ABC transzporterek az ssejtekben

E01

ABC transzporterek az ssejtekben Sarkadi Balázs1, Laczka-Özvegy Csilla1, Barry N.Elkind1, Homolya László1, Szentpétery Zsófia1,2, Váradi András2, Várady György1, Ujhelly Olga1, Cervenák Judit1, Bácsi Krisztián1, Német Katalin1 1 Országos Gyógyintézeti Központ, Haematológiai és Immunológiai Intézet, Budapest, 2 MTA-SZBK Enzimológiai Intézet, Budapest Az ABC (ATP-Binding Cassette) fehérjecsalád tagjai homológ transzmembrán doménekb l (TMD) és nukleotid-köt doménekb l (ABC) épülnek fel. Az ABC fehérjék az ATP kötése és hidrolízise révén felszabaduló energiát úgy alakítják át konformációs mozgássá, hogy különböz fiziológiai funkciókat látnak el: lehetnek aktív transzporterek, ion-csatorna regulátorok, vagy receptorok. Az emberi genomban 48 ABC fehérjét kódoló gént azonosítottak, de az ABC fehérjék valamennyi eddig megismert genomban megtalálhatóak. Munkacsoportunk els sorban azokkal az ABC transzporterekkel foglalkozik, amelyek gyógyszerek és változatos xenobiotikumok aktív transzportjára képesek (ún. multidrog transzporterek). A három nagyobb alcsaládba (ABCB/MDR, ABCC/MRP, és ABCG2) tartozó multidrog transzporterek a szervezetben els sorban méregtelenít funkcióval rendelkeznek, míg felszaporodásuk esetén a rákos daganatokban széleskör gyógyszerrezisztenciát okoznak.






















Az elmúlt évek kutatásai szerint egyes ABC transzporterek kitüntetett szerepet játszanak az ssejtekben. Különösen az ABCG2 fehérjér l vált ismertté, hogy több ssejt-típusban is nagymértékben kifejez dik, így az ssejtek kiválogatására is felhasználható. A vérképz ssejtek esetében ugyanez a fehérje védelmet biztosít a hipoxiás károsodással szemben, míg a daganat- ssejtekben való megjelenése éppen a betegséget fenntartó sejtek gyógyszeres eltávolítását gátolhatja meg. Az el adásban azokról az új eredményekr l számolok be, amelyeket munkacsoportunk az emberi ABCG2 fehérje funkciójának és molekuláris mechanizmusának vizsgálatában, ill. antitestekkel és funkcionális módszerekkel történ specifikus detektálásában ért el.
































Különösen izgalmas területet jelent kutatásainkban az ABCG2 fehérje génterápiás - sejtterápiás alkalmazásának kidolgozása. A saját ssejtek genetikai módosítása forradalmi áttörést ígér az orvoslásban, ugyanakkor az ex vivo génterápia fontos segít je megfelel szelekciós markerek alkalmazása. Az ABCG2 pont-mutáns formái nagy hatékonysággal, de az endogén fehérjét l eltér en transzportálnak változatos gyógyszereket, így az ssejtekben elvégezhet kifejeztetésük lehet séget ad a génterápiás alkalmazásra. Legújabb in vitro és in vivo eredményeink egyaránt ígéretesek ezen a területen.























Kulcsszavak: ABC (ATP-Binding Cassette) transzporterek, ABCG2, glycoprotein, multidrog transzporter fehérjék, gén-terápiás szelekciós marker

26

MDR1/P-

E02

A lipid környezet hatása az ErbB2 receptor tirozinkináz jelátviteli folyamataira Herceptin rezisztens és szenzitív sejtvonalakon Szöll si János, Nagy Péter, Vereb György Debreceni Egyetem, Biofizikai és Sejtbiológia Intézet, Debrecen 

Az ErbB2 (HER2) fehérje az EGF transzmembán receptor tirozinkináz család (ErbB család) tagja. Bár az ErbB2 fehérjének nincs ismert ligandja, a legújabb biofizikai és biofizikai eredmények szerint az ErbB2 fehérje más ErbB fehérjék preferált heteroasszociációs partnere. Orvosi jelent sége abban áll, hogy túlzott kifejez dése eml és egyéb tumorokban együtt jár különböz tumoros fenotípus változással, például magasabb transzformációs képességgel, emelkedett metasztatikus potenciállal, megnövekedett angiogenezissel és drog rezisztenciával. A klinikai gyakorlatban már alkalmaznak egy ErbB2 ellenes humanizált antitestet a Herceptint (vagy trastuzumab-t), amely az ErbB2 pozitív eml tumorok ~40%-ában citosztatikus hatással bír. Munkahipotézisünk szerint az ErbB receptor tirozinkinázok expressziós szintje, egymással, valamint más sejtfelszíni molekulákkal mutatott kölcsönhatása a multimolekuláris komplexekben, ill. a komplexek lipid környezete meghatározza a ErbB2 ellenes terápia eredményét. Összehasonlítottuk az ErbB2 fehérje integrinnel és lipid tutajokkal mutatott asszociációs mintázatát Herceptin rezisztens (JIMT-1, MKN-7) és szenzitív (SKBR-3, N-87) sejtvonalakon. Áramlási citometriás fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) mérések és konfokális mikroszkópos vizsgálatok alapján megállapítottuk, hogy az ErbB2 és beta1integrin molekuláris asszociációt mutat a sejtek felszínén, és kolokalizálódnak egymással és a lipid tutajokkal. Az a tény, hogy az ErbB2 és a beta1-integrin gyenge funkcionális kölcsönhatást mutat és, hogy az ErbB2 nem követi az beta1-integrin keresztkötésével kiváltott foltképz dést a sejtek felszínén, arra utal, hogy az ErbB2 és a beta1-integrin funkcionális szempontból jól megkülönböztethet molekuláris klasztereket képez. Bár a Herceptin szenzitív sejtek felszínén több ErbB2 és kevesebb beta1-integrin molekula volt, mint a rezisztens sejtekén, ez a megfigyelés valószín leg nem magyarázza meg a Herceptin rezisztencia fenotípusát, miután csak gyenge kölcsönhatást tapasztaltunk az ErbB2 és az beta1-integrin között. Megfigyeléseink arra utalnak, hogy a Herceptin rezisztens sejtek felszínén jóval kevesebb az aktív ErbB2 homodimer, ezért a sejtosztódását kiváltó jelátviteli folyamatok más ErbB dimert l, valószín leg ErbB2-ErbB3 heterodimert l indulhatnak ki. Eredményeink azt sugallják, hogy a tumoros transzformációban szerepl fehérjék szerepének megítélésekor az expressziós szintjükön túl, molekuláris kölcsönhatásaikat is figyelembe kell vennünk.

































Kulcsszavak: ErbB2 receptor tirozin kináz, lipid tutaj, trastuzumab rezisztencia, beta-1 integrin, fluoreszcencia rezonnacia energia traszfer

27

E03

Exploring the interplay between chromosome structure, nuclear architecture and genome stability Chi Tang, Apolinar Maya-Mendoza, and Dean Jackson University of Manchester, Faculty of Life Science, UK In higher eukaryotes, extremely complex regulatory systems are known to control fundamental chromatin functions – transcription, DNA replication and DNA repair. In the cell, these different regulatory systems must interact to define a coherent regulatory network. In proliferating cells, and particularly during development, patterns of gene expression must be preserved in cells that have active DNA repair mechanisms and efficiently duplicate both DNA and the associated chromatin status – the histone code. The systems that regulate DNA synthesis and genome stability are integrated with those that regulate the efficacy of RNA synthesis so that both the integrity of the genome and patterns of gene expression are maintained. I will describe how a detailed understanding of nuclear architecture is allowing us to explore the interplay between the nuclear systems that regulate fundamental aspects of chromatin function. The principles of nuclear organisation will be explored and the molecular mechanisms that define chromosome structure and nuclear architecture discussed. A critical aspect of this analysis will be to understand how active nuclear compartments are defined and how cross talk between the different chromatin functions is established. For example, using RNAi techniques to manipulate the structure of the nucleoskeleton in mammalian cells, I will describe how the nuclear compartments can be structured in space and evaluate the impact of these observations on chromatin function. In describing how both nuclear architecture and chromosome structure can impact on chromatin function I will emphasise how DNA foci represent structural units of chromosomes and also play a crucial role in dictating the course of S phase in mammalian cells. I will describe how S phase is regulated in vertebrate cells and how surveillance mechanisms control the activation of potential replication origins and the interaction of systems that drive DNA replication and repair.

28

E04

Sejtmagi fehérjekomplexek szerepe a fényindukált jelátvitelben Kishore Panigrahi, Tim Kunkel, Ádám Éva, Medzihradszky Katalin, Klement Éva, Eberhard Shchäfer, Nagy Ferenc MTA SZBK és Albert-Ludwigs Universität, Németország A magasabbrend növények vörös/távoli vörös fényt elnyel fotoreceptorai, a fitokrómok meghatározó szerepet játszanak a növények fényfügg egyedfejl désében (fotomorfogenezis). A fitokróm fotoreceptor család által indukált jelátviteli lánc(ok) a fotomorfogenezist els sorban a transzkripció szintjén szabályozzák. A fitokrómok a fotonabszorbciót követ en a sejtmagba transzlokálódnak és a ott különböz fehérje-komplexek alkotórészeként detektálhatók. A fitokrómok sejtmagba iráyuló importját és a sejtmagi komplexek szervez dését a fény min sége és intenzitása szabályozza. A sejtmagi, fitokrómokat tartalmazó fehérje-komplexek biológiai funkciójának felderítése érdekében a fitokróm-B fotoreceptort tartalmazó fehérje-komplexet izoláltuk, a komplexben található fehérjéket tömegspektrogáfiás és immun-elektronmikroszkópos módszerekkel azonosítottuk és szerepüket a fényindukált jelátviteli láncban specifikus mutánsok izolálásával és jellemzésével meghatároztuk. Eredményeink arra engednek következtetni, hogy ezek a növényi sejtmagban fény hatására szervez d fehérje-komplexek az állati sejtekben található ICG komplexek (interchromatin granule clusters) növényi homológjai és valószín leg szerepet játszanak a fotoreceptorok degradációjában és specifikus mRNS-ek fényfügg processzálódásában. 




































Kulcsszavak: fény, fotoreceptor, sejtmag, transzkripció, ICG komplex

E05

Miért tesznek a muslica n stények anyai eredet 



-tubulint petéikbe?

Szabad János, Venkei Zsolt és Gáspár Imre Szegedi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Orvosi Biológiai Intézet A Kavar18c domináns mutációt hordozó Kavar18c/+ Drosophila n stények petéiben, bár megtermékenyülnek, nem kezd dik el az embriógenezis. S t azokban a petékben sem, amelyek a kavarr revertáns allélokra homo-, vagy hemizogóták. A Kavar18c/+ és a kavarr/− n stények petéiben egy kis mikrotubulus pamacs és két leánycentroszóma látszik egymás közelében. Duplikációkkal, betérképeztük a Kavar18c mutációt: a Kavar18c/+/+ n stények sok petéjében elkezd dik (de nem fejez dik be) az embriógenezis, jelezve, hogy Kavar18c a funkciónyeréses, azon belül is a domináns negatív mutációk egyike. A Kavar18c mutáció funkciónyeréses természetét az is mutatja, hogy a Kavar18c/− n stények petéib l izolált citoplama toxikus: vadtípusú embrióba injektálva megakadályozza a hosszú mikrotubulusok (MTk) képz dését, az orsórendszer kialakulását. De csak akkor, ha olyan


























29




szinciciális embriókba injektáljuk, amelyekben a sejtmagok még távol vannak egymástól. A blasztoderma stádium el tti embriókba injektálva, melyekben a sejtmagok közel vannak egymáshoz, a citoplazma hatástalan. A kavarr/− n stények (ahol − egy deficienciát szimbolizál), megmutatták, hogy az ép Kavar gén a 67C citológiai régióban, egy olyan 30 kbpnyi szakaszban van, amelyben négy gén ismert. Az egy-egy gént tartalmazó transzgének (TG) megmutatták, hogy Kavar18c és kavarr allélok az Tubulin67C gént azonosítják: a Kavar18c/+; TG Tub n stények utódai csaknem kikelnek, a kavarr/−; TG Tub n stények fertilisek. Az Tubulin67C gén az anyai hatású -tubulin4 izoformát kódolja. Egy vadtípusú Drosophila n stény petéjében három -tubulin féleség van: a konstitutiven expresszálódó, evolúciósan er sen konzervált -tubulin1 és -tubulin3, amelyek a pete citoplazma tubulin készletének 80%-át teszik ki, valamint -tubulin4. Bár kavarr/− n stények petéiben meglehet sen sok -tubulin van – a -tubulinok mellett –, mégis csak rövid MTk képz dnek, jelezve, hogy az -tubulin4 a hosszú MTk képz déséhez szükséges. Azt gondoljuk, hogy az -tubulin4 funkciója a RanGTP/RanGDP gradiens érzékelése. Az EMS-indukált Kavar18c egyetlen bázispárcsere típusú mutáció (G244 A) eredménye. A Kavar18c-kódolt -tubulin4 mutáns E82K molekulában annak a Glu82–nak a helyét Lys foglalja el, amely egy Mg2+ ionon át GTP-t köt, az -tubulin szerkezeti elemét. Az E82K -tubulin4 molekulák ugyan beépülnek a MTk-ba, ám – lévén instabilak –, a mikrotubulusok széteséséhez vezetnek.

































































Kulcsszavak: -tubulin, mikrotubulus, anyai hatás, domináns negatív mutáció, Drosophila 

E06

Genetikai fogékonyság eml rákra Oláh Edit Országos Onkológiai Intézet, Molekuláris Genetikai Osztály, Budapest Az orvostudomány korszakos felfedezésének bizonyult az ezredforduló éveiben azon gének megismerése, amelyek öröklött meghibásodása nagymértékben fokozza a mutációhordozók daganatos megbetegedési kockázatát. Tíz éve ismertük meg a legtöbb örökletes eml rákkal kapcsolatba hozható BRCA1 és BRCA2 gént. E gének m ködésével, meghibásodásaikkal kapcsolatos kutatás az utóbbi években sok új ismeretet eredményezett az eml rákról, a rák iránti genetikai fogékonyságról, de a várt áttörés az eml rákok (és petefészekrákok) kezelésében és megel zésében még nem következett be. A kockázati adatok korlátozott értékelhet sége ellenére a BRCA-teszt (a BRCA1 és BRCA2 gének öröklött meghibásodásával kapcsolatos genetikai rákhajlam meghatározása) mára beépült a klinikai onkológiai gyakorlatba. Az el adás ismerteti a daganatos prediszpozició genetikai alapjait tisztázó nemzetközi vizsgálatok és munkacsoportunk legfrissebb kutatási eredményeit, valamint bemutatjuk a daganatos betegséghajlam felmérésére végzett molekuláris genetikai sz r vizsgálataink hazai tapasztalatait.
























OTKA T-046570 és OM Széchenyi terv NKFP 1/48/2001 támogatással végzett munka. 30

E07

Lipidomika: új módszerek - új szemlélet Balogh Gábor, Horváth Ibolya, Vígh László MTA Szegedi Biológiai Központ Biokémiai Intézet, Szeged A lipidomika - a genomika és a proteomika tesvéreként - robbanásszer fejl désnek indult azzal a céllal, hogy rendszerszemlélet megközelítéssel tanulmányozhassuk az él lények szerv, sejt vagy akár sejtorganellum szint lipidprofilját - “lipidom”-ját, valamint a lipidek és fehérjék funkcionális szervez dési hierarchiát, amelyek az életfolyamatok m ködését meghatározzák. Az elmúlt húsz és különösen az utóbbi néhány év gyökeresen megváltoztatta a lipidek szerepér l alkotottt képünket. Egyre több lipidosztályhoz, ill. molekula specieszhez rendelhet ek egyedi funkciók: az arachidonsav kitüntetett szerepének megértését l mára eljutottunk az omega3 zsírsavak beható funkcionális vizsgálatáig, vagy a sejtben csak mintegy 3%-ban jelenlev foszfatidil-szerin szubmembrán szint viselkedésének elemzéséhez az apoptózis folyamataiban. Bizonyos membrán mikrodomének - a raftok, a receptorm ködés, az immunválasz vagy a transzportfolyamatok tanulmányozásának megkerülhetetlen objektumaivá váltak. A mikrodomének olyan különleges lipid-fehérje asszociációk, melyekben a fehérjék m ködésének tanulmányozása a specifikus lipidkörnyezet összetételének és tulajdonságainak leírása nélkül már nem vezethet kell eredményre. A lipidek vizsgálata nem korlátozódik kizárólag a membránalkotó valamint tároló funkciójú lipidek analízisére. A lipid eredet jelátviv molekulák nagy, és egyre növekv száma arra serkent minket, hogy minél teljesebb elemzést végezhessünk a lipidekb l származó metabolitok – pl. ciklooxigenáz, lipoxigenáz termékek, ceramidok és egyéb szfingolipidek, lizoszármazékok terén. Ily módon a korszer lipidomika részben magában foglalja a metabolomikát is. Hogyan tudunk megfelelni ennek a kihívásnak? A lehet séget, hogy néhány perc alatt több száz egyedi lipid specieszr l kaphassunk kvantitatív információkat, a tömegspektrometria és a számítógépes háttér ugrásszer fejl dése teremtette meg. A ma már elérhet nagyérzékenység , jó felbontású MS-MS ill. MSn elemzést is lehet vé tev tömegspektrométerek az elektrospray ill. az atmoszférikus nyomású kémiai ionizációs ionforrásaik révén közvetlenül oldatból, vagy HPLC-hez kapcsolva képesek rövid id alatt többdimenziós analízisre. Meglep módon a módszer fejl dését az analitikai és m szerfejlesztési ipar még nem követte, mivel a kívánatos standardok, a lipidvizsgálathoz optimalizált ionforrások vagy a hatalmas mennyiség adatot kiértékelni képes szofverek kereskedelmi forgalomban még nem kaphatók. A lipidomika módszertana ezért intenzív fejlesztést igényl terület, mely a közvetlen kutatási kérdések megválaszolásában is rendszerszemlélet matematikai és statisztikai eljárások bevezetését teszi szükségessé. Az el adásban betegségmodelleken és tenyésztett sejteken végzett kísérleteink példáival mutatjuk be a fenti eszköztár hatékonyságát, és felvázoljuk a hamarosan üzembe helyezend új tömegspektrométer alkalmazásában rejl lehet ségeket, valamint azt a most alakuló európai hálózati struktúrát, mely az információcsere révén az ilyen, egymástól több száz kilométerre lev központok m ködését megkönnyíti és hatékonyságát jelent sen növelni képes. 














































































































Kulcsszavak: lipidomika, tömegspektrometria, membrán, mikrodomén, jelátvitel 31

E08

A sejtfelszíni P-glikoprotein molekulák konformációs és topológiai heterogenitása Goda Katalin, Bacsó Zsolt, Fenyvesi Ferenc, Nagy Henrietta, Pataki Judit és Szabó Gábor Debreceni Egyetem, OEC, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet, Debrecen, A daganatos betegségek kemoterápiás kezelésének egyik súlyos problémája a citosztatikumok széles spektrumával szemben fellép ún. multidrog rezisztencia, melynek kialakulásában egyéb mechanizmusok mellett fontos szerepet játszanak az ABC transzporterek, közöttük, a P-glikoprotein (Pgp). A Pgp amfifil, lipofil molekulák sokaságát, köztük a daganatos betegségek kemoterápiájában alkalmazott citosztatikumok többségét szubsztrátként ismeri fel és képes a sejtekb l ATP hidrolízis energiájának felhasználásával eltávolítani. Az UIC2 antitest, vagy ennek Fab fragmentuma, kezeletlen sejteken csak a Pgp molekulák kis hányadát jelöli meg, míg bizonyos Pgp szubsztrátok/modulátorok jelenlétében vagy a sejtek ATP depléciója hatására köt dése 2-10-szeresére n . Az UIC2-vel szubsztrátok adása nélkül is megjelölhet Pgp populáció (PgpI) nagysága id ben nem változik (1.5-2 óra), ami ezen molekulák esetleges funkcionális elkülönülésével lehet magyarázható. Fluoreszcein-konjugált UIC2 Fab-vel (vagy teljes antitesttel) szelektíven megjelöltük a szubsztrátok adása nélkül is (PgpI) ill. a csak szubsztrátok jelenlétében elérhet Pgp populációkat (PgpII), vagy az összes sejtfelszíni Pgp-t (PgpT), és áramlási citometriás, TritonX-100 kioldási kísérletekben (Bacsó et al. és Gombos et al., Cytometry 61, 105-126, 2004) vizsgáltuk a detergens-oldhatatlan membrán régiókhoz asszociált Pgp molekulák arányát a különböz Pgp populációkban. Sejtvonalakon (NIH 3T3 MDR1, KB-V1, 2780AD) végzett kísérleteink alapján a PgpI molekulák 50-60%-a koleszterinben gazdag membrán mikrodoménekhez asszociált (caveolák, raftok), szemben a PgpII-kel, melyeknek csak kb. a 20-25 %-a ilyen tulajdonságú. NP-40 detergenssel végzett kioldási kísérletekben szintén különbséget tapasztaltunk a PgpI és II populációk detergens rezisztenciájában, ami kapcsolatos lehet a PgpI fokozott asszociáltságával citoszkeletonhoz kapcsolódó fehérjékhez. A PgpI populáció raft ill. citoszkeleton asszociáltsága a sejtmembrán koleszterin tartalmának depléciójával ill. citoszkeleton depolimerizáló ágensekkel csökkenthet volt. A PgpI és PgpII populációk membrán mikrodoménekhez való különböz mérték asszociáltságát a raft-ok biokémiai szeparálásával és a bennük lév Pgp-k mikrogyöngyáramlási-fluorimetriás kimutatásával is meger sítettük. A két Pgp populáció biofizikai tulajdonságait FRAP (fluoreszcencia újraéledés fotokioltás után) és FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) alkalmazásával tanulmányoztuk. Jelenleg ezen topológiai különbségek fehérje trafficking-gel való esetleges összefüggését vizsgáljuk. Ismert, hogy az UIC2 antitest köt dése – változó fokban - gátolja a Pgp általi drog transzportot. Kimutattuk, hogy a Pgp er s gátlószerei hatására (pl. ciklosporin A, PSC833, vinblasztin) az UIC2 mind a PgpI, mind a II populáció molekuláioz kapcsolódik és a modulátorok eltávolítása után is – és szinte teljes mértékben - meggátolja a drog transzportot. Az UIC2 gátlás teljes vérben is kifejl dik, ami a fenti jelenség terápiás alkalmazását is












































32



el re vetítheti. Ennek további vizsgálatára jelenleg in vivo kísérleteket végzünk SCID egerekbe transzplantált, Pgp-t expresszáló tumorokon.


Kucsszavak: P-glikoprotein, multidrog rezisztencia, citoszkeleton, membrán mikrodomének, raft

E09

Az endoplazmás retikulum mint metabolikus kompartimentum Csala Miklós és Bánhegyi Gábor Semmelweis Egyetem, Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet Az endoplazmás retikulum (ER) számos biokémiai reakciónak, illetve sejt-biológiai folyamatnak otthont adó organellum. Az ER luminális kompartimentumát a citoplazmától folyamatos membrán különíti el. Mivel a legtöbb intraluminális reakció szubsztrátja a citoplazmában szintetizálódik, illetve terméke oda távozik, a két kompartimentum közötti anyagforgalom jelent sége vitathatatlan. Ennek ellenére nincs konszenzus abban az alapvet kérdésben, hogy az ER membránja rés-e, avagy er s bástya. Az egyik széls séges álláspont szerint kisebb molekulák nem szelektív diffúzióval viszonylag szabadon jutnak át. Mások azt vallják, hogy az ER membrán gyakorlatilag impermeábilis, érdemleges sebesség anyagforgalom csak transzporterek által történhet. Ezt az álláspontot gyengíti az a tény, hogy mindezidáig csak néhány ER transzportert sikerült molekuláris szinten azonosítani. A csak funkcionálisan jellemzett transzporterek közül is többnek széles ligandspecifitása van. Mégis, a legtöbb kísérleti eredmény azt sugallja, hogy az ER lumen a citoszóltól mer ben eltér sajátosságokkal bír, melyek az intraluminális reakciók meghatározói. Az el adás összefoglalja és értékeli azokat a biokémiai, farmakológiai, patológiai, klinikai és genetikai adatokat, melyek alátámasztják azt, hogy az ER lumen elkülönült metabolikus kompartimentumnak tekinthet .

























Kulcsszavak: endoplazmás retikulum, transzport, permeabilitás, lumen, kompartimentum

E10

Hogyan függ a mikrotubulusok hossza az anyai eredet A méret a lényeg? 



-tubulintól?

Gáspár Imre, Venkei Zsolt és Szabad János Szegedi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Orvosi Biológiai Intézet, Szeged Az embriógenezis egyik legfontosabb mozzanata az anyai, és az apai eredet pronukleuszok fúziója az els mitotikus osztódás során. A pronukleuszok egymásra találásához szükség van olyan pályákra, amelyek legf bb alkotói a mikrotubulusok (MT), és MTk-hez kapcsolódó motor molekulákhoz. Ha bármely komponens funkciója sérült (vagy hiányzik), az embrióge







33

nezis el sem kezd dik, vagy elakad, és az embriók elpusztulnak, a n stények sterilek. A Kavar18c/+ domináns n stény-steril mutációt hordozó, illetve a kavarnull/− hemizigóta Drosophila n stények petéiben a MTk szokatlan jellege miatt el sem kezd dik az embriógenezis. A Kavar18c és a kavarnull mutációk az -tubulin4 anyai hatású, embrió-specifikus -tubulin féleséget kódoló gént azonosítják. A Kavar18c allél egy olyan bázispár-csere típusú mutáció (G244 A) nyomán képz dött, amely a Glu82 Lys (E82K) cserét eredményezi. A Glu82 egy Mg2+ ionon keresztül köti azt a GTP-t, amely az -tubulin szerkezeti eleme. Az E82K tubulin4 molekulák nem kötik a GTP-t. A Kavar18c/+ anyák embrióiban az els mitotikus orsó „önmagába roskad”, az osztódás gátolt, éppúgy, mint az -tubulin4 fehérjét nem tartalmazó kavarnull/− hemizigóta n stények petéiben. Az -tubulin4 szerepét megértend , in vitro polimerizációs kísérletekben tanulmányoztuk az ép, valamint az E82K -tubulin4 molekulák szerepét. Megtudtuk, hogy az E82K -tubulin4 molekulák beépülnek a MT-okba, és a MT-ok instabilitását okozzák. Kiderült, hogy -tubulin4 hiányában (vagy E82K molekulák jelenlétében) bár képz dnek MT-ok, azok szignifikánsan rövidebbek, mint azok, amelyek ép tubulin4 jelenlétében képz dnek. A rövid MTk alkalmatlanok azoknak a nagy távolságoknak az áthidalására, amelyek az óriás citoplazmát jellemzik. Azt gondoljuk, hogy az -tubulin4 szerepe kett s: egyrészt lehet vé teszi a hosszú MTk képz dését, amelyek az embriógenezis kezdetén pályákat képeznek a legkülönfélébb sejtalkotók szállításához, másrészt a MTk dinamikáját a polimerizáció irányba tolja el, amely a mitotikus orsó kialakításához nélkülözhetetlen er k forrása.








































































Kulcsszavak: anyai hatás, alfa-tubulin 4, mikrotubulus, in vitro polimerizáció, dinamikus instabilitás

E11

Mikrotubulusok az osztódási orsóban: váz, pálya, és er kifejtés Venkei Zsolt, Gáspár Imre és Szabad János Szegedi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Orvosi Biológiai Intézet, Szeged Egy mitózis folyamán a megkett z dött örökít anyag egyenl en oszlik meg az utódmagokban. A kromoszómák egyenl elosztását az osztódási orsó biztosítja. Az orsók alakját azok a mikrotubulusok (MTk) adják, amelyek (i) a replikálódott centroszómákból indulnak ki, egymással átfed k, és antiparallel állásúak, valamint (ii) azok a MTk, amelyek a kromoszómák kinetochorjaihoz kapcsolódnak. Milyen er k határozzák meg az orsó alakját, méretét? Milyen er k határozzák meg a centroszómák, a kromoszómák, és a leánykromatodák pozícióját? A létez modellek szerint az osztódási orsó méretét és alakját a sejtciklus szabályozása alatt álló motormolekulák, valamint azok a MTk határozzák meg, amelyekhez a motor molekulák kapcsolódnak. A MTk dinamikája (felépülése és szétszerel dése) toló- és vonóer t fejt ki a centroszómákra, illetve a kromoszómákra. A motormolekulák a kötegekké rendez dött MTk mentén haladva alakítják az orsó szerkezetét. Ismertek olyan motormolekulák (citoplazmatikus dineinek, bipoláris kinezinek), melyek hiánya az osztódási orsó összezuhanásához, mások (Ncd) hiánya pedig az orsó megnyúlásához vezet. A különféle motorok és a



































34

MT pálya közti kapcsolat min sége meghatározza a motorok által kifejtett hatás jellegét és mértékét. Nyilvánvaló, hogy a motor-MT kapcsolat megismerése elengedhetetlen az orsót felépít folyamatok megértéséhez. Több olyan motormolekula mutáció ismert, melyek a motorok MT-köt helyeit szüntetik meg. Meglep , de a MT felszínén mutációval eddig nem azonosítottak olyan elemet, ami a motor-MT kapcsolathoz szükséges. Az el adásunkban olyan, az anyai hatású -tubulin4 felszínén történt aminosav cserét (E426K) mutatunk be, amely a motorok egyik kapcsolódási helyét azonosítja. A mutáció hatása megnyilvánul (i) a mutáns fehérjét hordozó embriók fenotípusában (leszakadt, és önállósodott centroszómák, összezuhant orsók és a szinciciális magok megrekedése a Drosophila pete citoplazma mélyén), (ii) motormolekula génekkel való interakcióban, valamint (iii) az E426K anyai hatású -tubulin4-et tartalmazó MTk viselkedésében in vitro kísérleti rendszerben.


















Kulcsszavak: anyai hatás, embriógenezis, osztódási orsó, -tubulin, motorköt hely 




E12

Egy új Drosophila formin szerepe a trachea sejtek aktinvázának kialakulásában és az idegsejt nyúlványok növekedésében Matusek Tamás1, Pataki Csilla1, Gombos Rita1, Alexandre Djiane2, Marek Mlodzik2 és Mihály József1 1 MTA SZBK, Genetikai Intézet, Szeged; 2Mount Sinai School of Medicine, New York A forminok családjába tartozó fehérjék funkciója az aktin sejtváz szabályozása. A forminok két fontos aktivitással bírnak, egyrészt képesek arra, hogy G-aktin jelenlétében új aktin szálak képz dését indítsák el, másrészt az aktin filamentumok ún. növekv végéhez köt dve a polimerizáció sebességét is befolyásolják. A forminok szupercsaládjának egyik nemrégiben leírt új tagja a DAM alcsalád, amelyr l azt feltételezik, hogy részt vesz egy morfogenetikus sejtmozgás, az ún. konvergens extenzió szabályozásában. Mindemellett az a hipotézis is felmerült, hogy a DAM fehérjék egy olyan jelátviteli út elemei, amelyet korábban szöveti polaritási jelátviteli útként írtak le. Tekintve, hogy laboratóriumunk f kutatási területe a szöveti polaritás vizsgálata Drosophila modell organizmusban, megvizsgáltuk a DAM gén muslicában betöltött funkcióját. Ennek érdekében dDAM mutánsokat állítottunk el és elvégeztük a mutánsok fenotípus analízisét. Eredményeink azt mutatják, hogy a dDAM gén ecetmuslicában nem szükséges a vad típusú síkbeli polaritási minták kialakításához, viszont szövetspecifikus módon szabályozza bizonyos aktin vázelemek felépülését a tracheában, az idegsejtekben és a petekamrákban. Eredményeink azt mutatják, hogy a dDAM gén terméke a trachea sejtekben a kutikula kiválasztását szabályozza oly módon, hogy a sejtek apikális részén aktin gy r k képz dését segíti el , amelyek kijelölik a kutikula szekréció helyét. Idegsejtek esetében a dDAM fehérje hozzájárul a nyúlványok növekedéséhez, míg a petekamrákban szabályozza az aktin gazdag, ún. gy r csatornák képz dését. Kísérleteink arra is fényt derítettek, hogy mindezen szövetspecifikus funkciókat a dDAM fehérje a src családba tartozó SRC42 és Tec29 tirozin kinázokkal együttm ködve látja el.































