0422: Tedjo Sasmono dkk.
KO-199
IDENTIFIKASI GENOTIPE DAN KARAKTERISASI GENOME VIRUS DENGUE DI INDONESIA UNTUK PENENTUAN PROTOTIPE VIRUS BAHAN PEMBUATAN VAKSIN DENGUE BERBASIS STRAIN INDONESIA Tedjo Sasmono1), Benediktus Yohan1),Tri Yuli Setianingsih1),Aryati2,3), Puspa Wardhani2,3), Fedik. A. Rantam3) Lembaga Biologi Molekuler Eijkman, Jl. Diponegoro 69, Jakarta 10430 Departemen Patologi Klinik dan 3)Lembaga Penyakit Tropis, Universitas Airlangga, Surabaya 1)
2)
Disajikan 29-30 Nop 2012
ABSTRAK Demam Berdarah Dengue saat ini masih merupakan penyakit virus terpenting di dunia, termasuk di Indonesia yang merupakan negara endemis penyakit ini. Penyakit ini disebabkan oleh virus dengue yang terdiri dari 4 serotipe yakni DEN-1, DEN-2, DEN-3, dan DEN-4. Saat ini belum tersedia obat untuk penyakit ini, demikian juga dengan vaksin, sehingga penanggulangan penyakit ini umumnya bergantung pada tatalaksana penderita dan pengendalian vektor nyamuk. Seperti penyakit lain yang disebabkan oleh virus, penyakit dengue bisa dicegah dengan vaksinasi. Saat ini beberapa pihak sedang mengembangkan vaksin dengue dan uji klinis vaksin ini juga sedang dilaksanakan di Indonesia. Walaupun ada kemungkinan keberhasilan vaksin dengue yang sedang diuji klinis saat ini, masih ada kemungkinan kegagalan atau ketidaksempurnaan vaksin tersebut untuk memberikan perlindungan terhadap infeksi dengue, terutama disebabkan karena faktor keragaman genetik virus dengue. Konsorsium Vaksin Dengue di Indonesia saat ini sedang mencoba mengembangkan vaksin dengue berbasis strain lokal Indonesia. Salah satu langkah awal pengembangan vaksin dengue adalah penyediaan strain virus prototipe yang akan dijadikan kandidat vaksin. Untuk itu, perlu dilakukan identifikasi genotipe dan karakterisasi genetik virus dengue di Indonesia, dengan harapan bisa menyediakan informasi dalam pemilihan strain lokal virus untuk seed vaksin.Dalam penelitian tahun pertama ini, telah dilakukan pengumpulan sampel isolat virus dengue dari delapan kota di Indonesia. Dari sampel-sampel tersebut, telah diketahui jenis-jenis serotipe virus dengue di Indonesia, di mana semua serotipe virus dengue beredar di Indonesia. Dari semua jenis serotipe tersebut, telah dilakukan penelitian mendalam untuk melihat genotipe dari masing-masing serotipe virus. Untuk virus DEN-1, genotipe yang beredar di Indonesia adalah Genotipe I dan IV, kemudian untuk DEN-2, genotipe yang ada adalah Genotipe Cosmopolitan. Selanjutnya DEN-3 didominasi oleh Genotipe I, serta DEN-4 didominasi oleh Genotipe II. Karakterisasi genetik terhadap virus dengue dilakukan lebih mendalam dengan melakukan pengurutan genom lengkap virus sebanyak 25 isolat. Variasi genetik didapatkan dari hasil analisa genom virus tersebut. Dari hasil penelitian ini, virus dengue yang secara genetik paling umum ditemukan di Indonesia akan dipilih sebagai prototipe virus yang selanjutnya akan digunakan dalam pengembangan vaksin dengue strain Indonesia oleh Konsorsium Vaksin Dengue Indonesia. Kata kunci: Dengue, genetik, genotipe, genom lengkap, vaksin
I. PENDAHULUAN Penyakit demam dengue (DD) merupakan salah satu penyakit virus terpenting pada manusia yang ditularkan melalui gigitan nyamuk dari genus Aedes. Penyakit ini menyerang hampir 50 juta orang di dunia setiap tahunnya dan sekitar 500.000 individu dirawat di rumah sakit akibat demam berdarah dengue [1]. Kebanyakan kasus dengue adalah asimptomatik ataupun demam ringan yang kemudian bias sembuh dengan sendirinya. Akan tetapi pada kasus tertentu, demam dengue bias berkembang menjadi keadaan yang lebih parah yang bias dikenali sebagai demam
berdarah dengue (DBD) dan sindrom renjatan dengue (SRD), yang apabila tidak ditangani dengan baik bias menjadi fatal [2]. Di wilayah Asia Tenggara, Indonesia menempati peringkat pertama dalam jumlah kasus per tahunnya (WHO-SEARO 2010). Kasus DBD pertama dilaporkan di Surabaya dan Jakarta pada tahun 1968, dan sejak saat itu jumlah kasus DBD meningkat. Kejadian luar biasa terjadi pada tahun 1988, 1998, dan 2004[3]. Infeksi oleh satu serotipe virus dengue menghasilkan kekebalan seumur hidup terhadap serotipe tersebut. Namun, tidak terdapat kekebalan protektif silang antar
0422: Tedjo Sasmono dkk.
