Skrining Fitokimia Metabolit Sekunder pada Daun Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) untuk Uji In Vitro Daya Hambat Pertumbuhan Aeromonas hydrophila (Phytochemical Screening of Secondary Metabolite in Binahong Leaves (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) to Test In Vitro Inhibitation Growth of Aeromonas hydrophila) Prita Yulianti Anasta br G1 , Mohammad Basyuni2, Indra Lesmana3 1. Program Studi Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara 2. Staff Pengajar Program Studi Kehutanan, Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara 3. Staff Pengajar Program Studi Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara
ABSTRACT Binahong leaves are one of natural product to be used to treat the disease of living organisme due to having secondary metabolite to show antibacterial activity. The purpose of this research was to study secondary metabolite of Binahong leaves of which showing antibacterial, to analysis effectivity of antibacterial Binahong leaves extract to inhibit growth of bacteria Aeromonas hydrophila. An experimental laboratory with six treatments and three replications for in vitro was tested. A paper disc soaked in a solution of Binahong leaves extract was used for in vitro at a concentration of 0% (w/v); 0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; positive control (Oxytetracycline). In vitro test showed that Binahong leaves extract inhibited the growth of bacteria A. hydrophila with a inhibition area around the paper disc. Diameter Inhibition area that formed was 0 mm ( 0 % negative control ), 8.4 mm (0.2 %), 9.4 mm (0.4 %), 10.5 mm (0.6 % ) ; 11 , 9 mm (0.8 % ), 27.5 mm (positive control). The increase concentration of Binahong leaves extract enhanced the growth inhibition area. Phytochemical screening of Binahong leaves extract showed that the extracts contained flavonoid, phenol, saponin, alkaloid, steroid/triterpenoid. Keywords : Binahong leaves, Aeromonas hydrophila, flavonoid, phenol, saponin, alkaloid, triterpenoid, β –sitosterol 1.
PENDAHULUAN Melihat potensi perairan dan sumber daya manusia serta sumber daya ikan yang ada dan untuk menjaga kelestarian sumberdaya perikanan serta memenuhi kebutuhan manusia akan produk perikanan, maka budidaya ikan di Indonesia merupakan salah satu usaha yang
dapat dilakukan. Budidaya ikan juga mengalami beberapa masalah. Masalah yang sering terjadi dalam proses budidaya ikan terbesar adalah terjadinya serangan penyakit (Ghufran dan Kordi, 2004). Satu diantara beberapa penyakit yang sering menyebabkan kematian ikan adalah penyakit
Motile Aeromonads Septicaemia (MAS). Penyakit MAS disebabkan oleh infeksi bakteri Aeromonas hydrophila. (Aoki, 1999). Penggunaan bahan-bahan alami untuk mengendalikan penyakit yang menyerang ikan perlu ditingkatkan untuk menggantikan bahan-bahan kimia yang dapat mengakibatkan pencemaran lingkungan. Satu diantara beberapa bahan-bahan alami yang dapat digunakan untuk pengendalian penyakit yaitu daun binahong. Tanaman binahong (Anredera cordifolia (Ten) Steenis) adalah tanaman obat potensial yang dapat mengatasi berbagai jenis penyakit (Manoi, 2009). Melihat manfaat dari tanaman binahong maka diperkirakan tanaman tersebut memiliki berbagai macam kandungan senyawa metabolit sekunder yang berguna dalam pengobatan penyakit. Oleh karena itu diperlukan skrining fitokimia untuk mengetahui kandungan senyawa metabolit sekunder yang terkandung di tanaman tersebut. Berdasarkan hal tersebut maka dilakukan penelitian untuk melihat apakah daun binahong (A. cordifolia) dapat digunakan untuk menghambat pertumbuhan bakteri A. hydrophila.
Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun binahong, etanol 96%, asam klorida (HCl) 2N, etil asetat, akuades, besi (III) klorida (FeCl3) 1%, pereaksi Liebermann-Bouchard, pereaksi Wagner, pereaksi Dragendroff, pereaksi Mayer, pereaksi Bouchardat, kultur murni bakteri Aeromonas hydrophila ATCC 35654 didapat dari Balai Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Medan I, tryptose soya agar (TSA), kertas blank cakram, kapas, natrium klorida (NaCl), kertas label, tissu, alumunium foil, alkohol 70%, larutan crystal violet, larutan iodine lugol, larutan alkohol aseton, larutan safranin, parafin, kertas oksidase, media O/F, media MIO. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah blender, ayakan mesh 65, stoples kaca, timbangan digital, penangas air (water bath), botol kaca, rotary evaporator, erlenmeyer, labu takar, corong, gelas ukur, autoklaf, cawan Petri, tabung reaksi, rak tabung reaksi, jarum ose, api bunsen, inkubator, laminar air flow, object glass, hot plate, pinset, jangka sorong, sarung tangan, masker, pipet tetes, kamera digital, mikroskop.
