Kód: EK-76
Bevezetés
ßhCG ELISA készlet A hCG ELISA készlet humán szérum koriongonadotróp hormon (hCG) tartalmának direkt meghatározására szolgál. A készlet 96 meghatározásra elegendo reagenst tartalmaz, amellyel egyszeri standardizálás esetén két párhuzamossal mérve 42 minta hCG koncentrációja határozható meg, a 0 - 100 mIU/ml mérési tartományban.
Tartalom
oldal
Bevezetés ..............................................................................................1 A mérés elve ..........................................................................................1 A készlet tartalma..................................................................................2 A készlet felhasználásához szükséges anyagok és eszközök ................................................................................................2 A mérendo minták gyujtése és tárolása .............................................3 A reagensek elokészítése....................................................................3 A meghatározás menete ......................................................................4 Az eredmények számítása ...................................................................5 Minoségi jellemzok................................................................................6 Megjegyzések, tanácsok, hibaforrások ..............................................6 Egyéb tudnivalók ...................................................................................7 Biztonsági óvórendszabályok ..............................................................7 HONLAP: Technikai e-mail: Kereskedelmi e-mail:
http://www.izotop.hu
[email protected] [email protected]
IZOTÓP INTÉZET KFT, BUDAPEST
A hCG (human koriongonadotróp hormon) kb. 38000-es mólsúlyú glikoprotein, amelyet a placenta sejtjei választanak ki. Hasonlóan a többi glikoprotein hormonhoz (hFSH, hLH, hTSH) a hCG is két különbözo alegységbol tevodik össze, az alfa és a béta láncból, amelyeket nem kovalens kötések kapcsolnak össze. Az alfa lánc aminosav sorrendje (92 aminosavból áll) gyakorlatilag azonos mind a négy hormon esetében, miközben a béta láncok (145 aminosav) eltéro felépítésuek. Az egyes molekulák biológiai sajátságaiért a béta láncok a felelosek. Így a hCG tartalom mérése csak akkor specifikus, ha a meghatározás a ß-alegységen történik.. Az így kapott total ßhCG tartalom tehát magába foglalja az intakt hCG molekulákat, valamint az esetleg jelenlévo szabad ß-alegységet is. A hCG hormon megjelenik a noi szérumban az embrió beágyazódása után körülbelül 5 nappal, és koncentrációja folyamatosan növekszik a terhesség harmadik hónapjáig. A maximális koncentráció akár 100 IU/ml-es értéket is elérhet. A hCG szint ezután lecsökken 25 IU/ml-re, és ezen érték körül marad az utolsó trimeszterig. A hCG koncentráció emelkedik trofoblasztikus és nem trofoblasztikus neopláziában, illetve korionkarcinómában. A hCG koncentráció növekedése férfi és nem terhes noi szérumban ektópiás hormontermelés eredménye. Ektópiás hCG termelést hepatóma, adenokarcinóma, gyomor, méh, tüdo, here és áttételes mell daganat okozhat.
A mérés elve A készlet muködése a szilárd fázisú immunometrikus assay elvén alapul. Ehhez két olyan monoklonális antitest szükséges, amelyek a molekula két különbözo epitopját ismerik fel. A két antitest egyike
jelzett (jelzo antitest), a másik jelöletlen (ún. befogó, vagy "capture" antitest). Az immunokémiai folyamatban a standardokban, illetve a mintákban lévo hormon mindkét antitesttel reagálva immunkomplexet ("szendvics") képez, amely szilárd fázison kötodik, és mennyisége arányos a hormon koncentrációjával. Jelen készletben a szilárd fázis szerepét szabványos, 8x12-es mikrotiter plate látja el, amely 12 db. egysoros egységbol áll. Az immunreakció 37 oC-on 2 óra alatt játszódik le, és a jelzo funkciót torma-peroxidáz (HRPO) enzim látja el, amely peroxid és tetrametilbenzidin (TMB), szubsztrát – kromogén, eleggyel reagálva 450 nmen detektálható jelet hoz létre. A szilárd fázison a jelet (optikai denzitást) szabványos ELISAfotométeren (ELISA-reader) mérjük, a mért jel intenzitása egyenesen arányos a rendszerben lévo hormon koncentrációjával. Az ismert koncentrációjú standardok kötési értékei alapján szerkesztett kalibrációs görbérol az ismeretlen minták koncentrációit kötési értékeik alapján visszaolvassuk.
5 üveg
ELLENORZO SZÉRUM, felhasználásra kész. 1 ml szérum 2 mg/ml klóracetamid (CAA) tartósítóval. Várható értékét a mellékelt minoségi bizonylat tartalmazza.