Kulcsszavak: trachea, sejtváz, idegrendszer, DAM, formin 35






E13

Collagént termel haemopoietikus eredet sejtek a fejl d szívben 

Hajdú Zoltán, Magyar Attila, Nagy Nándor, Oláh Imre Semmelweis Egyetem, Humánmorfológiai és Fejl désbiológiai Intézet, Budapest

Az endocardium cs , a myocardium, a coronariák és az ingervezet rendszer fejl dése az embryológiai kutatások homlokterében állnak, de a szív rostos vázának kialakulása alig kapott figyelmet. A billenty k, valamint az ingervezet rendszer fejl désével párhuzamosan történik az egységes pitvar-kamrai myocardium „szétvágása” pitvari és kamrai izomzatra, melyek között a folytonosság megsz nését a szív vázának kialakulása jelzi. Az újabban eml sben leírt u.n. „peripheral blood fibroblast”-okat (PBF) kimutattuk csirke embryonális fehérvérsejtek között és kimérás kísérletekkel igazoltuk, hogy ezek a sejtek szerepet játszanak az organogenesisben. Jelen munkánk célja volt: megvizsgálni hogy a PBF-ok résztvesznek-e a myocardialis cs „szétvágásában”, azaz a szív rostos vázának és a szívbillenty k kialakulásában? Collagént expresszáló CD45 pozitív (haemopoietikus eredet ) sejtek a 4. embryonális napon kimutathatóak a fejl d endocardium párnákban. A fejl d rostos vázban és a billenty kben számuk a 6.-7. embryonális napon tet z dik, majd csökken, de postembryonálisan is kimutatható néhány CD45 és collagen pozítv sejt. Eddigi immuncytokémiai és kimérás vizsgálataink azt mutatják, hogy a szív rostos vázának és billenty inek kialakulásában haemopoietikus eredet (CD45 pozitív) fibrocyták is részt vesznek.




















































Kulcsszavak: szívfejl dés, rostos váz, CD45, collagen, csirke Készült az OTKA T042558 számú pályázatának támogatásával.


E14

A madarak Langerhans sejteinek- és vándorlásuknak vizsgálata Igyártó Botond-Zoltán, Lackó Erzsébet, Oláh Imre, Magyar Attila Semmelweis Egyetem, Humánmorfológiai és Fejl désbiológiai Intézet, Budapest

A Langerhans sejt a dendritikus sejtek családjába tartozik, és az eml sepidermiszben megtalálható sejtek közül a legfontosabb antigénprezentáló sejt. A csontvel b l származó el alakok a véráram útján jutnak el az epidermiszbe, ahol a b rt alkotó sejtek mintegy 23%-át teszik ki. Ezen sejtek jellegzetes markerei közé tartoznak az MHCII valamint a CD1a molekulák, illetve jellemz rájuk a Bierbeck granulumok megléte. A Langerhans sejtek szerepe a b r felületére jutott antigének felvétele. Elhagyva az epidermiszt a legközelebbi nyirokcsomó parakortikális régiójába vándorolnak, ahol a vándorlás közben feldolgozott antigéneket immunkompetens sejteknek mutatják be. Mindezen adatok nagy általánosságban valamennyi eml sre jellemz ek. Jelenleg nem ismert, hogyan zajlanak ezek a folymatok a madaraknál.























36




A madarak b rének hámja is tartalmaz az eml s Langerhans sejtekhez morfológiailag hasonló sejteket. Ezek a sejtek Ca2+ és Mg2+ függ ekto-ATPáz-, valamint MHCII pozitívaknak bizonyultak. Korábbi vizsgálataink során kiderült, hogy a madár Langerhans sejtek is hemopoetikus eredet ek (CD45+), ugyanakkor a többi dendritikus sejtre jellemz vimentin intermedier filamentumot is tartalmazzák. In vitro végzett kísérletekkel kimutattuk, hogy a madár Langerhans sejtek, hasonlóan az eml sökéhez, képesek antigénfelvételre. Jelen munkánkban a madár Langerhans sejteken végzett újabb morfológiai és funkcionális eredményeinkr l számolunk be. Új hámleválasztásos (enzime, illetve mechanikus) módszert dolgoztunk ki az epidermisz, illetve ennek sejtjeinek izolálására. Ezekkel a módszerekkel sikerült a Langerhans sejtek részletes fenotipizálása. Így, többek között azonosítottunk bennük különböz lizoszomális fehérjéket és enzimeket, sejtfelszínükön megtaláltunk makrofág-alpopulációkra jellemz markereket, de, ellentétben az eml sökkel, a madár Langerhans sejtek nem expresszálnak E-kadherint. Citoszoljukban megtalálhatók a Bierbeck granulumok. Kett s festésekkel a CD45+/vimentin+/ATPáz+ populáción belül több alpopuláció azonosítható, ami a Langerhans sejtek intradermális differenciálódására utal. Funkcionális vizsgálat során 1% FITC oldatot vittünk fel az állat b rére. A kezelt b rterületet kimetszettük és vagy in vitro tenyésztettük vagy immunhisztokémiai festést végeztünk rajta. A hámból kivándorolt CD45+ sejtek FITC pozitívaknak bizonyultak. A b rb l készült metszeteken FITC+ sejteket találtunk a dermisz nyirokerei körül. A nyirokerek mentén kis, kerekded nyirokszövetképletek találhatók, melyekben a nyiroktüsz höz hasonló képletek perifériáján fordultak el FITC+ sejtek. Ezen ovális limfoid képletekben els sorban Th sejteket és dendritikus sejteket találunk, míg B-limfociták kisebb számban vannak jelen. A limfociták egy MHCII+ hálózatban foglalnak helyet. Mindez hatékony antigénprezentációra utal.




















































Kulcsszavak: Langerhans sejt, b rhöz asszociált nyirokszövet, Bierbeck granulum, Ekadherin, in vitro OTKA: T-042558, 145/99


E15

A Rho-ka és a kináz – egy növénymese Dorjgotov Dulguun, Sz cs Attila, Ötvös Krisztina, Dudits Dénes, Fehér Attila MTA Szegedi Biológiai Központ, Növénybiológia Intézet, Funkcionális Sejtbiológiai Laboratórium

A magasabbrend szervezetek összehangolt m ködése bonyolult molekuláris jelátviteli hálózatokon alapul. A jelek továbbítását a sejtek között és a sejteken belül az esetek nagy részében fehérjék végzik más fehérjék poszt-transzlációs módosítása révén. Bár a GTP-köt fehérjék és a fehérjék foszforilációs változásait katalizáló kinázok és foszfatázok mind az állati, mind a növényi sejtekben alapvet szerepet töltenek be ezekben a folyamatokban, napjaink genomikai kutatásai alapvet különbségekre derítettek fényt. A növényi sejtekb l számos olyan fehérje hiányzik vagy alul reprezentált (pl. RAS, heterotrimerikus GTP-köt 37 


















fehérjék, tirozin-specifikus receptor kinázok stb.), amelyek az állati sejtekben köztudottan központi szereppel rendelkeznek, ugyanakkor bizonyos fehérje típusok csak a növényekre jellemz k (pl. citoplazmatikus receptor-szer kinázok), vagy a növényekben lényegesen nagyobb változatosságot mutatnak (pl. általánosságban véve a kinázok és a transzkripciós faktorok). Az el adásban egy, a jelátviteli modulokban meglév azonosságokat és különbségeket jól demonstráló, példa kerül bemutatásra, amely a kis molekulasúlyú RHO típusú GTPázokhoz kapcsolódik. A RAS szupercsaládba tartozó RHO GTPázok, mind az állati mind a növényi sejtekben, alapvet en a citoszkeleton szervez désének szabályozásában vesznek részt, bár emellett fontos szerepet töltenek be oxidatív folyamatok (NADPH oxidáz aktiválás) és génexpressziós változások (mitogenezis, stressz) kontrollálásában is. Ezek a fehérjék, szemben az állati sejtek három csoportjával (RHO, RAC, CDC42), növényekben egy speciális csoporttal (ROP) képviseltetik magukat. Az utóbbi évek kutatásai nyilvánvalóvá tették, hogy mind a ROP GTPázok szerkezete, mind a jelátviteli hálózatban felettük álló (regulátor) mind az általuk szabályozott (effektor) fehérjék csoportja mutat evolúciósan konzerválódott és csak a növényekre jellemz elemeket egyaránt. Máig sem ismert azonban az, hogy a meglev különbségek hogyan befolyásolják a ROP GTPázok jelátviteli szerepét, beleértve a receptorok és a GTPázok közötti kapcsolatot és az effektorok-felé történ jelátadás mechanizmusát. Laboratóriumunkban lucernában vizsgáltuk ennek a fehérje csoportnak néhány reprezentánsát. Fehérje-fehérje kapcsolataikat vizsgálva azonosítottunk egy olyan növényspecifikus kináz csoportot, melynek tagjai képesek a GTPázokat specifikusan foszforilálni. In vitro vizsgálataink arra engednek következtetni, hogy a foszforiláltsági állapot befolyásolja a ROP GTPázok jelátviteli aktivitását. Ezeknek az eredményeknek az in vivo meger sítésével egy, a növényekben eddig ismeretlen jelátviteli kapcsolatra derülne fény, amely jelent sen hozzájárulhat a növényekben zajló jelátviteli folyamatok megértéséhez. Az el adásban ezeknek az eredmények az ismertetésére és megvitatására is sor kerül. Az el adásban ismertetett kutatások az OTKA (T 034818 és T 049491) támogatásával folytak és folytatódhatnak, amelyért a kutatók köszönetüket fejezik ki.





































Kulcsszavak: jelátvitel, foszforiláció, RHO GTPáz, receptor kináz, Medicago sp.

E16

Jelátviteli útvonal kapcsolatok Caenorhabditis elegansban Vellai Tibor Eötvös Loránd Tudományegyetem, Genetikai Tanszék, Budapest Az állati egyedfejl dés f lépéseit, a sejt differenciációt és a mintázatképz dést, csupán korlátozott számú jelátviteli útvonal szabályozza. A legtöbb sejt-sejt kölcsönhatást az embrionális fejl dés során a Hedgehog, Wingless (Wnt), TGF- (transforming growth factorbeta), RTK/Ras/MAPK (receptor tyrosine kinase), insulin/IGF-1 (insulin-like growth factor 1), Notch, JAK/STAT és a nukleáris hormon receptor genetikai útvonalak közvetítik. Hogyan alakítja ki ez a néhány útvonal a meglep en sokféle sejttípust és morfológiai 38
















változatosságot az egyedfejl dés során, valamint hogyan járulnak hozzá az állati fajok szembet n diverzitásához (testfelépítési evolúciójához)? Ezek a problémák a biológiai megismerés központi kérdései közé tartoznak. Laboratóriumunkban a fonálféreg Caenorhabditis elegans fejl dés genetikai rendszeren kutatjuk a jelátviteli útvonalak potenciális kapcsolatait („signalling crosstalk”). Genetikai interakciók vizsgálatával és episztázis elemzéssel jelenleg a hermafrodita vulva fejl dés jelátviteli hálózatát „térképezzük”. A sejtosztódás, sejtnövekedés és sejtpusztulás jelátviteli szabályozásának vizsgálata a másik kutatási területünk. Az el adásban kutatásaink utóbbi éveinek eredményeit mutatom be. Választ keresek arra, hogyan specifikálhat egy vagy néhány genetikai kaszkád elméletileg korlátlan sejttípust.
















Kulcsszavak: genetikai útvonal, differenciáció, episztázis, a fonalféreg Caenorhabditis elegans, sejtsors

E17

Új fehérje funkció a növényi cirkadián órában: egy kis GTP-köt fehérje azonosítása és jellemzése Arabidopsis-ban Kevei Éva1, Gyula Péter1, Fehér Balázs1, Kozma-Bognár László1, Tóth Réka1, Andrew Millar2 és Nagy Ferenc1 1 MTA Szegedi Biológiai Központ, Növénybiológiai Intézet, Szeged 2 Department of Biological Sciences, University of Warwick, Coventry, United Kingdom Az él világban széles körben megfigyelhet , hogy bizonyos folyamatok szabályszer ismétl déseket, ritmikus kifejez dést mutatnak. A biológiai ritmusok közül a legszembet n bbek és leginkább kutatottak a napi ismétl dést mutató, kb. 24 órás periódusú cirkadián ritmusok, melyeket egy bels id mér mechanizmus, a cirkadián óra hoz létre. A cirkadián ritmusok küls környezeti tényez kt l függetlenül, állandó körülmények között is fennmaradnak. A cirkadián óra kialakulása az evolúció során adaptív el nnyel járt, mivel lehet vé tette az él lények számára a környezetben ritmikusan bekövetkez változások el rejelzését és a bels folyamatok megfelel napszakra történ id zítését. A cirkadián óra szerepe a növények életében kimagaslóan fontos, hiszen a fejl désükhöz szükséges fényenergia a környezetben nem érhet el folyamatosan, így a fény maximális hasznosítása érdekében szükségessé vált a fotoszintetikus folyamatok szigorú id beli szervez dése. A növényi cirkadián óra megismerése már régóta foglalkoztatja a kutatókat, a ma felvázolható modell mégis igen hiányos és számos kérdést vet fel. Munkánk céljául t ztük ki új cirkadián óra elemek azonosítását és jellemzését, melynek segítségével részleteiben ismerhetjük meg az óra m ködését. Arabidopsis thaliana mutagenezise és a mutáns növényi populáció vizsgálata eredményeként azonosítottunk egy új gént, mely egy, a kis GTP-köt fehérjék családjába tartozó fehérjét kódol. A gén (red lip: red light insensitive period) deléciója a vizsgált cirkadián ritmusok periódushosszának rövidülését okozza mind folyamatos sötétben, mind folyamatos fényben. A folyamatos fény hullámhossza (kék, vörös, távoli vörös) nem befolyásolja a fenotípus er sségét, de
























































































39

magas intenzitású vörös fényben a mutáns fenotípus nem nyilvánul meg. A mutáció nem érinti az óra h mérsékletkompenzációs képességét, a red lip növények periódushossza minden vizsgált h mérsékleten kb. 2 órával rövidebb a vad típusú növényekénél. A mutáció fényfügg egyedfejl dési folyamatokat is befolyásol: a mutáns növények kevésbé érzékenyek a vörös fényre, mint a vad típusú növények. A RED LIP fehérje tehát kett s szerepet tölt be: részt vesz a cirkadián óra által irányított ritmusok periódushosszának kialakításában és a fotomorfogenezis szabályzásában. Az eddig leírt növényi órafehérjék strukturálisan és funkciójukat tekintve is igen sokfélék: MYB-domént hordozó transzkripciós faktorok, fehérje degradációban résztvev „F-box” fehérje, „response-regulator” fehérjék, fény receptor fehérjék. A RED LIP az els ként azonosított növényi GTP-köt fehérje, mely szerepet játszik a fényfügg jelátviteli folyamatokban és a cirkadián óra m ködésében.




























Kulcsszavak: cirkadián óra, fotomorfogenezis, mutagenezis, GTP-kötés, Arabidopsis

E18

A Mediátor szerepe a génexpresszió szabályozásában Szilágyi Zsolt1, Miklós Ida1, Sipiczki Mátyás1,2 Debreceni Egyetem, TTK Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék, Debrecen, 2 MTA- Debreceni Egyetem Mikrobiális Fejl désgenetikai Kutatócsoport, Debrecen 1



Az él szervezetek leny göz képessége, hogy küls illetve bels környezetükb l érkez szignálokra rendkívül érzékeny és hatékony választ képesek generálni. A szignálok fogadásának és a válaszreakciónak központi egysége a sejt, amelyben bonyolult szignál transzdukciós útvonalakon keresztül jut el a jel a génekhez. A válaszadó gének m ködésének szabályozásával, azok ki- és bekapcsolásával éri el a sejt azt, hogy a legkülönböz bb környezeti helyzetekben is a lehet legpontosabb és leghatékonyabb válasz születhessen meg. Ezért a gének m ködésének szabályozásában szerepet játszó mechanizmusok megértése a biológiai/genetikai kutatások egyik központi területe. A génexpresszió szabályozásának kutatása különösen az eukarióta sejtekben kapott nagy figyelmet, ahol az utóbbi évek kutatásai alapján kirajzolódni látszik egy rendkívül bonyolult szabályozási rendszer, amely lehet vé teszi az eukarióta szervezetre jellemz sokrét m ködési feladatok érzékeny és precíz szabályozását. Ezen eredmények alapján a génexpresszió szabályozásában központi szerepet játszik az ún. Mediátor komplex, amelynek feladata a környezeti szignálokat továbbító génspecifikus regulátoroktól érkez szabályozási szignálok továbbítása a gének transzkripcióját végz apparátus felé. A komplex strukturálisan és funkcióját tekintve is evolúciós szinten konzervált, az eddig vizsgált egyszer eukariótákban és magasabbrend állati szervezetekben is megtalálható. A Mediátor komplex funkciójáról mind a mai napig a genetikai analízisre kiválóan alkalmazható éleszt modellszervezetek (Saccharomyces cerevisiae és Schizosaccharomyces pombe) szolgáltatják a legtöbb információt. A komplex eddig ismert alegységeit kódoló 40




















































géneket ezen modellekben azonosították. Munkacsoportunk komplex defektusokat mutató mutánsok klasszikus és a gének molekuláris analízise során bukkant rá a Mediátor komplex létezésére a hasadó éleszt ben, amelyet egyéb vizsgálatok meger sítettek. Eredményeink azt mutatják, hogy a sep10, sep11 és sep15 gének a Mediátor komplex részeként számos sejtszint folyamat szabályozásában vesznek részt, funkcionális átfedésben. A sep10 és sep15 konzervatív alegységek, homológjaik minden eddig azonosított Mediátor komplexben megtalálhatóak, míg a sep11 éleszt specifikus alegység. Az el adásban áttekintésre kerülnek a Mediátor komplex felépítésér l és funkciójáról jelenleg rendelkezésre álló eredmények, különös tekintettel a hasadó éleszt Mediátor gének funkcióianalízise során kapott eredmények hozzájárulására a komplex feladatainak megértésében.



















Kulcsszavak: Mediátor, sejtosztódás, transzkripció, éleszt , sep


E19

Az e3B1 fehérje szerepe kisméret G-fehérjék aktiválásában 

Jenei Veronika1, 2, Tommy Andersson2, Jakus Judit1, Karim Dib2 MTA, Kémiai Kutatóközpont, Biomolekuláris Kémiai Intézet, Biooxidációs csoport, Budapest 2 Division of Experimental Pathology, Lund University, University Hospital, Malmö, Svédország 1

Az e3B1 (eps8 SH3 domén köt fehérje-1) egy körülbelül 70 kDa méret , a sejtplazmában található fehérje, amely az EGF-receptoron (EGFR) keresztül aktiválódó jelátviteli lánc tagja. Komplexet alkot az eps8 (egy EGFR szubsztrát), a Sos-1 illetve a PI3K fehérjékkel, és résztvesz a Ras és a Rac aktiváció szabályozásában. Az e3B1 fehérjér l ismeretes továbbá, hogy gátolja a sejtosztódást, hatással van az aktin átrendez désére, a kontakt inhibícióra, és korábbi eredményeink szerint bizonyos ECM fehérjék esetén a sejtletapadásra is. Kísérleteinkben megvizsgáltuk ennek a fehérjének a hatását különböz G-fehérjék aktivációjára, melyeken keresztül az e3B1 hatást gyakorolhat a fenti folyamatokra. Tanulmányoztuk továbbá azokat a lehetséges mechanizmusokat, melyeken keresztül e fehérje részt vehet a G-fehérjék aktivációjának szabályozásában. Kísérleteinkhez az NIH3T3 fibroblaszt sejtvonalat használtuk, amelyben genetikai manipuláció során vagy az EGFR, vagy pedig az EGFR+e3B1 fehérje túltermel dik. Kísérleteinkben megvizsgáltuk az e3B1 fehérje túltermel désének hatását a Ras, Rac, illetve a korábban még nem vizsgált, az integrinek szabályozásában résztvev Rap1 EGFindukálta aktivációjára. Az EGFR+e3B1 fehérjét túltermelõ sejtvonalban az EGF már alacsonyabb koncentráció esetén is maximális Rac aktivációt váltott ki, míg az EGFR-t túltermelõ sejteknek ugyanehhez a hatáshoz er sebb stimulusra volt szükségük, ami meger síti egy korábbi tanulmány eredményeit. Érdekes módon hasonló eredményt kaptunk a Rap1 aktivitás mérése esetén is. Ellentétben egy korábbi modellel azonban, a mi sejtvonalainkban az e3B1 túltermel dés nem a Ras aktiváció gátlása révén szabályozza a sejtproliferációt. A továbbiakban inhibítorok segítségével megvizsgáltuk a foszfatidil41































inozitol-3-kináz, az Abl-kináz és a Src-tirozin-kinázok szerepét a Rap1 aktivációjában. Eredményeink szerint az e3B1-et túltermel sejtekben a Rap1 aktivációja Src-függ , de Abl és PI3K-független folyamat. Érdekes módon ezt a Src-függ G-fehérje aktivációt kizárólag adherens sejtekben tapasztaltuk, ami felveti az integrinek lehetséges szerepét ezekben a folyamatokban. Immunoprecipitáció segítségével vizsgáltuk, hogy az e3B1 fehérje milyen guanin-nukleotid cserél faktoron (GEF) keresztül hat a Rap aktivációra. A legismertebb Rap GEF a C3G, amelyr l korábban már kimutatták más jelátviteli utakban, hogy Src-kináz-függ módon aktiválja a Rap1-et. Mivel azonban az általunk alkalmazott Srckináz inhibítorok nem voltak hatással a C3G foszforilációjára/aktivációjára, modellünkben valószín síthet en nem ez a f Rap1 aktivátor. Összefoglalva elmondható, hogy az e3B1 fehérje egy új, eddig még nem tanulmányozott hatását irtuk le, nevezetesen, hogy nemcsak a korábban vizsgált Rac, de a Rap1 aktivációját is szabályozza. Szintén els ként írtuk le, hogy az e3B1 fehérje Src-kinázokon keresztül hat a Rap1 aktivációjára, amely azonban valószín leg független a C3G-t l. Eredményeink felvetik a lehet ségét, hogy az e3B1 fehérje nemcsak a Ras-on, de az azzal rokon Rap1-en keresztül is hathat a sejtproliferációra illetve a sejtletapadásra.




































Kulcsszavak: e3B1, EGF receptor, G-fehérje, Src-kinázok, sejtproliferáció

E20

Merre visz a növényi szteroid hormon szintézisút? Bancos Simona1, Szatmári Anna-Mária1, Koncz Csaba2, Masaharu Mizutani3, Takao Yokota4, Nagy Ferenc1, Szekeres Miklós1 1 MTA Szegedi Biológiai Központ, Növénybiológiai Intézet, Szeged, 2Max PlanckInstitut für Züchtungsforschung, Köln, Institute for Chemical Research, 3Kyoto University, Kyoto, 4Department of Biosciences, Teikyo University, Utsunomiya A brasszinoszteroid (BR) csoportba tartozó szteroid hormonok fontos szerepet játszanak a növények fej dési folyamatainak szabályozásában. Bár e viszonylag újonnan felismert hormoncsalád tagjainak bioszintézise és hatásmechanizmusa mára viszonylag jól ismertté vált, két bioszintetikus gén funkciójának tisztázására irányuló vizsgálataink lényegesen átalakították a brasszinoszteroid anyagcsereútról az elmúlt tíz év során kialakult képet. Eredetileg a BR szintézis reakcióútját jelölt prekurzorok átalakulásainak nyomonkövetésével tisztázták. Az Arabidopsis genetika gyors fejl dése révén az elmúlt évtizedben számos BR-deficiens mutánst sikerült izolálni, lehet vé téve egyes bioszintetikus enzimek génjeinek azonosítását. A mutánsok funkcionális jellemzése során használt intermedier menekítés és hormonanalízis gyakran ellentmondásos eredményre vezetett, amit általában e mószerek technikai nehézségeivel magyaráztak. Munkánk célja az Arabidopsis CYP90C1 és CYP90D1 génjei által kódolt citokróm P450 enzimek szerepének tisztázása volt. Bár az ismert CYP90C1-deficiens rot3 mutáns nem mutatta a jellegzetes BR-hiányos törpe fenotípust, expressziós vizsgálataink és a CYP90C1 és CYP90D1 nagyfokú homológiája arra utaltak, hogy e gének a BR szintézisút eddig ismeretlen, átfed funkciójú monooxigenázait kódolják. A cyp90c1 és cyp90d1 null mutáns 42











vonalakat PCR-alapú inverz genetikai módszerrel azonosítottuk a rendelkezésünkre álló TDNS inszerciós Arabidopsis mutánsgy jteményben. A homozigóta cyp90c1 és cyp90d1 vonalak keresztezésével el állított kett s mutáns jellegzetes, hormonkezeléssel menekíthet BR-deficiens fenotípust mutatott, igazolva a CYP90C1 és CYP90D1 funkciók redundáns voltát. A cyp90c1cyp90d1 kett s mutáns intermedier menekítési és hormonanalízis eredményei nem adtak megbízható információt az érintett gének BR szintézisben betöltött szerepér l. Egyértelm adatokkal szolgáltak viszont azok az in vitro konverziós kísérletek, amelyeket Escherichia coli-ban kifejeztetett és funkcionálisan rekonstituált CYP90C1 és CYP90D1 enzimekkel végeztünk. Mivel korábban a más heterológ rendszerben expresszáltatott CYP90 fehérjék rendre enzimatikusan aktívnak bizonyultak, módszerünk segítségével lehet ség nyílt a konverziós lépések és szubsztrát preferenciák pontos meghatározására ezen enzimcsalád valamennyi tagjának esetében. Eredményeink egy olyan, a korábban elfogadottnál egyszer bb BR bioszintézis út dominanciájára utalnak, amely nincs ellentmondásban a mutánsok menekítése és hormonanalízise során kapott adatokkal. 























Kulcsszavak: szteroid hormon szintézis, brasszinoszteroid, inverz getetika, heterológ expresszió, Arabidopsis

E21

Kemotaktikus drug-targeting. - Ciklodextrin hordozók szerepének vizsgálata szteroidok és SXWS peptidek alkalmazásával egysejt modell-rendszerben. 

K hidai László, Szabó Lajos, Láng Orsolya, Katona Júlia, Csaba György Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, Budapest 

A ciklodextrinek (CD) olyan ciklikus, nem-redukáló, 6-8 glukopiranozid egységb l felépül oligoszaccharidok, melyek speciális hengeres térszerkezetük és amfipatikus karakterük révén hidrofób ligandok molekuláris szint targetálását teszik lehet vé. Szteroid hormonok CD-ekhez való kötése módot ad olyan molekula-komplexek kialakítására, amelyekb l a sejtmembrán közelében felszabaduló hormon az újonnan leírt, sejtfelszíni membránban elhelyezked szteroid-receptor család egyes tagjaival léphet interakcióba, indukálhatja azokat. Jelen kísérletünkben (i) eltér kémiai szerkezet CD-ek, mint a kemotaktikus drugtargeting potenciális hordozómolekuláinak kemotaktikus képességét vizsgáltuk, valamint azt, hogy (ii) CD-szteroidokkal kemotaktikusan szelektált eukaryota csillós egysejt ek kemotaktikus válaszkészségét mennyiben befolyásolja az alkalmazott szteroid. (iii) A kemotaktikus szignalizáció szteroid- és citokin-függ voltának feltételezett keresztreakcióit a több citokin-receptor extracelluláris domainjének konzervatív alkotóelemeként is leírt, SXWS peptid felhasználásával elemeztük. Vizsgálatainkat Tetrahymena pyriformis GL sejtek logaritmikus növekedési fázisban lév tenyészeteinek sejtjein végeztük. A vizsgált 7 ciklodextrin: β-CD (CD), (2-hidroxi)propilβ-CD (HPCD), etil-β-CD (ECD), acetilatált-β-CD (ACD), karboximetil-β-CD (CMCD),































43

karboxietil-β-CD (CECD), szukcinil-β-CD (SCD) (CycloLab, Budapest) volt. Az alkalmazott HPCD-szteroidok: tesztoszteron, β-ösztradiol, dexamethason, progeszteron és hidrokortizon (Sigma Ltd. St.Louis); a vizsgált SXWS derivátumok SGWS, SEWS, SYWS voltak. A sejtek kemotaktikus aktivitásának meghatározására, illetve a kemotaktikus szelekcióra kapilláris kemotaxis esszét alkalmaztunk. A kísérleteket 8-8 párhuzamos mintán végeztük, a nyert eredmények statisztikai analízisére ANOVA-t használtunk. Eredményeink mutatják, hogy maguk a vizsgált CD derivátumok jelent s mértékben eltér kemotaktikus hatással bírnak. A komplexekben gyakran hordozóként használt HPCD e sejtfiziológiai hatását mind az acetilezett (ACD), mind a szukcinilezett forma (SCD) a vizsgált koncentrációk (10-12-10-6 mg/ml) szinte mindegyikében felülmúlja, míg a vizsgált másik három derivátum elmarad attól. A szteroidokkal képzett konjugátumok kemotaktikus hatásvizsgálata jelzi, hogy ez a sejtfiziológiai paraméter a ligand szerkezeti változásait (ld. A-gy r aromás jellege, oldalláncok mérete és karaktere) érzékenyen követi. A leghatásosabb, rapid indukciós id vel (15 perc) ható kemoattraktáns ligandnak a tesztoszteron (10-9-10-5 mg/ml), míg a legkifejezettebben kemorepellensnek a hidrokortizon (10-9-10-3 mg/ml) bizonyult. A hatás receptor-függ voltát jelzi, hogy a fenti két liganddal végzett kemotaktikus szelekció révén kialakított szubpopulációk követéses vizsgálata mindkét esetben fokozott kemotaktikus válaszkészség szubpopulációt mutat (tesztoszteron - Chemsel= 248%; hidrokortizon- Chemsel=202%). A szelekcióval kialakított csoportok, a három eltér kemotaktikus karakter SXWS peptid iránti válaszkészségének vizsgálata jelzi, hogy: (i) a hidrokortizon szelekció a semleges SGWS és a repellens SYWS peptid esetében is fokozott válaszkészség szubpopulációkat eredményez; (ii) a tesztoszteronnal szelektált sejtek esetében is megfigyelhet a semleges SGWS preferenciája; (iii) a tesztoszteron meg rzi jobb szelektáló jellegét SYWS-sel szemben, míg az SEWS-nek a szteroiddal hasonlóan pozitív a hatása.






























Kulcsszavak: kemotaxis, ciklodextrin, szteroid, SXWS, Tetrahymena

E22

A lassú vázizom összehúzódási és elernyedési génje külön szabályozódik Zádor Ern 1, Rácz Gábor1, Fenyvesi Rita1 és Frank Wuytack2 SZTE ÁOK Biokémiai Intézet, Izomdifferenciálódási csoport, 2 KULeuven, Department of Physiology, Leuven, Belgium 

1

A vázizom oxidatív anyagcserét folytató, lassú m ködés formája csak a megfelel motoros beidegzés hatására képes kialakulni. Az izomfehérjék mintegy 20%-át jelent , az öszszehúzódásban lényeges szerepet játszó lassú miozin génje is idegimpulzusra indukálódik. A beidegzés és a miozin gén transzkripciójának kapcsolata két különböz jelátviteli úton is lehetséges, az egyik a Ras, a másik a kalcineurin-NFAT. Kérdésünk az volt, hogy vajon a többi lassú izomra jellemz gén is hasonló módon szabályozódik-e a miozinéhoz? Kísérleteinkben az elernyedést biztosító szarkoplazmás/endolazmás retikulum Ca2+ ATPáz 















44

(SERCA2a) kifejez dését követtük a patkány innervált és denervált regenerálódó lassú soleus izmában mRNS (RT PCR) és fehérje szinten (immunoblott, immunhisztokémia). A jelátviteli utak szerepét a SERCA2a kifejez désre domináns negatív és pozitív Ras-t valamint kalcineurin gátló fehérjét expresszáló plazmidok in vivo transzfekciójával vizsgáltuk. Eredményeink azt mutatják, hogy a beidegzés közvetlenül nem szükséges a SERCA2a transzkript és fehérje szint emelkedéséhez, csak hosszabb távon lehet módosító hatása. A Ras és a kalcineurin-NFAT utak sem befolyásolják a SERCA2a-t. Ezzel bizonyítottuk, hogy az összehúzódásáért felel s miozin és az elernyedést biztosító SERCA2a gén kifejez dése eltér módon szabályozódik a lassú izomban. Ez ellentétes a két fehérje rostokban történ nagy arányú együttes kifejez désével a gyors-lassú ill. lassú-gyors izomtranszformáció során. A magyarázat az lehet, hogy az adaptáció során lejátszódó átalakulások viszonylag hosszú folyamatában a SERCA2a kifejez dés képes követni a lassú miozinét.























