések is (pl. hepatitisz stb.).
A mérés elve A készlet muködése a szilárd fázisú immunometrikus assay elvén alapul. Ehhez két olyan monoklonális antitest szükséges, amelyek a molekula két különbözo epitopját ismerik fel. A két antitest egyike jelzett (jelzo antitest), a másik jelöletlen (ún. befogó, vagy "capture" antitest). Az immunokémiai folyamatban a standardokban, illetve a mintákban lévo hormon mindkét antitesttel reagálva immunkomplexet ("szendvics") képez, amely szilárd fázison kötodik, és mennyisége arányos a hormon koncentrációjával. Jelen készletben a szilárd fázis szerepét szabványos, 8x12-es mikrotiter plate látja el, amely 12 db. egysoros egységbol áll. Az immunreakció 37 oC-on 2 óra alatt játszódik le, és a jelzo funkciót torma-peroxidáz (HRPO) enzim látja el, amely peroxid és tetrametilbenzidin (TMB), szubsztrát – kromogén, eleggyel reagálva 450 nmen detektálható jelet hoz létre. A szilárd fázison a jelet (optikai denzitást) szabványos ELISAfotométeren (ELISA-reader) mérjük, a mért jel intenzitása egye-
nesen arányos a rendszerben lévo hormon koncentrációjával. Az ismert koncentrációjú standardok kötési értékei alapján szerkesztett kalibrációs görbérol az ismeretlen minták koncentrációit kötési értékeik alapján visszaolvassuk.
Minoségellenorzési bizonylat Használati utasítás
A készlet felhasználásához szükséges anyagok és eszközök
A készlet tartalma 1 üveg
TRACER, felhasználásra kész. 12 ml pufferes oldat 0,01 % mertiolát és 2 mg/ml klóracetamid (CAA) tartósítóval.
5 üveg
STANDARD (0-4), felhasználásra kész. 5*1 ml szérum-oldat, 2 mg/ml klóracetamid (CAA) tartósítóval, koncentrációjuk O (S 0), 10 (S 1), 25 (S 2), 50 (S 3), 100 (S 4) IU/ml. Kalibrálva a 1 st IS 72/225 WHO preparátumra.
1 üveg
ELLENORZO SZÉRUM, felhasználásra kész. 1 ml szérum 2 mg/ml klóracetamid (CAA) tartósítóval. Várható értékét a mellékelt minoségi bizonylat tartalmazza.
muanyag kémcsövek és kémcsotartó adagoló pipetták, 100, 200 és 300 µl-es eldobható muanyag hegyekkel örvénykevero (vortex) desztillált víz ELISA reagens-tálkák ELISA - termosztát ELISA - fotométer (450 nm hullámhosszra) Ajánlott: 8-csatornás adagoló pipetta orbitális kevero ELISA mosó-automata
A mérendo minták gyujtése és tárolása
1 db
MIKROTITER PLATE, 12 stripet tartalmaz szabványos keretben.
1 üveg
TMB SZUBSZTRÁT, ≥25 ml felhasználásra kész oldat, sötét muanyag flakonban. Fénytol védve tartandó.
1 üveg
MOSÓPUFFER KONCENTRÁTUM 20 ml puffer, 0,01 % mertiolát tartósítóval. Rekonstituálandó 600 ml desztillált vízzel
1 üveg
STOP REAGENS 1 M kénsav
1 db
Plate térkép
A vizsgálandó szérummintákat a más, ugyancsak szérumot igénylo laboratóriumi vizsgálatoknál követett módon készítjük el. Amennyiben az AFP-meghatározás a mintavételt követo 1-2 napon belül megtörténik, a mintákat +2 - +8 °C-on, késobbi felhasználás esetén -18 °C-on mélyhutve tartjuk. A fagyasztott mintákat hagyjuk felolvadni, és felhasználás elott alaposan homogenizáljuk. Kerüljük az ismételt visszafagyasztást. Lipémiás, hemolizált, vagy más szempontból rendellenes szérumot ne használjunk mérésre. A legmagasabb standard értéknél magasabb koncentrációjú mintákat hígítás után ismételten mérjük meg. Hígításhoz fiziológiás sóoldat használható fel.
6 ml
-2-
A reagensek elokészítése
8)
A mérés megkezdése elott engedjük szobahomérsékletre melegedni a reagens oldatokat, beleértve a mérendo mintákat is. A mosó puffer koncentrátumot öntsük hozzá 600 ml desztillált vízhez, így 620 ml hígított mosópuffert kapunk. A kihígított mosóoldatot késobbi felhasználásra +2 - +8 °C-on tároljuk.
Vegyük ki a platet a termosztátból, vegyük le a zárófóliát, és öntsük ki a wellek tartalmát. 8-csatornás ismétlo pipettával adjunk mindegyik wellbe 300 µl mosópuffert, majd öntsük le a felülúszót. Lásd még Megjegyzések 2.
9)
Ismételjük meg egymás után ötször a 8. lépést. Ha rendelkezésre áll ELISA mosó, a hatszori mosást azzal végezzük.
