Uji Proliferasi dan Ekspresi P53 Ekstrak Etanol Minyak Buah Merah Terhadap Sel Kanker Servik SiHa Agung Wiwiek Indrayani1, Ida Ayu Ika Wahyuniari2, I Gusti Ayu Artini1 Bagian Farmakologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Udayana Denpasar 2 Bagian Histologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Udayana Denpasar
1
ABSTRAK Latar Belakang: Buah merah (Pandanus conoideus Lam.) secara empiris telah digunakan untuk pengobatan kanker. Buah merah mengandung ß-carotene dan αtocopherol, yang merupakan sumber antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek antiproliferasi dan ekspresi tumor supressor gene p53 ekstrak etanol minyak buah merah (EEMBM) pada sel kanker servik SiHa. Metode: Uji proliferasi dan uji ekspresi p53 dilakukan secara in vitro. Uji proliferasi menggunakan enam variasi dosis EEMBM dan dievaluasi dengan metode tryphan blue staining setelah inkubasi selama 24, 48, dan 72 jam. Uji ekspresi tumor supresor gene p53 menggunakan tiga variasi dosis EEMBM dan dievaluasi dengan metode imunohsitokimia setelah inkubasi selama 24 jam. Hasil: Hasil penelitian menunjukkan bahwa persentase penghambatan proliferasi sel kanker servik SiHa oleh EEMBM pada dosis tertinggi (0,125 µg/mL) setelah inkubasi selama 24, 48 dan 72 jam berturut-turut adalah 97,97%; 100,0%; dan 100,0%. Bila dibandingkan dengan kontrol positif (doksorubisin), persentase penghambatan sel kanker pada dosis tertinggi setelah inkubasi 24, 48 dan 72 jam berturut-turut adalah 85,31%; 94,43%; dan 99,82%. Terdapat perbedaan bermakna pada persentase penghambatan proliferasi sel kanker servik SiHa antar kelompok uji pada masing-masing waktu inkubasi (p<0,001). EEMBM juga meningkatkan ekspresi tumor supresor gene p53 pada dosis 0,06250; 0,03125; dan 0,01562 µg/mL berturut-turut sebesar 43,69%; 61,99%; dan 18,14%. Bila dibandingkan dengan kontrol positif, ekspresi p53 pada tiga variasi dosis (3,75; 1,875; 0,9375 µg/mL) berturut-turut sebesar 42,63%; 41,88%; dan 35,94%. Terdapat perbedaan bermakna pada ekspresi p53 antar kelompok uji (p<0,001). Kesimpulan: Ekstrak etanol minyak buah merah memiliki efek antiproliferasi dan dapat meningkatkan ekspresi tumor suppressor gene p53 pada sel kanker servik SiHa in vitro. Kata Kunci: Ekstrak etanol minyak buah merah, efek antiproliferasi, ekspresi tumor suppressor gene p53, sel kanker servik SiHa
The Study of Antiproliferative Effect and P53 Expression of Red Fruit Oil Ethanol Extract on Cervix Cancer Cell Line SiHa Agung Wiwiek Indrayani1, Ida Ayu Ika Wahyuniari2, I Gusti Ayu Artini1 Department of Pharmacology, Faculty of Medicine, Udayana University Denpasar 2 Department of Histology, Faculty of Medicine, Udayana University Denpasar
1
ABSTRACT Backgrounds: The red fruit (Pandanus conoideus Lam.) has been used for cancer treatment empirically. It contains ß-carotene and α-tocopherol, which are the source of antioxidant. Aim of our study was to investigate anti proliferative effect and tumor supresor gene p53 expression of red fruit oil ethanol extract on cervix cancer cell line SiHa. Methods: Proliferation and tumor supressor gene p53 expression studies were performed in vitro. The study of antiproliferative effect was conducted in six dose variations of red fruit oil ethanol extract and evaluated using tryphan blue staining methods after 24, 48, and 72 hours of incubation. The study of tumor supressor gene p53 expression was performed in three dose variations of red fruit oil ethanol extract and was evaluated using imunocytochemistry staining method after 24 hours of incubation. Results: The result showed that the proportion of proliferation inhibition on cervix cancer cell line SiHa induced by red fruit oil ethanol