Kulcsszavak: vázizom, SERCA2a, miozin, Ras, kalcineurin-NFAT

E23

Lítium és galaktóz metabolizmus Miseta Attila, Strassz András, Nagy Tamás és T kés-F zesi Margit Laboratóriumi Medicina Intézet, OEC, ÁOK, Pécsi Tudományegyetem, Pécs 

A lítium a mániás – depressziós megbetegedések kezelésében a gyakran használt hangulatstabilizáló gyógyszer. Hatásmechanimusa részben ismeretlen. A legelterjedtebb hipotézis szerint az inozitol foszfatázok gátlása útján fejti ki hatását. Az utóbbi években el térbe került a glikogén szintáz kinázra kifejtett gátló hatása is. Hat éve fedeztük fel, hogy egy Saccharomyces cerevisiae sejtvonal, melyben az összes PGM aktiviás 90% -ért felel s PGM2 gént töröltük, 6-9szer több kalciumot akkumulál a megnövekedett plazamamembrán kalcium átereszt képességének betudhatóan galaktóz jenlétében. Változik a kalcium ionokhoz kötött jelátvitel is. Glükóz jelenlétében hasonló változást nem láttunk. A glükóz-1–foszfát (G1P) szint jelent sen emelkedett a PGM2 hiányos sejtvonalban galaktózon, de a glükóz-6-foszfát (G6P) szint lényegesen nem változott. Egy második a foszfofruktokináz m ködését akadályozó mutáció (PFK2 deléció) segítségével elértük, hogy a (G6P) szint is kompenzatórikusan emelkedett a kett s PGM:PFK mutánsban galaktózon. Ebben a mutánsban a kalcium ion homeosztázisával összefüggésbe hozható fenotípus jegyek jelent sen enyhültek. Újabb méréseink szerint hatását a PMC1 Ca2+-ATP-ázra gyakorolt közvetlen stimuláló hatás révén alakul ki a fokozott kalcium kompartmentalizáció. Mivel a lítium ismerten gátolja a PGM a m ködését, teszteltük a lítium hatását S. cerevisiae-n, szövetkultúrákban és Wistar patkányokban. Azt találtuk, hogy a lítium hatás a fent leírt, a PGM2 génhiányos fenotípusokhoz hasonlókat eredményez: azaz emelkedett G1P-t, fokozott kalcium felvételt és 4-6szor megnövekedett sejt kalcium tartalmat mértünk. Lítiummal kezelt hím Wistar patkányokban jelent sen emelkedik a PGM aktivitás az agyban, váz és szívizomban valamint a májban. Ugyancsak emelkedett PGM aktivitást mértünk izolált patkány trigeminus ganglionokban és Jurkat sejtekben. A különböz szöve45



























ti ion-tartalmakban (Ca2+, Mg2+, K+, Na+) lényeges eltéréseket nem találtunk. Ugyanakkor a S. cerevisiae-ben mérthez hasonló változásokat láttunk Jurkat sejtek anti-CD3 ellenanyaggal kiváltott intracelluláris kálcium jelében. Az Intézetünkben ellen rzött, lítiummal kezelt betegek eseteiben jelent s szérum PGM aktivitás növekedést mértünk. Kavantitatív real-time PCR módszerrel mértük ezen betegek izolált fehérvérsejtjeiben a PGM-et kódoló gén expresszióját. Eredményeink szerint szignifikáns mértékben emelkedett a betegek PGM mRNS szintje. Jelenlegi vizsgálatainkban a táplálék galaktóz (laktóz) tartalma és a lítium hatás közötti összefüggést keressük.





Kulcsszavak: lítium, kalcium, galaktóz, glükóz-foszfátok, foszfoglükomutáz

E24

A Hailey-Hailey b relváltozás, mint a PMR1 gén hibájából fakadó ortho-betegség Saccharomyces cerevisiae-ben Kellermayer Richárd1, Szigeti Réka2, Miseta Attila3, Sheau-Chiou Chao4, Kosztolányi György1,5 1 PTE-ÁOK Orvosi Genetika Intézet, Pécs; 2Baranya Megyei Kórház Központi Laboratórium, Pécs; 3PTE-ÁOK Központi Laboratórium, Pécs; 4Department of Dermatology, National Cheng Kung University Hospital, Tainan, Taiwan; 5MTAPTE Klinikai Genetikai Kutatócsoport, Pécs Az ortho-betegség fogalmát nemrégiben vezették be az olyan humán betegségek leírására, amelyekben a kórokozó gének orthológokkal rendelkeznek genetikai modell él lényekben. Itt a Hailey-Hailey betegséget, avagy benignus familiáris pemphigust ismertetjük, amelyet a humán szekretoros útvonal kalcium/magnézium ATPázát (hSPCA1) kódoló gén, az ATP2C1 mutációi okoznak. E gén orthológja Saccharomyces cervisiae (azaz éleszt )-ben a PMR1 gén. A hSPCA1 teljesen komplementálja a PMR1 hiányos éleszt törzsek fenotípusait és a pmr1∆ S. cerevisiae hasznos modell organizmusként szolgálhat az ATP2C1 mutációk funkcionális sz résére, a Hailey-Hailey betegség molekuláris hátterének megértésére, valamint esetleges farmakoterápiák kidolgozására. Ezen megfigyelések alapján a Hailey-Hailey b relváltozás az ortho-betegségek kit n példája.


















Kulcsszavak: Hailey-Hailey betegség, Saccharomyces cerevisiae, kalcium, orthológ, PMR1

46

E25

Hosszú QT szindrómát okozó génmutációk azonosítása magyar betegekben Sepp Róbert1, Csanády Miklós1, Carlo Napolitano2, Sághy László1, Pap Róbert1, Aris Anastasakis3, Silvia G Priori2, Peter J. Schwartz4, Forster Tamás1 1 Szegedi Tudományegyetem, II. sz. Belgyógyászati Klinika és Kardiológiai Központ; 2 Fondazione Salvatore Maugeri, Centro Medico di Pavia, Italy; 3 Department of Cardiology, University of Athens, Greece; 4 Department of Cardiology, University of Pavia, Italy. A hosszú QT szindróma (long QT syndrome, LQTS) a szívizomsejtek meghosszabbodott repolarizációja következtében létrejöv arrhythmogén kórkép, melyet a testfelszíni elektrokardiogram (EKG) szívfrekvenciára korrigált QT id tartamának (QTc) megnyúlása jellemez. Az LQTS fatális arrhythmiákkal, halmozottan jelentkez eszméletvesztéses epizódokkal, polimorf kamrai tachycardiával és a hirtelen szívhalál fokozott kockázatával társulhat. A kórképet els sorban a szív ioncsatornáit kódoló öt gén, a KCNQ1 (11p15.5), HERG (7q35), SCN5A (3p21), KCNE1 (21q22) és KCNE2 (21q22) gének mutációi okozzák. Munkánkban magyar LQTS betegek klinikai és genetikai vizsgálatát végeztük el. A betegcsoportban 5 familáris és 3 sporadikus LQTS beteget vizsgáltunk. Minden betegben típusos LQTS fenotípust észleltünk (QTc<460 ms). A molekuláris genetikai vizsgálatokat perifériás vérmintából izolált DNS-en végeztük. A vizsgálat során a KCNQ1, KCNH2, SCN5A, KCNE1 és KCNE2 gének kódoló szakaszait polimeráz láncreakcióval amplifikáltuk. A mutációanalízis ’single strand conformation polimorphism’ (SSCP) ill. ’denaturing high performance liquid chromatography’ (DHPLC) metodikával történt. A genetikai analízis során a öt kóroki mutációt mutattunk ki. A KCNQ1 génben két pontmutációt észleletünk (Arg259Cys, ill. Tyr315His), a KCNH2 génben egy pontmutációt (Trp568Cys) ill. egy 11 nukleotidból álló inzerciót azonosítottunk, mely „frameshift” mutációt hozott létre. A KCNE1 génben talált mutáció pontmutáció volt (Val109Ile). Hasonló eltérést nem észleltünk 150 f s normál kontroll populáció vizsgálatakor. Mindegyik génmutáció klinikai megjelenése típusos volt (KCNQ1 és KCNE1 gén: LQT1 altípus, KCNH2 gén: LQT2 altípus). Összefoglalva, magyar LQTS betegcsoportban öt LQTS génmutációt mutattunk ki. A mutációk az els magyar betegben igazolt hosszú QT szindrómát okozó génmutációk.

















Kulcsszavak: hosszú QT szindróma, ioncsatorna, mutációanalízis, génmutáció

47

E26

Mutációanalízis hypertrophiás cardiomyopathiában Sepp Róbert1, Csanády Miklós1, Blazsó Péter1, Pálinkás Attila1, Jebelovszki Éva1, Aris Anastasakis2, Raskó István3, Forster Tamás1 1 Szegedi Tudományegyetem, II. sz. Belgyógyászati Klinika és Kardiológiai Központ, Szeged; 2Department of Cardiology, University of Athens, Greece; 3Genetikai Intézet, MTA Szegedi Biológiai Központ A hypertrophiás cardiomyopathia (HCM) a szívizom primer megbetegedése, melyet az interventricularis septum aszimmetrikus hypertrophiája, malignus arrhythmiák és a hirtelen szívhalál fokozott kockázata jellemez. A betegséget túlnyomó többségben a szarkomert kódoló gének mutácói okozzák, melyek közül a béta myozin nehéz lánc- (MYH7, 14q11), troponin T- (TNNT2, 1q3), myozin köt C fehérje- (MYBPC3, 11p11.2) és troponin I (TNNI3, 19p11) gének mutációi a leggyakrabbak. Munkánkban a HCM-et okozó gének mutációspektrumát vizsgáltuk magyar HCM-es betegcsoportban. A MYH7 gén mutációanalízisét ötvenhárom (férfi: 39, életkor: 50±16 év, maximális diastolés bal kamra falvastagság: 22.8±6.1 mm) a TNNT2 és TNNI3 gének analízisét hatvanhat (férfi: 41, átlagéletkor: 53±16 év, maximális diastolés bal kamra falvastagság: 21.6±6.1 mm) magyar HCM-es betegben végeztük el. Szelektált esetekben a MYBPC3 gén analízisére is sor került. A betegek perifériás vérmintáiból DNS extrahálás történt, a HCM gének kódoló részeit (MYH7: 3-23 exon, TNNT2: exon 9, 11, 14, 15, 16, TNNI3: exon 7 és 8, MYBPC3: exon 1-35) polimeráz láncreakcióval (PCR) amplifikáltuk. A mutációanalízis manuális vagy automatizált ’single strand conformation polimorphism’ (SSCP) analízissel történt, nem denaturáló poliakrilamid géleken, két különböz h mérsékleten, ezüst festés ill. fluoreszcens festékkel jelölt PCR primerek alkalmazásával. A mintákban két kóroki mutációt találtunk (MYH7: Arg719Gln, exon 19; MYBPC3: Gln1226Stop, exon 33), valamint több, a fehérje aminosavsorrendjét nem befolyásoló polimorfizmust [MYH7: GCA199GCG (exon 7); TTC244TTT (exon 8); AAG365AAA (exon 12); AAC923AAT (exon 23); TNNT2: G/A (intron 14); TNNI3: GAG179GAA (exon 7)]. A kóroki mutációt hordozó mindkét beteg „malignus” fenotípusú betegcsoportba tartozott. Fenti adatok arra utalnak, hogy a béta myozin nehéz lánc gén, troponin T és I gének mutációi nem gyakoriak magyar HCM-es betegekben.





Kulcsszavak: hypertrophiás cardiomyopathia, szarkomer, mutációanalízis

48




E27

Transzkripciós faktorok klinikai genetikai jelent sége 1

Tészás Alexandra1, Kárteszi Judit1, Kosztolányi György1,2 PTE OEC ÁOK Orvosi Genetikai és Gyermekfejl déstani Intézet, 2 MTA-PTE Klinikai Genetikai Kutatócsoport, Pécs

A transzkripciós faktorok (TF) több százmillió éve lényegében változatlan szerkezet , konzervatív fehérjék, amelyek a génexpresszió szabályozásán keresztül kontrollálni képesek más fehérjék hatását, s ezáltal szerepük van a sejtnövekedés, - szaporodás, -differenciálódás folyamataiban, befolyásolják a differenciált szövetek normális m ködését, a morfogenezist, egyedfejl dést. A TF-k mutációja többnyire halálos kimenetel , de ismert, hogy testi- szellemi, növekedési elégtelenség, szervi fejl dési rendellenességek (végtag, koponya, csontrendszer), endokrin kórképek, daganatok kialakulásához is vezethet. Ezért a klinikai genetikusok – f ként az embrionális fejl désben szerepet játszó géncsaládok (HOX, PAX, SHOX, stb.) jelent ségének megértésére – egyre fokozódó figyelemmel fordulnak feléjük. Az általunk vizsgált methyl-CpG-köt fehérje 2 (MeCP2) a speciális szabályozó TF-k közé tartozik. Génje az X-kromoszóma hosszú karján helyezkedik el. Ez az ubikviter fehérje a metilált DNS-hez köt dve kulcsszerepet játszik egy ún. transzkripciós „silencing” komplex kialakításában. A fehérjét kódoló gén mutációit leírták egy szinte kizárólag lányokban el forduló idegfejl dési rendellenesség, a Rett szindróma hátterében. Irodalmi adatok szerint a Rett szindrómás gyermekek 50-80%-ban mutatható ki az MECP2 gén valamely mutációja. Vizsgálataink során 61 magyar Rett szindrómás betegben, 53%-ban találtunk a génben különféle, közülük öt korábban még le nem írt mutációt. Viszonylag nagy arányban (47%) volt a két X kromoszóma közt non-random inaktiváció. Rett szindróma gyanúját kelt fiúgyermekek egyikében sem volt kimutatható a lányokban leggyakoribb MECP2 mutáció. 



































Kulcsszavak: transzkripciós faktor, génexpresszió, fejl dési rendellenességek, methylCpG-köt fehérje 2, Rett szindróma





E28

Halak, mint nem eml s gerinces modellek alkalmazása a humán daganatpathológiai és onkogenetikai kutatásokban Magyary István 1, Szekeres György 2, Battyáni Zita 3, Miseta Attila4, Repa Imre 3,4, Tóth Anett 1, Horn Péter 1 1 Kaposvári Egyetem, Állattudományi Kar, Kaposvár 2 Hisztopatológia Kft., Pécs 3 Kaposi Mór Megyei Kórház, Kaposvár 4 Kaposvári Egyetem, ÁTK, Diagnosztikai és Onkoradiológiai Intézet, Kaposvár A malignus tumoros betegségek, melyek világszerte sok millió embert érintenek egyaránt megtalálhatók valamennyi gerinces állatfajban. Gerinctelenekben (pl. férgekben és rovarokban) is leírtak abnormális sejtosztódásokat, de patológiai és klinikai értelemben vett 49

rákbetegségr l szinte kizárólag csak gerinces fajok esetén beszélhetünk a halaktól egészen az emberig. Ezért ha meg akarjuk érteni a malignus tumorok kialakulását, növekedését és terjedését gerinces állatmodellekre van szükségünk. A halak sok szempontból ideális gerinces állatmodellei a humán rákkutatásnak. Ezirányú hasznosításuk több mint 70 éves múltra tekint vissza. Az 1930-as években az amerikai Myron Gordon és a német Kurt Kosswig egymástól függetlenül fedezték fel, hogy két mexikói eredet Xiphophorus nemzetségbe tartozó halfaj hibridjét (X. helleri x X. maculatus) X. hellerivel visszakeresztezve (BC1) az utódok egy részében melanoma alakul ki, melynek oka az, hogy a hibridben a X. maculatusból származó onkogén tumor-szupresszor hiányában manifesztálódik. Ezt követ en további halfajokat vontak be a karcinogenezis kutatásába, melyek közül a legjelent sebb a zebradánió (Danio rerio) volt. A zebradánió volt az els halfaj amelyen kémiai karcinogenezis kísérleteket végeztek az 1960-as évekt l kezdve. A D. rerio intenzív kutatása mintegy 25 évvel ezel tt kezd dött, amikor George Streisinger és munkatársai a faj embriogenezisének részletes kutatását kezdeményezték. A zebradánió ívásakor egy anyahal 100-200 ikrát rak le. Az embriók ideális tulajdonságokkal rendelkeznek amelyek mind a fejl désbiológiai, mind az orvosi biológiai kutatásokban hasznosak: az áttetsz embriók gyorsan fejl dnek, a gasztruláció, a morfo- és organogenezis 24 órán belül lezajlik. A zebradánió nagy egyedszámban, olcsón tartható. Generációs intervalluma igen rövid: 3 hónap alatt ivaréretté válik. Az 1990-es évek elején fedezték fel, hogy az ethylnitrosurea (ENU) pontmutációkat idéz el a zebradánió genomjában. Ezzel a módszerrel megközelít leg 2000 mutáns változatot állítottak el , melyekkel az embriogenezis minden aspektusa tanulmányozható. Ezen mutánsok egy része a humán betegségek tanulmányozásában is felhasználható. A fejl désbiológiával és a karcinogenezissel kapcsolatos nagymennyiség ismeretanyag a zebradániót alkalmassá tette arra, hogy a rákkutatásban – els sorban mint genetikai modell- fontos szerepet kapjon. A zebradániót napjainkban a rákkutatás számos területén alkalmazzák pl: az apoptosis és angiogenesis genetikai szabályozása, humán onkogének és szupresszor gének ortológjainak azonosítása, expressziójuk transzgénikus zebradánióban, mutagenezis és hatása a tumorgenezisre, gyógyszerhatóanyagok tesztelése. Kutatásaink f célja Xiphophorus sp. és Danio rerio halfajok, mint több évtizedes múlttal rendelkez és napjainkban egyre inkább preferált nem eml s gerinces állatmodellek bevezetése a daganatos betegségek hazai preklinikai, els sorban immunhisztokémiai, daganatpatológiai és onkogenetikai kutatásába. A projekt megvalósítása során az eddig publikált külföldi eredmények alapján e két legfontosabb halmodellt bevezetjük a hazai onkológiai kutatásba, vizsgáljuk alkalmazhatóságukat és adaptáljuk a szakirodalomban leírt eredményes hisztopathológiai és molekuláris genetikai módszereket annak érdekében, hogy komplettáljuk eszköztárunkat a korszer daganatpathológia területén.






























































Kulcsszavak: onkogenetika, daganatpathológia, állatmodellek, halak, immunhisztokémia

50

E29

Pszichogenetika: Az eset-kontrol vizsgálatoktól az endofenotípusig Sasvári-Székely Mária1, Gervai Judit2, Gádoros Júlia3, Rónai Zsolt1, Nemoda Zsófia1, Székely Anna4 1 Semmelweis Egyetem, Orvosi Vegytani, Mol. Biol. és Pathobiok. Intézete 2 MTA Pszichológiai Intézet 3 Vadaskert Alapítvány a Gyermekek Lelki Egészségéért 4 ELTE Pszichológiai Intézet Ikervizsgálatok eredményei alapján régóta ismert, hogy a személyiség vonások örökölhet sége (heritabilitás) jelent s (30-40%). Ezek a kutatások azonban nem adtak támpontot abban a kérdésben, hogy mely gének/génváltozatok játszanak szerepet a személyiségjegyek kialakulásában. A pszichogenetikai kutatásokhoz óriási lendületet adtak azok az els kandidáns gén asszociáció vizsgálatok (Benjamin, 1996; Ebstein, 1996), melyek összefüggést mutattak ki az „Újdonságkeresés” személyiségvonás és a dopamin D4-es receptor (DRD4) gén úgynevezett „hosszú” változata között. Az elmúlt évek során számos publikáció foglalkozott a dopamin és a szerotonin rendszer polimorf allél változatai és különböz pszichológiai jellegek, illetve pszichiátriai rendellenességek kapcsolatával. Az eredmények azonban sokszor ellentmondásosak, ezért elindult egy törekvés a különböz szubpopulációkban mért eredmények metaanalízisére, valamint a fenotípus pontosítására. A diagnosztikus kategóriák, mint például a gyermekkori hiperaktivitási zavar (ADHD) különösen problematikus fenotípusok. Ezért a pszichogenetikában az eset-kontrol tanulmányokat ma egyre inkább felváltják az objektív, kvantitatív skálákon mérhet fenotípusos jegyek, az úgynevezett endofenotípusok vizsgálata, valamint a gén-környezet kölcsönhatások vizsgálata. Az NKFP_1A_0008_2002 projekt támogatása lehet vé tette a dopamin és a szerotonin rendszer kandidáns génjeinek hazai pszichogenetikai vizsgálatát. A konzorcium molekuláris genetikusok, pszichológusok és pszichiáterek összefogásával jött létre. Az elmúlt két évben jelent s el relépés történt a DRD4 gén promoter polimorfizmusainak megismerésében(1) és a haplotípusok analízisében(2). Munkánk során kimutattuk, hogy a csecsem kori dezorganizált köt dés genetikai rizikófaktora lehet a DRD4 gén úgynevezett T.7-es haplotípusa(3). A feln tt személyiségjegyek vonatkozásában összefüggést találtunk a „Kitartás” személyiségdimenzió és a „hosszú” DRD4 allél között(4), ezt az összefüggést a hiperaktív gyermekek vonatkozásában is megkaptuk. Folyamatban vannak azok a vizsgálataink, melyek a genetikai faktorokkal legjobban alátámasztható endofenotípusok meghatározására, valamint a gén-környezet kölcsönhatásainak meghatározására irányulnak.



































(1) Ronai Z, Szantai E, Szmola R, Nemoda Z, Szekely A, Gervai J, Guttman A, SasvariSzekely M. A novel A/G SNP in the -615th position of the dopamine D4 receptor promoter region as a source of misgenotyping of the -616 C/G SNP. Am J Med Genet (Neuropsychiatric Genet) 2004, 126(1): 74-78. (2) Szantai E, Kiraly O, Nemoda Z, Kereszturi E, Csapo Z, Sasvari-Szekely M, Gervai J, Ronai Z. Molecular haplotyping of the dopamine D4 receptor gene promoter region. Psychiatric Genetics. 2005 (in press) 51

(3) Gervai J, Nemoda Z, Lakatos K, Ronai Z, Toth I, Ney K, Sasvari-Szekely M. Transmission Disequilibrium Tests confirm the link between DRD4 gene polymorphism and infant attachment. Am J Med Genet (Neuropsychiatric Genet) 2005, 132B:126–130. (4) Szekely A, Ronai Z, Nemoda Z, Kolmann G, Gervai J, Sasvari-Szekely M. Human personality dimensions of persistence and harm avoidance are associated with DRD4 and 5-HTTLPR polymorphisms. Am J Med Genet (Neuropsychiatric Genet) 2004, 126(1): 106-110. Kulcsszavak: poligénes rendszerek, pszichiátriai genetika, kandidáns gén asszociáció analízis, dopamin D3-es receptor, ADHD

E30

A genetikai asszociáció vizsgálatok módszertani problémái Rónai Zsolt1, Szántai Eszter1, Jill Platko2 és Sasvári-Székely Mária1 Semmelweis Egyetem, Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet 2 Psychiatric and Neurodevelopmental Genetics Unit, Center for Human Genetic Research, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School

1

A pszichiátriai rendellenességek és más hasonló komplex jellegek genetikai hátterének vizsgálata különös körültekintést igényel. Az egyes génvariációk ugyanis csak csekély mértékben járulnak hozzá a fenotípus kialakításához, ezen hatás kimutatása gyakran nehéz, más esetekben viszont éppen az ál-pozitív eredmény (populáció stratifikáció) veszélyével kell számolnunk. A pszichogenetikai asszociáció vizsgálatok egyik gyakori célpontja a D4-es dopamin receptor (DRD4) gén, mely több pszichiátriai rendellenesség (pl. figyelemhiányos hiperaktivitás) feltételezett kandidáns génjének tekinthet . Mind az 5’ promoter, mind pedig a kódoló régió nagy számú polimorfizmust tartalmaz, ezért ezen variánsok vizsgálata során a gondosan optimalizált genotipizáló módszerek alkalmazása különösen nagy fontosságú. Az 5’ régióban található polimorfizmusok együttes elemzése céljából direkt molekuláris módszereket dolgoztunk ki a régió haplotípus szerkezetének megállapítására. A 120 bp duplikáció és a –521 CT elemzése allél-specifikus amplifikáción alapuló technikával történik [1], két ill. három SNP (–616CG, –615AG [2], –521CT) haplotípusának azonosítására pedig allél-specifikus PCR–RFLP módszert alkalmazunk [3]. A kapott fragmentumok automatizált, nagy hatékonyságú elemzésére kapilláris elektroforetikus vizsgálati rendszert állítottunk be [4]. Ezen technikák más gének haplotípus szerkezetének vizsgálatára is megfelel en adaptálhatók. A haplotípus meghatározó módszereket az asszociáció vizsgálat mellett a régió kapcsoltsági viszonyainak elemzésére is alkalmaztuk. Megállapítottuk, hogy a DRD4 gén 5’ régiójában lév polimorfizmusok között a kis fizikai távolság ellenére sem mutatható ki számottev genetikai kapcsoltság [2]. Az ál-pozitív asszociáció hibájának elkerülése céljából a különböz tanulmányaink során eltér módszereket alkalmaztunk. Amennyiben a biológiai szül k (családi triók) vizsgálata megvalósítható, úgy a preferenciális allél-átadás (transmission disequilibrium test, TDT) 52




















elemzése megbízható megoldást jelent. Más esetekben - amikor a szül k nem elérhet k – a genetikai asszociáció vizsgálatára az eset–kontroll megközelítést alkalmazzuk [5]. Kidolgozott módszereink a DRD4 gén pszichogenetikai asszociáció vizsgálatának fontos alappilléreit jelentik, és segítségül szolgálhatnak más gének hasonló vizsgálati rendszereinek beállítása során. A fenti munkát az NKFP_1A_0008_2002 és a FIRCA_R03 TW006014 projektek támogatásával végezzük





1. Ronai Z, Guttman A, Nemoda Z, et al. Electrophoresis. 2002 May;23(10):1512-6. 2. Ronai Z, Szantai E, Szmola R, et al. Am J Med Genet. 2004 Apr 1;126B(1):74-8. 3. Szantai E, Kiraly O, Nemoda Z, et al. Psychiatr Genet, 2005 nyomtatás alatt 4. Szantai E, Szilagyi A, Guttman A, et al. J Chromatogr A. 2004;1053:241-245. 5. Lyons-Ruth K, Holmes BM, Sasvari-Szekely M, kézirat Kulcsszavak: haplotípus, DRD4 gén, genetikai asszociáció vizsgálat, komplex jelleg, genetikai polimorfizmus

E31

Familiaris porphyria cutanea tarda Remenyik Éva1, Koszó Ferenc3, Mario Lecha4, Cèlia Badenas4, Vass Viktória1, Kiss Attila2, Balogh Attila1, Horkay Irén1 1 B r-és Nemikórtani Klinika és 2II. Belgyógyászati Klinika Debreceni Egyetem 3 Szegedi Tudományegyetem, B rgyógyászati és Allergológiai Klinika 4 University of Barcelona, Hospital Clinic, Spain



A porphyria cutanea tarda (PCT) az uroporfiirinogén dekarboxiláz (URO-D), a porfirin metabolizmus ötödik lépését katalizáló enzim csökkent m ködése következtében kialakuló betegség. Többségében szerzett/sporadikus (I típusú PCT) formában fordul el , ekkor csak a májban lév enzim aktivitása csökkent. Az örökl d /familiáris (II típusú) PCT-ben a szervezet minden sejtjében csökkent az enzim aktivitása. Az öröklésmenet autoszómális domináns változó, de többnyire alacsony penetranciával. A betegség genetikailag heterogén, eddig 60 mutációt regisztráltak. A DEOEC b rklinika 286 gondozott PCT-s betege között 35 év alatt 3 családi halmozódás fordult el . Az el adásban egy olyan család klinikai, biokémiai és genetikai vizsgálati eredményét ismertetjük, ahol három gyermek szenved, különböz súlyosságú klinikai tünetekkel járó PCT-ben. Két fiúgyermek (13, 20 éves) vvt URO-D aktivitása 50% alatti, míg a legtünetesebb lány (23 éves) enzimaktivitása 60%-os. A diagnózis felállításakor mindhármuk vizelet össz- és uroporfirin tartalma a normál érték többszöröse volt. Az URO-D gén 10 exonjára kiterjed mutáció analízis két mutációt talált. Az egyik az 1 exon M1V korábban már publikált M1T-hez hasonló, amelyre az anya heterozigóta. A másik a 7 exonon szintén familiáris PCT-ben már ismert, a fehérje konzervatív katalitikus egységén aminosavcserét eredményez P235S mutáció. A gyermekek mindkét mutáns allélt hordozzák. Az apa korai halála miatt nála enzimaktivitás és genetikai vizsgálat nem történt. 53 































Haemochromatosis gén mutációt nem hordoz egyik családtag sem. Viszont microcyter anaemia mindenkinél kimutatható, ami a PCT-ben szokatlan. A család különlegessége nemcsak a ritka familiáris, örökl d PCT, hanem, hogy a tünetes egyének két mutációt hordoznak az URO-D génen. Hasonló esetr l közlést az irodalomban nem találtunk. További ritkaság, hogy a tünetek gyermekkorban jelentkeztek és a két fiún spontán javultak. A lány fokozott tüneteiben szerepe lehet a diagnózis felállítása el tt alkalmazott ösztrogénnek. A vas PCT-ben betöltött patogenetikai szerepére pedig rámutat, hogy az anaemia miatti vas szubsztitució után romlottak a klinikai tünetei. A familiáris PCT jól példázza genetikai és környezeti faktorok együttes szerepét egy betegség kialakulásában.











Kulcsszavak: porphyria cutanea tarda, faliliaris, uroporfirinogén dekarboxiláz, mutáció, anaemia

E32

Az izolált plexus choroideus cysta jelent sége a praenatalis diagnosztikában Mika Péter, Bajnóczky Katalin PhD, Nagy Sándor Petz Aladár Megyei Oktató Kórház, Szülészeti és N gyógyászati Osztály Gy r



A praenatalis diagnosztika egyik legvitatottabb kérdése az izolált plexus choroideus cysták praenatalis ellátása. Az ultrahang vizsgálat során felismert plexus choroideus cysták esetén egyéb fejl dési rendellenesség után kell kutatni. Pozitív esetben magzati kromoszómavizsgálat indokolt. A szakirodalom ebben a kérdésben egységes véleményt ad. De mit tegyünk társuló fejl dési rendellenesség hiányában, negatív leletek esetén? A cysta mérete, elhelyezkedése befolyásolja-e a diagnosztikus döntést? Ezekre a kérdésekre kerestük a választ az irodalmi adatok és a saját tapasztalataink összehasonlítása alapján.





Kulcsszavak: terhesség, genetikai tanácsadás, plexus cysta, praenatalis diagnosztika, kromoszómavizsgálat

54

E33

Gyors molekuláris genetikai módszer a Klinefelter-szindróma diagnosztizálására Fodor Flóra, Kámory Enik , Csókay Béla Laborigo Diagnosztikai Kft., Budapest 

A Klinefelter-szindróma a férfi infertilitás leggyakoribb genetikai oka. A medd ség kivizsgálási folyamatának részét képezi a metafázisos kromoszómák analízise perifériás lymphocytákban. A cytogenetikai vizsgálat azonban önmagában is id igényes, amely magyar viszonyok között a laboratóriumok leterheltsége miatt hetekre, s t, hónapokra nyúlhat. A számfeletti X kromoszóma kimutatására olyan megbízható molekuláris genetikai módszert fejlesztettünk ki, amely 3 munkanap alatt elvégezhet . A perifériás vérb l izolált DNS-mintákon multiplex fluoreszcens PCR-t végeztünk a következ 5 marker kimutatására: amelogenin, amely mindkét nemi kromoszómán jelen van diallelikus formában; X22, amely egy er sen polymorph pentanukleotid STR az X és Y kromoszóma pseudoautosomalis régiójában; DXS6803 és DXS6809, két polymorph Xspecifikus tetranukleotid STR; valamint az Y kromoszómán található SY134. A PCRtermékeket ABI 310 genetikai analizátoron futtattuk. A különböz hosszúságúra tervezett PCR-termékek, valamint két különböz fluoreszcens festék használata lehet vé tették a markerek szimultán elemzését és átfedésmentes azonosítását. A markerek és a csúcsméretek automatizált jelölését saját kidolgozású Genotyper templáttal végeztük. A számfeletti X kromoszóma jelenlétére vagy a vártnál több csúcs, vagy valamely csúcs görbe alatti területének relatív megnövekedése utal. A Klinefelter-szindróma diagnózisának megállapítására a fentiek alapján pozitív és negatív kontrollokkal többszörösen ellenrzött pontos kritériumokat határoztunk meg. A teszt kvantitatív természete lehet vé teszi az identikus (hibás meiosis II-b l származó) számfeletti X-kromoszóma kimutatását is. A cytogenetikai vizsgálathoz hasonlóan ezzel a módszerrel sem mindig lehetséges a mozaik esetek felismerése. Az elmúlt két év során anyagunkban 10 Klinefelteres esetet találtunk, melyek mindegyikét kés bb meger sítette a cytogenetikai vizsgálat is. Jóllehet, a cytogenetikai vizsgálat tekintend a betegség standard módszerének, az általunk kidolgozott teszt jelent sen lerövidíti a kór felismerését, s már a meger sít cytogenetikai vizsgálat elkészülte el tt elkezdhet a megfelel hormonális kezelés, esetleg reprodukciós technikák alkalmazása. A negatív molekuláris eredmény egyéb kromoszómarendellenességre utaló jel hiányában szükségtelenné teszi a cytogenetikai vizsgálatot.

































































Kulcsszavak: Klinefelter-szindróma, aneuploidia, fluoreszcens PCR, polymorphismus, STR

55

E34

Populáció eredetvizsgálat régészeti anyagból Csányi Bernadett1, Bogácsi-Szabó Erika1, Tömöry Gyöngyvér1, Kalmár Tibor1, Cs sz Aranka1, Priskin Katalin1, Mende Balázs2, Langó Péter2, Németh István3, Raskó István1 1 MTA Szegedi Biológiai Központ, Genetikai Intézet, Szeged 2 MTA Régészeti Intézet, Budapest 3SZTE ÁOK Pathológiai Intézet, Szeged 

A X. századi magyarság genetikai összetételének vizsgálatához olyan markereket választottunk ki, melyek segítségével képet alkothatunk a honfoglalók eredetér l, rokonsági viszonyairól. Az anyai ági rokonság tanulmányozásához a csontokból mitokondriális DNS-t izoláltunk. Az si csontokból nyert adatokat összehasonlítottuk az általunk vizsgált 101 ma él magyarországi magyar és 77 székely egyén mitokondriális DNS mintázatával, valamint további számos más eurázsiai populáció adataival. Az adatok kiértékelése alapján elmondható, hogy az archaikus populációban európai és ázsiai típusú mitokondriális genetikai elemek fordulnak el , de szignifikánsan több az ázsiai típusú elem a 2 modern népcsoporthoz viszonyítva. Az európai népcsoportokat tekintve a honfoglalóknál talált haplotípusok uráli, kelet-európai, közép-európai és balkáni populációkban leírt szekvenciákkal mutatnak azonosságot. Az apai ági leszármazási vonalak vizsgálatához Y-kromoszómális SNP markereket tanulmányoztunk. Az SNP markerek közül a Tat (M46) mutáció, melyet uráli migrációs markernek is neveznek, az eddigi vizsgálatok szerint jelen van a legtöbb uráli nyelvet beszél népességben, ugyanakkor hiányzik mind a ma él magyarországi magyarok, mind pedig a csángók mintájából. Az általunk analizált 60 székely és 34 magyarországi magyar férfi közül egyetlen székely férfi hordozza ezt a polimorfizmust. 4 vizsgált csontmintából 2 esetben sikerült a kérdéses mutációt hordozó DNS fragmentumot kimutatnunk, mely szerint mindkét minta a mutáns allélt hordozza Y kromoszómáján. Annak bizonyítása érdekében, hogy a humán leleteknél alkalmazott módszerünk, valamint az alkalmazásával kapott eredményeink hitelesek, honfoglalás kori lovak, szarvasmarhák és juhok vizsgálatába kezdtünk. Az archaikus állatok tanulmányozásával szeretnénk képet kapni a korai magyar háziállat állomány genetikai jellemz ir l. Modern hucul lovak, szürkemarhák, illetve racka juhok vizsgálatával arra a kérdésre szeretnénk választ kapni, hogy ezekben az “ si magyarnak vélt” háziállat fajtákban fellelhet -e az archaikus állatok genetikai öröksége.





