KO-200 serotipe sehingga seseorang yang tinggal di area yang endemik dengue dapat terinfeksi oleh lebih dari satu serotipe virus dalam hidupnya [1]. Virus dengue yang merupakan anggota familia Flaviviridae memiliki empat serotipe, yaitu: DEN-1, DEN-2, DEN-3, dan DEN-4. Genom virus dengue berupa RNA (Ribonucleic Acid, asam ribonukleat) untai tunggal berukuran kurang lebih 10,7 kilo basa (kb). Seperti halnya dengan virus lainnya, virus dengue mempunyai keragaman genetik yang disebabkan oleh laju mutasi yang tergolong cepat, seperti tampak pada adanya kelompok-kelompok virus yang mempunyai kemiripan genetik dalam satu serotipe, yang lazim disebut sebagai “genotipe”. Masing-masing serotipe virus dengue mempunyai beberapa genotipe, misalnya Genotipe I-IV pada DEN-1, Genotipe Cosmopolitan dan Asian pada DEN-2 dan sebagainya [4]. Terdapat paling tidak dua aspek yang berhubungan dengan keragaman genetik/genotipe virus dengue. Pertama adalah bahwa genotipe tertentu mempunyai penyebaran geografis yang khas dan hanya dtemukan di daerah tertentu di dunia, misalnya genotipe III dari DEN-1 yang tersebar di Amerika, India, dan Asia Tenggara, sedangkan genotipe I DEN-1 hanya terbatas di Asia Tenggara [4]. Aspek kedua adalah bahwa genotipe virus dengue bisa jadi berhubungan dengan keganasan penyakit, misalnya genotipe American dari DEN-2 diketahui menyebabkan derajat keparahan yang lebih rendah daripada genotipe Asian dari DEN-2 [4]. Penyebaran geografis genotipe virus dengue yang tidak seragam dan terjadinya perpindahan genetik serta keluar masuknya genotipe-genotipe tertentu virus dengue di suatu daerah bisa berimplikasi terhadap pengembangan vaksin dengue. Vaksin dengue didisain untuk memberikan imunitas terhadap semua serotipe, namun bisa jadi tidaklah mampu memberikan imunitas silang yang sempurna [5]. Hal yang mungkin terjadi adalah bahwa suatu vaksin yang dibuat dengan menggunakan virus dengue yang berbeda genotipenya dengan genotipe yang beredar di suatu daerah tidak memberikan imunitas sempurna. Sebagai contoh adalah vaksin dengue yang saat ini sedang dikembangkan oleh pabrikan Sanofi Pasteur, yang menggunakan seed vaksin dengue DEN-1, -2, -3 dari Thailand dan DEN-4 dari Indonesia [6], apakah nantinya vaksin tersebut bisa benarbenar protektif terhadap virus-virus yang beredar di Indonesia? Penelitian awal kami [7] menemukan adanya perbedaan genotipe virus dengue di Indonesia dengan strain virus untuk vaksin tersebut. Hal-hal inilah yang membuat penelitian mengenai aspek genetik virus dengue secara detil sampai mencakup urutan nukleotida genome lengkap di Indonesia diperlukan. Konsorsium Vaksin Dengue Indonesia pada saat ini berupaya untuk mengembangkan vaksin dengue dengan menggunakan strain virus lokal dari Indonesia. Penelitian bersama dimulai dari karakterisasi genetik virus dengue dari berbagai daerah di Indonesia, pemilihan prototipe virus
yang akan digunakan untuk pembuatan vaksin, pembuatan vaksin dengan metode a.l. live attenuation, rekombinan virus dll. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan karakterisasi genetik virus-virus dengue Indonesia melalui pemetaan serotipe dan genotipe virus dengue, pengurutan genome lengkap virus dengue, karakterisasi biologis, serta pemilihan strain virus yang selanjutnya akan dipakai dalam pembuatan seed vaksin dengue. Pada makalah ini, akan dilaporkan hasil penelitian tahun pertama.