extract at highest concentration (0.125 µg/mL) after 24, 48, and 72 hours of incubation were 97.97%; 100.0%; and 100.0%, respectively. If compared with positive control (doxorubicin), the proportion of proliferation inhibition on cervix cancer cell at its highest concentration after 24, 48, and 72 hours of incubation were 85.31%; 94.43%; and 99.82%, respectively. There were significance differences in the proportion of proliferation inhibition among groups in each incubation period (p<0,001). The result also showed that red fruit oil ethanol extract increased tumor supressor gene p53 expression at concentration 0.06250; 0.03125; and 0.01562 µg/mL by 43.69%; 61.99%; and 18.14%, respectively. If compared with positive control, its p53 expression at three dose variations (3.75; 1.875; 0.9375 µg/mL) were 42.63%; 41.88%; and 35.94%, respectively. There were significance differences in the p53 expression among groups (p<0,001). Conclusions: In conclusion, red fruit oil ethanol extract has antiproliferative effect and increases tumor suppressor gene p53 expression on cervix cancer cell line SiHa in vitro. Keywords: Red fruit oil ethanol extract, antiproliferative effect, tumor suppressor gene p53 expression, cervix cancer cell line SiHa
PENDAHULUAN Kanker merupakan penyebab kematian kedua di dunia.1,2 Di Indonesia, kanker menempati
peringkat
keenam
penyebab
kematian
sesudah
penyakit
infeksi,
kardiovaskular, kecelakaan lalu lintas, defisiensi nutrisi dan penyakit kongenital.3 Insiden kanker di Indonesia diperkirakan 100 orang per seribu penduduk per tahun atau sekitar 200.000 penduduk per tahun.2 Berdasarkan sepuluh kanker primer pada wanita di Indonesia, kanker leher rahim menduduki posisi pertama.3 Masalah utama yang saat ini dihadapi dalam pengobatan kanker adalah toksisitas dari kemoterapi terhadap jaringan normal. Sejak diketahui beberapa bahan kemoterapi mempengaruhi sintesis asam nukleat dan protein, maka sel kanker maupun sel normal akan dihancurkan. Penghambatan terhadap sel normal inilah yang bertanggung jawab terhadap timbulnya efek samping yang tidak diharapkan dari obat antikanker.4 Paparan radiasi dan agen kemoterapi menginduksi apoptosis dengan mekanisme yang diinisiasi oleh kerusakan DNA dan melibatkan tumor supressor gene p53. Gen ini berakumulasi ketika DNA rusak dan menghentikan siklus sel pada fase G1 untuk menambah waktu DNA repair. Bila DNA repair gagal, maka p53 akan memicu apoptosis. Apabila terjadi mutasi pada p53 maka ketahanan hidup sel akan meningkat dan terjadi disregulasi apoptosis. Penurunan apoptosis dan memanjangnya ketahanan hidup sel akan mengakibatkan terjadinya akumulasi sel dengan hasil akhir kanker.5,6 Salah satu upaya alternatif pengobatan yang sudah dirintis sejak jaman dulu adalah pemanfaatan fitofarmaka, menggali kandungan unsur kimiawi dalam tumbuh-tumbuhan yang potensial untuk dikembangkan sebagai obat. Buah merah (Pandanus conoideus Lam) merupakan salah satu bahan makanan yang memiliki kandungan senyawa
antioksidan yang sangat tinggi, yaitu karotenoid, tokoferol, dan vitamin C.7,8 Beberapa penelitian telah membuktikan bahwa beberapa jenis antioksidan berperan dalam menghambat proliferasi dan menginduksi apoptosis, sehingga mempunyai potensi cukup besar dalam pengobatan kanker.9,10 Hingga saat ini belum dijumpai penelitian yang mengkaji aktivitas penghambatan proliferasi dan ekspresi p53 buah merah pada sel kanker serviks SiHa. Oleh karena itu, dilakukan penelitian mengenai hal tersebut untuk membuktikan secara ilmiah efek buah merah terhadap proliferasi sel dan ekspresi p53 sel kanker servik, sehingga dapat menjadi dasar bagi penelitian lanjutan untuk pengembangan buah merah sebagai fitofarmaka antikanker.