1 db
MIKROTITER PLATE, 12 db. stripet tartalmaz szabványos keretben. TMB SZUBSZTRÁT, ≥25 ml felhasználásra kész oldat, sötét muanyag flakonban. Fénytol védve tartandó. MOSÓPUFFER KONCENTRÁTUM 20 ml puffer, 0,01 % mertiolát tartósítóval. Rekonstituálandó 600 ml desztillált vízzel. HÍGÍTÓ SZÉRUM. 15 ml puffer, 2 mg/ml CAA tartósítóval. További üveg hígító szérumok rendelhetok. STOP REAGENS 6 ml 1 M kénsav
1 üveg
1 üveg
1 üveg
1 üveg
A készlet tartalma 1 üveg
1 üveg
TRACER, felhasználásra kész. 12 ml pufferes oldat 0,01 % mertiolát és 2 mg/ml klóracetamid (CAA) tartósítóval. STANDARD (0-4), felhasználásra kész. 5*1 ml szérum-oldat, 2 mg/ml klóracetamid (CAA) tartósítóval, koncentrációjuk O (S 0), 10 (S 1), 25 (S 2), 50 (S 3), 100 (S 4) mIU/ml. Kalibrálva a 3 rd IRP Int. Std. WHO preparátumra.
1 db.
Plate térkép
1 db
Minoségellenorzési bizonylat
1 db
Használati utasítás
A készlet felhasználásához szükséges anyagok és eszközök muanyag kémcsövek és kémcsotartó adagoló pipetták, 100, 200 és 1000 µl-es eldobható muanyag hegyekkel örvénykevero (vortex) desztillált víz ELISA reagens-tálkák -2-
ELISA - termosztát ELISA - fotométer (450 nm hullámhosszra) Ajánlott: 8-csatornás adagoló pipetta orbitális kevero ELISA mosó-automata
terhes szérumot, valamint a már azonosítottan magas hCG koncentrációjú mintákat hígítsuk a mellékelt hígító szérummal. A javasolt hígítási eljárás: 1. lépés: 10 µl minta + 190 µl hígító szérum (1:20 hígítás) 2. lépés: 10 µl 1:20 hígított minta (1. lépés alapján) + 490 µl hígító szérum (1: 1000 végso hígítási arány).
A mérendo minták gyujtése és tárolása A vizsgálandó szérummintákat a más, ugyancsak szérumot igénylo laboratóriumi vizsgálatoknál követett módon készítjük el. Amennyiben a hCG-meghatározás a mintavételt követo 1-2 napon belül megtörténik, a mintákat +2 - +8 °C-on, késobbi felhasználás esetén -18 °C-on mélyhutve tartjuk. A fagyasztott mintákat hagyjuk felolvadni, és felhasználás elott alaposan homogenizáljuk. Kerüljük az ismételt visszafagyasztást. Lipémiás, hemolizált, vagy más szempontból rendellenes szérumot ne használjunk mérésre.
A reagensek elokészítése A mosópuffer koncentrátum kivételével minden reagens felhasználásra kész. A mosópuffer koncentrátumot öntsük hozzá 600 ml desztillált vízhez, így 620 ml hígított mosópuffert kapunk. A kihígított mosóoldatot késobbi felhasználásra +2 - +8 °C-on tároljuk. A mérés megkezdése elott engedjük szobahomérsékletre melegedni a reagens oldatokat, beleértve a mérendo mintákat is. Ha készletet terhességi tesztként, vagy tumor marker meghatározásra használjuk, a vizsgálandó szérumot hígítatlanul mérjük meg. Terhes szérumok esetében a minták koncentrációja meghaladja a a standardsor mérési tartományát (> 100 mIU/ml), ezért minden -3-
10) Öntsük ki az TMB-szubsztrátot a tálkájába, majd 8-csatornás pipettával adagoljunk minden wellhez 200 µl-t, és hagyjuk szobahomérsékleten, fénytol védve 30 percig. Lásd még Megjegyzések 3.
A meghatározás menete (ld. folyamatábra, 1. táblázat) 1)
2)
3)
Készítsük elo a mérendo mintákat, vegyük elo a készletbol a standardokat, az ellenorzo szérumot, a tracert, valamint az ELISA-platet, és hagyjunk mindent szobahomérsékletre melegedni. Jelöljük meg külön plate térképen az alábbi minták pozícióját, 2-2 párhuzamosban: - standardok (S 0-4)(S 0=NSB) - ellenorzo szérum (C) - vizsgálandó minták (Mx) Felhasználás elott a mintákat és az összes reagenst alaposan homogenizáljuk, de kerüljük el a habzást. Öntsük ki a tracert ELISA tálkába.
4)
Mérjünk 100 µl Standardot (S 0-4), 100 µl Ellenorzo szérumot (C), és 100 µl szérummintát (Mx) a megfelelo wellekbe. Az adagolást egy-csatornás pipettával végezzük, és minden reagenshez új pipetta-hegyet használjunk.