Kulcsszavak: populáció, eredet, rokonság, mitokondriális DNS, Y kromoszóma

56

E35

Embrionális ssejt vonalak alapítása laboratóriumi egértörzsekben Kobolák Julianna1, Ruttachuk Rungsiwiwut1,2, Gócza Elen3, Dinnyés András1,4 1 Mez gazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, Állatbiológiai Intézet, Mikromanipulációs és Genetikai Újraprogramozási csoport; 2 Department of Obstetrics Gynaecology and Repr. Faculty of Veterinary Sci. Chulalong Univ. Bangkok, Thailand; 3 Mez gazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, Állatbiológiai Intézet, In vivo génexpressziós és regulációs csoport; 4 SZIE/MTA Alkalmazott Állatgenetikai és Biotechnológiai Kutatócsoport, Gödöll





Az egér embrionális eredet ssejt vonalak (ES sejtvonalak) hólyagcsíra fejl dési állapotú egérembrió embriócsomójából (ICM) származó sejtek, amelyek optimális tenyésztési feltételek mellett folyamatosan osztódnak. Gazdaembrióba injektálva beépülnek annak embriócsomójába, differenciálódni kezdenek, és a normális embrionális fejl dés folyamatába bekapcsolódva a legkülönböz bb sejttípusokká képesek alakulni, ún. kimérákat képeznek. Képesek a csíravonal sejtjeivé differenciálódni, így a genetikai módosítások, mint például a génkiütés számára alkalmas in vitro rendszert biztosítanak. Sejtmagátültetéses klónozás során sejtmag donorként ES sejteket használva a testi sejteknél magasabb arányban születnek életképes utódok. Emellett, ha a tenyészt tápoldathoz különböz differenciálódást el idéz anyagokat adunk, akkor a legkülönböz bb differenciálódott sejttípusok megjelenése érhet el. Így az ES sejtvonalak alkalmasak a sejtek differenciálódása során lejátszódó folyamatok in vitro tanulmányozására. Az ES sejtvonal alapítás a mai napig igen körülményes, költség- és id igényes feladat. Az új sejtvonalak létrehozásának jelent s biológiai és technikai korlátai vannak. Több kutatócsoport próbálkozott már hatékony módszerek kidolgozásával, mint például az ICM kultivációs, immunkomplementációs (immunosurgery), a beágyazódásban akadályoztatott hólyagcsíra embriókat alkalmazó (delayed blastocyst), Oc4-neomicin transzgénikus, ssejt szelekciós (stem cell selection), valamint az ún. permisszív egértörzsekkel való visszakeresztezéses ES sejtvonal alapítási eljárással. Kísérletek folytak 8-sejtes, és morula állapotú embrió blasztomerjeinek disszociációjával történ ES sejt alapításra, de a legelterjedtebb módszer mindmáig az ICM-b l való ES sejtvonal alapítás maradt. Az ivari kiméra képzésre alkalmas pluripotens ES sejtvonalak létrehozása számos szerz szerint törzsfügg , így csak néhány egértörzs alkalmas ES sejtvonal alapításra. A legtöbb jól m köd pluripotens sejtvonal 129SV egértörzs eredet . Csak korlátozott számú ES sejtvonal érhet el C57BL/6 egértörzsb l és e sejtvonalak csak kis százalékban képeznek ivari kimérát és alacsony hatásfokkal alkalmazhatók tetraploid embrióval történ aggregáltatásra. Mindazonáltal néhány hibrid ES sejtvonal, 129SV és C57BL/6 egértörzs keresztezésekb l is elérhet , amelyek hatékonysága és alkalmazhatósága technikailag megfelel a 129SV sejtvonalaknak, azonban e sejtvonalak genetikailag nem homogének, így nem képesek a beltenyésztett törzsekb l származó el nyök biztosítására sem. Kísérleteinkben a felsorolt ES sejtvonal alapítási módszereket hasonlítottuk össze annak eldöntésére, hogy melyik módszer eredményezi a legnagyobb hatékonyságot. Több egértörzs embrióit is alkalmaztuk a törzsfügg ség meglétének, vagy hiányának igazolásához. 57 



















































































Munkánk során a különböz ES-sejtvonal alapítási technikák összehasonlítása révén kívánjuk megvilágítani, hogy valóban genetikai okokra visszavezethet törzsfügg jelenségr l van-e szó, amikor az ES sejtvonal alapítás nehézségeivel találkozunk, vagy csupán technikai nehézségekr l, amelyek mögött a pluripotencia fogalmának korlátozott ismerete áll. Az elért eredményekre alapozva az új ES sejt vonalakat többek között sejtmagátültetéses klónozási, valamint ivarsejt differenciációs kísérletekben használjuk fel. A csoport fent említett kutatásainak támogatói: EU (FP6-Marie Curie Excellence Grant No. 509582), a Wellcome Trust (International Senior Research Fellowship, D.A.), a TET GB52/01 és TET A10/02, OTKA T046171, valamint az NKTH BIO-00017/2002 projektek.














Kulcsszavak: embrionális ssejt, egér, génkiütés, klónozás, sejtvonal alapítás


E36

Idegsejt vagy asztroglia? – Idegi sejtsors-elkötelez dés szabályozásának in vitro vizsgálata Herberth Balázs, Hádinger Nóra, Varga Balázs, Madarász Emília MTA-KOKI, Budapest - Idegi Sejtbiológiai Laboratórium A központi idegrendszer kialakulása során egymást követ sorrendben jönnek létre a f bb neuroektoderma eredet sejttípusok: az idegsejtek genezisét az asztroglia majd az oligodendroglia sejtek képz dése követi. Ez a sejtfejl dési sorrend - esetenként egyes lépései - in vitro differenciációs rendszerekben is azonosítható. Sok adat bizonyítja, hogy a gerincesek primitív epiblaszt sejtjei, küls indukciós hatások nélkül képesek idegsejtekké alakulni. Az is ismert hogy a korai fejl dési stádiumokban fontos szerepet játszó LIF, CNTF és BMP-2,4 szolúbilis faktorok képesek idegi ssejtek asztroglia irányú differenciációját el segíteni és, hogy ezt a folyamatot a proneurális transzkripciós faktor, a Neurogenin aktivációja gátolja. A sejtsorsok közötti váltást szabályozó folyamatok, valamint az, hogy elválnak-e és ha igen mikor az egyes sejttípusok létrehozására képes ssejtek azonban még távolról sem tisztázottak. A vizsgálatainkban alkalmazott NE-4C neuroektodermális sejtvonal retinsav (RA) kezelés hatására, rövid sejtosztódási szakasz után, ideg- majd asztrogliasejteket hoz létre. In vitro rendszerünkben nincsenek jelen küls organizátorok, amelyek forrásai lehetnének a differenciációt befolyásoló szolúbilis faktoroknak. A kezdetben homogén sejtpopuláció az indukció hatására saját bels mechanizmusai révén szabályozza a különböz sejtsorsok kialakulását. A differenciáció egyes fázisait jól jelzi a neurogenezist el segít , de asztroglia képzést gátló Neurogenin expressziója, amely a kezelést követ els naptól n , majd az érett neuronok megjelenésének id szakában, az asztroglia sejtek megjelenése el tt csökken. Az idegsejtek képz dése rövid idej (néhány órás) RA kezelés esetén is megkezd dik, de az indukció második hetére számuk jelent s mértékben elmarad a több napos kezelés során létrejöv neuronok számától. Az így indukált tenyészetekben nem, vagy csak nagyon kis számban fejl dnek asztroglia sejtek, ugyanakkor LIF kezeléssel az asztroglia képzés elindítható/fokozható. Ez azt mutatja, hogy ezekben a tenyészetekben is jelen vannak az 58











































































asztroglia sejtek képzésére alkalmas sejtek, de megfelel indukció hiányában a gliasejt fenotípus nem alakul ki. A rövid távú RA kezelés ismétlésével növelhet az idegsejtek száma, amit az asztroglia sejtek megjelenése követ, ugyanakkor a RA folyamatos jelenléte mellett az asztroglia sejtek száma szintén csökken. Feltételezésünk szerint a RA els sorban az idegsejtek kialakulását indukálja, és közvetlenül nem okozza az asztroglia sejtek genezisét. A tenyészetekben lév idegsejtek termelhetnek olyan faktort (vagy faktorokat) amelyek az indukció folyamán szintén változó ssejtek egy részét asztroglia sejtek létrehozására késztetik. Hipotézisünket alátámasztja az a korábbi megfigyelésünk is, hogy hosszú id n át indukált NE-4C tenyészetekben, az asztroglia sejtek többsége a neuronok közelében jelenik meg.

















Az el adás anyaga az OMFB-0203/2002 valamint az OTKAT 034692 és D 45959 pályázatok támogatásával készült Kulcsszavak: neuroektodermális ssejt; idegsejt-képzés; asztroglia-képzés; ssejt differenciáció; in vitro








E37

Emberi mesenchymalis ssejtek neuronalis irányú differenciálódása – artefakt vagy m köd idegsejt? 

1

Kertész Zsuzsanna1, Világi Ildikó2, Kovács János3 és Uher Ferenc1 OGYK, ssejt-biológia;; 2ELTE, Élettani és Neurobiológiai Tanszék 3 ELTE, Állatszervezettani Tanszék, Budapest 

A csontvel i ssejtek plaszticitását f ként transzplantációs kísérletek igazolták. Állatmodellekben és csontvel -transzplantáció után elhunyt betegek szövetmintáiban a beültetett ssejtek sorsa nyomon követhet és megállapítható, hogy a donor eredet ssejtek számos szervben – többek között a központi idegrendszerben is - megtelepednek, majd az adott szöveti környezetnek megfelel érett sejtekké differenciálódnak. A szinte végtelennek t n szöveti ssejt plaszticitás klinikai felhasználásához azonban az eddig megfigyeltnél sokkal nagyobb mérték graft- beépülésre és az ssejtek fejl désének ellen rzött irányítására lenne szükség. Hasznos lehetne például ha az ssejtek érését már a beültetés el tt - in vitro kultúrában – el tudnánk indítani a megfelel sejtfejl dési sor irányába. Ezért számos munkacsoport dolgozott ki a mesenchymalis ssejtek (MSC) neuronalis irányú differenciáltatására alkalmas módszert. Közülük a legegyszer bb a Woodbury és mtsai (J Neurosci Res 61: 364, 2000) által leírt sejttenyészet, amelynek lényege, hogy az MSC-ket szérummentes tápfolyadékban, nagy menynyiség 2-merkaptoetanol (2-ME) jelenlétében inkubálják. Ilyenkor az MSC-k jelent s morfológiai változáson mennek keresztül és néhány, idegsejtekre jellemz fehérjét expresszálnak. Ugyanakkor a legtöbb kritika is ezt a módszert érte. Felvet dött, hogy az er s redukálószer stresszt okoz, aminek következtében jelent s átrendez dés történik a citoszkeletonban, megváltozik a sejtek alakja és néhány neuronalis fehérjére specifikus ellenanyag egyszer en keresztreagál a károsodott sejtekkel. Jelen munkánkban azt szerettük volna tisztázni, hogy mi is történik az ilyen sejttenyészetekben? Megállapítottuk, hogy szérummen













































































59







tes DMEM médiumban - 2,5 mM 2-ME jelenlétében - az emberi MSC-k 40-70%-a valóban a tipikus idegsejtekre emlékeztet alakot (morfológiát) vesz fel. A korábban lapos, szétterül sejtek lekerekednek és összehúzódnak miközben hosszú, axon- és dendrit-szer nyúlványokat képeznek. A hosszabb nyúlványok (axonok?) végén jól látható kúp van. Néhány óra múlva Nissl-rögök is megjelennek az átalakuló sejtekben. Két-három nap múlva a sejtek citoplazmájában neuron specifikus enoláz (NSE), sejtmagjukban pedig neuron specifikus nukleáris fehérje (NeuN) mutatható ki indirekt immunfluoreszcens módszerrel. (GFAP pozitív sejteket egyetlen 2-ME-al kezelt MSC kultúrákban sem találtunk). Western blot technikával a kezeletlen MSC-kben csak nestint tudtunk kimutatni, ami a sejtek differenciálódása során fokozatosan elt nik a citoplazmából, miközben egyre több NSE és neurofilament-H (NF-H) expresszálódik. Mivel az immunfluoreszcens vizsgálatokat a Chemicon, a Western blottokat a Santa Cruz Biotechnology ellenanyagaival végeztük (tehát összesen hat különböz ellenanyag felhasználásával dolgoztunk), ez meger síti azt a feltevést, hogy a 2-MA-al kezelt MSC-kben idegsejtekre jellemz fehérjék jelennek meg. Ráadásul, ha a redukálószer mellett Jagged-1 fehérjét is adunk a tenyészetekhez, „dendrit-virágzás” figyelhet meg, azaz a sejtek több, jobban elágazó, de rövidebb nyúlványt hoznak létre, mint a Jagged-1-et nem tartalmazó kultúrákban. A dendrit-virágzást az NF-H fokozott intracelluláris expressziója kíséri. Elmondhatjuk tehát, hogy az MSC-kb l - szérummentes tápfolyadékban - 2-ME hatására a neuronokra jellemz fehérjéket expresszáló és a küls szignál(ok)ra (Jagged-1) reagáló, él sejtek keletkeznek. Természetesen további – els sorban elektrofiziológiai – vizsgálatokra van szükség annak eldöntéséhez, hogy ezeket az MSC eredet sejteket valódi neuronoknak tekinthetjük-e?






































Kulcsszavak: mesenchymalis ssejt, differenciálódás, idegsejt, merkaptoetanol, Jagged-1


E38

Emberi mesenchymális ssejtek chondrocyta irányú differenciálódása Kunstár Aliz1, Dudics Valéria2, Kovács János3, Géher Pál2, Gömör Béla2 és Uher Ferenc1 1 OGYK, ssejt-biológia; 2Budai Irgalmasrendi Kórház, Reumatológiai Osztály; 3 ELTE, Állatszervezettani Tanszék, Budapest 

A betegség vagy sérülés következtében károsodott izületi porc az érellátás hiánya és a porcsejtek rendívül kis fajlagos mennyisége miatt alig, vagy egyáltalán nem képes regenerálódni. Ezért rendkívül nagy az érdekl dés minden olyan módszer iránt, amely alkalmas lehet a szervezetbe beültethet porcszövet (vagy teljes izületi protézis) in vitro el állítására, esetleg a sérült porcterület in situ pótlására. A csontvel i stromából izolálható mesenchymalis ssejtek (MSC) különösen ígéretes kiindulási anyagot jelentenek e próbálkozások során. Az MSC-k olyan multipotens sejtek, amelyek bármilyen köt - és támasztószövet valamint a vérképzést támogató stroma irányába egyaránt képesek differenciálódni. Jelen munkánkban egy, a csontvel i stromából izolált MSC-k porc irányú differenciálódásának vizsgálatára alkalmas, 96-lyuku tenyészt tálcán kivitelezhet mikromódszert fejlesztettünk ki. A csontvel mintákat csíp protézis m téten átesett betegek eltávolított combfejéb l nyertük. A csontvel i adherens sejteket 10-20 generáción keresztül sorozatos átoltással tartottuk fenn. A szuszpenzióba vitt MSC-ket U-aljú tenyészt tálcákon szélesztettük (2x105sejt/lyuk), centrifugáltuk (micromass 60











































pellet), majd 14 napig inkubáltuk ket 10% foetalis borjúsavót (FCS), 5ng/ml rekombináns TGF- 3-at, 6 g/ml inzulint és 10-7 M dexamethazont, vagy 10% FCS-t és demineralizált csont-mátrixot (DBM), illetve 10% FCS-t, rekombináns növekedési faktorokat és DBM-et egyaránt tartalmazó DMEM/F12 médiumban. Az egyes lyukak fenekén kialakult miniat r szövetkorongok összetételét fény és elektronmikroszkópos módszerekkel, valamit izotópos jelölés segítségével tanulmányoztuk. A chondrogenesis során szintetizálódott szulfatált glükózamino-glikánokat 0,1%-os dimetil-metilénkék festéssel tettük láthatóvá (metakromázia). Az I-es és II-es típusú kollagén jelenlétét indirekt immuncitokémia módszerrel igazoltuk a mintákban. A fehérjeszintézis mértékét a kultúrák 3H-leucin felvétele, a kén beépülését 35S tartalmú szulfátion felvételük alapján határoztuk meg. Megállapítottuk, hogy a chondrogenesis TGF-β3, inzulin és dexamethazon, vagy DBM, illetve a növekedési faktorok és DBM egyidej jelenlétében is megindul. Utóbbi – kombinált kezelés - esetében azonban a differenciálódás sokkal markánsabb, mint a csak növekedési faktorokkal és dexamethazonnal, vagy csak DBM-el kezelt kultúrákban. A TGF- 3, inzulin, dexamethazon és DBM egyidej jelenlétében képz dött szövetkorongok kevés lekerekedett sejtb l és nagy mennyiség – proteoglikánokat és II-es típusú kollagént (is) tartalmazó - extracelluláris mátrixból állnak. 3H-leucin és normalizált szulfát-felvételük is magasabb, mint a csak növekedési faktorokkal vagy csak DBM-el kezelt mintáké. Utóbbiak több sejtet és kevesebb extracelluláris mátrixot tartalmaznak a kéthetes inkubálás után. A DBM tehát biológiailag aktív formában tartalmazza mindazokat a morfogéneket és növekedési faktorokat amelyek az MSC-k chondrocyta irányú differenciálódásához szükségesek. Ráadásul a DBM lassan degradálódik és nem immunogén in vivo. Ezért feltételezzük, hogy az MSC/DBM kompozit olyan önálló egységet alkot, amely – különösen TGF- 3-al és inzulinnal el kezelve - a szervezetbe juttatva képes a legkülönböz bb porckárosodások kockázat és mellékhatások nélküli “kijavítására”, vagyis közvetlenül a klinikai gyakorlatban is felhasználható. Végül legalább ilyen fontos, hogy a protézis m tétek során nyerhet csontvel minták alkalmasak lehetnek egy emberi MSC bank létrehozására.






































Kulcsszavak: mesenchymális ssejt, chondrocyta, differenciálódás, morfogének, csontmátrix


E39

Hisztidin dekarboxiláz (HDC-/-) deficiens es sejtek in vitro szívizom irányba történ differenciálódásának vizsgálata Gócza Elen1, Carstea Valer Bogdan1, Uzonyi Barbara2, Tóth Sára2, Anna Wobus3, Falus András2 1 Mez gazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, Gödöll 2 Semmelweis Egyetem, ÁOK, Genetikai, Sejt és Immunbiológiai Intézet, Budapest 3 Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, Dept. of Cytogenetics, In vitro Differentiation, Gatersleben



A hisztaminnak, az azonnali típusú hiperszenzitivitási reakcióban és az immunválaszban betöltött általánosan ismert szerepe mellett úgy t nik, szerepe lehet az egér embriók beágyazódási folyamatában is. A méhben termel d hisztamin az embrió trofoblaszt sejtjein található hisztamin H2 receptoron (H2R) keresztül befolyásolja az embriók beágyazódását. 




61




Ismert, hogy anafilaxia esetén a hízó-, és bazofil sejtekb l származó hisztamin mind a szívizom, mind pedig az érrendszer endotél sejtjeire hat. A hisztamin hatását, illetve a különböz hisztamin receptorok expressziójának szintjét eddig azonban még nem határozták meg embrionális eredet ssejtekben (ES sejtekben). Munkánk során azt vizsgáltuk, hogy hisztamin hozzáadása befolyásolja-e az ES sejtek pluripotenciáját, illetve szerepe van-e a hisztaminnak az ES sejtek in vitro szívizom irányba történ differenciáltatása során. A HDC -/- ES sejteket egér hisztidin dekarboxiláz hiányos (knock out) egér embrióból kiindulva alapítottuk. Ez év els felében sikerült új, a már meglév HDC-/- ES sejtvonalnak megfelel genotípusú, CD1 egértörzsb l származó kontroll sejtvonalakat (CD1/EGFP/HDC+/+) is létrehoznunk. TX-WES médiumot használtunk az ES sejtvonalak alapításakor. A CD1/HDC-/- és a kontroll CD1/EGFP/HDC+/+ ES sejtek szívizom irányba történ in vitro differenciáltatása során Anna Wobus és munkatársai által kidolgozott protokollt alkalmaztuk. Különböz id pontokban a pulzáló, differenciálódott ES sejt csomók számát és a pulzáló szívizomsejtek pulzálásának frekvenciáját határoztuk meg. Ugyan ezekben az id pontokban a nesztin, titin, ßIII-tubulin, citokeratin és dezmin expressziót és a pluripotens ES sejtekre jellemz Oct4 transzkripciós faktor és SSEA-1 markerek expresszióját is meghatároztuk immuncitokémiai módszerekkel. Az ES sejtekb l ugyan ezeken a napokon mRNS mintákat is gy jtöttünk. Az ES médiumot 10-5 M hisztaminnal kiegészítve a pulzáló csomók száma és a pulzálás frekvenciája szignifikánsan lecsökkent mind a kontroll, mind a HDC-/- sejtekben. Az Oct 4 transzkripciós faktor expressziójának szintje nagymérték csökkenést mutatott a kontroll sejtvonalban, 10-5 M hisztaminnal történt kiegészítés hatására. Sem a HR3, sem a HR4 hisztamin receptor jelenlétét nem tudtuk kimutatni, ezzel szemben a H1R és a H2R receptor expresszálódott mind a kontroll, mind a KO sejtekben, a differenciálódás el tt és differenciálódást követ en is.





















































Kulcsszavak: embrionális eredet Oct4 




ssejtvonal, in vitro differenciáltatás, hisztamin, HDC,

E40

ssejt niche felépítése és m ködése – döntéshozó molekulák

A vérképz



Uher Ferenc1, Monostori Éva2, Vas Virág1, Kertész Zsuzsanna1, Kiss Judit1, Kunstár Aliz1 és Kovács János3 1 OGYK, ssejt-biológia, Budapest;; 2MTA SZBK Genetikai Intézet, Szeged;; 3 ELTE, Állatszervezettani Tanszék, Budapest 

A vérképz ssejtek csontvel i mikrokörnyezete – a haematopoeticus ssejt niche - az egyik legösszetettebb szövetünk. Az ssejteket különböz stroma sejtek (fibroblasztok, osteoblasztok, adipocyták, macrophagok, reticularis sejtek, stb.), fejl d vérsejtek, valamint gazdag sejtközötti állomány, extracelluláris mátrix veszi körül. A stroma sejtek részben közvetlen sejt-sejt kölcsönhatások, részben az általuk termelt szolubilis és/vagy az




















62




extracelluláris mátrixhoz kötött morfogének (Wnt, Hedgehog), cytokinek (SCF, Flt-3L, TPO), kemokinek (SDF-1), és lektinek (galektin-1) segítségével befolyásolják - vagy inkább irányítják - az ssejtek sorsát (Rattis et al., 2004, Curr Opin Hematol, 11:88). Munkacsoportunk az elmúlt években két ilyen „döntéshozó” – a Notch jeltovábbító rendszer és a stromasejtek által termelt galektin-1 – vizsgálatával foglalkozott (Uher et al., 2003, Acta Microbiol Immunol Hun, 50:3). A Notch egy filogenetikailag si, a soksejt szervezetek differenciálódása során nélkülözhetetlen sejt-sejt kölcsönhatásokat biztosító és az érintett sejtek további sorsát meghatározó jeltovábbító rendszer. Emberben és egérben négy receptorból (Notch1, 2, 3, 4) és legalább öt ligandumból (Jagged1, 2 és Delta(-like)1, 2,4) áll. Kulcsszerepe van a genomban tárolt fejl dési program(ok) kifejez désében, a különböz szervek és szövetek kialakulásának szabályozásában. A vérképz s- és el dsejt kompartmentben - többek között – a Notchrendszer biztosítja az önfenntartó osztódás(ok) és a differenciálódás megfelel egyensúlyát, azaz a folyamatos vérképzés fenntartását. Munkánkban ezért mindenekel tt a csontvel i stroma sejtek felszínén legnagyobb mennyiségben expresszálódó Notch-ligandum – a Jagged1 fehérje – szolubilis (monovalens) és sejtfelszíni vagy Sepharose-4B szemcsék felületéhez kötött (multivalens) formájának a vérképz s- és el dsejtek fejl désére gyakorolt hatását szerettük volna tisztázni. Megállapítottuk, hogy a stroma sejtek felszínén expresszálódó vagy Sepharose-4B szemcsék felszínén immobilizált Jagged-1 fehérje SCF, Flt3L, és TPO egyidej jelenlétében önfenntartó osztódásra készteti a macskak kultúrában csak 28-35 nap után kolóniát képz , fiatal vérképz sejteket. Ugyanakkor nagyobb mennyiség (5-10 µg/ml) szolubilis Jagged-1 fehérje gátolja ezt a kölcsönhatást (Vas V et al., 2004, J Leukoc Biol 75:714). A következ lépésben - a sejtek sorozatos transzplantációjával – azt is igazoltuk, hogy a multivalens Jagged-1 az in vivo tartós repopulációra képes, valódi vérképz ssejtek önfenntartó osztódását (is) fokozza ezekben a kultúrákban (Kertész et al., submitted). A Notch jeltovábbító rendszer tehát valóban kulcsszerepet játszik a vérképz ssejtek sorsának meghatározásában. A megfelel Notch ligandum(ok) segítségével ezek a sejtek in vitro kultúrában is jól szaporíthatók anélkül, hogy akár önfenntartó, akár in vivo repopulációs képességüket elvesztenék. A csontvel i stroma sejtek által (is) termelt kis molekulasúlyú lektin, a galektin-1 többféle mechanizmus – apoptózis kiváltása, proliferáció fokozása és/vagy gátlása, differenciálódás elindítása segítségével képes befolyásolni a vérképz s- és el dsejtek aktuális korstruktúráját in vitro kultúrában (Vas V et al., 2005, Stem Cells, in press). In vivo pedig igen er teljesen gátolja a vérképz s- és el dsejtek, valamint a granulocyták és monocyták mobilizációját, azaz kilépését a keringésbe. Ez – legalábbis részben – magyarázatot adhat arra, hogy miért olyan hatékony immunszuppresszív és gyulladás gátló anyag a galektin-1 in vivo.





































































































Kulcsszavak: ssejt, vérképzés, mikrokörnyezet, Notch, galektin-1


63

E41

A mesenchymalis ssejtek plaszticitása és öregedése 1

Kiss Judit1, Varga Gergely2, Mikala Gábor3 Kovács János4 és Uher Ferenc1 OGYK, ssejt-biológia; 2SE III. sz. Belgyógyászati Klinika; 3OGYK, Haematológiai és Belgyógyászati Osztály; 4ELTE, Állatszervezettani Tanszék; Budapest 

A mesenchymalis ssejteket (MSC) bízvást nevezhetjük a szervezet Janus-arcú szöveti ssejtjeiknek. Becslések szerint 1:105 - 1:106 gyakorisággal fordulnak el a csontvel ben, de nem ismerünk olyan specifikus markert vagy marker kombinációt, amivel akár in vivo, akár in vitro azonosítani lehetne ket. Izolálásuk lényegében adherenciájukon alapul. A csontvel b l kitapasztott stroma sejteket, miután ben tték a rendelkezésükre álló felületet, felszedjük és kis sejts r ség mellett átoltjuk. Többszöri átoltás után egy jórészt fibroblastszer sejtekb l álló, exponenciálisan növeked tenyészetet kapunk, amit – ha már nem tartalmaz vérképz sejteket - MSC kultúrának tekinthetünk. Emberi csontvel b l kiindulva általában már három, egér csontvel esetén hat-nyolc átoltás után érjük el ezt az állapotot. Az ilyen sejtek egységesen CD133, CD34, és CD45 (ember), illetve CD34, CD3, CD45/B220, CD11b, Ly-6G, és TER-119 (egér) negatívak. Lágy gél kultúrában haematopoieticus növekedési faktorok jelenlétében sem képeznek kolóniát. Visszajuttatva ket a szervezetbe nem vándorolnak a csontvel be (minden csontvel -transzplantált beteg és kísérleti állat stromája recipiens eredet ), hanem inkább szétszóródnak a különböz szövetekben. Ugyanakkor in vitro kultúrában ezek a legplasztikusabb szöveti ssejtek. Mesodermalis (vérképzést támogató stroma, csont, porc, zsírszövet, inak, simaizom), ectodermalis (neuron , glia) és endodermalis (májsejtek, inzulintermel β-sejtek) irányba egyaránt képesek differenciálódni. Plaszticitásuk azonban – ellentétben az embrionális ssejtekével – id vel fokozatosan csökken. Megállapítottuk, hogy el ször neuronalis irányú differenciálódási képességüket veszítik el (emberi MSC-k esetén 6-8 átoltás után), majd egyre nehezebben alakítanak ki vérképzést támogató stromát. Az öregedés következ fázisában már nem, vagy csak alig differenciálódnak zsírsejtekké izobutil-metilxanthin hatására. Legtovább, gyakorlatilag a kultúrák teljes elöregedéséig (25-30 átoltás), osteoblastokká képesek alakulni. Ha az MSC-k, és ennek következtében a stroma – pontosabban a vérképz ssejt niche - öregedése felgyorsul, megn az esélye annak, hogy egy-egy beteg vérképz klón elszaporodjon a csontvel ben. Amikor például myelodysplasiás (MDS) és myelomás (MM) betegek csontvel mintáiból izolált MSC-k tenyészetét hasonlítottuk össze egészséges csontvel donorokéval, megállapítottuk, hogy a myelomás betegekb l származó stroma tenyészetek, az egészséges emberek MSC-ib l kialakított stroma rétegekhez hasonlóan jól növekednek in vitro, érett állapotban konfluensek és minden irányba jól differenciálódnak. Ezzel szemben a myelodysplasiás strómák morfológiailag kevésbé egységes képet mutatnak, lassabban növekednek, er sen apoptotikusak és általában nem érik el a konfluenciát. Neuronális irányba egyáltalán nem képesek differenciálódni és jelent s mennyiség adipocyta keletkezését is csak néhány MDS beteg stromájában sikerült indukálni. Vérképzést támogató képességük gyakran szintén rosszabb mint az egészséges emberek vagy MM-es betegek csontvel jéb l kialakított stroma rétegeké. MM-ben tehát egy
























































































































64

olyan kölcsönös paracrin kapcsolatot van a neoplasztikus plazmasejtek (a tumor) és a stroma között, amely a betegség progresszióját el segít , de korántsem visszafordíthatatlan változásokat indukál az egyébként egészséges csontvel i mikrokörnyezetben. Ugyanakkor MDS-ben valószín leg a stroma betegsége az els dleges, annak akcelerált öregedése teszi lehet vé egy beteg vérképz klón „elszabadulását”.



