2. METODE PENELITIAN Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret sampai bulan Mei 2013 di Laboratorium Kimia Bahan Alam, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara dan di Balai Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Medan I.
3. PELAKSANAAN PENELITIAN Persiapan bahan dan pembuatan simplisia Daun binahong diperoleh dari tanaman pekarangan rumah di Binjai, Sumatera Utara sebanyak 400 gram. Daun dicuci sampai bersih, lalu ditiriskan. Daun dikeringkan dengan cara diangin-anginkan sampai kering selama 5 hari, setelah kering diblender sampai menjadi bubuk.
Pembuatan ekstrak daun binahong Pembuatan ekstrak dilakukan secara maserasi dengan cara melarutkan serbuk simplisia sebanyak 50 gram ke dalam 500 ml etanol 96% lalu ditutup dengan alumunium foil dan dibiarkan selama 2 hari sambil sesekali diaduk. Setelah 2 hari, sampel yang direndam tersebut disaring dengan kapas sehingga diperoleh filtrat dan ampas. Filtrat dievaporasi dengan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental daun binahong. Kemudian dilanjutkan pemekatan ekstrak dengan penangas air (water bath). Skrining Fitokimia (Indah (2006) dan Harborne (1987) dalam Laelatul, dkk., (2010). Skrining fitokimia saponin Ekstrak sampel sebanyak 2 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 10 ml aquades. Selanjutnya dikocok sekuat-kuatnya selama 10 detik. Jika terbentuk buih dengan ketinggian 110 cm yang stabil kurang lebih 10 menit dan buih tidak hilang jika ditambahkan 1 tetes HCl 2N maka menunjukkan adanya saponin Skrining fitokimia steroid/terpenoid Ekstrak sampel sebanyak 2 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian dilakukan pengujian steroid/terpenoid sebagai berikut: a. Ekstrak ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi LiebermannBouchard. Apabila terbentuk warna biru ungu/biru hijau menunjukkan adanya steroid/terpenoid Skrining fitokimia alkaloid Ekstrak sampel sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian dilakukan pengujian alkaloida sebagai berikut :
a.
b.
c.
d.
Ekstrak ditambahkan 2 tetes pereaksi Wagner. Apabila terbentuk endapan berwarna cokelat maka reaksi positif. Ekstrak ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendroff. Apabila terbentuk endapan berwarna merah/jingga maka reaksi positif. Ekstrak ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer. Apabila terbentuk endapan menggumpal berwarna putih/kuning maka reaksi positif. Ekstrak ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat. Apabila terbentuk endapan berwarna cokelat sampai hitam maka reaksi positif.
Skrining fitokimia fenolik dan flavonoid Ekstrak sampel sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi untuk dilakukan pengujian fenolik dengan cara ekstrak ditambahkan pereaksi FeCl3 1%, jika terjadi warna hitam menunjukkan adanya senyawa fenolik. Untuk memisahkan adanya senyawa flavonoid, maka serbuk daun kering (simplisia) ditambahkan 5 ml etil asetat dan dikocok hati-hati lalu didiamkan sebentar, kemudian ditambahkan pereaksi FeCl3 1%. Apabila terjadi perubahan warna menjadi warna hitam menunjukkan adanya flavonoid. Sterilisasi Alat Alat-alat yang akan dipakai seperti cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer dibersihkan terlebih dahulu lalu dibungkus dengan menggunakan kertas selanjutnya di autoklaf dengan suhu 121oC dan tekanan 15 lbs atau 1 atm selama 15 menit (Waluyo, 2007).