5)
Mérjünk minden wellbe 100 µl Tracer oldatot a 8-csatornás pipettával. Lásd még Megjegyzések 1.
6)
Rögzítsük a zárófóliát, és helyezzük az ELISA-termosztátba.
7)
Inkubáljuk a platet 2 órán keresztül 37 °C homérsékleten.
8)
Vegyük ki a platet a termosztátból, vegyük le a zárófóliát, és öntsük ki a wellek tartalmát. 8-csatornás ismétlo pipettával adjunk mindegyik wellbe 300 µl mosópuffert, majd öntsük le a felülúszót. Lásd még Megjegyzések 2.
9)
11) Adjunk mindegyik wellhez 50 µl stop reagenst, és hagyjuk 5 percig szobahomérsékleten állni. Lásd még Megjegyzések 3.
1. Táblázat Folyamatábra, Pipettázási kalauz (térfogatok mikroliterben)
Well Reagensek Standard Minta Ellenorzo szérum Tracer
Standard
Minta
Ellenorzo szérum
100 100 100 100
100 100 Inkubálás 37 oC-on 2 órán át. Mosópuffer 300 300 300 Felülúszó leöntése Mosás-leöntés ismétlése 5 további ciklusban TMB szubsztrát 200 200 200 Inkubálás szobahomérsékleten 30 percig, fénytol védve. Stop reagens 50 50 50 Inkubálás szobahomérsékleten 5 percig. Fotometriás mérés, kiértékelés 12) Tegyük a platet a fotométerbe, és végezzük el a mérést 450 nm hullámhosszon. 13) Számítsuk ki az eredményeket a következo fejezet szerint.
Ismételjük meg egymás után ötször a 8. lépést. Ha rendelkezésre áll ELISA mosó, a hatszori mosást azzal végezzük. -4-
koncentrációk közül csak azok tekinthetok valósnak, amelyek értéke magasabb, mint a mérés statisztikailag meghatározott kimutatási határa (ld. ÉRZÉKENYSÉG).
Az eredmények számítása Kézi számítás A számítás menetét jellemzo mérési adatokkal szemléltetjük. A kapott számadatoknak, és a kalibrációs görbének hasonlítaniuk kell a 2. táblázathoz, illetve az 1. ábrához. Adatfeldolgozó program hiányában a kiértékelést manuálisan az alábbiak szerint végezzük el: 1) 2) 3) 4)
2. táblázat
Jellemzo mérési eredmények ßhCG mIU/ml
S0 S1 S2 S3 S4 C
Számítsuk ki a párhuzamosok középértékét. Vonjuk ki az NSB-t (azaz az So OD értékét) a standardok, illetve a minták átlagos OD értékeibol (NSB korrekció). Lin-lin papíron ábrázoljuk a standard koncentrációkhoz tartozó NSB-vel korrigált OD értékeket. Olvassuk le a mérendo minták koncentrációit a standard görbérol az NSB-vel korrigált OD értékek alapján.
0 10 25 50 100 -
ßhCG O.D.
0,043 0,255 0,712 1,471 2,442 1,744
O.D.
0,047 0,283 0,728 1,470 2,368 1,680
O.D. átlag
0,045 0,269 0,720 1,471 2,405 1,712
B/Bmax %
1,871 9,314 28,066 59,293 100 69,314
mIU/ml
67,761
3 2,8 2,6 2,4 AU, O.D. (NSB korr.)
Egyes adat-kiértékelésekhez, rendszerint minoségellenorzési célból, szükség lehet a specifikus kötési értékekre. Erre a B/Bmax értékek használhatók, amelyek számításához szintén a standardok, illetve minták NSB-vel korrigált értékeit osztjuk a maximális standard OD értékével az alábbi egyenlet szerint: S1-4/Mx (AU) -S0 (AU)
B/Bmax (%) =
_________________ S4 (AU) - S0 (AU)
2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8
x 100
0,6 0,4 0,2
Számítógépes adatkiértékelés
0 0
A korszeru mérokészülékek lehetové teszik a fotometriás mérést követo azonnali ("on-line") számítógépes adatfeldolgozást is. A sokféle feldolgozó program közül jelen készítményhez speciálisan immunometrikus assayre kifejlesztett illeszto programok (spline vagy simított négyzetes spline ) használatát javasoljuk. Ügyeljünk arra, hogy vannak olyan kiértékelo programok, amelyek a Ostandard és az elso standard között is interpolálnak, de a számított
20
40
60
80
Koncentráció, mIU/ml
1. ábra Tipikus standard görbe (Mintameghatározásra nem használható!) -5-
100
Minoségi jellemzok Intra-assay átlag (mIU/ml) CV % 4,30 11,07 12,74 4,34 28,53 8,65 62,14 4,99 76,19 2,89 83,93 4,83
Az assay jellemzo paraméterei Bo/Bmax <5% Érzékenység Jelen készlettel az analitikai érzékenység a 0-standarddal 15 párhuzamos mérésbol meghatározva 1,5 mIU/ml. Értéke egyenlo a Bo+2*SD kötési értékhez tartozó koncentrációval.