METODE Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Minyak buah merah didapatkan dari Drs. I Made Budi, yaitu peneliti kandungan senyawa aktif buah merah yang juga membudidayakan tanaman buah merah di Papua. Uji Proliferasi dengan Metode Tryphan Blue Exclusion Assay Sel kanker yang akan diberi perlakuan diinkubasi selama 24 jam pada mikrokultur 96 sumuran di dalam inkubator CO2 5% 37oC, dengan jumlah sel 1,5x104/sumuran. Penghitungan jumlah sel dilakukan sebelum diberi perlakuan atau pada jam ke-0. Selanjutnya bahan uji diberikan dengan enam variasi konsentrasi yaitu 0,1250; 0,0625; 0,03125; 0,01562; 0,00781; dan 0,00391 µg/mL. Doksorubisin digunakan sebagai kontrol positif dengan enam variasi dosis yaitu 15; 7,5; 3,75; 1,875; 0,9375; dan 0,46875 µg/mL.
Sebagai kontrol negatif digunakan sel kanker yang diberi media RPMI 1640 tanpa perlakuan. Tiap konsentrasi dilakukan tiga ulangan (triplikat). Sel kanker yang telah diberi perlakuan diinkubasi selama 24, 48, dan 72 jam pada suhu 37ºC dengan aliran CO2 5% serta dihitung pertumbuhan sel secara visual tiap 24, 48, dan 72 jam. Penghitungan sel yang mengalami kematian diamati secara visual dengan menggunakan tryphan blue exclusion assay. Sel yang hidup (viabel) akan tampak membulat, berwarna putih mengkilat, dan bersinar. Sel yang mati (non viabel) akan berwarna biru tua dan ukurannya lebih besar daripada sel hidup. Persentase penghambatan proliferasi sel kanker servik SiHa didapat dengan membandingkan sel yang hidup pada perlakuan dengan bahan uji dan sel hidup pada kelompok tanpa perlakuan. Uji Ekspresi P53 dengan Metode Imunositokimia Sel kanker yang akan diberi perlakuan diinkubasi selama 24 jam pada plate 24 sumuran di dalam inkubator CO2 5% 37oC, dengan jumlah sel 20.500x103 /sumuran. Penghitungan jumlah sel dilakukan sebelum diberi perlakuan atau pada jam ke-0. Selanjutnya bahan uji diberikan dengan tiga variasi konsentrasi. Sebagai kontrol negatif digunakan sel kanker yang diberi media RPMI 1640 tanpa perlakuan sedangkan kontrol positif menggunakan doksorubisin. Tiap konsentrasi dilakukan tiga ulangan (triplikat). Sel kanker kemudian difiksasi dan dilakukan pengecatan kemudian dihitung sel yang mengekspresikan gen p53 secara visual. Jumlah sel yang mengekspresikan p53 dihitung setiap 100 sel per lapang pandang. Sel yang mengekspresikan p53 akan tampak berwarna kecoklatan pada inti selnya.
HASIL Efek Antiproliferasi Ekstrak Etanol Minyak Buah Merah pada Sel Kanker Servik SiHa Hasil pengamatan morfologi sel kanker servik yang hidup dan mati dapat dilihat pada Gambar 1. Sel yang hidup (viabel) akan tampak membulat, berwarna putih mengkilat, dan bersinar. Sel yang mati (non viabel) akan berwarna biru tua dan ukurannya lebih besar daripada sel hidup.
Gambar 1. Morfologi sel kanker servik SiHa dengan pewarnaan tryphan blue (400x) Tanda panah biru menunjukkan sel yang hidup sedangkan tanda panah hitam menunjukkan sel yang sudah mati.