II. METODOLOGI Pengumpulan isolat virus dilakukan bersama-sama dengan anggota konsorsium dari delapan kota di Indonesia yang meliputi Jakarta, Surabaya, Medan, Denpasar, Makassar, Samarinda, Jayapura, danKendari. Isolasi virus dilakukan secara langsung dari serum pasien atau setelah propagasi pada kultur sel C6/36.Ekstraksi RNA virus dilakukan menggunakan QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen). Deteksi virus dan penentuan serotype virus dilakukan menggunakan metode Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction (RT-PCR) berdasarkan metode Lanciotti et al(1992) [8] dan Harris et al (1998) [9]. Penentuan genotipe virus dengue dilakukan dengan pengurutan (sequencing) gen E (Envelope) di fasilitas DNA sequencing Lembaga Eijkman. Analisis filogenetik dilakukan terhadap sekuen gen E menggunakan model Minimum Evolution dengan model substitusi Tamura-Neidan 500 replikasi boot strap yang terdapat pada program MEGA versi 5 [10]. KlasifikasiisolatkedalamgenotipedilakukanpadamasingmasingserotipeberdasarkanklasifikasiGoncalvezet al (2002) [11], Twiddyet al (2003) [12],Lanciottiet al (1994) [13] dan Lanciottiet al (1997) [14] masing-masing untuk DEN-1, DEN2, DEN-3, dan DEN-4 secara berurutan. Pengurutan genome lengkap (whole genome sequencing) dilakukan terhadap virus-virus perwakilan masing-masing serotipe. Metode yang digunakan adalah sesuai dengan metode Ong et al (2008) [15] (sekuens primer lengkap dapat dilihat pada referensi tsb). Hasil pengurutan lengkap genome virus dengue dilakukan pensejajaran untuk dilihat homologi dan keragaman dari genom. Secara bersamaan, dilakukan karakterisasi biologis dari virus-virus terpilih untuk melihat karakter pertumbuhannya. Analisa pertumbuhan dilakukan dengan menggunakan metode plaque assay[16] ataupun dengan mengukur jumlah kopi genome menggunakan metode RT-PCR.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN Peta serotipe virus dengue di Indonesia Dalam penelitian ini, dilakukan pemetaan virus dengue untuk mengetahui penyebaran keempat serotipe virus. Hal ini perlu dilakukan untuk mendapatkan gambaran nyata
0422: Tedjo Sasmono dkk. serotipe apa saja yang ada dan dominan di Indonesia. Sampel didapatkan dalam kurun waktu 2010 sampai 2012 di delapan kota di Indonesia. Dari semua sampel dilakukan deteksi secara molekuler untuk konfirmasi infeksi dan dilakukan penetuan serotipenya. Tidak semua sampel berhasil diketahui serotipenya. Demikian juga dengan genotipenya, tidak semua sampel bisa ditentukan genotipenya. Hal ini bisa sebabkan a.l. karena kualitas sampel yang buruk sehingga menyebabkan terjadinya degradasi RNA virus yang menyebabkan tidak berhasilnya amplifikasi cetakan DNA untuk penentuan serotipe dan genotipe. Selain itu, bisa jadi pengambilan sampel dilakukan setelah masa viremia sehingga virus tidak berada dalam jumlah yang cukup dalam darah untuk deteksi secara molekuler. Jumlah sampel deteksi dan serotipe dapat dilihat di Tabel 1. Table 1. Jumlah sampel dan penentuan serotipe serta genotipe.