Analisa Kriteria Bakteri Aeromonas hydrophila (SNI 7303, 2009) Pewarnaan Gram Cara kerja dari pewarnaan Gram yaitu disiapkan object glass yang telah dibersihkan dengan alkohol 70% dan diberi label, lalu diteteskan 1 tetes akuades steril pada permukaan object glass. Kemudian diambil isolat sebanyak 1 ose dengan menggunakan jarum ose steril, lalu dicampur dengan akuades dan diaduk merata pada permukaan object glass. Campuran isolat dan akuades kemudian difiksasi dengan melewatkan preparat di atas api (jarak 15 cm) beberapa kali sampai terlihat kering, kemudian diteteskan larutan crystal violet pada preparat dan diamkan selama 1 menit, kemudian preparat dicuci dengan air mengalir. Selanjutnya diteteskan larutan iodine lugol dan didiamkan selama 1 menit, lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan. Selanjutnya diteteskan larutan alkohol aseton sampai merata dan didiamkan maksimal 30 detik, setelah itu preparat dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan. Kemudian diteteskan larutan safranin sampai merata dan didiamkan selama 2 menit, kemudian preparat dicuci dan dikering anginkan. Setelah itu diamati menggunakan mikroskop dan diamati sifat bakteri Gram negatif ditandai dengan sel bakteri berwarna merah/pink, bentuk batang pendek. Uji motilitas Cara kerjanya adalah diambil isolat murni bakteri dengan ose steril dan dinokulasikan dengan menusukkan pada media semi solid (MIO agar), kemudian diinkubasikan pada suhu 25oC-28oC selama 18 jam24 jam. Setelah itu dilakukan
pengamatan reaksi positif ditandai dengan adanya pertumbuhan bakteri yang menyebar dan tidak terlihat bekas tusukan. Uji oksidase Cara kerjanya kultur murni bakteri diambil sebanyak 1 ose dengan menggunakan ose steril lalu digoreskan ke kertas oksidase. Selanjutnya diamati perubahan warna yang terjadi. Reaksi oksidase positif ditandai munculnya warna biru keungunan pada goresan. Uji O/F (Oksidatif/Fermentatif) Cara kerjanya adalah disiapkan 2 tabung reaksi yang berisi media O/F, lalu diambil isolat bakteri dengan menggunakan ose steril. Kemudian inokulasi isolat bakteri ke dalam tabung reaksi yang berisi media O/F dengan cara ditusukkan. Lalu satu tabung diisi dengan parafin cair steril hingga ketinggian 1 cm di atas permukaan media O/F, sedangkan tabung lainnya tanpa parafin cair. Setelah itu diamati perubahan yang terjadi. Reaksi fermentatif ditandai dengan perubahan warna media pada tabung yang diisi parafin cair dari hijau menjadi kuning. Uji Rimmler-Shoots (RS) Cara kerja Uji RimmlerShoots (RS) adalah diambil isolat bakteri dengan jarum ose steril dan digoreskan pada media RS, kemudian diinkubasikan pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Setelah itu diamati koloni yang tumbuh, apabila berwarna kuning tanpa warna hitam di tengah koloni berarti positif A. hydrophila. Pembuatan Media Pembuatan media agar miring Bubuk TSA sebanyak 5 gram dilarutkan dalam 125 ml aquades di dalam erlenmeyer, disterilisasi.
Setelah itu, erlenmeyer yang berisi larutan dimasukkan kedalam water bath sampai larutan agak dingin, kemudian larutan dituangkan sebanyak 5 ml ke tabung reaksi. Kemudian tabung reaksi diposisikan miring dengan kemiringan 15o (Singkoh, 2011). Pembuatan media dasar Bubuk TSA sebanyak 10 gram dilarutkan dalam 250 ml aquades di dalam labu takar, kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC dan tekanan 15 lbs atau 1 atm selama 15 menit. Setelah itu, erlenmeyer yang berisi larutan dimasukkan kedalam water bath sampai larutan agak dingin, kemudian larutan TSA dituangkan sebanyak 15 ml ke dalam cawan petri (Singkoh, 2011). Uji Efektivitas Antibakteri Peremajaan bakteri Bakteri diremajakan pada media agar miring dengan cara menggoreskan jarum ose yang mengandung bakteri A. hydrophila. Penggoresan dilakukan secara aseptis yaitu mendekatkan mulut tabung pada nyala api bunsen saat menggoreskan jarum ose. Kemudian tabung reaksi ditutup dengan kapas dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam di dalam inkubator (Lathifah, 2008). Pembuatan larutan NaCl 0,9% Pembuatan larutan dilakukan dengan cara melarutkan NaCl 0,9 gram dan 100 ml akuades, kemudian di aduk hingga tercampur rata. Pembuatan suspensi bakteri Bakteri diambil dari kultur murni dengan jarum ose kemudian disuspensi ke dalam tabung reaksi berisi 10 ml NaCl 0,9% steril sampai kekeruhannya sama dengan suspensi standart 0,5 Mc.Farland dan