10) Öntsük ki az TMB-szubsztrátot a tálkájába, majd 8-csatornás pipettával adagoljunk minden wellhez 200 µl-t, és hagyjuk szobahomérsékleten, fénytol védve 30 percig. Lásd még Megjegyzések 3.
A meghatározás menete (ld. folyamatábra, 1. táblázat) 1) Készítsük elo a mérendo mintákat, vegyük elo a készletbol a standardokat, az ellenorzo szérumot, a tracert, valamint az ELISA-platet, és hagyjunk mindent szobahomérsékletre melegedni. 2)
3)
4)
11) Adjunk mindegyik wellhez 50 µl stop reagenst, és hagyjuk 5 percig szobahomérsékleten állni. Lásd még Megjegyzések 3. 12) Tegyük a platet a fotométerbe, és végezzük el a mérést 450 nm hullámhosszon.
Jelöljük meg külön plate térképen az alábbi minták pozícióját, 2-2 párhuzamosban: - standardok (S 0-4)(S 0=NSB) - ellenorzo szérum (C) - vizsgálandó minták (Mx) Felhasználás elott a mintákat és az összes reagenst alaposan homogenizáljuk, de kerüljük el a habzást. Öntsük ki a tracert ELISA tálkába.
13) Számítsuk ki az eredményeket a következo fejezet szerint.
Az eredmények számítása Kézi számítás A számítás menetét jellemzo mérési adatokkal szemléltetjük. A kapott számadatoknak, és a kalibrációs görbének hasonlítaniuk kell a 2. táblázathoz, illetve az 1. ábrához. Adatfeldolgozó program hiányában a kiértékelést manuálisan az alábbiak szerint végezzük el:
Mérjünk 100 µl Standardot (S 0-4), 100 µl Ellenorzo szérumot (C), és 100 µl szérummintát (Mx) a megfelelo wellekbe. Az adagolást egy-csatornás pipettával végezzük, és minden reagenshez új pipetta-hegyet használjunk.
5)
Mérjünk minden wellbe 100 µl Tracer oldatot a 8-csatornás pipettával. Lásd még Megjegyzések 1.
6)
Rögzítsük a zárófóliát, és helyezzük az ELISA-termosztátba.
7)
Inkubáljuk a platet 2 órán keresztül 37 °C homérsékleten.
1) 2) 3) 4) -3-
Számítsuk ki a párhuzamosok középértékét. Vonjuk ki az NSB-t (azaz az So OD értékét) a standardok, illetve a minták átlagos OD értékeibol (NSB korrekció). Lin-lin papíron ábrázoljuk a standard koncentrációkhoz tartozó NSB-vel korrigált OD értékeket. Olvassuk le a mérendo minták koncentrációit a standard görbérol az NSB-vel korrigált OD értékek alapján.
1. Táblázat Folyamatábra, Pipettázási kalauz (térfogatok mikroliterben)
Well Reagensek Standard Minta Ellenorzo szérum Tracer
Standard
Minta
standard és az elso standard között is interpolálnak, de a számított koncentrációk közül csak azok tekinthetok valósnak, amelyek értéke magasabb, mint a mérés statisztikailag meghatározott kimutatási határa (ld. ÉRZÉKENYSÉG).
Ellenorzo szérum
100 100
2. táblázat
100 100
AFP IU/ml
100 100 o Inkubálás 37 C-on 2 órán át. Mosópuffer 300 300 300 Felülúszó leöntése Mosás-leöntés ismétlése 5 további ciklusban TMB szubsztrát 200 200 200 Inkubálás szobahomérsékleten 30 percig, fénytol védve. Stop reagens 50 50 50 Inkubálás szobahomérsékleten 5 percig. Fotometriás mérés, kiértékelés
S0 S1 S2 S3 S4 C
0 10 25 50 100 -
0,057 0,214 0,574 1,091 2,159 1,089
O.D.
0,048 0,231 0,628 1,133 2,088 1,000
O.D. átlag
0,053 0,223 0,601 1,112 2,124 1,045
B/Bmax %
2,50 8,212 26,471 51,155 100 30,88
IU/ml
46,367
Minoségi jellemzok Az assay jellemzo paraméterei Bo/Bmax <5% Érzékenység Jelen készlettel az analitikai érzékenység a 0-standarddal 15 párhuzamos mérésbol meghatározva 0,8 IU/ml. Értéke egyenlo a Bo+2*SD kötési értékhez tartozó koncentrációval.
S1-4/Mx (AU) -S0 (AU)
_________________ S4 (AU) - S0 (AU)
AFP O.D.