Untuk serotipe virus dengue, selama waktu penelitian, didapatkan hasil bahwa semua jenis serotipe dengue ada di Indonesia. Di beberapa kota misalnya Surabaya dan Jayapura, DEN-1 tampak mendominasi, sedangkan di kota lain seperti di Medan dan Denpasar, DEN-3 yang lebih banyak dijumpai (Gambar 1). Data ini memberikan gambaran terkini penyebaran virus dengue di Indonesia dan menjadi modal awal untuk memperoleh data selajutnya.
KO-201 Peta genotipe virus dengue Setelah mengetahui sebaran serotipe virus, dilakukan penelitian lebih mendalam mengenai genotipe virus dari masing-masing serotipe. Mengunakan analisis filogenetik berdasarkan sekuens gen E dan dibandingkan dengan virusvirus referensi dari berbagai negara, didapatkan data genotipe dengue di Indonesia (Tabel 2, data pohon filogeni tidak ditampilkan di sini). Seperti yang terlihat pada Tabel 2, untuk virus serotipe DEN-1, di Indonesia bersirkulasi dua macam genotipe, yakni Genotipe I dan IV. Genotipe IV adalah genotipe lama yang sudah beredar di Indonesia sejak lama [15], sedangkan Genotipe I tampaknya merupakan genotipe yang ditemukan baru-baru ini. Untuk DEN-2, virus-virus yang beredar di Indonesia termasuk dalam Genotipe Cosmopolitan (Tabel2). Genotipe ini cukup merata penyebarannya di dunia dan di Indonesia pun genotipe ini mendominasi. Untuk DEN-3, penyebaran virus dengue didominasi oleh Genotipe I. Kemudian untuk virus DEN-4, genotipe yang umum ditemukan di Indonesia adalah Genotipe II (Table II).Berdasarkan hasil ini, secara umum bisa dikatakan bahwa data genotipe virus dengue di Indonesia sudah diketahui. Informasi ini bisa menjadi dasar untuk penentuan strain virus dari genotipe apa yang dominan saat ini. Dari aspek pemilihan genotipe virus untuk kandidat seed vaksin, bisa dipilih genotipe-genotipe dominan. Untuk DEN-1, karena jumlah Genotipe I dan IV hampir seimbang, bisa dipakai kedua genotipe tersebut, sedangkan untuk DEN-2, -3, dan -4, bisa dipilih genotipegenotipe seperti terlihat pada Tabel 2. Table 2. Data genotipe virus dengue di berbagai kota di Indonesia. Data dari kota dengan tanda bintang adalah data lama dari publikasi sebelumnya.
Karakteristik genetik virus dengue Indonesia dilihat dari sekuens genomnya Gambar 1. Distribusi serotipe dengue di 8 kota di Indonesia tahun 2010-2012. Angka dalam grafik batang menunjukkan jumlah sampel yang berhasil ditentukan serotipenya.
Untuk melihat lebih dalam karakteristik genetik virus dengue di Indonesia, dilakukan pengurutan genome lengkap terhadap beberapa isolat virus dengue yang mewakili masing-masing serotipe. Rencana awal untuk kegiatan penelitian ini adalah masing-masing serotipe akan diurutkan genom lengkapnya sebanyak 10 isolat (total 40
KO-202 genom). Pada kegiatan tahun pertama ini, berhasil dilakukan pengurutan genome lengkap terhadap 25 isolat virus. Isolatisolat yang sudah berhasil diurutkan genom lengkapnya adalah seperti terlihat pada Tabel 3. Karena panjangnya genom dari masing-masing virus, data sekuens genom tersebut tidak dapat kami tampilkan di sini. Pengurutan genom akan dilanjutkan pada tahun kedua penelitian.
0422: Tedjo Sasmono dkk. virus-virus yang dikoleksi (Gambar 2C). Hal ini menandakan bahwa virus-virus DEN-2 di Indonesia cukup stabil secara genetis.
Table 3. Isolat virus dengue dari beberapa kota yang sudah berhasil diurutkan genom lengkapnya.