Persentase penghambatan proliferasi sel kanker servik SiHa didapat dengan membandingkan sel yang hidup pada perlakuan dengan bahan uji dan sel hidup pada kelompok tanpa perlakuan. Nilai rerata jumlah sel kanker servik SiHa yang hidup dan persentase penghambatan proliferasi sel kanker servik SiHa setelah diberi perlakuan dengan bahan uji ditunjukkan pada Tabel 1.
Tabel 1. Rerata jumlah sel kanker servik SiHa yang hidup dan persentase penghambatan proliferasi sel kanker servik SiHa setelah pemberian bahan uji pada inkubasi 24, 48 dan 72 jam
Bahan Uji Ekstrak Etanol Minyak Buah Merah
Doksoru bisin
Kontrol negatif
Inkubasi (jam)
Konsen trasi (µg/mL)
0 N (103 )
N (103 )
0,125
20.500,00
833,33
97,97±1,86
0,00
100,00±0,00
0.00
0,0625 0,3125 0,01562 0,00781 0,00391 15 7,5 3,75 1,875 0,9375 0,46875
20.500,00 20.500,00 20.500,00 20.500,00 20.500,00 20.500,00 20.500,00 20.500,00 20.500,00 20.500,00 20.500,00 20.500,00
13.333,33 20.500,00 25.000,00 28.833,33 33.000,00 6000,00 12.500,00 16.166,67 18.666,67 21.833,33 25.166,67 40.833,33
67,35±2,49 49,80±3,02 38,77±0,43 29,39±2,45 19,18±1,35 85,31±2,45 69,39±1,24 60,41±0,61 54,28±1,59 46,53±2,46 38,36±0,62 0,00±0,00
20.166,67 34.000,00 50.333,33 59.833,33 69.000,00 4.666,67 8.666,67 14.166,67 17.500,33 19.333,33 23.000,00 84.000,00
75,95±0,73 59,44±1,32 39,96±0,72 28,63±0,68 17,69±0,85 94,43±0,36 89,66±0,91 83,30±1,15 79,13±1,19 76,55±0,85 72,56±0,60 0,00±0,00
26.666,67 51.333,33 99.333,33 116.333,33 145.166,67 333,33 1.166,67 2.666,67 2.666,67 3.000,00 3.166,67 189.500,00
#
24* P (%±SD)
N (103 )
48* P (%±SD)
N (103 )
72* P (%±SD) 100,00±0,00 85,93±1,08 72,91±1,23 47,58±0,65 38,61±0,85 23,39±0,61 99,82±0,15 99,38±0,41 98,59±0,40 98,59±0,15 98,42±0,01 98,33±0,15 0,00±0,00
0,00
N menyatakan rerata jumlah sel kanker servik SiHa yang hidup setelah perlakuan (x 10 3) P menyatakan persentase penghambatan proliferasi sel kanker servik SiHa setelah perlakuan (%±SD) # Inkubasi jam ke-0 merupakan jumlah sel kanker servik SiHa setelah diinkubasikan 24 jam sebelum diberikan perlakuan dengan bahan uji * menunjukkan terdapat perbedaan bermakna antar kelompok pada masing-masing waktu inkubasi (p<0,001)
Peningkatan konsentrasi ekstrak etanol minyak buah merah akan menyebabkan peningkatan persentase penghambatan proliferasi sel kanker. Setelah dilakukan inkubasi 24 jam, ekstrak etanol minyak buah merah pada konsentrasi tertinggi (0,1250 µg/mL) mampu menghambat pertumbuhan sel kanker sebesar 97,97±1,86%, sedangkan doksorubisin pada konsentrasi tertinggi (15 µg/mL) mampu menghambat pertumbuhan sel kanker sebesar 85,30±2,43%. Hal ini juga tampak setelah inkubasi 48 dan 72 jam. Terdapat perbedaan bermakna pada persentase penghambatan proliferasi antar kelompok pada inkubasi 24, 48 dan 72 jam (Tabel 1). Pada kelompok kontrol negatif semakin lama masa inkubasi semakin banyak sel kanker servik SiHa yang tumbuh. Jumlah sel kanker yang hidup setelah diberikan bahan uji untuk masing-masing waktu inkubasi 24, 48, serta 72 jam lebih rendah dibandingkan
kelompok kontrol negatif (Tabel 1). Hal ini membuktikan baik ekstrak etanol minyak buah merah maupun doksorubisin mempunyai kemampuan penghambatan proliferasi sel kanker servik SiHa.