konsentrasi bakteri yang diperoleh adalah 108 cfu/ml (Siregar, 2009). Pembuatan konsentrasi larutan uji Konsentrasi % (b/v) yang akan digunakan yaitu 0 % (kontrol); 0,2 %; 0,4 %; 0,6 %; 0,8 % (Muslim, dkk., 2009). Untuk konsentrasi 0% (kontrol) digunakan kontrol negatif (akuades) dan kontrol positif (Oksitetrasiklin). Pengujian Antibakteri Metode difusi Pengujian antibakteri dilakukan dengan metode difusi disk menggunakan kertas cakram. Larutan suspensi bakteri disebar diatas media TSA dan diratakan, lalu didiamkan sebentar. Kertas cakram yang telah direndam larutan uji dengan berbagai konsentrasi selama 15 menit diletakkan di atas media TSA yang sebelumnya telah disebar larutan suspensi bakteri. Selanjutnya cawan petri diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam di inkubator Parameter yang Diamati Pengamatan zona hambat pertumbuhan bakteri Pengamatan dapat dilakukan setelah masa inkubasi yaitu dengan melihat daerah bening yang terbentuk di sekitar kertas cakram pada berbagai konsentrasi ekstrak. Diameter zona hambat diukur dengan menggunakan jangka sorong. Pengumpulan Data Data-data yang dikumpulkan dalam penelitian ini meliputi : a. Hasil fitokimia daun binahong berupa senyawa metabolit sekunder yang terkandung di dalamnya. b. Pengaruh ekstrak daun binahong yang mempunyai daya hambat terhadap pertumbuhan bakteri.
c.
Diameter zona hambat pertumbuhan bakteri Analisis Data Penelitian ini menggunakan metode eksperimental laboratoris untuk uji in vitro. Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan enam perlakuan dan setiap perlakuan diulang tiga kali.
Data hasil penelitian pengaruh ekstrak dianalisis secara statistik dengan menggunakan model ANOVA (Analisis Variansi) dilanjutkan dengan uji Dunnett. Kemudian data zona hambat pertumbuhan bakteri dianalisis secara deskriptif yaitu dengan membandingkan diameter zona hambat antar perlakuan.
4. HASIL DAN PEMBAHASAN Persiapan Bahan dan Pembuatan Simplisia Pada proses pengeringan, diperoleh daun kering sebanyak 50 gram. Daun kering dihaluskan menjadi serbuk (simplisia) dan Skrining Fitokimia Berdasarkan skrining fitokimia didapatkan hasil bahwa ekstrak mengandung senyawa
diperoleh serbuk kering sebanyak 50 gram. Ekstraksi Ekstrak yang diperoleh berupa ekstrak pekat berwarna cokelat tua dengan bau seperti jamu sebanyak 20 gram. metabolit sekunder yaitu fenolik, flavonoida, terpenoida/steroida alkaloid dan saponin.
Gambar 1. Ekstrak daun binahong yang mengandung senyawa (A) triterpenoid/steroid, (B) saponin, (D) alkaloid, (F) fenolik
Gambar 2.
Hasil uji fenolik dan flavonoida menunjukkan adanya senyawa fenolik dan flavonoida ditandai perubahan warna hijau ekstrak asli (A) menjadi warna hitam (B dan C).
Gambar 3. Hasil skrining fitokimia : (A) alkaloid dengan pereaksi Dragendroff menunjukkan adanya endapan dan (B) saponin menunjukkan adanya buih
Analisa Kriteria Bakteri Aeromonas hydrophila Hasil analisis kriteria bakteri A. hydrophila menunjukkan bahwa kultur
murni bakteri merupakan hydrophila (Tabel 1).
Tabel 1. Hasil analisa kriteria bakteri A. hydrophila Uji
bakteri
A.
Hasil
Pewarnaan Gram
Gram negatif, bentuk batang pendek
Uji Motilitas
Motil
Uji Oksidase
Positif Oksidatif
Uji Oksidatif/Fermentatif
Positif O/F
Uji RS
Positif RS
Gambar 4. Hasil pewarnaan Gram menunjukkan bakteri Gram negatif dengan adanya sel bakteri berwarna merah. Gambar 6. Hasil uji oksidase menunjukkan reaksi positif oksidase ditandai dengan warna biru-keunguan pada goresan di kertas oksidase.