Sebagai langkah awal untuk melihat keragaman genetik virus dengue di Indonesia, dilakukan pensejajaran sekuens asam amino (AA) dari gen-gen tertentu yakni gen Envelope (E) dan gen Non-structural Protein 1 (NS1). Gen E merupakan penyandi protein Envelope yang berfungsi dalam menempelnya virus dengue dan fusi virus kedalamsel inang [17]. Selain itu, protein ini merupakan protein struktural yang paling conserved serta target dari antibodi netralisasi [18]. Adapun protein NS1 merupakan protein yang berperan dalam replikasi virus [19] dan merupakan protein target untuk vaksin. Virus-virus yang beredar sebelumnya, yakni tahun 2004 dan 2005 [15], digunakan sebagai referensi. Dari hasil pensejajaran AA protein E, terlihat bahwa secara umum virus dengue Serotipe 1bisa dibedakan dalam dua kelompok genotipe, yakni Genotipe I dan IV (Gambar 2A dan B). Virus-virus Genotipe I tampak lebih sedikit variasi AA-nya (8 variasi per 495 AA di protein E) dibandingkan dengan virus-virus Genotipe IV (8/495). Hal ini bisa mengindikasikan bahwa virus Genotipe I merupakan virus yang belum lama masuk ke Indonesia dan lebih sedikit mengalami perubahan genetik dibanding Genotipe IV.Untuk virus-virus DEN-2, pensejajaran AA gen E menunjukkan relatif sedikitnya perubahan genetik pada
Gambar 3. Pensejajaran asam-amino protein E isolat virus dengue. Hanya ditampilkan urutan AA yang mengalami perubahan dari total 495 AA di protein E DEN-1, -2, dan -4 serta 493 AA dari DEN-3. Kemudian untuk DEN-3, didapatkan variasi AA protein E yang cukup banyak (Gambar 3D) yang mengindikasikan kedinamisan karakteristik genetik virus ini di Indonesia. Sedangkan untuk DEN-4, hanya ditemui sedikit perubahan AA di protein E (Gambar 3E) yang menandakan stabilnya sifat genetik serotipe ini di Indonesia. Untuk pensejajaran urutan AA pada protein NS1, terdapat pola yang agak mirip dengan pada protein E. DEN1 juga dikelopmokkan dalam dua genotipe, yakni I dan IV. Genotipe I lebih sedikit bervariasi AA nya dibanding Genotipe IV (Gambar 4A dan B). Kemudian untuk DEN-2, variasi AA juga lebih sedikit (5 AA dalam 352) yang menandakan stabilnya genetik virus ini (Gambar 4C). Untuk DEN-3, keragaman genetik mirip dengan yang ada pada protein E (Gambar 4D). Sedangkan DEN-4 menunjukkan adanya variasi genetik yang lebih banyak daripada DEN-2
0422: Tedjo Sasmono dkk. (Gambar 4E) yang mengindikasikan terjadinya dinamisasi protein NS1. Hasil yang didapat dalam penelitian ini belumlah final karena masih akan dilanjutkan pada tahun ke dua. Akan tetapi dari hasil analisa genetik di atas, bisa diambil kesimpulan sementara bahwa terdapat variasi genetik pada tingkatan genotipe untuk DEN-1, sedangkan untuk serotipe lainnya, hanya ada satu genotipe yang dominan.
KO-203 pada Gambar 5. Terlihat adanya kemiripan laju pertumbuhan virus antara keduanya. Hasil ini masih perlu dikonfirmasi dengan menggunakan lebih banyak isolat dan juga menggunakan sel mamalia sebagai inang pertumbuhan, yang akan dilakukan pada tahun kedua penelitian.
IV. KESIMPULAN Dari hasil yang didapat selama tahun pertama penelitian ini, beberapa kesimpulan dapat diambil. Di Indonesia saat ini beredar keempat serotipe virus dengue yakni DEN-1, -2, 3, dan -4. Dominasi serotipe bervariasi tergantung dari kota yang diteliti. Dari serotipe-serotipe yang ada di Indonesia, didapatkan data bahwa DEN-1 terdiri dari Genotipe I dan IV, DEN-2 termasuk dalam Genotipe Cosmopolitan, DEN-3 didominasi Genotipe I, dan DEN-4 termasuk Genotipe II. Terdapat variasi genetik pada masing-masing serotipe walaupun pada umumnya masih cukup seragam. Genome lengkap dari 25 isolat virus sudah berhasil diurutkan. Penelitian lebih lanjut akan dilaksanakan pada tahun kedua. Informasi genetik yang didapatkan diharapkan bisa digunakan dalam pemilihan strain virus bahan pembuatan vaksin dengue Indonesia.