Ekspresi p53 pada Sel Kanker Servik SiHa oleh Ekstrak Etanol Minyak Buah Merah Gambaran mikroskopis sel kanker servik SiHa yang tidak mendapat perlakuan (kontrol negatif), yang mendapat ekstrak etanol minyak buah merah dan yang mendapat doksorubisin setelah dilakukan pengecatan imunositokimia p53 dapat dilihat pada Gambar 2. Sel yang mengekspresikan p53 akan tampak berwarna kecoklatan pada intinya. Kontrol negatif
Buah Merah
Doksorubisin
Gambar 2. Ekspresi tumor supressor gene p53 sel kanker servik SiHa (400x) Tanda panah hitam menunjukkan ekspresi tumor supressor gene p53.
Perbandingan nilai rerata persentase ekspresi tumor supresor gen p53 setelah perlakuan dengan ekstrak etanol minyak buah merah dan doksorubisin dapat dilihat pada Gambar 3. Ekstrak etanol minyak buah merah meningkatkan ekspresi tumor supresor gen p53 pada beberapa tingkat dosis yaitu pada dosis 0,06250 µg/mL dengan ekspresi p53 sebesar 43,69±2,16%; dosis 0,03125 µg/mL dengan ekspresi p53 sebesar 61,99±1,89% dan dosis 0,01562 µg/mL dengan ekspresi p53 sebesar 18,14±1,162%. Kontrol positif (doksorubisin) juga meningkatkan ekspresi tumor supresor gen p53 pada dosis 3,75 µg/mL dengan nilai sebesar 42,63±0,91%; dosis 1,875 µg/mL sebesar 41,88±1,79%; dan dosis 0,9375 µg/mL sebesar 35,94±0,47% (Gambar 3). Terdapat perbedaan bermakna pada ekspresi p53 antar kelompok uji (p<0,001).
70 60 50 persentase
40 30
Ekstrak etanol minyak buah merah
20 10 0
Doksorubisin
0,016
0,063
1,875
dosis
Gambar 3. Grafik persentase ekspresi tumor supresor gen p53 sel kanker servik SiHa pada masing-masing konsentrasi ekstrak etanol minyak buah merah dan doksorubisin.
PEMBAHASAN Buah merah mengandung 12.000 ppm total karotenoid, 11.000 ppm total tokoferol, 700 ppm betakaroten, 500 ppm alfa tokoferol, asam oleat 58 %, asam linoleat 8,8 %, asam linoleat 7,8 %, dekanoat 2,0 %. Berdasarkan kandungan yang dimilikinya yang kaya
dengan antioksidan maka buah merah dapat dikaji aktivitasnya pada sel kanker dalam hal ini cell line kanker servik SiHa.7,8 Pada penelitian ini terlihat baik ekstrak etanol minyak buah merah maupun doksorubisin menyebabkan penghambatan proliferasi yang ditandai dengan kematian sel kanker yang meningkat. Ketidakseimbangan yang terjadi pada gen-gen yang mengontrol proliferasi, apoptosis, serta diferensiasi merupakan karakteristik utama sel kanker. Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa beberapa jenis antioksidan mempunyai efek terhadap aktivitas proliferasi ataupun apoptosis sel kanker. Vitamin E, C, dan beberapa fitokimia selektif menginduksi apoptosis pada sel kanker dan sedikit pada sel normal.9 Bukti in vitro menunjukkan bahwa vitamin E dan selenium bekerja secara sinergis untuk menyebabkan cell-cycle arrest, menginduksi apoptosis yang diperantai oleh caspase.10 Antioksidan selenium menghambat proliferasi sel kanker prostat melalui beberapa mekanisme seperti peningkatan fungsi sistem imun dan menginduksi apoptosis.11 Penelitian lain yang menunjukkan bahwa antioksidan dapat menghambat proliferasi sel kanker adalah penelitian isoflavones pada sel kanker yang diambil