Gambar 5. Hasil uji motilitas dan uji O/F menunjukkan reaksi positif pada uji motilitas ditandai tidak terlihat bekas tusukkan (A) dan reaksi fermentatif/oksidatif pada uji O/F ditandai dengan perubahan warna menjadi kuning (B dan C).
Pengujian Antibakteri Pengujian antibakteri menggunakan metode difusi disk menggunakan kertas cakram dengan
Gambar 7. Hasil uji RS menunjukkan hasil positif ditandai dengan adanya pertumbuhan koloni bakteri berwarna kuning.
diameter 6 mm. Pengamatan dilakukan setelah masa inkubasi selama 24 jam dan diperoleh hasil sebagai yaitu 0 mm (0% kontrol
negatif); 8,4 mm (0,2%); 9,4 mm (0,4%); 10,5 mm (0,6%); 11,9 mm
(0,8%); 27,5 mm (kontrol positif).
Pembahasan Hasil pengukuran diameter zona hambat ekstrak daun binahong terhadap bakteri A. hydrophila menunjukkan kertas cakram yang tidak mengandung ekstrak daun binahong (kontrol negatif dengan akuades) tidak terhambat, terbukti dari diameter zona bening/hambat 0 mm diakibatkan karena akuades tidak memilki zat aktif yang mampu menghambat bakteri. Kertas cakram yang mengandung antibiotik oksitetrasiklin (kontrol positif) menunjukkan zona hambat yang
luas. Oksitetrasiklin merupakan antibiotik bagian dari golongan Tetrasiklin. Diameter zona hambat terkecil diperoleh pada konsentrasi ekstrak daun binahong 0,2 % (8,4 mm) dan yang terbesar 0,8 % (11,9 mm). Hasil pengukuran diameter zona hambat ekstrak daun binahong terhadap pertumbuhan bakteri A. hydrophila kemudian dianalisis secara statistik dengan Analisis Sidik Ragam. Hasil analisis dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil analisis sidik ragam diameter zona hambat ekstrak daun binahong terhadap pertumbuhan bakteri A. hydrophila F tabel Sumber Derajat Jumlah Kuadrat keragaman bebas kuadrat tengah F hitung 5% 1% Ulangan 2 0.02 0.01 0.14 4.10 7.56 ** Konsentrasi 5 1206.08 241.22 3259.72 3.33 5.64 Galat 10 0.74 0.074 Total 17 1206.84 Keterangan : ** = sangat nyata Analisis terhadap perbedaan diameter zona hambat berbagai konsentrasi ekstrak daun binahong terhadap bakteri A. hydrophila dapat dilanjutkan dengan uji Dunnett dengan membandingkan diameter
zona hambat yang terbentuk pada berbagai konsentrasi dengan kontrol positif dan kontrol negatif. Hasil perhitungan uji Dunnett dapat dilihat pada Tabel 5
Tabel 3. Hasil uji Dunnett diameter zona hambat berbagai konsentrasi ekstrak daun binahong terhadap kontrol positif dan kontrol negatif Rata-rata Beda dengan Beda dengan kontrol Konsentrasi rendemen kontrol negatif positif Akuades (Kontrol Negatif) 0 -27.5tn Oksitetrasiklin (Kontrol Positif) 27.5 27.5 ** 0.2 8.4 8.4 -19.1tn ** 0.4 9.4 9.4 -18.1tn 0.6 10.5 10.5** -17.0tn
0.8
11.87 d0.05 = 0.56 Keterangan : tn = tidak nyata ** = sangat nyata Kertas cakram yang diberi berbagai konsentrasi larutan dibandingkan dengan kertas cakram yang diberi akuades menunjukkan ekstrak daun binahong dapat menghambat pertumbuhan bakteri yang dipengaruhi senyawa metabolit sekunder yang terkandung didalamnya, seperti flavonoid, fenolik, alkaloid, saponin, steroid/triterpenoid. Flavonoid dapat berperan langsung sebagai antibiotik dengan menggangu fungsi kerja dari mikroorganisme seperti bakteri (Manoi, 2009). Flavonoid yang telah di uji secara in vitro lebih efektif sebagai zat antimikroba terhadap berbagai macam mikroorganisme (Tsuchiya, dkk., 1996). Menurut Robinson (1991) saponin dapat bekerja sebagai antimikroba. Menurut Murphy (1999) alkaloid merupakan golongan senyawa nitrogen heterosiklik. Alkaloid juga memiliki sifat antibakteri, karena memiliki kemampuan menginterkalasi DNA. Senyawa fenol bekerja dengan cara mendenaturasi protein sel dan merusak dinding sel bakteri tanpa dapat diperbaiki lagi sehingga pertumbuhan bakteri terhambat (Pelczar dan Chan, 1988). 5. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan 1. Hasil skrining fitokimia ekstrak daun binahong mengandung senyawa fenolik, flavonoid, triterpenoid, β-sitosterol, alkaloid, dan saponin. 2. Hasil diameter zona hambat pertumbuhan bakteri A.