Kulcsszavak: mesenchymalis ssejt, plaszticitás, differenciálódás, öregedés, betegségek


E42

A porcosodó high density mezenchimális kultúrák transzfekciós lehet ségei Juhász Tamás1, Matta Csaba1, Mészár Zoltán1, Szíjgyártó Zsolt2, Czifra Gabriella3, Módis László1, Gergely Pál2, Zákány Róza1 1 Debreceni Egyetem OEC Anatómiai, Szövet- és Fejl déstani Intézet, Debrecen 2 Debreceni Egyetem OEC Orvosi Vegytani Intézet, Debrecen 3 Debreceni Egyetem OEC Élettani Intézet, Debrecen

Kísérleteink során csirkeembriók végtagtelepeib l izolált kondroprogenitor sejtekb l el állított primer sejtkultúrákon vizsgáltuk a porcdifferenciáció jelátviteli útvonalának egyes lépéseit. A kondrogenezis molekuláris mechanizmusának feltárásában lényeges adatokat szolgáltathatnak egyes enzimek transzfekciója is. A primer mesenchymális sejtek transzfekciójára vonatkozó irodalmi adatok hiányában, el ször a különböz transzfekciós módszerek hatékonyságát vizsgáltuk. Mivel a kalcineurin alapvet fontosságú a porcdifferenciáció folyamán, kiterjesztettük kísérleteinket kalcineurint tranziensen expresszáló kultúrák el állítására is. GFP-t és GFP-hez konjugált kalcineurin-A alegységét tartalmazó pEGFP-C1 vektort transzformáltuk TOP10 E.coli baktériumtörzsbe. A plazmidokat Quiagen Maxi- és Minipreppel izoláltuk, majd XhoI restrikciós enzimmel linearizáltuk és PCR marker mellett azonosítottuk. A tranziens expressziót többféle transzfekciós kit segítségével végeztük (Superfect, DMRIE, AMAXA, Saint Mix), melynek eredményeként az AMAXA nukleofekciós módszer segítségével GFP-t expresszáló plazmidot bejuttatva a sejtekbe 93%-os transzfekciós arányt értünk el, de a sejtek folyamatos pusztulása miatt a kísérlet 3. napjára metakromáziát mutató porctelepeket nem tudtunk detektálni. A Saint Mix transzfekciós kit protokollját módosítva hasonló transzfekciós hatékonyságot kaptunk és a tenyésztés 6. napján savas dimetilmetilénkékkel vörös metakromáziát mutató porctelepeket is detektáltunk. Mivel a kezeletlen kontrollhoz viszonyítva a transzfektált kultúrákban csökkent metakromáziát detektáltunk, ezért megvizsgáltuk a transzfektált sejtek életképességét és proliferációját, valamint megszámoltuk a kultúrákból fölvált sejteket. A kalcineurinnal transzfektált kultúrákban a metakromázia fokozódást észleltünk a csak transzfekciós reagenssel kezelt kultúrákhoz viszonyítva. A porcképz dés fokozódását és a kalcineurin transzfekció eredményességét RT-PCR és immunoblot segítségével is konkretizáltuk.




















65




Vizsgálataink során megállapítottuk, hogy a primer mesenchymális sejtek rendkívül érzékenyek a transzfekciós módszerekre, megfelel körülmények között nem toxikus reagenseket alkalmazva nagy hatásfokkal transzfektálhatók, az overexpresszált enzimek molekuláris biológiai módszerekkel könnyen kimutathatók.


Kulcsszavak: kondrogenezis, kalcineurin, transzfekció, módszertan, primer high density mezenchimális kultúrák

E43

Transzgenikus modellállatok el állítása sejtmagátültetéses klónozással Dinnyés András1,2, Bodó Szilárd1, Kobolák Júlia1, Szmolenszky Ágnes1 1 Mez gazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, Gödöll ; 2 MTA/SZIE Alkalmazott Állatgenetikai és Biotechnológiai Kutatócsoport, Gödöll





A modern orvostudományban forradalmi fejl dés zajlott le a betegségek genetikai hátterének megismerésében. Ezáltal válik lehet vé a betegség hajlamok kimutatása és a megbetegedések megel zése, illetve a genetikai eredet betegségek gyógyítása. Mindezen fejl dés nem lett volna lehetséges a génkiütéses transzgenikus egér technológia nélkül. A génkiütéses módszer egérben az embrionális ssejtek genetikai manipulálhatóságán alapul. Más fajokban (ember kivételével) jól m köd embrionális sejtvonalak el állítása nem sikerült, így tartós finomabb genetikai manipulációkra kevéssé nyílik lehet ség. A közelmúlt kutatási eredményei azonban új lehet ségeket nyitottak ezen a téren. A sejtmagátültetéses klónozási technológia lehet vé teszi testi sejtekb l életképes utódok el állítását. A Mez gazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont Mikromanipulációs és Genetikai Újraprogramozási Kutatócsoportja és az MTA/SZIE Alkalmazott Állatgenetikai és Biotechnológiai Kutatócsoportja célul t zték ki testi- és embrionális ssejtekb l klónozott egerek el állítását, valamint a klónozási technológia felhasználásával génkiütött egerek el állítását betegségmodell és gyógyszertesztelési célokra. A klónozási technológia felhasználásával lehet ség nyílik új fajokban, így például nyúlban transzgenikus és génkiütött egyedek el állítására betegségmodell és gyógyszertesztelési célokra. A kutatások sikeréhez komplex megközelítés szükséges. Els sorban fontos a klónozási technológia hatékonyságának növelése. A genetikai újraprogramozás folyamatát segítheti az s-sejt kivonatokkal való sejtmag el kezelés. A génkiütési technikák fejlesztése testi- és embrionális ssejt tenyészetekben elengedhetetlen ahhoz, hogy a korlátozott osztódási számmal bíró testi sejttenyészetekben is lehetséges legyen a finomabb genetikai manipuláció. A kutatások eddigi eredménye az egér mikromanipulációs, aktivációs és kultivációs rendszer optimalizálása. Sikerült az els hazai testi sejtekb l klónozott embriók el állítása, sejtmag donorként kumulusz sejtekb l kiindulva. A kezelések hatás vizsgálatára a fejl dési és sejtszám adatokon túl felhasználható a Real-time RT PCR módszer, amivel a laboratóriumban egyedi embriókból is sikerült jellemz génexpressziós szinteket meghatározni. Az ssejt kivonatok fibroblaszt tenyészetekre gyakorolt hatásának vizsgálata során egér embrionális ssejtek lízissel, illetve cukor-grádiensen történ ultracentrifugálással el állított kivonatait teszteltük, primer egér embrionális fibroblaszt tenyészeteken. A tesztek 66








































































































eredményeként a legnagyobb osztódási ráta növekedés a nukleáris extrakt kezelést követ en volt megfigyelhet . A proteáz inhibitorok adagolása a vizsgált kezelési id tartamban szignifikánsan javította sejtek túlélését. A kezelés id tartamának meghatározásakor dózisfügg hatást tapasztaltunk. A kapott eredményeket a génexpresszió vizsgálatával is elemeztük és igazoltuk a sejtosztódás blokkolását a kezelések következtében. Távlati célként a kezelés eredményessége esetén sejtmag átültetést követ en a transzdifferenciáltatott fibroblaszt sejtek klónozásra való alkalmasságát is meg kívánjuk vizsgálni. A csoport fent említett kutatásainak támogatói: EU (FP6-Marie Curie Excellence Grant No. 509582), a Wellcome Trust (International Senior Research Fellowship, D.A.), a TET GB52/01 és TET A10/02, valamint az OMFB-01895/2002 projektek.

















Kulcsszavak: transzgenikus, klónozás, orvosi modell, embrió, egér

E45

Génbevitel a szinapszisokon keresztül Boldogk i Zsolt, Dénes Ádám, Ördög Balázs SZTE ÁOK Orvosi Biológiai Intézet, Szeged 

Az idegsejtekbe történ génbevitel egy speciális módja a szinapszisokon keresztül történ géntranszfer. Ez a technika egy szinapszisokon keresztül terjed vírusvektorok felhasználásán alapul. Miért viszünk be transzgéneket a szinapszisokon keresztül? Egyrészt azért, mert a vírus vektorokba épített fluoreszcens markerek által láthatóvá tehet k teljes idegi hálózatok. Másrészt pedig, lehet vé válik egy idegpálya jól ismert pontjáról tetsz leges transzgének bevitele távoli neuronokba, amelyekr l más módszerekkel nem is tudnánk megállapítani, hogy a vizsgált idegpályához tartoznak-e vagy sem. Van azonban egy paradoxon ebben a rendszerben. Egyrészr l, a vektornak nem szabadna hatással lennie a célsejtre, másrészr l pedig, ahhoz, hogy a vírus a szinapszisokon keresztül terjedjen, a pályát alkotó neuronokban replikálódnia kell, ami citotoxikus hatással jár. A paradoxont úgy oldhatjuk fel, ha mutációkkal annyira gyengítjük le a vírust, hogy még éppen ne veszítse el a terjed képességét. Emellett, a mutációk gyengít hatását ellensúlyozni tudjuk a vírus terjed képességét javító specifikus mutációkkal. Az Aujeszky-féle vírus (AyV) egy neurotrop herpeszvírus, amely transzszinaptikusan terjed az idegrendszerben. Az el nyös tulajdonságai miatt, ezt a vírus használjuk transzszinaptikus génbevitelre. A vadvírus, mivel túlságosan virulens, nem alkalmas erre a feladatra. Ehelyett, az Bartha-féle AyV törzset használjuk anyavírusként. Több problémát is meg kell oldani, hogy egy ideálisrendszerünk legyen a fenti feladat megoldására. Ezek a feladatok a következ k: (1) A citotoxicitás csökkentése. Ezt elérend , kiütöttük a vírus egyik legjelent sebb citotoxicitás faktorát A virion host-shut-off (VHS) gént, ami egy ribonukleázt kódol. El állítottunk egy korai fehérje (EP) 0 knockout vírust is. Az EP0 gén funkciója a vírus replikációs stratégiájának (litikus vagy látens) meghatározása. Ett l a vírustól azt várjuk, hogy terjedése során egyes neuronokban vonuljon látens állapotba, miközben fejezze ki a





















































67

genomba beépített zöld fluoreszcens proteint (GFP) kódoló gént. Ezekre a sejtekre a vektor nem lesz hatással, s így a fert zött sejteket natív állapotban vizsgálhatjuk. (2) A terjed képesség javítása. Az AyV terjed képességét úgy javíthatjuk, ha a fert zés típusát eldönt másik gén, az IE180 gén, m ködését szabályozzuk. Ennek lényege az, hogy az IE180 gént blokkoló antiszensz mechanizmust elimináljuk, s ezáltal ez a vírus a látens fert zés helyett a litikus fert zést fogja választani, s így nem el meg a terjedésben. (3) Specifikus terjedés. Ha a vírus lízis útján kijut a citoplazmából, akkor megfert zhet szomszédos neuronokat, amelyek ne tartoznak a vizsgált idegpályához, ami félrevezetheti a kutatást. Két módszerrel védhetjük ki ezt. Az egyik azon alapul, hogy a virulencia csökkenés miatt a vírus terjedési sebessége lecsökken, s ezért az immunrendszernek elegend ideje lesz a fert zött sejt izolálására. A másik módszer a gD gén kiütésén alapul. A gD knockout vírus ha nem szinapszison keresztül lép ki a sejtb l, nem képes új fert zést kezdeményezni. (4) Aktivitás markerek bevitele. A fluoreszcens genetikailag kódolt aktivitás markerek (pH és Ca ion szenzorok) a neuron m ködését jelzik a marker intenzitásának vagy színének megváltozásával. Ilyen markereket építettünk a vírus genomba, s teszteljük különböz rendszerekben.










































Kulcsszavak: génbevitel, herpesz vírus vektor, transzszinaptikus génbevitel, idegsejtek, aktivitás markerek

E46

A 16-3 fág lizogéniájának szabályozása Csiszovszki Zsolt ELTE Genetikai Tanszék, Budapest; MBK Genetikai Intézet, Gödöll

A 16-3 fág a Rhizobium meliloti 41 szimbiotikus nitrogénköt baktérium mérsékelt bakteriofágja. A fágkromoszóma a gazda fert zése után körré záródik. Ez az el feltétele az integratív helyspecifikus rekombinációnak, amelynek segítségével a fággenom a gazda kromoszómájába épül. A cirkularizáció a ragadós végek kovalens kapcsolódásával jön létre. A 16-3 fág ragadós végeit 10 bp hosszú, 3’ túlnyúló, szimmetrikus szekvencia alkotja. A fág helyspecifikus rekombinációs rendszere ismert és m ködése jól jellemzett. Az integrációval létrejön a lizogénia, amelyet a profág által kódolt fehérjék teremtenek meg és tartanak fent. A mérsékelt bakteriofágok nagy részében a lizogéniát, hasonlóan a λ fághoz, egy immunitási régióba rendez d represszor vagy represszorok génjei szabályozzák. A 16-3 fág lizogéniájának megismerése során azonosítottunk egy második immunitási régiót (immX), amely szintén szabályozó fehérjék génjeit és célszekvenciáit tartalmazza. Ezek alapján a 16-3 fágot, a jóval ritkábban el forduló, két immunitási (immC és immX) régióval rendelkez fágok közé sorolhatjuk, amelyek archetípusa a S. typhimurium P22 fágja. A 16-3 immC régiója jól ismert: a c gén, és a gén mellett található jobb és bal oldali operátor régió alkotja. A régió különlegessége, hogy a két operátoron belül a köt helyek között eltér hosszúságú térköz található. A represszor kapcsolódása az operátorokhoz a fehérje




























68

flexibilitásán és a DNS konformáció változásán keresztül valósul meg. Az immC nagy szerkezeti hasonlóságot mutat az egy immunitási régióval rendelkez fágok azonos szerep régióihoz. Az immX régió szintén rejt magában egy különlegességet. A szabályozó fehérjék két, ellentétes polaritású, nagy mértékben átfed cisztronok termékei és a represszor funkcióhoz mind a két fehérje m ködése elengedhetetlen feltétel. A régió szerkezete és szekvenciája eltér az eddig ismertekt l. Eredményeink alapján a két immX fehérje DNSköt fehérje lehet és betérképeztünk a két cisztron közelében lév mutációkat, amelyek a fehérjék lehetséges hatóhelyeit mutatják meg. A kísérleti eredményeink alapján a lizogénia irányításában bizonyos hierarchia van a két régió között. Az immC funkciója episztatikus viszonyban van immX m ködésével, ahol az immX a hiposztatikus elem. A két szabályozó gén az alábbi útvonalba rendezhet : immX→immC→lizogénia. Mutánsaink viselkedése azt mutatja, hogy a lizogénia létrehozásában az immC régiónak, a fenntartásában mind a két régiónak szerepe van. Az immX régió m ködésének részletesebb feltárása a 16-3 fágot a lizogénia szabályozás egy újszer modelljévé emelheti.



























Kulcsszavak: bakteriofág, lizogénia, génszabályozás, represszor, operátor

E47

Evolúciós sejtbiológia Jékely Gáspár, Kristin Tessmar-Raible, Florian Raible és Detlev Arendt European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Németország A jelenleg él kétoldali szimmetriát mutató állatcsoportok (Bilateria) sei a kambriumi robbanás során az óceánban fejl dtek ki. Ezen állatok közös se egy szelvényezett, viszonylag fejlett központi idegrendszerrel rendelkez , csillós trocophora lárva stádiumon keresztül fejl d féregszer lény volt. A legintenzívebben kutatott gerinctelen szárazföldi modellállatok (Drosophila, C. elegans) nagyon eltávolodtak ezen si fejl dési és életmódtól. A szárazföldi élethez való alkalmazkodás során igen gyors evolúción mentek keresztül, számos si tulajdonságot elvesztettek és sok új, modern tulajdonságot fejlesztettek ki (pl. Drosophila szegmentáció). A tengerben maradt gerinctelen rokonaik nem siettek ennyire. A kétoldali szimmetriát mutató állatok közös séhez minden bizonyal a tengeri soksertéj gy r sférgek (Polychaeta) állnak a legközelebb. Igaz ez a morfológia/életciklus szintjén is, de a gének és a sejttípusok szintjén is. Egyik fajuk, a Platynerei dumerilii az újdonsült tengeri gerincteren modellálatok egyik legigéretesebb képvisel je. Könnyen és olcsón szaporítható a laboratóriumban, egy megtermékenyítéssel sok száz szinkronban fejl d embrió nyerhet , a génkifejez dési mintázatok sejt szint felbontással elemezhet k az embriókban (e tekintetben szinte egyedülálló), teljes genomjának szekvenálása hamarosan megkezd dik. A Platynereis-b l származó 20000 EST elemzése során kiderült, hogy e faj sok száz olyan gént hordoz, amely elveszett az eddig megszekvenált gerinctelen állatok genomjából, de megtalálható gerincesekben. E gének némelyike olyan sejttípusokban fejez dik ki, amelyek a gerinctelen





































































69

modellállatokban szintén nem, de a gerincesekben megtalálhatók. A Platynereis mindezekért ideális referenciamodell az összehasonlító genomikai, fejl désbiológiai és neurobiológia vizsgálatokhoz. Ezt az egyik legizgalmasabb sejttípus, az agyi csillós fotoreceptor példájával mutatjuk be. E sejttípus nemcsak morfológiailag hasonlít a gerinces retina csapjaira és pálcikáira, hanem azokkal ortológ opszin molekulát is hordoz (copszin), és ortológ transzkripciós faktort (retinal homeobox, Rx) fejez ki. A Platynereis agyában található csillós fotoreceptorok tehát homológok a gerincesek fotoreceptorjaival (azaz e sejttípusok a két állatcsoport közös sében meglév csillós fotoreceptorokból erednek). E felfedezések teljesen új megvilágításba helyezik a gerinces szem evolúcióját. Az si csillós fotoreceptorok fiziológiás szerepe még nem ismert (fototaxis? nap-éj ritmus? menekülési reakciót kiváltó un. off-válasz?), de a Platynereis fényreakcióinak vizsgálata erre is választ adhat. A fotoreceptorok és egyéb konzervált sejttípusok azonosítását, m ködésük és evolúciójuk jobb megértését valamint molekuláris jellemzését (pl. transzkripciós faktorok, G-fehérje kapcsolt receptorok) célul kit z kutatások az összehasonlító neuroanatómia/fiziológia és az evo-devo kutatás frontvonalát képezik.


















Kulcsszavak: evolúció, fotoreceptor, csilló, opszin, neurobiológia

E48

Kemotaktikus drug-targeting formil-peptidekkel. – Szerkezet/hatás kapcsolata és annak filogenetikai aspektusai Láng1 Orsolya, Birinyi1 Judit, Bai2 Katalin, Láng1 Júlia, Mez 2 Gábor, Hudecz2 Ferenc, K hidai1 László 1 Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, Budapest 2 Eötvös Loránd Tudományegyetem-MTA, Peptidkémiai Munkacsoport, Budapest 



A kemotaktikus drug-targeting (CDT) egy a gyógyszerek és egyéb biológiailag hatásos vegyületek szelektív célbajuttatására szolgáló, újonnan javasolt technika. A CDT során olyan konjugátumokat alkalmazunk, melyek kemotaktikusan aktív ligandból, hordozó molekulából és hatóanyagból állnak. A hatóanyag pontos targetálását a konjugátumok kemotaktikus jellege biztosítja. A kemoattraktáns komponens a hatóanyag gyors és szelektív célbajutását biztosítja a pozitív kemotaktikus válaszkészség sejtek esetében, míg a repellens karakter ligand megvédi a molekulát a gyors, nem-célsejtek általi lebontástól. Az alkalmazni kívánt konjugátumok molekula és célsejt specifitása is nagyban függ az azt alkotó komponensek molekuláris jellegét l. Célkít zések: jelen munkánkban (i) vizsgáltuk a CDT –ben a ligand és a hordozó molekulák szerkezet/hatás összefüggéseit; (ii) jellemeztük a konjugátumok alapvet sejtfiziológiai paramétereit; továbbá (iii) elemeztük a vizsgált peptidek hatásainak eltéréseit a filogenezis különböz szintjein. Anyag és módszer: kísérleteink modell-sejtjei THP-1 monociták voltak. Filogenetikai összehasonlító vizsgálatainkat Tetrahymena pyriformis GL eukaryota csillós egysejt n végeztük. Nyolc peptid-konjugátum hatását elemeztük. Hordozó molekulaként polilizin (EAK, SAK) 
















70

és oligotuftszin (T20) származékok szerepeltek, míg a kemotaktikus ligandok fMLF, fNleLF, fMMM voltak. A THP-1 sejtek kemotaktikus válaszkészségét NeuroProbe® kamrában, míg a Tetrahymena esetében kapilláris kemotaxis assay-vel határoztuk meg. A fluoreszcensen jelölt konjugátumok internalizációját FACS analízissel értékeltük ki. A biológiai hatás szignalizációjának specifitását a kemotaxis PI3K-függ szignalizációs útjának gátlásával (Wortmannin) elemeztük. Az adatok statisztikai kiértékelése ANOVA-val történt. Eredmények THP-1 sejteken (i) A három formil-peptid natív kemotaktikus hatásának eredménye alapján csak a fMLF és a fNleLF tekinthet k hatásos kemoattraktáns ligandnak. (ii) A hordozó leghatásosabb kemoattraktáns peptiddel - fMLF - való konjugálása fokozott kemotaktikus hatású molekulákat eredményezett, azonban a válaszreakció mértékében lényeges különbségek voltak. (iii) A két polilizin alapú konjugátum eltér en viselkedett, csupán az EAK-fMLF (10-17-10-16 M) volt er s kemoattraktáns. (iv) A különböz formil-peptidet tartalmazó T20 konjugátumok attraktánsak voltak, azonban a legszignifikánsabb választ az fMLF jelenléte kölcsönözte a molekulának. (v) A T20 hordozó alapláncának integritása meghatározó, annak változtatása (szukcinil vagy formil csoportokkal) neutralizálja a kemoattraktáns jelleget. (vi) Egyéb sejtfiziológiai paraméterek vizsgálatakor is jelent s volt az eltérés a natív hordozó és a konjugátumok hatásai között. (vii) Az eredmények csillós modellel való összevetése a protozoon kifejezett érzékenysége mellett arra is utal, hogy a vizsgált ligandok szignalizációjában számos, filogenetikailag konzervált elem vesz részt. Összefoglalva: Eredményeink további szerkezeti és funkcionális bizonyítékkal szolgálnak a molekula- és célsejt-specifikus CDT kutatásához.

















Kulcsszavak: kemotaxis, kemotaktikus drug-targeting, fMLF, tuftszin, THP-1

E49

A képalkotó citometria alkalmazási lehet ségei Bacsó Zsolt1, Megyeri Attila2, Szabó Gábor1 és James F. Eliason3 1 DE OEC, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet, Debrecen 2 DE OEC, Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet, Debrecen 3 Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, Michigan, USA A sejtbiológia és az orvostudomány fejl dése szorosan kapcsolódik modern technológiák kifejlesztéséhez. Így kapcsolódott a patológia a fénymikroszkóp feltalálásához és így lett napjainkban az áramlási citométer a klinikai labordiagnosztika egyik sarokpillére. Az áramlási citometria szuszpenziós mintákban egyedi sejtek tömeges és gyors kvantitatív analízise révén lehet séget adott az immunfenotipizálásra, a tumorok ploiditásának vizsgálatára, vagy intracelluláris fehérjéinek mennyiségi meghatározására. A szövettani képi információknak az áramlási citometriában mért sejtek kvantitatív adataihoz való direkt hozzárendelésnek ugyanakkor korlátot szabott a tárgylemezen végezhet statisztikai analízisek hiánya. A képalkotó citometria letapadó sejtkultúráknak az áramlási citometriához hasonló egyedi sejteken történ kvantitatív képi analízisét biztosítja, lehet vé téve ilyen módon a szövettani és a citometriás ismeretek integrálását.














71

A metodika általános bemutatása után egyik munkánkban módszert fejlesztettünk ki egyedi sejtek apoptótikus illetve nekrótikus sejtelhalásának mérésére. Jurkat sejteken anti-CD95 antitesttel apoptózíst indukálva mértük az apoptótikus sejtekre jellemz foszfatidilszerinexternalizációt FITC-jelzett annexinnel és a nekrótikus sejteketet is megitél propidium jodidos kett s jelöléssel. Ennek a szupravitális festésnek a mérése után ugyanezen sejteken meghatároztuk a sejtek DNS fragmentációját alkalikus comet-assay alkalmazásával. Méréseinkkel megállapítottuk, hogy a foszfatidil externalizáció megjelenése nagyon er s korrelációt mutat az egyedi sejtek apoptótikus DNS fragmentációjával. Így Jurkat sejteken az apoptotikus membrán markerek pozitivvá válása, mely a plazmamembrán lipid asszimetriájának a felborulását mutatja - és a DNS fragmentációhoz képest egy korábbi apoptótikus markernek tekintettek -, azonos id ben következik be az apoptótikus DNS fragmentáció kialakulásával. A módszert továbbfejlesztve a comet assay helyett egy egyszer apoptotikus halo assayt alkalmazva a DNS fragmentáció és a membrán asszimetria kialakulásának az együttes mérésén keresztül tudunk apoptózist befolyásoló gyógyszerek hatását kvantitatíve egyedi sejtek szintjén meghatározni. Egy másik munkánkban, egy az antitumor terápiában használatos prodrug, a capecitabin hatásának el rejelzésére fejlesztettünk ki képalkotó citometriai módszert a capecitabin intratumorális metabolizmusában kulcsszerepet játszó enzimek arányának kvantitatív mérésével. A timidin foszforiláz (TP) és a dihidropirimidin dehidrogenáz (DPD) a capecitabin aktiválásban illetve inaktiválásban szerepet játszó két enzim melyek aránya jobban korrelál a tumorok gyógyszer érzékenységével, mint bármelyik enzim mennyisége önmagában. Megállapítottuk, hogy a képalkotó citometria alkalmas a TP és a DPD arányának mérésére szöveti metszetekben.



















Kulcsszavak: lézer-pásztázó citometria (LSC), comet-assay, apoptózis, nekrózis, gyógyszer metabolizáló enzimek

E50

Biológiai mikrogyöngyök áramlási citometriás alkalmazásai Szabó Miklós1,3, Pataki Judit3, Székvölgyi Lóránt3, Heged s Éva3, Lakatos Erika2, Lustyik György2,3, Szabó Gábor3 1 Izotop Intézet Kft., Budapest 2 Soft Flow Hungary Kft., Pécs 3 DE OEC Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

Fejlesztéseink célja egy olyan új, az áramlási citometriás készülékeken és metodikákban használható szilárdfázis/szeparáló reagens kifejlesztése, mely helyettesíteni tudja (méret, köt kapacitás, felhasználhatóság stb. szempontjából) a kereskedelemben kapható polimer mikrogyöngyöket és melynek alkalmazása azoknál lényegesen kevésbé költséges. Saccharomyces cerevisiae illetve Staphylococcus aureus, éleszt ill. baktérium sejteket formaldehiddel fixáltunk és a fixált sejteket avidinnel vagy sztrepavidinnel vontuk be egy kémiai konjugálási eljárás segítségével. A kapcsolási metodika biztosította számunkra a 72





megfelel mennyiség (Strept)avidin (> 1 x 106 db fehérje molekula / sejt ) stabil rögzítését a felületen. A kapott “biológiai mikrogyöngyöket” különböz molekuláris biológiai és fehérje analitikai eljárásokban használtuk fel: enzimaktivitás tesztelésére, mutáció-, deléció-, inszerció- tesztekben és immunoassay meghatározások céljaira. 1. Hidrolitikus enzimek aktivitását mértük olyan módon, hogy a megfelel szubsztrátokat megjelöltük biotinnal és valamilyen fluoreszkáló festékkel, majd kezeltük a vizsgált enzimekkel és a visszamaradó, mikrogyöngyökön immobilizált intakt szubsztrát molekulák mennyiségét áramlási citometriával mértük. A módszer kiválóan alkalmas proteáz- endoés exonukleáz aktivitás kimutatására, titrálására. 2. Fluoreszcens és biotinilált primerrel sokszoroztuk fel ugyanazt a génszakaszt, genomiális illetve plazmid templátok esetén. A kétféle templátról származó PCR termék összehibridizálása után e minták hibrid DNS molekuláit kémiailag (K-permanganát, hidroxilamin, piperidin) vagy S1 nukleázzal hasítottuk. Az avidinált sejteken kiköt d , el nem hasított PCR termékekb l származó jelekb l következtettünk a plazmid és a genomi DNA templátról származó DNS szekvenciák közötti méret vagy szekvencia eltérésekre. 3. Kidolgoztunk egy, biológiai gyöngyökön elvégezhet AFP és ßhCG meghatározási eljárást, módszerünk az immunoassay metodikákban történ alkalmazás lehet ségeit demonstrálja. Összefoglalva eddigi tapasztalatainkat: áramlási citometriás, biológiai mikrogyöngyökön alapuló mérési rendszerünk alkalmas számos különböz molekuláris biológiai és biokémiai eljárás gyors és pontos, költségkímél módon történ kivitelezésére, – és mintegy univerzális laboratóriumi platformként alkalmazható.








































Kulcsszavak: Áramlási Citometria, Biológiai Mikrogyöngyök, Avidin-Biotin, Szeparáció, Szilárd Fázis

E51

A Schizosaccharomyces japonicus, egy új modellszervezet a genetikai kutatások számára Enczi Klára, Bozsik Anikó, Sipiczki Mátyás Debreceni Egyetem, Molekuláris Biológia és Genetika Tanszék, Debrecen A S. japonicus var. japonicus egysejt , haploid hasadó éleszt gomba. Életciklusára a dimorfizmus jellemz : fiatal telepei hosszúkás, hengeres sejtekb l állnak, majd 8-10 nap után szilárd táptalajon a valódi gombákra jellemz , többsejt hifafonalakat fejlesztenek. Ez az átalakulás érdekl désre számot tartó jelenség, hiszen a patogén gombák jelent s része is mutat dimorfizmust, ahol gyakran a fonalas alak invazív, azaz a roncsoló hatású forma. Ezért kutatásunk célja a két megjelenési alak genetikai hátterének tanulmányozása, a közöttük lev különbségek, hasonlóságok felderítése volt. Mivel a S. japonicus egy új modellszervezet, le kellett fektetni a vele való munka alapjait, jól követhet markereket kidolgozni, mutánsokat létrehozni. Genetikai markerekként az auxotróf (anyagcserehibás) mutánsokat alkalmaztuk. A már meglév auxotróf törzsekb l, 






























73




további mutagenezissel számos micélium képzésben sérült mutánst izoláltunk (myc). Három eltér mutáns típust különböztettünk meg: a hiperaktív hifaképz k csoportját (myc++), a vadhoz képest gyengébben hifázókat(myc-) illetve a gombafonalat nem képz mutánsokat (myc--). Az egyes mutánsokat komplementációs csoportokba rendeztük, ahol a csoportok géneknek felelnek meg; egy csoportba az azonos génben sérült mutánsok tartoznak. Ily módon a myc-- mutánsok között számos gént azonosítottunk be, melyeknek feltehet en szerepe van a dimorf átalakulás lejátszódásában. Citológiai vizsgálatnak alávetve a myc-- törzseket jellegzetes, a vad típustól eltér vakuoláris mintázatot figyeltünk meg, amely szignifikánsan köt dött a myc fenotípushoz. A S. japonicus molekuláris vizsgálatához még nem állnak rendelkezésre megfelel vektorok ezért elkezdtük egy ebben a fajban m köd vektor létrehozását illetve a vektor egyik fontos részének az ARS szekvenciának az izolálását. Mivel a S. japonicus nem képes felhasználni a S. pombe autonóm replikációs szekvenciáját (ARS) így el bb genomiális génkönyvtárat készítettünk és azzal kerestünk fajazonos ARS-t. E transzformációs rendszer birtokában megleltük a már klónozott S. pombe gének egyrészének homológjait. Számos mutáns transzformálására is lehet ség nyílik e vektor segítségével.































Kulcsszavak: Schizosaccharomyces japonicus, hasadó éleszt gomba, dimorfizmus, micélium képzésben sérült mutánsok, ARS


E52

Klónozás alkalmazása a tejel szarvasmarha tenyésztésben – számítógépes szimuláció Sz ke Szilvia1, Komlósi István2 Debreceni Egyetem, Agrártudományi Centrum, Gazdaságelemzési és Statisztika Tanszék, Debrecen 2Állattenyésztési és Takarmányozástani Tanszék 

1

Az állattenyészt k régi álma teljesülhetne a klónozás általános alkalmazásával, mert a legkiválóbb teljesítményt nyújtó állatok tetsz leges számban el állíthatók lennének. Van azonban árnyoldala is az új technológia alkalmazásának, hiszen az azonos genetikai felépítés egyedek tömeges el állításával jelent sen csökkenne a genetikai variancia, és megn ne a beltenyésztettség az állományban. A genetikai variancia csökkenése a szelekciós célok megváltozásánál, esetleg valamilyen új járványos megbetegedés esetén okozna nehézséget. A beltenyésztettség növekedése a genetikai terheltség halmozódásához, a fitness tulajdonságok romlásához vezethetnek. Számítógépes szimuláció segítségével összehasonlítottuk a testi sejtes klónozás, és az embriódarabolási technológia tömeges alkalmazásának lehetséges hatását egy szimulált tejel szarvasmarha állományra nézve egy kontrollpopulációt alapul véve. Az alappopuláció több, mint 200000 egyedb l állt. Vizsgáltuk a genetikai el rehaladás mértéket, és a genetikai variancia változását.




