dari saluran gastrointestinal. Hasil penelitian tersebut menunjukkan dua derivat isoflavone yakni biochanin A dan genistein menghambat proliferasi sel pada cell line kanker lambung melalui aktivasi transduksi sinyal apoptosis.12 Antioksidan lain yang mempunyai kemampuan menghambat proliferasi adalah flavonoid quercetin. Pada penelitian yang dilakukan Kaneuchi et al. (2003) dijumpai bahwa quercetin menghambat proliferasi pada adenokarsinoma endometrial manusia dengan cara menurunkan regulasi reseptor epidermal growth factor dan gen D1 cyclin.13 Penelitian lain memperlihatkan flavonoid quercetin yang merupakan antioksidan mempunyai penghambatan proliferasi
terhadap sel kanker prostat melalui penghambatan ekspresi onkogen dan gen yang mengatur siklus sel pada G1, S, G2, dan M.14 Ekstrak etanol minyak buah merah terbukti secara in vitro dapat meningkatkan ekspresi p53 pada sel kanker servik. Tumor supressor gene p53 merupakan gen yang mengatur siklus sel dan apoptosis. Apabila terdapat kerusakan DNA, protein p53 akan mengistirahatkan siklus sel dan memberikan waktu kepada sel untuk memperbaiki DNA, dan jika kerusakan tidak dapat diperbaiki maka p53 berfungsi sebagai proapoptotic signal. Kehilangan ekspresi p53 atau terjadinya mutasi pada p53 akan menyebabkan tidak stabilnya gen yang akan menyebabkan terbentuknya kanker. Gen p53 menekan terbentuknya formasi tumor serta menghambat progresi yang malignan dengan cara mengeliminasi kerusakan dan mengeliminasi sel yang berpotensi menjadi sel kanker melalui cell cycle arrest, apoptosis, atau mekanisme repair.15,16 Beberapa penelitian mengenai efek antioksidan terhadap ekspresi p53 telah dilakukan beberapa peneliti. Penelitian yang dilakukan oleh Liu et al. (1998) menggunakan
antioksidan
sulfur
yang
mengandung
N-acetylcysteine
dan
dimercatopropanolol yang dapat menginduksi apoptosis pada cell line. Melalui penelitian ini diketahui bahwa N-acetylcysteine meningkatkan ekspresi p53 posttranskripsi dengan meningkatkan p53 mRNA translasi.17 Pada penelitian yang dilakukan oleh Ding et al. (2007) diketahui aktivitas peningkatan p53 protein pada HPV positive cervical carcinoma cells diantagonis oleh E6 onkoprotein. Penelitian ini menunjukkan pemberian antioksidan dapat meningkatkan ekspresi p53 dan meningkatkan ketahanan terhadap H2O2 yang menginduksi kerusakan oksidatif dibanding cell line HeLa, CaSki, dan MEI 180.18 Penelitian Yaginuma dan Westphal (1991) pada tumor servik positive human papilloma
virus (HPV) yaitu HeLa, S-3, CaSki, SiHa, C-41 dan MEI-180, menjelaskan bahwa tidak aktifnya p53 terjadi melalui mekanisme viral E6/cellular p53 protein association.19 Antioksidan pyrrolidine-dithiocarbamate (PDTC) dikatakan memodifikasi beberapa faktor transkripsi yang penting dalam susunan komplek transkripsi spesifik HPV, sehingga terjadi penekanan selektif terhadap ekspresi gen virus.20
KESIMPULAN Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol minyak buah merah mempunyai aktivitas penghambatan proliferasi dan meningkatkan ekspresi tumor supressor gene p53 pada sel kanker servik SiHa in vitro.