11.87** d0.01 = 0.78
-15.6tn d0.01 = 0.78
hydrophila dalam berbagai konsentrasi ekstrak yaitu 0 mm (0% kontrol negatif); 8,4 mm (0,2%); 9,4 mm (0,4%); 10,5 mm (0,6%); 11,9 mm (0,8%); 27,5 mm (kontrol positif). Hasil diameter zona hambat menunjukkan bahwa ekstrak daun binahong dapat menghambat pertumbuhan A. hydrophila penyebab penyakit Motile Aeromonads Septicaemia (MAS) secara in vitro. Saran Sebaiknya dilakukan pengujian lebih lanjut secara in vivo dengan langsung menguji ekstrak daun binahong terhadap ikan yang sakit. DAFTAR PUSTAKA Aoki T. 1999. Motile Aeromonads (Aeromonas hydrophila). Journal Laboratory of Genetics and Biochemistry 11: 427-435. Ghufran M, H dan Kordi K. 2004. Penanggulangan Hama dan Penyakit Ikan. PT. Rineka Cipta dan PT. Bina Adiaksara. Jakarta. Lathifah, Q. A. 2008. Uji Efektifitas Ekstrak Kasar Senyawa Antibakteri Pada Buah Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L.) Dengan Variasi Pelarut. [skripsi]. Malang: Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri (UIN).
Laelatul, L., A. Kadarohman, R. Eko. 2010. Efektivitas Biolarvasida Ekstrak Etanol Limbah Penyulingan Minyak Akar Wangi (Vetiveria zizanoides) Terhadap Larva Nyamuk Aedes aegyptii, Culex sp., Anopheles sundaicus. Jurnal Sains dan Yeknologi Kimia 1(1):60-61. Manoi, F. 2009. Binahong (Anredera cordifolia) Sebagai Obat. Warta Penelitian dan Pengembangan Tanaman Industri 15(1):3-4. Muslim, M.P. Hotly, H. Widjajanti. 2009. Penggunaan Ekstrak Bawang Putih (Allium sativum) untuk Mengobati Benih Ikan Patin Siam (Pangasius hypophthalmus) yang Diinfeksi Aeromonas hydrophyla. Jurnal Akuakultur Indonesia, 8(1):99100. Murphy MC. 1999. Plant products as antimicrobial agents. Clin Microbiol Rev 12: 564–582l. Pelczar, M. J., dan Chan, E. C. S. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. Diterjemahkan oleh Hadioetomo, R. S., Imas, T., Tjitrosomo, S. S., dan Angka, S. L. UIPress. Jakarta. Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Penerjemah Padmawinata, K. Penerbit ITB. Bandung. Singkoh, M. F. O. 2011. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Alga Laut Caulerpa racemosa dari Perairan Pulau Nain. Jurnal
Perikanan dan Kelautan Tropis, 7(3): 124. Siregar, R. F. 2009. Uji Aktivitas Antibakteri dari Ekstrak Etanol dan Air Rebusan Kulit Batang Ingul (Toona sinensis M). SNI 7303: 2009. 2009. Metode Identifikasi Bakteri Aeromonas hydrophila secara biokimia. Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang. Tsuchiya, H., M. Sato, T. Miyazaki, S. Fujiwara, S. Tanigaki, M. Ohyama, T. Tanaka, and M. Iinuma. 1996. Comparative study on the antibacterial activity of phytochemical flavanones against methicillinresistant Staphylococcus aureus. J. Ethnopharmacol. 50:27–34.