74

A számítógépes szimulációkat Scilab nyelven írtuk, és a Nemzeti Információs Infrastruktúra Fejlesztési Program szuperszámítógépén futottak, az eredmények kiértékeléséhez pedig az SPSS statisztikai programot használtuk fel. Kulcsszavak: állattenyésztés, genetikai variancia, beltenyésztettség, klónozás, számítógépes szimuláció

E53 

szi búza (Triticum aestivum L.) genetikai hátterének változása, az EU igényeinek megfelel genotípusok el állításáig Pepó Pál Debreceni Egyetem Agrártudományi Centrum Mez gazdaságtudományi Kar, Debrecen

Az elmúlt évtizedekben jelent s változások történtek a búza genetikai hátterét illet en. A korábbi mennyiségi szemlélet helyett egyre inkább er södtek a min ségi elvárások. Európa országaiban – így hazánkban is – a végtermék jó min ségét és ezzel egyid ben a környezetvédelmet célzó kutatások az ökogazdálkodásra alkalmas új fajták el állítását irányozzák el , amely magába foglalja mind a hagyományos technológia elemek racionalizálását; mind a m trágyák, növényvéd szerek alkalmazásának okszer csökkentését. A búzagenetikai kutatásoknak ki kell elégítenie az EU konform búzatermesztés min ségi dimenzióit, amely a termékmin séget, technológiai min séget és a környezeti min séget foglalja magában. A búza genetikai hátterét napjainkban egy paradoxon jellemzi: addig, amíg az államilag min sített fajták száma meghaladja a százat, addig a vetésterület 70 %-át 10-12 fajta képezi. Kedvez tlen tendencia továbbá, hogy a külföldi fajták részaránya növekv tendenciát mutat, mintegy 30 %-ot tesz ki. A fajtarotáció felgyorsulásának eredményeképpen a fajták termelésben tartásának id tartama napjainkban 5 év alá csökkent. Az integrált növénytermesztés a fenntartható fejl dés elveit követi, aminek következtében szükségessé vált a biológiai alapok korszer sítése és az új fajták el állítása. Az organikus gazdálkodásra alkalmas fajták létrehozása a szelekció minden egyes lépcs jébe beillesztett, meghatározott szempontok szerinti, igen hosszú id szakra visszatekint , szigorú szelekcióval lehetséges csupán. Genetikai programunkban a korábban termesztésben lév ill. fajtajelöltként szerepl , az adott id szakban a legmagasabb nemesítettségi szintet képvisel hazai és külföldi fajták számítógépes clusterezését a kiváló min ségi paraméterek tekintetében, valamint a környezetkímél gazdálkodás szempontjai szerint végeztük el. A keresztezési programot követ en hagyományos genetikai és új biotechnológiai eljárásokat alkalmaztunk az ökológiai gazdálkodásra alkalmas genotípusok létrehozására. A genetikai programunkban olyan szi búzafajtákat hoztunk létre, amelyek termesztésével a környezeti terhelés mértéke csökken, kevesebb m trágya és növényvéd szer szükséges megfelel termésszint eltéréséhez, továbbá a környezetkímél agrotechnikákba beilleszthet k. A termesztés során a fajták hatékonysági mutatói (m trágya hasznosítás, tápanyagfeltáró képesség) meghaladják a hagyományos fajtákét, kedvez tlen természeti és termesztési feltételek mellett is átlagon felüli teljesítményre képesek, továbbá extenzív viszonyok között is biztonságosan és gazdaságosan termeszthet k. Mindemellett a korai csoportba sorolható HP Árkus stabilan ma


















































































































75




gas sikértartalommal rendelkezik, a középérés HP Pusztaszél és a középkései HP Hajdúság stabil A1-A2 min ségével javító szintet ér el. Az említett fajták alacsony költségigény ek, ökogazdálkodásra alkalmasak, jövedelmez en termeszthet k és alkalmasak az EU követelmények kielégítésére. 












Kulcsszavak: szi búza, genetikai el rehaladás, környezetbarát technológia, EU min ségi követelmények








E54

Arabidopsis és a környezeti stressz: az ozmotikus sresszválasz genetikai jellemzése inszerciós mutánsok alkalmazásával Szabados László1, Ábrahám Edit2, Zsigmond Laura1, Székely Gyöngyi1, Borsos Éva1, Rigó Gábor1, Alvarado Martha1, Koncz Csaba2 1 MTA Szegedi Biológiai Központ, Szeged 2 Max-Planck-Institut für Züchtungsforschung, Köln, Németország A szárazság, hideg és a talaj magas sótartalma els sorban a magas ozmotikus nyomás révén károsítja az ilyen típusú stresszhez nem alkalmazkodott virágos növényeket. Az ozmotikus stresszel szembeni választ egy komplex jelátviteli rendszer szabályozza, amely számos gén aktivitását megváltoztatja. A génexpressziós változások eredménye az ozmoprotektív molekulák, detoxifikáló enzimek bioszintézise, specifikus ioncsatornák aktiválása, amik bizonyos mérték alkalmazkodáshoz vezet. Csoportunkban a ma legjobban ismert modellnövény, az Arabidopsis thaliana (lúdf ) több olyan génjét illetve inszerciós mutánsát izoláltuk és jellemeztük, amelyek az ozmotikus stresszválasz szabályozásában vesznek részt. A prolin bioszintézist és degradációt ellen rz P5CS illetve PDH gének inszerciós mutánsai a prolinszint drasztikus módosításával a só stresszel szembeni érzékenység megváltoztatását eredményezték. A p5cs1 mutánsok stressz érzékenységéhez a reaktív oxigén molekulák felhalmozódása, fokozott oxidatív stressz járult hozzá. A p5cs2 mutáció letalitást eredményezett ami a p5cs2 gén esszenciális voltára utal. A prolin bioszintézist szabályozó gének m ködését hormonok (pl. ABA), különböz transzkripciós faktorok, jelátvitelben résztvev fehérjék ellen rzik. A PPR doménekkel rendelkez , mitokondriális SAS1 (Salt, ABA, Sugar sensitive) fehérje az ABA érzékenység szabályozásán keresztül befolyásolja a prolin bioszintézist illetve a növény stresszel szembeni ellenállóképességét. A sas1 inszerciós mutáns só, ABA és cukor hiperszenzitivitást, míg a SAS1 túltermel növény fokozott ellenállóképességet mutatott. A SAS1 overexpresszió abi2 mutáns háttérben alapvet en megváltoztatta az abi2 mutáns ABA érzékenységét, ami a SAS1 és ABI2 gén kölcsönhatására utal.





























Kulcsszavak: arabidopsis, stressz, mutáns, prolin, ABA

76




E55

Az SNF1 kináz komplex GAL83-as alegységének gátlása korai szeneszcenciát okoz burgonyában Toldi Ottó1, Lovas Ágnes1, Stiller Ibolya1, Dancs Gábor1, Dulai Sándor2, Victoria Nikiforova3, Joachim Kopka3, Hölger Hesse3, Rainer Höfgen3, Bánfalvi Zsófia1 1 Mez gazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, 2 Eszterházy Károly F iskola, 3 Max-Planck-Institut of Molecular Plant Physiology, Németország



Az SNF1 protein-kináz az eukariótákban általánosan el forduló enzim komplex, amely a metabolizmust szabályozza a sejtek energiaellátottságának, illetve energiaigényének függvényében. Szabályozó szerepe kett s: egyrészt foszforilálással aktiválni, illetve gátolni képes a szénhidrát anyagcsere és nitrogén asszimiláció néhány kulcsenzimét, másrészt transzkripciós szint változásokat is el idéz. Az SNF1 komplex GAL83-as alegysége felel s a szubsztrát specifitásért és szükséges a kináz funkció ellátásához is éleszt ben. El z munkáinkban igazoltuk, hogy a StubGAL83 alegység (burgonya GAL83 analóg) antiszensz gátlása befolyásolja a gyökér és gumófejl dést burgonyában, és növeli a növény sóérzékenységét. A StubGAL83 alegység funkciójának pontosabb megértése érdekében metabolit profilokat készítettünk antiszensz StubGAL83-as és vad típusú burgonyavonalakból GC-MS analízissel. Ismételt méréseink során az antiszensz StubGAL83-as növényekben minden alkalommal szignifikánsan nagyobb volt az egyszer fenolok (kávésav származékok), a mezo-inozit és a glutamin/glutamát koncentráció, mint a vad típusú kontrollban. Ezen túlmen en, az antiszensz növények lényegesen többet tartalmaztak a Krebs és a glioxalát ciklus közös intermedierjeib l is. Az egyszer fenolokat a mezo-inozittal együtt gyakran hozzák kapcsolatba a sejtszint antioxidáns védekez rendszerrel, mint annak nem enzimatikus komponenseivel. Ezért nem ért bennünket meglepetésként, hogy az antioxidáns védekez rendszer egyéb elemei is fokozott aktivitást mutattak az antiszensz StubGAL83-as növényekben. Például a fenilalanin-ammónia-liáz mRNS mennyisége és az enzim aktivitása is szignifikánsan magasabb volt az antiszensz vonalakban. De magasabb volt az aktivitása az aszkorbát-peroxidáz, peroxidáz és kataláz antioxidáns enzimeknek is. Az oxidatív stressz közvetítésében fontos szerepet játszó H2 O2 mennyiségi meghatározása és in situ lokalizációja is csak meger síteni tudta a fenti adatokat. Az antiszensz StubGAL83-as növényekben tehát oxidatív stressz alakul ki, melyet a biológiai membránok és vitális makromolekulák (fehérjék, klorofill, membránlipidek) fokozott degradációja kísér. Ez egyúttal fokozatosan csökken hatékonyságú fotoszintézist is eredményez. Tényként állapítható meg tehát, hogy az SNF1 protein-kináz StubGAL83-as alegységének gátlása a növények korai szeneszcenciáját okozza. Ez pedig arra utal, hogy a komplex része lehet a szeneszcencia szabályozó mechanizmusának.

















































Kulcsszavak: SNF1 protein kináz, szeneszcencia, oxidatív stressz, reaktív oxigén gyök, Solanum tuberosum

77

E56

A hidegadaptálódás molekuláris szabályozása gabonafélékben Vágújfalvi Attila1, Luigi Cattivelli2, Jorge Dubcovsky3, Galiba Gábor1 MTA Mez gazdasági Kutatóintézete, Martonvásár, 2Experimental Institute for Cereal Research, Fiorenzuola d'Arda, Italy, 3University of California, Davis, CA, USA

1



A gabonafélék terméshozamát befolyásoló abiotikus stresszek közül az alacsonyh mérsékleti stressznek van talán a legfontosabb szerepe. Ezért nélkülözhetetlen, hogy a stresszadaptáció mechanizmusát, annak genetikai kontrollját minél részletesebben megismerjük. Arabidopsis-ban egyértelm összefüggést mutattak ki egy hideg-indukálható gén (COR15a) expressziója és a fagyállóság között. Igazolták azt is, hogy a COR gének szabályozásában a CBF transzkripciós faktoroknak kiemelked szerepük van: a CBF1 gén túlvezérlésével a COR gének indukcióját és a fagyállóság növekedését igazolták. A közelmúltban végzett kutatásaink során sikerült két régiót (Rcg1 és Rcg2) azonosítanunk a búza 5A kromoszómájának hosszú karján, amelyek a Cor14b hideg-indukálható gén szabályozásában vesznek részt. Alakorban (T. monococcum) az Rcg1 régiónak megfelel helyre térképeztünk egy olyan gént (QTL-t), amely a Cor14b gén expresszióját regulálja. Ugyan abba a térképpozícióba térképeztünk egy új fagyállósági gént, az Fr-A2-t és egy transzkripciós faktort kódoló gént, a Cbf3-at. Ismertetend munkánk kezdetén azt vizsgáltuk, hogy van-e különbség fagyálló és fagyérzékeny búzafajták között a Cbf gének expressziójában. A Northern analízishez a Cbf gének konzervatív régióját (AP2 domain és Cbf signiture) tartalmazó DNS-t használtunk hibridizációs próbaként, hogy az expresszióról egy általános képet kapjunk. Megállapítottuk, hogy 2 órás hideg-stressz után a fagyálló búzafajtákban nagyobb mérték az expresszió. Mivel különbség volt a fagyálló Cheyenne és a fagyérzékeny Chinese Spring fajták között, ezért lehet vé vált, hogy az e két fajtából el állított szubsztitúciós vonalakat is vizsgáljuk. E kísérlet során az 5A kromoszóma kiemelked szerepe igazolódott. Egyetlen kromoszómára rekombináns vonalak analízisével pedig azt is sikerült tisztáznunk, hogy az 5A kromoszóma Rcg1 régiója játszik szerepet a Cbf gének regulációjában. Azt, hogy e kromoszómarégió melyik Cbf gén megnyilvánulását befolyásolja qRT-PCR-rel tisztáztuk. Az alakor 5-ös kromoszómáján térképezett Cbf génekre specifikus primereket terveztünk, és kimutattuk, hogy a vizsgált Cbf gének közül két gén regulációja köthet az Rcg1 régióhoz.



























A kutatási munkánkat a következ pályázatok segítették: OTKA T046573, NKFP Búzakalász konzorcium, CNR-MTA (2004-2006)


Kulcsszavak: búza, fagyállóság, géntérképezés, génexpresszió, génszabályozás

78

E57

Laktoferrin, mint stresszjelzés a neutrofil granulociták felszínén Keresztes Margit1, Rudisch Tibor2, Lajtos Zsuzsa1, Ocsovszki Imre1, Tajti János3, Pet Zoltán2, Dux László1 Szegedi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar: 1Biokémia Intézet, 2 Pszichiátriai Klinika, Neuropszichiátriai Rehabilitációs Osztály, 3Neurológiai Klinika, Szeged 

A neutrofil granulociták aktíválódása-adhéziója során számos receptor és más fehérje kerül az intracelluláris kompartmentumokból a sejtmembránhoz (pl. az M 2 integrin adhéziós receptor a specifikus granulumból; az N-formil-Met-Leu-Phe kemotaktikus receptor a szekretórikus granulumból). Korábbi vizsgálatainkban kimutattuk, hogy a sertés neutrofil granulociták polisztirénhez való (35 perces) adhéziója során egy 80 kDa glükoprotein dúsul fel jelent s mértékben a sejtmembrán frakcióban; e fehérjét laktoferrinként azonosítottuk. A laktoferrin a neutrofil aktíválódás egyik kés i markere, mely a nyugvó sejtekben a specifikus granulumokban raktározódik. E glükoprotein egyre inkább ismert mint immunmodulátor és mint véd (antibakteriális, antifungális, antivirális és antitumor hatású) fehérje. Stresszállapotban el térbe kerül a neutrofil granulociták/mikrofágok védelmi szerepe, mert a tímusszal kapcsolatos immunm ködés gátlás alá kerül. Mivel egyes irodalmi adatok arra utalnak, hogy pszichés stressz is granulocita aktíválódást idézhet el , kutatásainkban a „granulocita tipusú stresszjelzés” vizsgálatát t ztük ki célul. Humán stresszkutatásainkban önkéntes, vizsgázó f iskolás hallgatók és szorongó, tenziós fejfájásban szenved betegek vettek részt. A laktoferrinen kívül két adhéziós receptor: Lszelektin, M 2 integrin és egy receptor ligand: CD15s (szializált Lewis X, szelektin ligand) sejtfelszíni jelenlétét határoztuk meg (indirekt immunflureszcencia alkalmazásával, áramlási citometria segítségével). A méréseket alacsony stressz szint id szakban (vizsgaid szak el tt), stresszállapotban (hallgatókon vizsgaid szakban és a krónikus szorongó betegeken) valamint stresszcsökkent relaxációs hipnózis sorozatot követ en (vizsgaid szakban három /heti egy/ ülés, a harmadik ülés után) végeztük el (vénás vérb l). Rutin vérvizsgálatok mellett pszichológiai-pszichofiziológiai mérések (pszichológiai tesztek, felszíni EMG) is történtek. A vizsgaid szak megkezdésével a hallgatókban mindegyik vizsgált aktíválódási marker sejtfelszíni megjelenése szignifikánsan fokozódott, de különösen a laktoferrin elleni ellenanyaggal jelölt sejtek aránya n tt meg látványosan (5-szörösére). A pszichoterápia után mind az egészséges hallgatókban, mind a betegekben szignifikánsan és jelent sen csökkent a laktoferrint hordozó sejtek magas aránya. A többi marker esetében kisebb illetve nem szignifikáns változások voltak észlelhet k. Eredményeink meger sítik azokat a korábbi megfigyeléseket, melyek szerint pszichés stressz granulocita aktíválódást idézhet el . Emellett adataink azt jelzik, hogy a laktoferrin megjelenése a neutrofil granulociták felszínén nemcsak e sejtek aktíváltsági állapotát tükrözi, hanem a szervezet stressz szintjére is utalhat. 












































































Kulcsszavak: neutrofil granulocita, aktíválódási marker, laktoferrin, stressz, relaxáció Kutatásainkat a Magyar rkutatási Iroda támogatja (TP 178). 

79

E58

A poli(ADP-ribozil)áció változása oxidatív stressz hatására kondrogenikus primer sejtkultúrákban Matta Csaba1, Juhász Tamás1, Bakondi Edina2, Szíjgyártó Zsolt2, Czifra Gabriella3, Módis László1, Gergely Pál2, Zákány Róza1, Virág László2 1 Debreceni Egyetem OEC Anatómiai, Szövet- és Fejl déstani Intézet, Debrecen 2 Debreceni Egyetem OEC Orvosi Vegytani Intézet, Debrecen 3 Debreceni Egyetem OEC Élettani Intézet, Debrecen

Az oxidatív stressz számos, az ízületi porcot érint betegség patogenezisében játszhat szerepet. Ismeretes, hogy az oxidatív stressz a porcképz dést is jelent s mértékben befolyásolja, de a folyamatok molekuláris mechanizmusa nagyrészt ismeretlen. Kísérleteink során arra a kérdésre kerestük a választ, vajon létezik-e valamiféle kapcsolat a fenti hatások és az oxidatív stressz során bekövetkez DNS-károsodás következtében aktiválódó poli(ADPribóz)-polimeráz (PARP-1) enzim m ködése között. A károsodott DNS-régióhoz köt d PARP-1 a NAD+-ot nikotinamidra és ADP-ribózra hasítja, majd ez utóbbi szubsztrátot polimerizált formában különböz sejtmagi fehérjékhez (hisztonokhoz, transzkripciós faktorokhoz és repair-enzimekhez) kapcsolja. Kísérleteinket csirkeembriók végtagtelepeib l el állított primer kondrogenikus mezenchymális sejttenyészeteken végeztük. Azt vizsgáltuk, hogy a peroxinitrittel (100–600 M) és hidrogén-peroxiddal (0,1–4 mM) kiváltott oxidatív stressz milyen hatással van a PARP1 enzim aktivitására. Kimutattuk, hogy a tenyésztés 2. napján a kétféle ágenssel kiváltott oxidatív stressz jelent s mértékben csökkentette a metakromáziával (dimetilmetilénkék festéssel) kimutatható porcterületek nagyságát; a PARP-1 aktivitása és a sejtmagban kimutatható poli(ADP-ribóz) mennyisége egyaránt fokozódott mind hidrogén-peroxid, mind pedig peroxinitrit hatására. A differenciáltabb (5 napos) HD-kultúrák metakromáziás fest dését az oxidatív stressz számottev en nem befolyásolta. Az oxidatív stressz következtében csökkent proliferációs rátát, a sejtek csökkent életképességét és a sejtekben kimutatható NAD mennyiségét a PARP-1 inhibitora, a 3-aminobenzamid (3-AB) azonban nem vagy csak kismértékben befolyásolta. Ezek az eredmények arra utalhatnak, hogy a 3-AB közvetlenül az extracelluláris mátrix komponenseinek szintézisére lehet hatással. Vizsgálataink alapján tehát az oxidatív stressz fokozza a poli(ADP-ribóz) metabolizmusát, a high density kultúrákban pedig PARP-1-függ módon csökkenti az extracelluláris mátrix (ECM) termelését. Eredményeink alapján olyan új terápiás eljárások kifejlesztése is elképzelhet , melyek célja a kondrogenikus sejtek mátrix-termel képességének a helyreállítása in vivo bekövetkez oxidatív hatásokat követ en.






















































Kulcsszavak: PARP-1, poli(ADP-ribozil)áció, oxidatív stressz, kondrogenezis, primer mezenchimális sejtkultúra

80

E59

Az ADP-riboziláció szerepe a PI3-kináz, Akt és MAPk jelátviteli útvonalak szabályozásában Sümegi Balázs1, Kovács Krisztina1, Tapodi Antal1, Hantó Katalin1,2, Radnai Balázs1, ifj. Gallyas Ferenc1, Hocsák Enik 1, Hideg Kálmán3 1 PTE ÁOK, Biokémiai és Orvosi Kémiai Intézet, I. sz. 2Belgyógyászati Klinika, 3 Szerves és Gyógyszerkémiai Intézet, Pécs 

A poli-(ADP-ribóz)-polimeráz (PARP) egy nukleáris lokalizációjú enzim, melynek aktivitása jelent s szerepet játszik számos, több szervre kiterjed károsodást, szöveti nekrózist, sejtkárosodást, illetve halált okozó pathofiziológiás mechanizmusban. A PARP enzim felismeri az oxidatív DNS károsodás következtében létrejött egyszálú DNS töréseket, köt dik hozzájuk, aktiválódik és NAD+-ot, mint szubsztrátot felhasználva ADP-ribozilál különböz nukleáris fehérjéket. Az aktivált PARP hosszú poli-(ADP-ribóz) láncokat szintetizál, ami felhasználja és kiüríti a sejt NAD+ és ATP tartalékait, ezáltal szöveti károsodást és sejthalált okozhat. Intézetünkben kiterjedt vizsgálatok folynak a PARP-inhibitorok hatásmechanizmusának különböz , általunk vizsgált oxidatív stressz modellekben történ megismerésére. Eredményeink azt mutatják, hogy a PARP gátlószerei segítik a sejtek túlélését, csökkentik a sejtalkotók oxidatív károsodását, anélkül, hogy jelent s scavanger aktivitással rendelkeznének. Eddigi vizsgálataink alapján elmondhatjuk, hogy a PARP az ADP-riboziláció révén számos jelátviteli útvonalat, és génkifejez dési mechanizmust befolyásol. CFY patkányok szívét Langendorff módszer szerint perfundáltuk HO-3089 (kísérleti fázisban lev PARP gátló vegyület) jelenlétében, és 31P NMR spektroszkópia segítségével követtük a szívizom nagyenergiájú foszfátvegyületeinek szintjét ischemia-reperfúzió (IR) során. Megvizsgáltuk továbbá, hogy a PARP enzimaktivitással nem rendelkez DNS-köt domainjének túltermeltetése illetve az enzim génkifejez désének RNS interferenciával történ gátlása, hogyan befolyásolja a WRL-68 (humán hepatocyta) sejtek túlélését H2O2 indukálta oxidatív stressz körülményei között. A PARP gátlóval történt kezelés el segítette a szívizom kreatin-foszfát és ATP raktárainak felépülését és csökkentette az elhalt szívizom területek nagyságát. A vegyületek mérsékelték az ischemia-reperfúzió indukálta lipid peroxidációt, fehérje oxidációt és a totál peroxid koncentrációt. A PARP-gátlóval történt kezelés fokozta az IR-indukálta Akt aktivációját, valamint az Akt egy downstream targetjének, a GSK-3ß-nak foszforilációját. A PI3 kináz/Akt jelátviteli útvonal gátlása wortmaninnal vagy LY294002-vel mérsékelte a PARP-gátlók által kiváltott Akt aktivációját IR során és jelent sen csökkentette a GSK-3ß foszforilációját, valamint az ATP és kreatin-foszfát felépülését. A PARP aktivitás RNS interferencia alkalmazásával, vagy az enzim overexpresszált DNS-köt domain-jével történt lecsökkentése jelent sen növelte a humán hepatociták túlélését a kontroll sejtekhez képest. A PARP gátlása az Akt/protein kináz B jelátviteli útvonal aktivációjához és GSK-3ß inaktivációjához vezetett. Eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy a citoprotektív PI3/Akt kináz rendszer aktiválása jelent sen hozzájárulhat a PARP-gátlók oxidatív stressz során kifejtett protektív hatásához.


















































Kulcsszavak: PARP, ischemia-reperfúzió, PI3K/Akt, siRNA, szignáltranszdukció 81




E60

A sejtosztódás fejl désgenetikai és sejtbiológiai boncolása Drosophilában Máthé Endre, Fenyvesvölgyi Csaba, Kalapos Balázs, Kovács Tibor, Németh Tamás, Zsvér-Vadas Zsanett Genetika és Molekuláris Biológia Csoport, Nyíregyháza A többsejt eukarióták sejtjeinek sajátságos osztódásai szavatolják életük folytonosságát és sejt-sorsbeli döntéseik kiteljesedését. Kutatócsoportunk a sejtosztódások szerkezeti és regulációs sajátosságait tanulmányozza, hogy megérthessük azt a molekuláris plaszticitást, amely lehet vé teszi a kromoszómák és citoplazmatikus alkotók megosztását az utódsejtek között, miközben osszcillátor típusú sejtciklus mechanizmusok összehangolják ezeket térben és id ben. Kísérleti modellünk a Drosophila, amelynek egyedfejl dési sajátosságait kihasználva egyszerre vizsgáljuk a centroszóma-organizált és centroszóma-nélküli osztódási orsók szervez dését és m ködését. Az el adás során beszámolunk a Vihar génnel kapcsolatos újabb eredményeinkr l, azaz a Vihar fehérje és ubiquitin-dependens proteolízis meglep szerepér l a sejtosztódás kezdeti szakaszában. 



























Kulcsszavak: mitózis, meiózis, citokinezis, sejtciklus, ubiquitin-dependens proteolízis

E61

A ciklin C fehérje hiánya az egér embrió korai pusztulását okozza Katona Róbert1, Székely Sz cs Kinga1, Sarah Roby2, Hadlaczky Gyula1, Jill M. Lahti2 1 MTA, SZBK, Genetikai Intézet, Szeged 2 St. Jude Children’s Research Hospital, Memphis, TN, USA

A ciklin C a ciklinek között a leger sebben konzervált fehérje. Felfedezése idején úgy hitték, hogy a sejtciklus G1 szakaszában játszik szerepet, de ez a kezdeti feltételezés nem igazolódott be. A kés bb felhalmozódott adatok egyre inkább arra engedtek következtetni, hogy bizonyos gének transzkripciójának szabályozásában játszik szerepet. További kísérletek igazolták, hogy a hematopoietikus sejtek szaporodását és a közöttük fellép homotipikus sejtadhéziót fokozza. Végül az utóbbi id ben sikerült kimutatni, hogy a sejtciklus egy másik szakaszában, a G0/G1 átmenet idején, alapvet fontosságú funkciót tölt be. Egér embrionális ssejtekben (ES), a homológ rekombináció jelenségét kihasználva, eltávolítottuk a ciklin C gén egyik alléljának jelent s részét. A kapott ES sejtekb l kiméra állatokat hoztunk létre, amelyek ivarsejtjeikben is hordozták a mutációt, és azt az utódjaikba örökítették. A heterozigóta egyedek keresztezése nem eredményezett életképes, az általunk el állított mutációra homozigóta egereket. Heterozigóta állatok keresztezéséb l embriókat gy jtöttünk az embrionális fejl dés különböz stádiumaiból, amely alapján megállapítot





































82

tuk, hogy a ciklin C homozigóta mutáns embriók er sen visszamaradnak fejl désükben és embrionális életük 9. és 10. napja között elpusztulnak. A ciklin C génkiütött embriókban nem sikerült kimutatni a gén mRNS-ét in situ hibridizációs kísérletekben. Real-time PCR kísérletek alapján bemutattuk, hogy a gén 3’, megmaradt részéb l mRNS szinten gyenge génkifejez dés történik. A ciklin C ellenanyaggal végzett immunhisztokémiai kísérletek azonban igazolták, hogy a génkiütött embriókban nincs jelen a ciklin C fehérje. A génkiütött embriókban a sejtszaporodás nem szenved károsodást, azonban több apoptótikus régió azonosítható. Hisztológiai festés alapján megállapítottuk, hogy a génkiütött embriók méhlepényének struktúrája súlyos hiányosságokat mutat. Az anyaméh és az embrió között nem alakul ki a táplálékellátáshoz elengedhetetlen kapilláris hálózat. A génkiütött embrió szikzacskójában nem találtunk kapilláris hálózatot. Mindez arra enged következtetni, hogy a ciklin C fehérje hiánya súlyos fejl dési rendellenességekhez vezet az extraembrionális szövetek és a táplálékot szállító kapillárisok kialakulásában, amely végül az embriók elhalásához vezet.














Kulcsszavak: Ciklin C, génkiütött, egér, transzkripció, sejtciklus

E62

D típusú ciklinek kifejez dése keratinocitákban Bels Nóra SZTE ÁOK, B rgyógyászati és Allergológiai Klinika, Szeged 



A sejtciklust szabályozó ciklinek között egyedül a D típusúak azok, melyeknek különböz izotípusai ismertek. Korábbi vizsgálatok igazolták, hogy a keratinocita sejtnyugalmi állapotából a sejtciklusba való indukcióját er s 5 integrin kifejez dés el zi meg. Ez alapján feltételezhet , hogy az 5 integrin részt vesz a keratinocita proliferáció szabályozásában. Vizsgálataival a szerz arra kereste a választ, vajon a D típusú ciklinek a keratinocita különböz sejtciklusaiban (G0-G1/S illetve G1/S tranzit) különböz képpen fejez dnek e ki, illetve arra, hogy az 5 integrin szabályozza-e a D típusú ciklinek kifejez dését. HaCaT keratinocitákat szérum-elvonással és kontakt gátlással sejtnyugalmi G0 fázisba kényszerített, majd a kontakt gátlás feloldásával és a szérum visszaadásával sejtciklus indukciót végzett, miközben követte a D típusú ciklinek kifejez dését Real Time RT-PCR technikát alkalmazva. Az 5 integrin szabályozó szerepét neutralizáló hatású 5 integrin ellenes monoklonális antitest alkalmazásával vizsgálta. Eredményei szerint a HaCaT keratinociták a D típusú ciklinek mindhárom fajtáját (D1, D2, D3) kifejezik. A D1 ciklin megjelenése jellemz a sejtek G0-G1/S fázisára, míg a sejtnyugalmi fázisból kikerült sejtek ismételt gyors osztódásakor (G1/S tranzit) inkább a D2 és D3 ciklinek megjelenése dominál. A sejtnyugalmi fázis elhagyását megel z en az 5 integrin gátlása a D1 ciklin megjelenését visszaszorítja a sejtekben, arra utalva, hogy a sejtproliferáció szabályozásában az 5 integrin ezen a ponton részt vesz.























































Kulcsszavak: keratinocita, D típusú ciklinek, sejtciklus szabályozás, alfa5 integrin, HaCaT sejt

83

E63

Az éleszt és humán II. típusú AP endonukleázok új funkciója a DNS reparációban Burkovics Péter, Unk Ildikó, Haracska Lajos MTA SZBK, Genetika Intézet, Szeged Minden sejtet folyamatosan érnek küls és bels hatások, amelyek károsítják a sejt DNS-ét. A sejtben felszaporodó DNS hibák gátolják a sejt normális m ködését, ami végül apoptózishoz vagy tumorképz déshez vezethet. Ezért a sejt normális m ködésének fenntartásához szükséges a DNS folyamatos karbantartása, reparálása. Számos út alakult ki a DNS hibáinak javítására. Ezek egyike a bázis excíziós reparáció. A sejt ezen az úton javítja többek között a sejt normális m ködése közben keletkez reaktív oxigén gyökök által okozott DNS károsodásokat (oxidált bázisok, egyesszálú lánctörések) és a h hatására történ spontán bázisvesztés által generált abázikus (AP) helyeket (kb. 10000 abázikus hely keletkezik spontán minden nap egy sejt genomjában). A bázis excíziós reparáció öt egymás utáni lépésb l áll. 1: a károsodott bázis felismerése, majd eltávolítása 2: az így keletkezett abázikus (AP) helyeknél történ bemetszés 3: a bemetszéssel keletkez láncvégek átalakítása (az 5’ dezoxi-ribóz-foszfát eltávolítása és a 3’ blokkoló végek eltávolítása) 4: a keletkezett hézag feltöltése 5: a ligálás. A II. típusú AP endonukleázok az abázikus hely melletti bemetszésben és a keletkez végek módosításában vesznek részt a rájuk jellemz AP endonukleáz és 3’ foszfodiészteráz aktivitásukkal. A Saccharomyces cerevisiae-ben két II. típusú AP endonukleáz ismert: az Apn1 és Apn2. Az Apn1 fehérje nagyon er s endonukleáz aktivitással rendelkezik, ugyanakkor az Apn2 endonukleáz aktivitása gyenge, viszont rendelkezik egy nagyon er s 3’-5’ exonukleáz aktivitással, amelynek az in vivo betöltött szerepér l eddig nincs információ. Munkánk során az éleszt Apn2 és humán homológja az Ape2 bázis excíziós reparációban betöltött szerepét vizsgáltuk meg. Az apn2 éleszt sejtek növekedésében és túlélésében nem találtunk különbséget a vadtípushoz viszonyítva. Az apn2 sejtek MMS (alkiláló szer, amely hatására a kezelt sejt abázikus helyeket generál a DNS-en) kezelésre csak gyengén érzékenyek. Ugyanakkor az apn1 közepes MMS érzékenysége az apn1 apn2 kett s mutáns törzsben az extrém módon megemelkedik. A kett s mutáns törzsben a mutációs ráta is drámaian megugrik az apn1 törzshöz képest. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az Apn1 a f AP endonukleáz az éleszt ben és az Apn2 csak, mint egy tartalékút vesz részt az abázikus helyek javításában. Az Apn1 kiesése esetén az Apn2 feltételezhet en képes részlegesen átvenni annak funkcióját. Ugyanakkor az Apn2 er s 3’-5’ exonukleáz aktivitás miatt feltételezhet , hogy más DNS reparációs útban is szerepet játszik. Célunk az volt, hogy megtaláljuki az Apn2 humán homológjának, az Ape2-nek a funkcióját biokémiai vizsgálatokkal. Megállapítottuk, hogy az Ape2 er s 3’-5’exonukleáz aktivitással rendelkezik. Jellemeztük ezt az aktivitást, majd kimutattuk, hogy ez a 3’-5’ exonukleáz aktivitás a hibás bázispárokat sokkal nagyobb affinitással hasítja, mint a korrekt bázispárokat. Ez a proofreader szer aktivitás felveti annak a lehet ségét, hogy az Ape2 esetleg DNS polimerázokkal dolgozik együtt. Ezt a lehet séget er síti, hogy számos DNS polimeráznak (pl. transzléziós polimerázok, DNS




































































































84

polimeráz-beta) nincs 3’-5’ exonukleáz aktivitása. Ezek a DNS polimerázok a PCNA fehérjével együtt képesek a hatékony m ködésre. A PCNA esszenciális résztvev je a DNS replikációnak, növeli a DNS polimerázok processzivitását. Az Ape2-n található egy funkcionálisan m köd PCNA köt motívum. El ször kimutattuk a fizikai interakciót az Ape2 és a PCNA között, majd megállapítottuk, hogy a PCNA jelent sen tudja fokozni a 3’-5’ exonukleáz aktivitását az Ape2-nek. Eredményeink alapján feltételezzük, hogy az Ape2 (mint valószín leg az éleszt Apn2 is) in vivo egy vagy több DNS polimeráz proofreader faktoraként is m ködik. 

