Egyes adat-kiértékelésekhez, rendszerint minoségellenorzési célból, szükség lehet a specifikus kötési értékekre. Erre a B/Bmax értékek használhatók, amelyek számításához szintén a standardok, illetve minták NSB-vel korrigált értékeit osztjuk a maximális standard OD értékével az alábbi egyenlet szerint: B/Bmax (%) =
Jellemzo mérési eredmények
Specificitás Az assay-ben felhasznált antitestek human szérum albuminnal nem keresztreagálnak.
x 100
Számítógépes adatkiértékelés A korszeru mérokészülékek lehetové teszik a fotometriás mérést követo azonnali ("on-line") számítógépes adatfeldolgozást is. A sokféle feldolgozó program közül jelen készítményhez speciálisan immunometrikus assayre kifejlesztett illeszto programok (spline vagy simított négyzetes spline ) használatát javasoljuk. Ügyeljünk arra, hogy vannak olyan kiértékelo programok, amelyek a O-4-
Pontosság és reprodukálhatóság Az intra-assay pontosságot 15 párhuzamossal egy sorozaton belül, az inter-assay pontosságot 2 párhuzamossal, 15 független mérésben értékelve, 6 mintára az alábbi adatokat kaptuk.
2,4 2,2
AU, O.D. (NSB korr.)
2 1,8 1,6
Intra-assay átlag (IU/ml) CV % 7,25 7,78 15,69 4,83 23,65 7,68 28,06 7,11 43,13 9,83 66,25 7,52
1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2
Inter-assay átlag (IU/ml) CV % 6,72 11,53 16,00 5,90 23,55 4,88 28,74 3,83 46,56 4,53 67,77 4,89
0 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Várható referens tartomány: Férfiak: 0,47 – 5,39 IU/ml Nok: 0,37 – 4,41 IU/ml 16. hetes terhes szérum: 25 IU/ml (1 MoM)
Koncentráció, IU/ml
1. ábra Tipikus standard görbe (Mintameghatározásra nem használható!)
Kóros értékek: hepatocarcinoma: › 100 IU/ml hepatitis: ‹ 100 IU/ml
Nagy-dózisú Hook effektus Az effektus 5000 IU/ml alatti koncentrációban nem jelentkezik.
Megjegyzések, tanácsok, hibaforrások
Ismert mennyiség visszanyerése ( "recovery") Egyéni szérummintákhoz ismert mennyiségu AFP-t adva, a visszanyerés (recovery) 86 ± 7,62 % (középérték ± SD, n= 12).
1) A standardok, ellenorzo minta, szérum minták, valamint a tracer bemérése után a reakcióelegy homogenizálása céljából a plate-t a termosztát keverteto programjával, vagy - ha ez nem áll rendelkezésre - akkor egy keverogép alacsony fordulatszámú használatával kb. 5 másodpercig kevertessük. A kevertetésnél ügyeljünk arra, hogy a wellek tartalma ne fröccsenjen ki.
Hígítási teszt (”linearity”) Egyéni szérumminták nulla standarddal végzett sorozat-hígításakor a várt (x) és a mért (y) koncentráció érték között az alábbi lineáris összefüggés adódott: y=0,9737 x – 0,2657, R = 0.9538, n= 12
-5-
2) Ha nem áll rendelkezésünkre ELISA mosó akkor kézi mosást kell végrehajtanunk, ami a reakcióelegy leöntésébol és 6 db. mosópuffer adagolás - leöntés ciklusból áll. A leöntéseket mindig a plate hirtelen lefordításával végezzük, majd csapkodjuk ki a wellek-ben maradt cseppeket egy nedvszívó papírra. A gyors kiöntésnek elsosorban a reakcióelegy eltávolítása esetén van nagy jelentosége, hiszen ellenkezo esetben a wellek tartalma elszennyezheti egymást, ami meghamisítja a mérést.
Biztonsági óvórendszabályok Fertozésveszély A kitben lévo humán szérumot tartalmazó komponensek eloállításához felhasznált szérum HIV-Ab és HBsAg vizsgálatra negatív eredményt adott. Ennek ellenére a humán szérumot tartalmazó komponenseket potenciálisan fertozoként kell kezelni, és az erre vonatkozó általános laboratóriumi higiénés szabályokat be kell tartani.
3) Ha rendelkezésünkre áll olyan ELISA inkubátor, vagy rázógép, amellyel a plate - a reagensek kifröccsenésének veszélye nélkül rázatható, akkor a szubsztrát reakciók (pNPP, TMB) elején, valamint a stop reagens adagolása után ajánlott egy kb. 10 másodperces óvatos rázatás.
Egyéb tudnivalók Tárolás A készlet komponensei -felbontott reagensek is- 2-8 °C között tárolhatók a lejárati idon belül. A készlet lejárati ideje A készlet a gyártástól számítva általában legalább 16 hétig használható. A pontos lejárati ido a kíséro bizonylaton és a dobozcímkén van feltüntetve. Felhívjuk a figyelmet arra, hogy a különbözo gyártási számú készletek egyes komponensei nem helyettesíthetok sem egymással, sem más gyártó AFP készletének komponenseivel.
-6-
IZOTÓP INTÉZET K ft. 1535 Budapest, Pf.: 851. Tel.: 395-2577 Fax: 395-9247
HONLAP: Technikai e-mail: Kereskedelmi e-mail:
http://www.izotop.hu
[email protected] [email protected]
EK80m/2. verzió/2001.04.12.
-7-