Gambar 5. Kinetik pertumbuhan dua isolat virus yang diukur selama 72 jam. Gambar 4. Pensejajaran asam-amino protein NS1 isolat virus dengue. Hanya ditampilkan urutan AA yang mengalami perubahan dari total 352 AA di protein NS1. Setelah diketahui karakteristik genetik virus dengue di Indonesia, penelitian akan dilanjutkan untuk melihat karakteristik biologis virus dengan melihat kecepatan pertumbuhan virus in vitro. Pada tahun pertama ini, sudah mulai dilakukan perbandingan kecepatan pertumbuhan virus dengan cara ditumbuhkan pada sel nyamuk C6/36 dan dipantau kecepatan replikasi dengan melihat jumlah kopi genom virus yang dihasilkan selama pertumbuhan virus tersebut. Isolat virus yang mulai dilihat kinetik pertumbuhannya adalah virus yang mewakili Genotipe I dan IV dari DEN-1. Hasil awal yang didapatkan bisa dilihat
DAFTAR PUSTAKA [1]
[2] [3]
[4]
Guzman MG, Halstead SB, Artsob H, et al. Dengue: a continuing global threat. Nat Rev Microbiol. 2010; 8 (12Suppl) : S7-16. Halstead SB. Dengue.Lancet.2007 Nov 10;370 (9599):1644-52. Review. Kusriastuti R. Dengue Problems in Indonesia. The 2nd Tuberculosis and Dengue International Symposium. Novartis-Eijkman-Hassanudin Clinical Research Institute. Universitas Hassanudin, Makasar. 2009. Holmes EC, RNA virus genomics: a world of possibilities. J Clin Invest. 2009, 119:9
KO-204 [5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
[15]
[16]
[17]
[18]
[19]
Whitehead, S.S., Blaney, J.E., Durbin, A.P., and Murphy, B.R. Prospects for a dengue virus vaccine. Nat. Rev. Microbiol. 2007; 5:518–528. Guy B, Saville M, Lang J. Development of Sanofi Pasteur tetravalent dengue vaccine. Hum Vaccin. 2010 Sep 16;6(9). Sasmono RT, Wahid I, Trimarsanto H, et al. Molecular Epidemiology of Dengue Viruses from MakassarIndonesia.2012Submitted for publication. Lanciotti RS, Calisher CH, Gubler DJ, et al. Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. J Clin Microbiol. 1992;30(3):545-51. Harris E, Roberts TG, Smith L, et al. Typing of dengue viruses in clinical specimens and mosquitoes by singletube multiplex reverse transcriptase PCR. J Clin Microbiol. 1998;36(9):2634-9. Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Mol Biol Evol. 2011;28(10):2731-9. Goncalvez AP, Escalante AA, Pujol FH, et al. Diversity andevolution of the envelope gene of dengue virus type 1. Virology. 2002;303(1):110-9. Twiddy SS, Farrar JJ, Vinh Chau N, et al. Phylogenetic relationships and differential selection pressures among genotypes of dengue-2 virus. Virology. 2002;298(1):6372. Lanciotti RS, Lewis JG, Gubler DJ, Trent DW. Molecular evolution and epidemiology of dengue-3 viruses. J Gen Virol. 1994;75(1):65-75. Lanciotti RS, Gubler DJ, Trent DW. Molecular evolution and phylogeny of dengue-4 viruses. J Gen Virol. 1997;78(9):2279-84. Ong SH, Yip JT, Chen YL, et al. Periodic re-emergence of endemic strains with strong epidemic potential-a proposed explanation for the 2004 Indonesian dengue epidemic. Infect Genet Evol. 2008 Mar;8(2):191-204. Fink, J., Gu, F., Ling, et al.. Host gene expression profiling of dengue virus infection in cell lines and patients. PLoS Negl Trop Dis 2007 (1) e86. Chen Y, Maguire T, Marks RM.Demonstration of binding of dengue virus envelope protein to target cells.J Virol. 1996 Dec;70(12):8765-72. Mandl CW, Guirakhoo F, Holzmann H, Heinz FX, Kunz C.Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level, using tick-borne encephalitis virus as a model.J Virol. 1989 Feb;63(2):564-71. Mackenzie JM, Jones MK, Young PR. Immunolocalization of the dengue virus nonstructural glycoprotein NS1 suggests a role in viral RNA replication.Virology. 1996 Jun 1;220(1):232-40.
0422: Tedjo Sasmono dkk.