Kulcsszavak: DNS reparáció, DNS károsodás, exonukleáz, PCNA, proofreading

E64

A def1 gén szerepe a poszt-replikációs repair gépezetben Blastyák András, Hajdú Ildikó, Szukacsov Valéria, Daraba Andrea, Unk Ildikó, Haracska Lajos MTA SZBK, Genetikai Intézet, Szeged Ha a DNS replikációját végz enzimkomplex olyan károsodott bázissal találkozik melyet a polimeráz alegység aktív centruma nem képes azonosítani, akkor a DNS szintézis ezen a ponton megáll, és sejt elpusztul. Ennek a katasztrófához joggal hasonlítható eseménynek az elkerülésére az eukarióta sejtek kifejlesztettek egy olyan hibajavító mechanizmust, mely többféle módon is képes a blokkolt replikációs villa menekítésére. Az egyik lehet ség a sejt számára, hogy speciális DNS polimerázok segítségével, akár a DNS információtartalmának a megváltozása árán, átírja a károsodott bázist lehet vé téve a replikáció befejez dését. Létezik ezen kívül egy másik lehet ség a replikáció folytatására, mely hiba nélkül végzi a feladatát, éleszt ben a RAD5 gén játszik ebben a folyamatban kulcsszerepet. Jelenlegi ismereteink a RAD5 gén molekuláris funkciójáról hiányosak és fehérje interaktor partnerei sem ismertek teljes kör en. Az el adás során a kísérletes megközelítés lehet ségeit vázoljuk fel egy új RAD5 interaktor fehérjével kapcsolatos eredményeink alapján.

























Kulcsszavak: DNS reparáció, poszt-replikációs repair

85

E66

Hogyan okoz a Drosophila HorkaD mutációja kromoszómavesztést az utódokban? 1

Szalontai Tamás1, Belecz István1, Boros Imre2 és Szabad János1 Szegedi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Orvosi Biológiai Intézet 2 Szegedi Tudományegyetem, Természettudományi kar, Genetika és Molekuláris Biológia, Szeged

HorkaD a Drosophila melanogaster domináns n stény-steril mutációinak egyike: a HorkaD/+ n stények embrióiban oly’ gyakoriak a kromoszómavesztések, hogy embrióik a életük kezdetén elpusztulnak. A HorkaD/+ n stények petéinek citoplazmája toxikus: vadtípusú embriókba injektálva kromoszómahidak képz dést, és az embriók pusztulását indukálja, jelezve, hogy HorkaD funkciónyeréses típusú. Pontosabban domináns negatív típusú, mert a A HorkaD/+/+ n stények embrióiban kissé jobb a helyzet, mint a HorkaD/+ n stényekében. A HorkaD-nek domináns apai hatása is van: a HorkaD/+ hímek utódai között módfelett gyakoriak a diplo/haplo mozaikok, köztük az XX/X0, n stény/hím mozaikok, a gynanderek. A HorkaD mutáns fenotípus alapján arra következtettünk, hogy az ép Horka génnek a kromoszóma stabilitásban van szerepe. Vajon mi a Horka gén funkciója? P-elemmel végzett mutagenezis során horkarP revertáns, funkcióvesztéses allélokat indukáltunk. A horkarP allélokból kiindulva megállapítottuk (i) a Horka gén helyét, (ii) a funkcióvesztéses fenotípust (a horkarP/− hemizigóta n stények sterilek, petéikben nem kezd dik el az embriógenezis), és (iii) az inverz PCR módszerével megklónoztuk a Horka gént. A szekvencia analízise megmutatta azt, hogy a HorkaD és a horkarP allélok a Drosophila lodestar génjét azonosítják. A lodestar gén a RecQ típusú helikázokra jellemz ún. DEAH motívumot tartalmazó ATP-ázok egyikét kódolja. Megtudtuk, hogy HorkaD egyetlen bázispár csere (G A) nyomán képz dött, és az azt követ Ala777 Tre aminosav-csere a HorkaD–vel kapcsolatos defektusok alapja. A lodestar génr l két mRNS, de csak egyféle fehérje képz dik. A HorkaD–vel kapcsolatos defektusokhoz szükség van a hosszabb mRNS 3’UTR régiójának 500 nukleotidjára. Az el adás arról szól, hogy mi lehet az 500 nukleotid szerepe, és miként okozhatja az Ala777 Tre aminosav-csere a jellegzetes HorkaD fenotípusokat.


















































Kulcsszavak: anyai hatás, domináns negatív mutáció, günander, helikáz, Drosophila

86

E67

Az Echerichia coli genom átalakítása Fehér Tamás, Umenhoffer Kinga, Karcagi Ildikó, Gy rfy Zsuzsa, Cseh Botond, Pósfai György MTA SZBK Biokémiai Intézet, Szeged 

Az Escherichia coli baktériumból egy olyan miniat r „biogépet” kívánunk létrehozni, mely alapvet platformként szolgálhat a sejt funkcionális genomikai vizsgálatához, az evolúciós és adaptációs folyamatok tanulmányozásához, valamint a biotechnológiai alkalmazásokhoz. A baktérium természetes evolúciójának „visszafordításával” egy nagymértékben egyszer sített genomú sejtet készítünk. Precíz deléciókkal eltávolítjuk a nélkülözhet nek ítélt géncsoportokat, és kiiktatjuk a genom változékonyságáért felel s rendszereket. A deléciók mellett inszerciókat is készítünk, hasznos tulajdonságok bevitelével „javítjuk fel” a sejtet. Több mint 50 delécióval eltávolítottuk a genom 17%-át: profágokat, a flagelláris apparátus génjeit, számos metabolikus és ismeretlen funkciójú gént, mobilis genetikai elemeket. Ez utóbbiak kiejtésekor nem várt genomi plaszticitást tapasztaltunk: az IS elemek 44 ismert pozíciója mellett 5 újat találtunk. Az IS elemek szerepének vizsgálatakor azt tapasztaltuk, hogy aktivitásuk drámaian megn het, ha a sejtet stressz éri. Egy idegen, toxikus fehérje termeltetése a transzpozíciós események megsokszorozását váltja ki. Feltételezésünk szerint az IS elemek védekez rendszerként, az idegen DNS „eltalálásával” és inaktiválásával mentesíthetik a sejtet vírusok vagy más genetikai elemek okozta stresszt l. Az IS elemekt l mentes, csökkent mutációs rátájú, robusztus növekedés deléciós törzsünk lehet vé teszi más gazdákban klónozhatatlan szekvenciák fenntartását, stabil DNS-klónok el állítását, és a tapasztalatok szerint el nyös lehet toxikus fehérjék termeltetésében. 



































Kulcsszavak: genomika, minimál genom, mobilis elem, Escherichia coli, biotechnológia

E68

Streptomycesek sejtdifferenciálódásának vizsgálata genomikai és proteomikai módszerekkel Birkó Zsuzsa, Kiss Zsuzsa és Biró Sándor DEOEC Humángenetika, Debrecen A Gram pozitív, fonalas növekedés Streptomycesek fontos ipari mikroorganizmusok. Jelent ségüket a különböz törzsek által a sejtdifferenciálódás egy meghatározott szakaszában termelt, kémiai szerkezetüket és hatásmechanizmusukat tekintve is rendkívül eltér és gazdag, a humán és állatgyógyászatban használatos antibiotikumok, illetve egyéb funkciójú szekunder metabolitok termelése támasztja alá. Életciklusuk tanulmányozása ezért nemcsak tudományos, hanem gyakorlati jelent séggel is bír. Mivel a különböz antibiotikumokat egymástól néha jelent sen eltér törzsek termelik, nem meglep , hogy a genetikailag legjobban ismert, de ipari szempontból jelentéktelen Streptomyces coelicolor után több ipari törzs (S. avermitilis, S. griseus, S. scabies, S. ambofaciens) genomi szekvenálása is 87 

























megtörtént illetve folyamatban van, továbbá elkészült a S. coelicolor minden génjét tartalmazó DNS mikroarray is. Laboratóriumunkban részben in silico analízissel, részben genomi DNS-sel való hibridizálásokkal igazoltuk, hogy a törzsek között nyilvánvalóan meglév különbségek ellenére, a S. coelicolor mikroarray alkalmas más Streptomyces törzsek, így az általunk vizsgált S. griseus génexpressziójának tanulmányozására is. A Streptomycesek differenciálódásában extracelluláris szignál molekulák, így az általunk azonosított C-faktor fehérje fontos szabályzó szereppel rendelkezik. Kísérleteinkben három törzs - a jól spórázó, vad típusú S. griseus B2682, annak egy nem spórázó kopasz mutánsa (S. griseus B2682 BAFN), illetve ezen utóbbi törzs C-faktor gén bejuttatásával helyreállított sporulációjú transzformánsa (S. griseus B2682 BAFN/SGF5) - génexpressziós profiljának vizsgálatával sporuláció specifikus és a C-faktor hatás közvetítésében szereppel bíró géneket próbáltunk azonosítani. Hasonló céllal, ugyanezeknek a törzseknek az extracelluláris proteomjait is összehasonlítottuk. El adásunkban ezen kísérletek eredményeir l számolunk be.








Kulcsszavak: Streptomyces, sejtdifferenciálódás, proteomika, DNS mikroarray, szabályzás

E69

A 16-3 bakteriofág genomja és részletesen tanulmányozott m ködési egységei 

Papp Péter1, Téglás Barbara2, Ganyu Anita1, Semsey Szabolcs1, Blaha Béla1, Ferenczi Szilamér1, Csiszovszki Zsolt1,2, Ponyi Tamás2, Nagy Tibor1, Orosz László1,2 1 Mez gazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, Genetikai Intézet, Gödöll 2 ELTE, TTK Genetika Tanszék, Budapest



A 16-3 bakteriofág a Rhizobium meliloti 41 mérsékelt fágja. Meghatározásra került a genomot felépít bázisok sorrendje, a kapott szekvencia adatok bioinformatikai kiértékelése folyamatban van. A 60 198 bp nagyságú fággenomban 117 fehérjét kódoló gént azonosítottunk. A gének termékeinek mintegy ötöde mutatott olyan jelent s homológiát már ismert génekkel, amelyek alapján szerepükre következtethetünk. A homológiák alapján feltételezéseket tehetünk a fág eredetére, bepillantást nyerünk evolúciójába. A fággenom megismerése alkalmat szolgáltat arra, hogy mint egy számvetést, az utóbbi 6-8 évet felölel , egyes fágfunkciókat érint kutatásainkat áttekintsük és az eredményeket a legújabb ismeretekkel kiegészítve bemutassuk. Az el adásban i) a fág-DNS pakolását érint , ii) a homoimmun fágokkal való fert zéssel szemben a gazdasejt számára immunitást, valamint a lizogén állapot fenntartását biztosító génm ködések, és 3) a fág integrációjáért és a profág kivágódásáért felel s helyspecifikus rekombinációs rendszer, valamint gyakorlati felhasználása kerül említésre.

























Kulcsszavak: bakteriofág, genom analízis, DNS-fehérje kölcsönhatások, helyspecifikus rekombináció, integratív vektorok 88

E70

Génexpresszió vs „folyamat”-expresszió: a génfunkciók vizsgálatának új fejezete Szilassy Dénes, PhD, Applied Biosystems Jelenleg több, mint 200 000 eukarióta gént prediktáltak a genomikai programokban, melyek funkcionális besorolása folyamatosan zajló munka. Jelenleg két átfogó, egymástól függetlenül kifejlesztett megközelítés létezik: a Gene Ontology (GO; Ashburner et al. 2000, Nat. Genet 25: 25-29) illetve a Panther (Thomas et al. 2003, Nucleic Acids Res. 31:334-341). Mindkét módszer a szekvencia homológiákat, valamint a kísérletes bizonyítékokat veszi alapul, de különböz képpen, és eltér lefedettséget eredményezve. „Molekuláris funkció”, illetve „biológiai folyamat” szerint mindkét rendszer osztályozza a géntermékeket, a „Panther” ezen túlmen en biológiai ösvények „pathway”-ek alapján is csoportosítja azokat – 90%-os lefedettséggel. Az gének annotációjának ez a szintje többek között lehet vé teszi a microarray kísérletek eredményeinek gyors biológiai értékelését, új szemléletet vezetve be a génexpressziós vizsgálatokban. Ezt a szemléletváltást példák segítségével igyekszem illusztrálni.











E71

Pillanatképek egy talajbaktériumról: a genomszekvenálástól a funkcionális genomikai vizsgálatokig , Frédérique Ampe2, Claude Bruand2, Delphine Capela2, Jacques Batut2 MTA Szegedi Biológiai Központ, Genetika Intézet Szeged 2 Laboratoire de Biologie Moléculaire des Relations Plantes-Microorganismes CNRSINRA Castanet-Tolosan, France Kiss Ern

1,2



1

A talaj korlátozott nitrogén tartalma nagymértékben befolyásolja mind a természetes ökoszisztémák, mind a mez gazdasági területek produktivitását. A talaj nitrogén veszteségeinek pótlásában kitüntetett szereppel bírnak a Rhizobiaceae családba tartozó talajbaktériumok, amelyek képesek a pillangósvirágú növényekkel (Leguminosae), nitrogénköt endoszimbiózis létrehozására. A folyamatban résztvev Rhizobium gének azonosítása és jellemzése nagy lendületet vett az utobbi id ben a szimbiózis egyik modell organizmusának (Sinorizobium meliloti) genomikai és poszt-genomikai vizsgálata révén. A baktérium genomjának teljes DNS bázis sorrendjét egy európai és amerikai kutatócsoportokat tömörít konzorcium keretében határoztuk meg nemrégiben. A szekvencia annotációja során kiválasztottuk azokat a géneket, amelyeket szerepet játszhatnak a szimbiózis különböz folyamataiban. A kiválasztott géneket el ször makro-array kísérletekben vizsgáltuk, amelyeket a teljes genomot reprezentáló miro-array DNS chip létrehozása követett. Kísérleteinkben a szabadon, valamint a nitrogénköt güm ben él baktériumok expressziós mintázatát hasonlítottuk össze. A szimbió





























89

zis-specifikus kifejez dést mutató géneket szisztematikusan inaktiváltuk, az ily módon el állított mutáns Rhizobiumokat funkcionális tesztekben analizáltuk.





Kulcsszavak : baktérium genetika, szimbiotikus nitrogénkötés, genom analízis, DNS-chip, mutagenezis

E72

Hagyományos kérdések, új eszközök: genetika a genomika korszakában Erdélyi Miklós, Szuperák Milán, Henn László és Vilmos Péter MTA SZBK Genetikai Intézet, Szeged Az utóbbi években a molekuláris biológia területén forradalmi változások tanúi lehettünk. Míg korábban egy-egy laboratóriumban egyidej leg csak néhány gén és géntermék vizsgálata volt lehetséges, mára létrejöttek a gyárszer adattermelésre képes kutatási egységek, melyek teljes genomszekvenciákat, a teljes proteómokra érvényes interakciós térképeket, tömeges transzkriptum-mérési eredményeket, valamint fehérjék ezreinek szerkezeti adatait állítják el sok-sok modellszervezet esetében. Új tudomány született, a genomika, melynek célja az egyes gének vizsgálatával fel nem ismerhet törvényszer ségek leírása. A genomika a „nagy tudományok” egyike lett, melynek költségigénye az rkutatáséval vagy éppen a részecskefizikáéval mérhet össze. A gemomikai vizsgálatok a genomszervez dés, az evolúció, a fehérjét nem kódoló szakaszok vizsgálata terén máris rengeteg új adatot szolgáltattak. Mindezen túl a genomika kialakulása és el retörése mindörökre megváltoztatta a genetikai és a fejl désbiológiai kutatásokat is. A szinte zavarba ejt en nagy számú adat új lehet ségeket ad, de ezzel egyidej leg új szemlélet kutatási módszereket is igényel a hagyományos genetikai, fejl désbiológiai kérdésekre választ keres kutatóktól. El adásunkban áttekintjük a Drosophila genomikai kutatások adta új lehet ségeket, valamint bemutatjuk, hogyan alkalmazzuk azokat saját területünkön az ivarsejt kutatás terén. Bemutatjuk továbbá az ivarsejt-kialakulásban szerepet játszó lokalizált RNS molekulák genom szint vizsgálatára kifejlesztett módszerünket, valamint az eddig elért eredményeinket. 

















































Kulcsszavak: Drosophila, genomika, ivarsejt, embriogenezis, DNS, microarray

90

E73

Genomikai kutatások a b rgyógyászatban 1

Széll Márta1, Bata Zsuzsanna1,2, Dobozy Attila1 és Kemény Lajos 1,2 MTA-SZTE Dermatológiai Kutatócsoport, 2SZTE B rgyógyászati és Allergológiai Klinika, Szeged

Az 1900-as évek eleje óta ismert, hogy egyes monogénesen örökl d b rbetegségek (genodermatózisok) hátterében abnormális szerkezet keratin filamentumok állnak. Az azóta eltelt id ben 350 genodermatózis genetikai hátterét sikerült azonosítani, a mutációk pontos helyét meghatározni és azokkal a b rbetegségek pathomechanizmusát megmagyarázni. Ennek a folyamatnak az utolsó évtizedben nagy lendületet adtak a Humán Genom Projekt által szolgáltatott adatok, a DNS adatbázisok mindenki által való elérhet sége, valamint az újonnan kifejlesztett molekuláris biológiai eljárások. Mindezek az adatok és módszerek nagy segítséget nyújtanak az un. multifaktoriális etiológiájú b rbetegségek pathomechanizmusának vizsgálatához is. Mivel ezeknek a betegségeknek a hátterében egyrészt általában több gén kóros m ködése áll, másrészt a tünetek kialakulásában a környezeti tényez knek is fontos szerepe van, pathomechanizmusuk pontos feltérképezése rendkívül összetett. A közelmúltban kutatócsoportunk olyan vizsgálatokat indított, amelyek célja a b r különböz eredet lézióival járó multifaktoriális b rbetegségek (lábszárfekély, festékhiányos b rbetegség) hátterében álló genetikai eltérések azonosítása. Ezen vizsgálatok során a fibroblaszt növekedési faktor 2 gén (FGFR-2) 3’ UTR-ban azonosítottunk egy SNP-t, amely szignifikánsan magasabb arányban fordul el fekélyes betegekben, mint az egészséges kontroll populációban, feltételezzük, hogy ez az SNP szerepet játszik az elhúzódó sebgyógyulásban. A vitiligo, a festékhiányos b rbetegség, a b r melanocitáinak léziójával járó kórkép. Ebben a betegségben a humán pigmentáció kialakításában fontos szerepet játszó két gén, a melanokortin 1 receptor (MC1R), valamint az Agouti Signaling Protein (ASIP) polimorfizmusainak allélgyakoriságát vizsgáljuk. Mivel a betegek és kontroll egyének színkomplexióra vonatkozó adatait (b rszín, hajszín, szemszín) folyamatosan rögzítjük, nem csupán az ASIP és MC1R gén SNP-k vitiligo pathogenezisében, hanem a magyar populáció színkomplexiójának kialakításában betöltött szerepét is vizsgáljuk. Kutatócsoportunk azonosította és jellemezte els ként keratinocitákon a veleszületett immunitásban fontos szerepet játszó mintázatfelismer receptorokat, a Toll-like receptor 2 és 4 molekulákat (TLR2 és TLR4). Jelenleg azt vizsgáljuk, hogy a TLR2 és TLR4 receptorok 2-2, már jellemzett SNP-jének van-e szerepe az acne vulgaris és az acne inversa, illetve a szénanátha pathomechanizmusában. Ugyanezen program keretében azt is vizsgáljuk, hogy az interleukin 1 antagonista gén (IL-1RA) számos betegséggel kapcsolt VNTR polimorfizmusa szerepet játszik-e az acne vulgaris és az acne inversa pathogenezisében. El zetes adataink arra utalnak, hogy a gén azon variációja, amely 2 kópiában hordozza a polimorfizmust okozó ismétl d szekvenciát, magasabb arányban fordul el az acne súlyos formájában (acne conglobata) szenved betegekben. Differential display módszerrel azonosítottunk egy nem-kódoló RNS gént (PRINS: Psoriasis Susceptibility-related RNA Gene Induced by Stress), amely magasabb szinten fejez dik ki a pikkelysömörös tünetmentes epidermiszben és in vitro vizsgálataink szerint szerepet













































































91

játszik egyrészt a multifaktoriális etiológiájú pikkelysömörre való hajlam, valamint a sejtek stressz válaszának kialakításában. Eredményeinkkel hozzájárulunk a vizsgált multifaktoriális b rbetegségek pathogenezisének megismeréséhez, ezek egyben kiindulási alapjai lehetnek olyan diagnosztikus eszközök kidolgozásának, amelyekkel a nagy rizikófaktorú betegcsoportokat azonosíthatjuk, illetve új terápiás megoldásokra nyújthatnak lehet séget.





Kulcsszavak: genodermatózisok, multifaktoriális etiológiájú b rbetegségek, SNP vizsgálatok, molekuláris biológiai módszerek, új diagnosztikai és terápiás lehet ségek





E74

Génexpressziós profil változások az egér mukózális hízósejtek in vitro differenciációja során Andrásfalvy Márton1, Wiener Zoltán2, Keszei Márton2, Szalai Csaba3, Falus András2,3 Kromat Kft. 2Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, Budapest, 3MTA-SE Immungenomikai Kutatócsoport, Budapest

1

A hízósejtek el ször az allergiás és asztmatikus folyamatokban játszott szerepük miatt váltak ismertté, kés bb azonban kiderült, hogy a természetes immunitás részeként is fontos szerepet töltenek be. Granulumaikban a hisztamin mellett más mediátorokat, kemotaktikus vegyületeket, valamint preformált TNF-α citokint is raktároznak. Ez a citokin a fert zés helyén azonnal felszabadul, ezáltal a kórokozók elleni immunvédekezés egyik els lépését biztosítja. Az egér hízósejteket fenotípus alapján két csoportba lehet sorolni: köt szöveti és mukózális típusú sejtek, amelyek citokin és mikrokörnyezett l függ en képesek egymásba átalakulni. Nemrég leírták, hogy TGF-βI és IL-9 jelenlétében in vitro érett mukózális hízósejtek állíthatók el , melyek a jellegzetes egér hízósejt proteázokat, az mMCP-1-et és mMCP-2-t fejezik ki. Ezek alapján célként a hízósejtfejl déshez elengedhetetlen és e további két citokin jelenlétében differenciálódó mukózális hízósejtek génexpressziós változásainak vizsgálatát t ztük ki, amelyhez az Agilent microarray rendszerét hívtuk segítségül. Balb/c n stény egerek csontvel ib l a c-kit+ progenitor sejtfrakciót mágneses eljárással szeparáltuk, majd a sejteket IL-3, IL-9, SCF és TGF-βI jelenlétében differenciáltattuk. A mintavételi id pontok a differenciáció 4. (éretlen stádium), 9. (köztes stádium) és 20. (érett stádium) napjára estek. Az izolált RNS minták integritását és koncentrációját az Agilent Bioanalyser automata chipelektroforézis-készülékén ellen riztük. A génexpresszió vizsgálatát az Agilent 60-mer oligoneukleotid DNS-chip segítségével végeztük el, majd néhány változást real-time PCR-technikával is meger sítettünk. A 22.000 vizsgált gén közül több mint 1400 mutatott legalább 2,5-szeres expressziós emelkedést, vagy csökkenést p<0.001-es szignifikancia szinten. A citokinek és receptoraik közül jellegzetes expressziós változást lehetett kimutatni az IL-3Rα, IL-4, IL-4Rα, IL-7R, IL-10Rα, IL-15 és a c-kit mRNS szintjében. Az extracelluláris mátrix átalakításában fontos











































92




szerepet játszó mátrix metalloproteináz (Mmp)-13, Mmp-3, Mmp-14 és Mmp-12 termel dése is változott a különböz vizsgált id pontok között. Az mMCP proteázokat a változás alapján két csoportba lehetett sorolni: míg az mMCP-5 és mMCP-7 mRNS szintje a korai differenciációs folyamatok során jelent sen megemelkedett, majd kés bb nagyjából állandó maradt, addig az mMCP-1 és mMCP-2 esetében a jelent s expressziós növekedés csak a kés i fázisban volt kimutatható. Érdekes módon a hisztamin bioszintéziséért felel s hisztidin dekarboxiláz (HDC) enzim szintje a hízósejt érés kés i fázisában lecsökkent. A gének rendszerezésére, statisztikailag szignifikáns eredmények kinyerésére trend- és clusteranalízist, valamint variancia analízist használtunk, amely a Rosetta Luminator program részeként állt rendelkezésünkre. Minthogy az adatok további feldolgozása és csoportosítása folyamatban van.


























E75

A DROSDEL deléció gy jtemény 

Maróy Péter Szegedi TudományEgyetem, Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék, Szeged A teljes genomot átfogó kutatások idejét éljük. Genetikus számára ez az igény nem új. Egy diploid szervezet géndózisának változtatása, egy genetikai rendszer kiépítése során, az egyik els dleges cél. A diploid géndózis egyre vagy nullára csökkentése az érintett gén funkciójának megismerése szempontjából informatív, hiszen ez tárja fel annak funkcióját. A gének egyenkénti dózisváltoztatása génmutációkkal valósul meg. A genomika igényeinek több mint tízezres tagszámú, mutánsgy jtemény felel meg. Az amorf allélok teljes genomra kiterjed összegy jtése, gy jteménybe rendezése és fenntartása még egyetlen szövetes eukarióta él lény esetén sem valósult meg. A több gént érint , kromoszóma mutációk közül a deléciók kit n en alkalmasak géndózisok genetikai manipulálására. Ezek a kromoszóma mutációk, szinte a Drosophila genetika kezdetét l, közel száz éve vannak használatban. Az id k során, különböz laboratóriumokban el állított, majd a törzsközpontok által összegy jtött deléciók a muslica genom körülbelül 70 százalékát fedik le. Más többsejt genetikai modell szervezetek esetén a készlet ennél jóval szerényebb. A muslica esetén 238 delécióból áll a legnagyobb lefedettséget biztosító, minimális készlet. Ennyi deléciós törzzsel nem okoz nehézséget, például egy allél térképezése, míg 10-15 ezer törzzsel ez szinte lehetetlen. A deléciók a génkölcsönhatások bizonyos típusainak tanulmányozására is alkalmasak. Az ilyen vizsgálatok kritikus feltétele azonban az izogén genetikai háttér. A különböz laboratóriumokból összegy jtött deléciók genetikai háttere sokféle, ezért genetikai kölcsönhatások tanulmányozására csak korlátozottan alkalmasak. Az éleszt FRT/FLP rekombinációs rendszere a muslicában, tervezett töréspontokkal határolt deléciók és duplikációk gyors és hatékony el állítását teszik lehet vé. Evvel a genetikai rendszerrel megvalósítható kromoszóma mutációk el állítása, ellen rzötten letális és P elem mentes, izogén genetikai háttéren. Hat, Európa különböz országaiban m köd laboratórium együttm ködésével (DROSDEL projekt) állítottunk el egy, a D.melanogaster genom mintegy 80 %-át lefed , izogén hátter deléciós gy jteményt. A deléciót hordozó kromoszómákat FRT szekvenciát tartalmazó RS3 és RS5 elemeket hordozó kromoszómákból, FLP aktivitás segítségével állítottuk el . Több 93

















































































mint 3000 RS inszerciós törzset állítottunk el . Az RS elemek beékel dési helyeit a muslica nukleotid sorrend térképén, meghatároztuk. Az RS gy jtemény több mint 12 000, 1-t l 1 Mbp méret deléció el állítását teszi lehet vé. A projektben 1 Mbp-nál kisebb, átfed deléciókat állítottunk el , szem el tt tartva a szempontokat, hogy kis számú delécióval fedjük le a genomot, és hogy a deléciós heterozigóták életképessége legyen jó. A deléciók töréspontjait is szekvenálással ellen riztük. A jellemzett törzseket (283 deléciós (Df(x)EDyyy) és 3108 RS törzs) elhelyeztük a Szegedi Drosophila Törzsközpont gy jteményében. A törzsközpont honlapján (http://expbio.bio.uszeged.hu/fly/index.php) át a törzsek és adataik minden kutatóhely számára elérhet k. Az RS törzsek felhasználásával további, tervezett deléció állítható el egyszer , kipróbált genetikai kísérlettel (a szükséges kísérleti protokoll ugyancsak a honlapon található). A DROSDEL törzsek forgalma 2003 és 2004 évben 2483 RS 1444 ED törzs volt. A DROSDEL Projektet az Európai Közösség az 5. Keret Programban támogatta.









































Kulcsszavak: Drosophila, deléció, P elem, mutáns gy jtemény, funkcionális genomika 

E76

Nyúl szatellit DNS családok izolálása, klónozása és jellemzése házinyúlban (Oryctolagus cuniculus) Ékes Csaba, Csonka Erika, Hadlaczky Gyula, Cserpán Imre Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Központ, Genetikai Intézet, Szeged Az alábbi összefoglaló tartalmazza nagyobb, egymástól különböz centromerikus szatellit szekvencia, illetve egy divergens alcsalád jellemzését nyúlban (Oryctolagus cuniculus). Minkét ismétl dés család head-to-tail elrendez dést mutat. A Rabsat I 375 bázispár körüli monomer egység méret . FISH segítségével ezen család nagy blokkjai mutathatóak ki 11 kromoszómapár centromerikus régiójában. A második család, a Rabsat 2 átlagos monomer mérete 585 bázispár körül van. Ez a centromerikus repeat 12 pár kromoszómán észlelhet . A két család egyes kromoszómapárokon átfedést mutat egymással. A Rabsat I 11 kromoszómaán, a Rabsat 2 12 kromoszómán található, amelyek közül 10 Rabsat I pozitív. A Rabsat II variáns, a Rabsat IIE, csak a 9-es és 16-os kromoszómán volt észlelhet . A négy rDNS-t tartalmazó kromoszómának különböz szatellit tartalma van: két szín in-situ hibridizáció kimutatta, hogy míg a Rabsat I nagy mennyiségben található a 20-as és 21-es kromoszómán, addig kimutathatatlan volt a 13-as és 16-os kromoszómán. Mindazonáltal, nagy Rabsat II blokkok voltak láthatóak a 16-os, 20-as és 21-es kromoszómán, de nehezen detektálható a 13-oson. Rabsat IIE a 16-os kromoszómán volt nagy mennyiségben. Ráadásul, a 21-es kromoszómán az rDNS jel a hosszú kar végén (21qter) volt látható. Ezen adatok azt sugallják, hogy a nyúl kromoszómákon legkevesebb négy, egymástól elkülönült szatellit család található. Ezen szatellit alapú különbségek a kromoszómaszerelvényben megkönnyítik az egyes kromoszómák identifikálását fluoreszcens in-situ hibridizáció során, illetve segít kialakítani a Leporidae kariotípus evolúciós történetét.





















Kulcsszavak: kromoszóma, heterokromatin, tandem ismétl dés, centromer, evolúció


94

E77

Az emberi 15-ös kromoszóma rövid karjának elemzése Cserpán Imre, Fodor Katalin, Ékes Csaba, Csonka Erika, Hadlaczky Gyula Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Központ, Genetikai Intézet, Szeged Az emberi genomban 5 pár akrocentrikus kromoszóma (13, 14, 15, 21, 22) van, melyek rövid karján a tandem szervez dés rRNS géneken kívül eddig más aktív genetikai elem nem ismeretes. Az akrocentrikus rövid karok szerkezete kevéssé ismert, az rDNS mellett csak különféle szatellit szekvenciákat találtak. Néhány nagylépték térképezési adaton kivül azonban a mai napig nincs publikált információ ezen szekvencia-családok szervez désére vontatkozóan. Mivel rendelkezésünkre áll egy olyan kínai hörcsög sejtvonal, amelyben csak egy 15-ös kromoszóma van, elvben lehetséges az egyértelm térképezés. A FISH technikával kimutatott DNS családok (α- és β-szatellit, proximális és disztális szatellit III, rDNS, telomer, illetve más kromoszómákon is el forduló pszeudogének) egymáshoz viszonyított elrendez dését PFGE térképezéssel vizsgáltuk. Megfelel en kiválasztott próbákkal emberi PAC könyvtárból olyan, 100-150 kb méret klónokat izoláltunk, amelyek szekvenálásával bázispár felbontású adatokhoz jutottunk pl. az FSHD pszeudogén töredék és a proximális β-szatellit kapcsolódásáról. A megkezdett, a 15p kart lefed "PACwalking"-ot tervezzük kiterjeszteni a 15p(tel), illetve a 15(cen) irányban.

