Inter-assay átlag (mIU/ml) CV % 4,84 18,46 12,59 14,85 26,84 10,44 56,73 5,06 70,69 7,58 80,57 6,56
Funkcionális érzékenység Várható referens tartomány: Egészséges felnottekben a referens tartomány: ≤ 5 mIU/ml. 16. hetes terhes szérum: 33 000 mIU/ml (1 MoM)
A készlet funkcionális érzékenysége 4 mIU/ml. Meghatározása alacsony hCG tartalmú minták 15 független méréssorozatban kapott inter-assay imprecíziós profiljából történt, értéke egyenlo egyenlo az imprecíziós görbe 22 %-os metszéspontjához tartozó hCG koncentrációval.
Kóros értékek: Daganatos szérum koncentrációk: >20 mIU/ml
Nagy-dózisú Hook effektus Az effektus 30000 mIU/ml alatti koncentrációban nem jelentkezik.
Megjegyzések, tanácsok, hibaforrások 1) A standardok, ellenorzo minta, szérum minták, valamint a tracer bemérése után a reakcióelegy homogenizálása céljából a plate-t a termosztát keverteto programjával, vagy - ha ez nem áll rendelkezésre - akkor egy keverogép alacsony fordulatszámú használatával kb. 5 másodpercig kevertessük. A kevertetésnél ügyeljünk arra, hogy a wellek tartalma ne fröccsenjen ki.
Specificitás Az assay-ben felhasznált antitestek keresztreakciója human TSH-ra 0,18 %, human LH-ra 0,37 % és human FSH-ra 0,05 %. Ismert mennyiség visszanyerése ( "recovery") Egyéni szérummintákhoz ismert mennyiségu hCG-t adva, a visszanyerés (recovery) 91 ± 11,6 % (középérték ± SD, n= 16).
2) Ha nem áll rendelkezésünkre ELISA mosó, akkor kézi mosást kell végrehajtanunk, ami a reakcióelegy leöntésébol és 6 db. mosópuffer adagolás - leöntés ciklusból áll. A leöntéseket mindig a plate hirtelen lefordításával végezzük, majd csapkodjuk ki a wellek-ben maradt cseppeket egy nedvszívó papírra. A gyors kiöntésnek elsosorban a reakcióelegy eltávolítása esetén van nagy jelentosége, hiszen ellenkezo esetben a wellek tartalma elszennyezheti egymást, ami meghamisítja a mérést.
Pontosság és reprodukálhatóság Az intra-assay pontosságot 15 párhuzamossal egy sorozaton belül, az inter-assay pontosságot 2 párhuzamossal, 15 független mérésben értékelve, 6 mintára az alábbi adatokat kaptuk.
-6-
3) Ha rendelkezésünkre áll olyan ELISA inkubátor, vagy rázógép, amellyel a plate - a reagensek kifröccsenésének veszélye nélkül rázatható, akkor a szubsztrát reakciók (pNPP, TMB) elején, valamint a stop reagens adagolása után ajánlott egy kb. 10 másodperces óvatos rázatás.
Egyéb tudnivalók Tárolás A készlet komponensei -felbontott reagensek is- 2-8 °C között tárolhatók a lejárati idon belül. A készlet lejárati ideje A készlet a gyártástól számítva általában legalább 16 hétig használható. A pontos lejárati ido a kíséro bizonylaton és a dobozcímkén van feltüntetve. Felhívjuk a figyelmet arra, hogy a különbözo gyártási számú készletek egyes komponensei nem helyettesíthetok sem egymással, sem más gyártó hCG készletének komponenseivel.
Biztonsági óvórendszabályok Fertozésveszély A kitben lévo humán szérumot tartalmazó komponensek eloállításához felhasznált szérum HIV-Ab és HBsAg vizsgálatra negatív eredményt adott. Ennek ellenére a humán szérumot tartalmazó komponenseket potenciálisan fertozoként kell kezelni, és az erre vonatkozó általános laboratóriumi higiénés szabályokat be kell tartani.
-7-
IZOTÓP INTÉZET K ft. 1535 Budapest, Pf.: 851. Tel.: 392-2577 Fax: 395-9247
-8-
EK-76m/3. verzió/2001.10.08.
-9-