DAFTAR PUSTAKA
1.
King RJB. Cancer Biology. Second edition. England: Pearson Education Limited, 2000.
2.
Dalimartha S. Ramuan Tradisional untuk Pengobatan Kanker. Jakarta: Penebar Swadaya, 2002.
3. Tjindarbumi D dan Mangunkusomo R. Cancer in Indonesia: Present and Future. Japan Journal of Clinical Oncology 2002; 32(1):17-21. 4.
Brodsky I, Crilley P, dan Terzian AEL. Cancer Chemotherapy in Basic Pharmacology in Medicine. Singapore: McGraw-Hill Publishing Company, 1990: 549-565.
5.
Aswin S. Biologi Molekuler Kematian Sel Terprogram. Yogyakarta: Pertemuan Ilmiah Tahunan Ilmu Penyakit Dalam FK UGM, 2002.
6.
Totok U. Kematian sel Terprogram (Apoptosis). Yogyakarta: Pertemuan Ilmiah Tahunan Ilmu Penyakit Dalam FK UGM, 2002.
7.
Budi M dan Paimin FR. Buah Merah. Jakarta: Penebar Swadaya, 2004.
8.
Budi M, Hartono, Setyanova I. Tanya-jawab Seputar Buah Merah. Jakarta: Penebar Swadaya, 2005.
9. Borek C. Dietary Antioxidants and Human Cancer. Integrative Cancer Therapies 2004; 3(4):333-341. 10. Klein EA. Selenium and Vitamin E Cancer Prevention Trial. New York Academic Science 2004; 1031:234-241. 11. Klein EA, Thompson IM, dan Lippman SM. Selenium and Vitamin E Cancer Prevention Trial. Journal of Urology 2001; 166:1311-5. 12. Yanagihara K, Ito A, Toge T, dan Numoto M. Antiproliferative Effects of Isoflavones on Human Cancer Cell Lines Established from the Gastrointestinal Tract. Cancer Research 1993; 53(23):5815-21. 13. Kaneuchi M, Sasaki M, Tanaka Y, Sakuragi S, Fujimoto S, dan Dahiya R. Quercetin Regulates Growth of Ishikawa Cells Through the Suppresion of EGF and Cyclin D1. International Journal of Oncology 2003; 22:159-164. 14. Nair HK, Rao KVK, Aalinkeel R, Mahajan S, Chawda R, dan Schwartz SA. Inhibition of Prostate Cancer Cell Colony Formation by the Flavonoid Quercetin
Correlates with Modulation of Specific Regulatoy Genes. Medical and Diagnostic Laboratory Immunology 2003; 11(1):63-69. 15. Hietanen S, Lain S, Krausz E, Blattner C, dan Lane DP. Activation of p53 in Cervical Carcinoma Cell by Small Molecules. PNAS 2000; 95(15):8501-8506. 16. Kastan MB dan Skapek SX. Molecular Biology of Cancer in the Cell Cycle in Cancer Principle & Practice of Oncology. Sixth edition. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins, 2001. 17. Liu M, Pelling JC, Ju J, Chu E, dan Brash DE. Antioxidant Action via p53 Mediated Apoptosis. Cancer Research 1998; 58:1723-1729. 18. Ding B, Chi GS, Kim SH, Kang S, Cho JH, Kim DS, dan Cho NH. Role of p53 in Antioxidant Defense of HPV-Positive Cervical Carcinoma Cells Following H2O2 Exposure. Journal of Cell Science 2007; 120:2284-2294. 19. Yaginuma Y dan Wetphal H. Analysis of the p53 Gene in Human Uterine Carcinoma Cell Lines. Cancer Research 1991; 51: 6506-6509. 20. Frank R, Das CB, Lengert M, Geldneky K, dan Hausen HZ. Antioxidant-Induced Changes of the AP-1 Transcription Complex are Paralled by a Selective Suppresion of Human Papillomavirus Transcription. Journal of Virology 1997; 71(1):362-370.