Kulcsszavak: akrocentrikus kromoszóma, FISH, PAC-walking, szatellit DNS, pszeudogén

E78

Hasonló ADA2 fehérjét tartalmazó hiszton acetiltranszferáz komplexek és eltér szerepük a transzkripció szabályozásban Pankotai Tibor1, Komonyi Orbán1,Tora László3, Boros Imre1,2 Szegedi Tudományegyetem, Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék, Szeged 2 Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Központ Biokémiai Intézet, Szeged 3 Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Strasbourg, France 1

Az eukarióta GCN5-tartalmú hiszton acetiltranszferáz (HAT) komplexek a H3 hisztonok N terminális végének acetilációjával fellazítják a kromatin szerkezetet, és lehet vé teszik a transzkripciót specifikus célgéneken. Számos HAT komplex állandó tagjai az ADA2 fehérjék, amely alapján feltételezhet , hogy esszenciális szerepet töltenek be a komplexek felépítésében. ADA2-homológ fehérjék éleszt kt l magasabbrend eukariótákig megtalálhatók, de tényleges funkciójuk – eltekintve a viszonylag jól jellemzett, egyetlen éleszt ADA2 fehérjét l – alig ismert. Kimutattuk, hogy Drosophila melanogaster-ben két ada2 gén található, amelyekr l homológ fehérjék képz dnek (ADA2a és ADA2b). A fehérjék funkciójának vizsgálatához mindkét génre mutáns allélokat hoztunk létre, és megállapítottuk, hogy mindkét ada2 funkció nélkülözhetetlen a normális egyedfej déshez. A kett s mutánsok vizsgálatával és a fehérjék ektopikus kifejeztetésével igazoltuk, hogy egyik fehérje sem képes a másik funkcióját ellátni. Ez az eredmény arra 95































utal, hogy a két fehérje homológ, eltér komplexek felépítésében vesznek részt, amelyek eltér biokémiai folyamatokat szabályoznak. Az ADA2b hiányában, a hiszton3 14-es lizinjének általános acetiláltsági szintje csökken, és a TAF10 transzkripciós faktor köt dése kevesebb helyen figyelhet meg a kromoszómán. ADA2a hiánya nem okoz látható eltérést sem az acetilált hisztonok mennyiségében, sem a TAF10 lokalizációjában. A két fehérje eltér en vesz részt egyes gének szabályozásában is. Közel 250 olyan gént azonosítottunk, amely transzkripciójának szintje az Ada2b hiányában szignifikáns csökkenést mutat. A p53 által szabályozott apoptózis normális mérték indukciójához kell az ADA2b fehérje jelenléte, míg az ADA2a nem szükséges. A már meglév adatainkkal els ként igazoljuk, hogy a magasabbrend eukariótákban jelenlév ADA2 típusú fehérjék nélkülözhetetlenek az egyedfejl dés során, és eltér , vagy részben átfed sejtbiológiai folyamatok szabályozásában vesznek részt.




































Kulcsszavak: hiszton 3 acetiláció, ADA2, TAF10, p53, transzkripció szabályozás

E79

A bxd PRE in situ vizsgálata Drosophila melanogasterben Kozma Gabriella, Sipos László MTA SZBK Genetikai Intézet, Szeged A magasabbrend kromatinszerkezet azon apró változásait tanulmányozzuk, melyek fontos szerepet játszanak az eukarióta génm ködés szabályozásában. Kísérleteinkben a Drosophila melanogaster homeotikus bithorax-komplexének egy 3 kb hosszú szakaszán belül elhelyezked „silencer” hatású régió, az ún. bxd PRE m ködését és kiterjedését vizsgáljuk deléciós analízis segítségével. Az ehhez használt kisméret deléciókat in situ, P-elem mediálta génkonverzió révén hozzuk létre, így az eddigi tanulmányoktól eltér en közvetlenül, eredeti környezetében tanulmányozhatjuk a bxd PRE génm ködés-szabályozásban betöltött szerepét. A deléciók létrehozására kétféle génkonverziós konstrukciót használunk. Az egyik konstrukció beépülése során keletkez kromoszóma abban különbözik a vad szekvenciától, hogy a vizsgálandó genomiális DNS-szakaszt FRT-szekvenciák határolják, melyek közrefognak egy markergént is, lehet vé téve ezáltal a konvertánsok egyszer azonosítását. Az FRT-szekvenciák közötti DNS-szakasz a flp-rekombináz enzim hatására kiejt dik, melyet a markergén elvesztése jelez. Az ilyen típusú konstrukciók meghatározott méret és pozíciójú deléciók létrehozására alkalmasak. A másik típusú konverziós konstrukcióban az FRT-szekvenciák a markergént határoló I-SceI felismer helyeket fogják közre, melyeket az I-SceI enzim specifikusan hasít, lehet séget termemtve random, kisméret deléciök keletkezésére a meghatározott beépülési hely környezetében. A létrehozott deléciós kromoszómákon visszamaradó FRT-szekvenciák segítségével az egyes deléciók összekapcsolhatók, illetve a megfelel duplikációk indukálhatók. Az egyes deléciók által okozott fenotípusokat elemezve megállapítottuk, hogy a bxd régió említett 3 kb-os szakaszában korábban immunoprecipitációval azonosított 3 PREfunkcióval rendelkez szakasz közül in situ csak a középs eltávolítása eredményezi a várt poszterior irányú transzformációt. Ezen szakaszon belül – a GAGA és PHO köt helyek elhelyezkedéséb l, illetve a mintázatuk iab-7 PRE-val mutatott hasonlóságából kiindulva – 96 



















































azonosítottunk egy 184 bp hosszú szekvenciát, amely eltávolítása feltétlenül szükséges a bxd régió derepressziójához. Ennél kisebb szakasz eltávolítása nem eredményez fenotipikus változást. Megvizsgáltuk továbbá, hogy a 184 bp-os deléció megnövelése eredményezi-e a fenotípus er sségének illetve penetranciájának növekedését. El zetes eredményeink alapján azt mondhatjuk, hogy mindkét jelleg növekszik egy átfed , 280 bp-os deléció esetében, a deléció további növelése viszont nem vezet újabb, lényeges változáshoz még akkor sem, ha a vizsgált 3 kb-os szakaszt távolítjuk el. A kísérletek objektív kiértékeléséhez szükséges az egyes deléciók által okozott fenotípusok kvantitatív módszerekkel történ mérése is. Eredményeink alátámasztására immunhisztokémiai módszerrel is vizsgáljuk a bxd régió által szabályozott Ubx gén kifejez dési mintázatát a deléciós mutánsainkban, a lokális kromatinszerkezetre pedig GFP-fluoreszcencia segítségével következtetünk. A közeljöv ben helyettesítjük a 184 bp-os szakaszt az iab-7 illetve Mcp PRE-k homológ szekvenciáival, valamint a benne található GAGA és PHO köt helyeket elrontjuk. Eredményeink segítségével remélhet leg tisztázhatjuk majd, vajon képesek-e az egyes PRE-k egymás helyettesítésére, illetve milyen szerepet töltenek be a GAGA és a PHO fehéjék a PRE m ködésében.

























Kulcsszavak: Drosophila, PRE, gene conversion, in situ, PHO

E80

A SET-domén fehérjék szerepe a hiszton-kód írásában és olvasásában 1

Bajusz I.1, Sauer F.2, Gyurkovics H.1 MTA SZBK Genetikai Intézet, Szeged 2 ZMBH Heidelberg, Németország

Az eukariótákban kialakuló testtáj-, sejt- és szövetspecifikus genexpressziós mintázat fenntartásának vizsgálata a fejl désbiológia központi kérdése. Az utóbbi néhány év a génkifejez dési folyamatok molekuláris szint megismerésének robbanásszer b vülését hozta. Az aktív és inaktív kromatin-szerkezet kialakulásának egyik alapvet feltételét a nukleoszómákat alkotó hisztonok farki régióinak kovalens módosításai képezik. A hisztonokon azonosított módosítások egy meghatározott része az átíródó aktív gén-mez kön detektálható, míg a módosítások egy másik csoportja a kikapcsolt állapotban lév , inaktív, esetleges heterokromatinizált gén-mez ket jellemzi. Nemcsak a hisztonokon fellelhet módosításokat és ezek „jelentését”, a hiszton-kódot, kezdtük megismerni, hanem egyre többet tudunk meg azokról a fehérjékr l is, amelyek képesek a kódot felépíteni, illetve leolvasni. Laboratóriumunkban évek óta foglalkozunk olyan mutánsok jellemzésével, amelyek a szoros fejl dési kontroll alatt álló homeotikus génkomplexek helyes kifejez dését meg rz folyamatokat zavarják meg. Több olyan mutációt sikerült azonosítanunk, amelyekr l a kés bbiekben kiderült, hogy a hibás gén a hiszton-kód kialakításában részt vev fehérjét azonosít. Az egyik ilyen funkciónyeréses mutáns az Enhancer of zeste gén konzervált SET-doménjében pontmutációt hordozó E(z)Trithorax mimic. Megállapítottuk, hogy a mutáns fehérje aktívan tartandó kromatin–régiókat is inaktivál. Bizonyítottuk, hogy a pontmutáció az inaktív kromatin













































97







állapot meg rzésében szerepet játszó SET-domén fehérjékben konzervált arginin aminosavat egy, az aktív kromatin integritását biztosító SET-doménekre jellemz lizinné konvertálta. Az E(z)Trm segítségével különböz genetikai interakciós rendszerekben feltérképeztük az ENHANCER OF ZESTE fehérje in vivo partnereit, és megkíséreltük pontosítani az allél által létrehozott ektopikus inaktiváció támadáspontját a szabályozó szerep cisz-regulátorokon belül. Jellemeztük, hogy miképpen befolyásolja az ektopikus inaktiváció kialakulását az E(Z) fehérje dózisának megváltoztatása, illetve különböz mutáns E(Z) fehérjék jelenléte. Megállapítottuk, hogy az E(Z)TRM mutáns fehérje együttm ködik a vad E(Z) fehérjével, és az inaktivációt két vagy több E(Z) fehérjét tartalmazó komplexek hozzák létre. Megállapítottuk azt is hogy az E(Z)TRM csak akkor képes transzgenikus rendszerekben a riportergén inaktivációjára, ha a konstrukció tartalmaz egy korábban aktiváló szerep SET-domén fehérjék támadáspontjaként azonosított szabályozó szakaszt (trithorax response element, TRE). Sikerült bizonyítanunk továbbá, hogy transzgenikus riportergén rendszerekben a transzgénen kialakuló inaktiváció mértékét az adott genetikai háttérben jelen lév aktiváló és inaktiváló, SET-domén tartalmú fehérjék kompetíciós viszonyai szabják meg. Mesterségesen termelt vad és mutáns E(Z)TRM fehérje felhasználásával biyonyítottuk, hogy az E(Z) SET-doménjének in vitro hiszton-metil-transzferáz aktivitása van, amelynek specifitása a vad és mutáns fehérjében különbözik. A termelt fehérjét kötési kísérletekben is felhasználtuk, és jellemeztük a vad és mutáns fehérje köt dését különböz pontokon metilált hiszton H3 peptidekhez. Kísérleteink alapján modelt alkottunk arról, milyen szerepet tölt be az E(Z) fehérje által létrehozott, inaktiválást jelz hiszton-metiláció a kromatin domének állapotának kialakításában és meg rzésében, hogyan befolyásolja ezt a m ködést az aktivitási jelként szerepl szomszédos lizin metilációja, mit jelenthet esetünkben a hiszton-kód integratív leolvasása.


































Kulcsszavak: drosophila, homeotikus gének

kromatinszerkezet,




hiszton-kód,

epigenetikus

reguláció,

E81

A CG15031/PPYR1 eredend en rendezetlen fehérje a Drosophila protein foszfatáz Y kölcsönható partnere Dombrádi Viktor1, Kókai Endre1, Tantos Ágnes2, Ádám Géza3, Szuperák Milán3, Vissi Emese4, Szö r Balázs4, Luke Alphey4, Tompa Péter2, Friedrich Péter2 és Gausz János3 1 DE OEC Orvosi Vegytani Intézet, Debrecen, 2MTA SzBK Enzimológiai Intézet és 3 Genetikai Intézet, Szeged, 4University of Oxford, Department of Zoology, Oxford 

A Drosophila genom program adatbázisa szerint összesen 17 szerin/treonin-specifikus foszfoprotein foszfatáz katalitikus alegységet kódoló gén található ebben a modell organizmusban. Ezen foszfatázok többségének funkciója még ismeretlen. Ezek egyike a protein foszfatáz Y (PPY), egy olyan Drosophila-specifikus enzim, amely csak a hímek heréjében található meg. Éleszt kéthibrid sz rés segítségével több PPY-nal kölcsönható fehérjét azonosítottunk, amelyek közül a CG15031 gén termékét (PPYR1) részletesen jellemeztük. A fehérje-fehérje kölcsönhatás specificitását többoldalúan bizonyítottuk megismételt kéthibrid teszttel, plazmon rezonancia spektroszkópiával, immunprecipitációval és úgynevezett „pull 98




down” kísérlettel. Azt találtuk, hogy a rekombináns PPYR1 gátolta a PPY aktivitását. A PPYR1 SDS jelenlétében észlelt anomális mozgékonysága, h stabilitása, proteázok iránti érzékenysége és aminosav szekvenciája alapján az eredend en rendezetlen szerkezet fehérjék közé tartozik. RNS-köt képességét in vitro és in vivo körülmények között is igazoltuk. A PPYR1 mRNS és protein kimutatható a fejl d spermatocitákban, ahol kölcsönhatásba léphet a PPY-nal. Ezen kívül mind a PPYR1 transzkriptum, mind a fehérje megtalálható a n stény muslicák ováriumában és a korai embriókban. Ez a fehérje az ováriumban els sorban a kis follikuláris sejtekben és a dajkasejtekben fordul el . Jól megfigyelhet , amint a dajkasejtekb l belép a petesejtbe, ahol RNS-ekhez köt dik. A korai embriókban csak az anyai eredet PPYR1 található meg, ami az embrió fejl dése során folyamatosan lebomlik. Tehát kísérleteink során sikerült azonosítanunk egy új, PPY-nal kölcsönható, rendezetlen szerkezet RNS-köt fehérjét, amely csak a Drosophila reproduktív szerveiben expresszálódik, és szerepet játszhat az embriók fejl désében.















































Munkánkat az OTKA 38061, 34255 és 40723 számú pályázatai, valamint az OMFB 00922/2003 pályázat támogatta. Kulcsszavak: Drosophila melanogaster, protein foszfatáz regulátor, eredend en rendezetlen fehérjeszerkezet, RNS-köt fehérje, embrionális fejl dés








E82

Kinázok és foszfatázok szerepe a caveola-ciklus szabályozásában Botos Erzsébet, L. Kiss Anna, Turi Ágnes, Müllner Nándor, Kovalszky Ilona Humánmorfológiai és Fejl désbiológiai Intézet Orvosi Vegytani, Molekuláris és Pathobiokémiai Intézet I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet Semmelweis Egyetem, Budapest

A caveolák a plazmamembrán 50-100 nm átmér j képletei. A caveolák burkának kialakításában a caveolin fehérjecsalád (caveolin-1, 2 illetve 3) valamint lipidek (koleszterin, szfingolipidek) vesznek részt. A jellegzetes morfológiájú caveolák kialakításában a caveolin1 fehérje esszenciális szerep . Ezen fehérje oligomereket képez, melyek hosszú filamentumokká f z dnek fel, és spirálisan feltekeredve hozzák létre a caveola jellegzetes burkát. A caveolák szerepet játszanak a jelátviteli folyamatokban, a sejtek transzport-folyamataiban, valamint a koleszterin-homeosztázis fenntartásában is. A caveolin-1 N-terminális részén a scaffolding domain a jelátvitelben fontos szerepet játszó molekulák kötésére képes. A caveolin-1-el való kölcsönhatás ezen molekulák aktivitását jelent sen megváltoztatja. A caveolákat hosszú ideig a plazmamembrán állandó, stabil képleteinek tartották, egyre több adat támasztja alá azonban, hogy dinamikus struktúrák. Ligand-kötés után lef z dnek a plazmamembránról. Így biztosítják például az endotélsejteken keresztüli albumintranszportot, de néhány kórokozó (pl. Clamidiák) sejtbe való bejuttatásában is részt vesznek.
















99




A caveolák stabilitását a citoszkeletonnal való kapcsolatuk tartja fenn: filamin segítségével a citoszkeleton aktin molekuláihoz kapcsolódnak. A caveolák lef z désének, esetleges reciklizációjának pontos mechanizmusa nem ismert. Az utóbbi id ben irodalmi adatok bizonyítják, hogy a caveolák lef z désében a citoszkeleton átépülése, fellazulása mellett a dinamin is fontos szerepet játszik mely a caveolák nyaki részéhez kapcsolódva, azok lef z désekor mintegy zárja a caveolákat. Az internalizáció során a dinamint a caveolák membránjában lokalizálódó Src-kináz foszforilálja. Feltételezhet en a caveolin tirozin-foszforilációja is megtörténik, mely folyamatok következménye a caveolák lef z dése. A caveola-ciklus szabályozásában tehát kinázok és foszfatázok összehangolt m ködése játszik szerepet. Ezen folyamatok részletesebb tanulmányozásához munkánk során okadánsavat használtunk. Az okadánsav a szerin/treonin protein-oszfatáz (PP1A) gátlószere, amely enzim az Src-kinázt gátolja. Az okadánsav hatását morfológiai vizsgálatokkal (flourescens immunjelöléssel, elektronmikroszkópos technika) tanulmányoztuk. A fehérjék foszforilációs módosulásait immunprecipitációt követ Western blot analízissel vizsgáltuk. Az okadánsav kezelés hatására a sejtfelszíni vezikulák, caveolák száma csökkent, a citoplazmában nagy méret , multivezikuláris testek, jelentek meg, melyeket „caveoszóma” néven írtak le. Anti-caveolin-1 ellenanyaggal végzett immunprecipitáció során azt tapasztaltuk, hogy a kezelés egy ~30kDa molekulatömeg (feltehet leg caveolin-2) fehérje tirozin-foszfoszforilációját eredményezi. A caveolák sejten belüli útja illetve a reciklizáció mechanizmusa kevéssé ismert. 





































Kulcsszavak: caveola, citoszkeleton, Src-kináz, tirozin, foszforiláció

E83

Protein-asszociált O-glcNAc szerepe a szívizomsejt intracelluláris kalcium szabályozásában Nagy Tamás1, Voraratt Champattanachai2, Richard B. Marchase2, John C. Chatham3 1 Laboratóriumi Medicina Intézet, OEC, Pécsi Tudományegyetem, Pécs 2 Department of Cell Biology, University of Alabama at Birmingham 3 Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham A szívizom m ködésének pozitív inotróp szabályozásában részt vev -adrenerg agonisták és az AngiotensinII (AngII) a foszfolipáz C aktivációján keresztül, az inozitol-trifoszfát (IP3) másodlagos messenger segítségével fejtik ki hatásukat. Az IP3, receptoraihoz kapcsolódva, a sejt kalcium raktárainak kiürüléséhez vezet, illetve, részleteiben még nem teljesen feltárt második lépésként extracelluláris kalcium beáramlást generál, ily módon a szabad, intracelluláris kalcium ([Ca2+]i) gyors emelkedését okozva. Megfigyeléseink szerint el zetes glukózamin kezelés vagy megnövelt glükóz-koncentráció hatására ezen kalcium-válasz lecsökken. A jelenség mögött feltehet en a hexózamin metabolikus útvonal (HBP) és az [Ca2+]i szabályozás közötti jelátviteli kapcsolat állhat. Ennek pontosabb megismerése érdekében, újszülött patkányból izolált szívizomsejteken vizsgáltuk az IP3-agonista hatására kiváltott [Ca2+]i választ, az egyes HBP metabolitok változásának függvényében. Azt találtuk, hogy glukózamin hatására az AngII indukálta 












100

[Ca2+]i emelkedés szignifikánsabban alacsonyabb volt, s ezen hatás kiváltásáért a HBP protein-glikozilációs végterméke, a protein-asszociált O-glcNAc felel s. Hasonlóképpen a foszforilációhoz, a proteinek ezen post-transzlációs módosulása dinamikus folyamat, mely az N-acetil-glukózamin-nak a proteinek szerin/threonin oldalláncaihoz kapcsolódásából áll. Ez számos protein esetében a foszforilációval való kompetíciót is jelenti. Az ismert, O-glikozilációra képes fehérjék számának növekedése és funkcionális sokszín ségük alátámasztja, hogy ezen mechanizmus a jelátviteli folyamatok széles skáláját befolyásolja, regulálja. Els ként a sejtek táplálék-felvételben játszott szerepére derült fény, majd felmerült szerepe inzulin rezisztenciában és diabétesz-ben, tumorigenesisben, és neurodegeneratív betegségekben, ischaemia-reperfúziós károsodásban illetve a stresszválaszban is. Ez utóbbira szolgáltatnak újabb bizonyítékot az általunk elvégzett vizsgálatok; a kapott eredményeink alapján a proteinek O-glikozilációja közvetve vagy közvetlenül szabályozza a [Ca2+]i homeostasist, mely központi szerepet játszik a stressz-indukált folyamatok regulációjában.







Kulcsszavak: kálcium, O-glcNAc, cardiomyocyta, CCE, diabetes

E84

A CREB transzkripciós faktor szerepe PC12 sejtek differenciációjában és apoptózisában Dr. Pap Marianna, Balogh András PTE, ÁOK, Orvosi Biológiai Intézet, Pécs Az intracelluláris jelátviteli utak jelent s része transzkripciós faktorok szabályozásán keresztül fejti ki hatását. A CREB aktivitását dönt en két jelátviteli út szabályozza növekedési faktorokon keresztül. Számos fehérjekináz képes a CREB Ser-133 foszforilációjára. A Ser-133 foszforilációjával a glikogén szintáz kináz -3 (GSK-3) foszforilálni képes a CREB-et Ser-129en. Nem egyértelm ek az adatok arra vonatkozóan, hogy a CREB Ser-129-es foszfori-lációja serkent vagy gátló hatással van-e a fehérjére nézve. Kutatásaink célja, hogy meghatározzuk a CREB Ser-129 és Ser-133 foszforilációjának jelent ségét PC12 sejtek differenciációjában és túlélésében. Kísérleteinkhez intézetünkben korábban el állított, stabilan transzfektált PC12 sejtvonalakat használtunk. Ezen szubklónokban a CREB foszforilációs helyeinek megfelel en a 129-es és 133-as pozícióban szerin helyett alanin található. Vad típusú PC12 sejtek, vad típusú CREB-et és a három mutáns fehérje egyikét expresszáló sejtek idegsejt növekedési faktor indukálta differenciációját hasonlítottuk össze. Vad típusú és mutáns CREB fokozott expressziója differenciációt okoz, amelyhez Ser-129 foszforilációja szükséges, míg Ser-133-é nem. Vizsgáltuk a vad típusú és a mutáns CREB-et fokozottan expresszáló sejtek apoptotikus készségét vad típusú PC12 sejtekhez viszonyítva foszfatidil inozitol 3-kináz gátoló LY294002 és szérum megvonás kezelések hatására. Mind a mutáns, mind a vad típusú CREB fokozott expressziója kontroll sejtjeinkhez viszonyítva antiapoptotikus hatású.



















Kulcsszavak: PC12, CREB, apoptózis, differenciáció, NGF 101

E85

Nitrogén-oxid hatása PC12 sejtek jelátvitelére Bátor Judit, Varga Judit, Szeberényi József PTE ÁOK Orvosi Biológiai Intézet, Pécs A jelátviteli fehérjék poszttranszlációs módosulásai jelent s szerepet játszhatnak a szignáltranszdukciós folyamatok szabályozásában. Munkánk célja a nitrogén-oxid (NO) esetleges moduláló hatásának tanulmányozása volt PC12 patkány phaeochromocytoma sejtek NGFjelátvitelében. Nitroprusszid-nátriumot (SNP) használtunk NO-donorként. A NO egyrészt serkenti a guanil-cikláz m ködését, másrészt kovalensen köt dik egyes fehérjékhez. Az általunk használt PC12 sejtek differenciációjában a cGMP jelátviteli út nem vesz részt, ezért a tapasztalt hatások valószín leg a fehérjenitroziláció következményei. Kis dózisú SNP kezelés gyorsítja az NGF hatására bekövetkez differenciációt, nagyobb (de nem toxikus) koncentrációjú SNP kezelés viszont gátolja azt. Megvizsgáltuk a jelenség biokémiai hátterét: rövid idej SNP-kezelés dózissal arányosan megnöveli az Akt és ERK fehérjék foszforilációját. NGFfel együtt adva feler sítik egymás hatását. Pár napos, differenciációt gátló koncentrációjú SNP-kezelés gátolja a CiklinD1 és p21 fehérjék NGF hatására bekövetkez indukcióját, míg ennél alacsonyabb koncentrációban nem gátolja az NGF hatását. Fos és Jun fehérjék mennyiségét az SNP dózisfügg módon emeli. A Ras fehérje nitrozilációjának hatását a neuronális differenciációra domináns negativ Rast expresszáló PC12 szubklón (M-M17-26) vizsgálatával teszteltük. Eredményeink arra utalnak, hogy a NO több jelpálya m ködését is befolyásolhatja PC12 sejtekben. A munka INTAS (51022), OTKA (T 037 528) és ETT (073/2001) támogatással készült.

























Kulcsszavak: Ras, nitroziláció, NGF, neuronális differenciáció, PC12 sejtek

E86

A szöveti transzglutamináz (TG2) G fehérjeként m ködve gátolja meg a májsejtek Fas receptor stimulációja által kiváltott apoptózisát 

Sarang Z1, Molnár P2, Németh T2, Gomba S2, Kardon T3, Melino G4, Fésüs L1 és Szondy Z1 Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet, 2Pathológiai Intézet, DEOEC, Debrecen; 3 Orvosi Vegytani Intézet, SOTE, Budapest; 4Medical Research Council, Toxicology Unit, Hodgkin Building, Leicester University, Leicester LE1 9HN, United Kingdom

1

A TG2 egy fehérjéket keresztköt enzim, amely kifejez dik májsejtekben, és indukálódik a májsejtek in vivo apoptózisa során. A TG2 emellett egy GTP-köt protein is, amely az alfa-1β-adrenerg receptor (AR) szignálútvonalát közvetíti májsejtekben. A Fas/Fas ligand interakció meghatározó szerepet játszik számos májbetegség pathomechanizmusában, és agonista anti-Fas antitestek egerekbe történ injektálása mind disszeminált endotheliális sejt apoptózist, mind fulmináns májelégtelenséget okoz. El adásunkban arról számolunk be, hogy az anti-Fas antitest egy olyan intraperitoneális dózisa (1 µg/g testsúly), amely szubletális vad tí














102

pusú egerekre, megöli mindegyik TG2-/- knock-out egeret 20 órán belül. Bár a TG2-/tímuszsejtek anti-Fas antitestek jelenlétében ugyanolyan sebességgel halnak el, mint a vad típusúak, a TG2-/- májsejtek mind in vivo mind in vitro fokozott érzékenységet mutattak az anti-Fas kezelés iránt, bár sem a sejtfelszíni receptorok száma, sem a Fas útvonalat gátló FLIP szintje nem változott bennük. Ugyanakkor az apoptózist gátló Bcl-xL szintje csökkent volt, és a megjelen apoptótikus sejtek egy része szokatlan morfológiát mutatott. Emellett lokalizált hemorrhagiás bevérzéseket is láttunk a májmetszeteken, ami az endotheliális sejtek apoptózisának következménye. Ugyanez az anti-Fas dózis vad típusú egerekben f leg endotheliális sejt apoptózist és a májsejtek következményes nekrózisát váltotta ki. Kloroetilklonidin, egy AR antagonista oltása vad típusú egrekben a bcl-xL downregulációját eredményezte a májsejtekben, és fokozta Fas érzékenységüket. Egyúttal az AR hiányos egerek májsejtjei is kevesebb Bcl-xL.-t fejeztek ki és érzékenyebbek voltak az anti-Fas hatásával szemben. Összegezve, eredményeink azt mutatják, hogy a TG2 hiánya érzékenyíti a májsejteket az anti-Fas antitestek öl hatásával szemben, és ez a Bcl-xL szintjét szabályozó AR jelátviteli út defektusának következménye. Támogatta: OTKA T034191, T034 918, ETT 48/2000 and ETT 04/605-00. Kulcsszavak: adrenerg receptor, apoptózis, szöveti transzglutamináz, Bcl-xL, májregeneráció








E87

A caveolák szerepe különféle tumorok kialakulásában Kovács Enik , Botos Erzsébet, Kis Melinda, L. Kiss Anna Semmelweis Egyetem, Humánmorfológiai Intézet, Budapest 

A caveolák számos sejttípusban, de f leg differenciált sejtekben fordulnak el . Membránjuk nagy mennyiségben tartalmaz koleszterint, szfingolipideket ill. caveolin fehérjéket, melyek közül a caveolin-1 nélkülözhetetlen a caveolák szerkezetének kialakításában. A caveolin az N-terminális szakaszán található scaffolding domain segítségével caveolinhoz ill. egyéb fehérjékhez képes köt dni. A caveolák fontos szerepet játszanak a szignáltranszdukciós folyamatok szabályozásában úgy, hogy különböz , a jelátvitelben jelent s szerepet játszó fehérjéket (Gs fehérjék alegysége, H-Ras, Src kináz, eNOS, MAP kináz, protein kináz C és EGF receptor) képesek megkötni, amelynek eredményeként a jelátviteli molekulák inaktiválódnak. Ha azonban valamilyen stimulus hatására a caveolák lef z dnek, ill. a caveolin-1 expresszió gátolt, ezek a fehérjék aktiválódnak és beindítják az általuk regulált szignáltranszdukciót, ami sok esetben a sejtek korlátlan osztódásához vezet. Számos in vitro kísérlet bizonyítja, hogy a caveolák mennyiségének csökkenése ill. a caveolin downregulációja fokozza a sejtek tumorigenitását, aktiválja a MAPK kaszkád m ködését, és a sejteket „beviszi” a sejtciklusba, míg a caveolin-1 overexpressziója a mitózist gátolja. Ezen eredmények alapján a caveolin géncsaládot a tumorszupresszor gének közé sorolják. A caveolin tumor genezisben betöltött szerepe azonban még korántsem egyértelm en tisztázott, ugyanis bizonyos tumorokban a caveolin-1 downregulációja helyett annak túltermel dését tapasztalták. Ezekben a daganatokban a caveolin a sejtek túlélését segíti el , fokozza azok agresszivitását és metasztatikus képességét. Ezt az ellentétet a szakirodalom azzal magyarázza, hogy a tumor genezis kezdeti szakaszában a caveolin-1 103































downregulációja következtében fokozódik a sejtproliferáció, amely akut tumorfejl dést eredményez. Ahogy a tumor egyre nagyobb, ill. kialakulnak a metasztázisok, változnak a daganatsejtek igényei, megindul az angiogenezis és újra fokozódik a caveolin-1 expressziója. A caveolin jelenlétének ill. hiányának kimutatása gyakorlati jelent séggel bírhat a daganatos megbetegedés fázisának a meghatározásában, ill. a caveolin-1 terápiás célokra való alkalmazásában a korai szakaszban. A n k körében kiemelked gyakoriságúak a különböz n gyógyászati daganatok, melyek nagy része ösztrogén dependens. Az ösztrogén mitogén hatása felel s a 30 éven felüli n k több mint egy harmadát érint eml és méh carcinoma kialakulásáért. Ezekben a sejtekben a caveolin-1 expressziója jelent s csökkenést mutat. Az ösztrogén hatása kétféle lehet: gyors, ún. nongenomikus és lassú, genomikus. Ez utóbbi hatásért f leg a magi receptorok felel sek, míg a nongenomikus hatást a plazmamembránhoz kötött ER (ösztrogén receptor) közvetíti. Ez a receptor valószín leg a caveolákhoz kapcsolódik, a membránhoz való köt désért palmitoiloldalláncok ill. egy ún. sztriatin nev fehérje a felel sek. Az ösztrogén a sejtproliferációt a nongenomikus útvonalon az Src kináz és a MAP kináz kaszkád aktiválásával éri el. Patkány uterus simaizomsejteken végzett kísérleteink is bizonyítják, hogy ösztrogén hatására a caveolin-1 szinte teljesen elt nik a sejtek felszínér l. Kimutattuk, hogy a caveolin-1 és az ER kapcsolódását az ösztrogén stimulálja, ezáltal beindítva a caveolához kötött jelátvitelt. A kapcsolat kialakulása során aktiválódik az Src kináz, amely a caveolin-1-et foszforilálja. A foszforiláció hatására a caveolák lef z dnek, csökken a caveolin-1 menynyisége a sejthártyában, amely a jelátviteli molekulák aktiválódását, majd sejtproliferációt eredményez.


























































Kulcsszavak: Caveolin, jelátvitel, tumor szupresszió, tumor genezis, ösztrogén/ösztrogén receptor

E88

p53-mal kölcsönható gének Drosophilában Szabó Kornélia1,3, Bálint Éva2, Hajdú Ildikó1, Molnár Enik 1, Domokos Klarissza1, Hozsó Adrienn1, Török István4, Bernard Mechler4 és Kiss István1 1 SzBK Genetikai Intézete, Szeged; 2SzTE TTK Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszéke, Szeged; 3SzTE AOK II. sz. B rklinika, Szeged; 4 Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Németország 



A p53 gén termékének központi szerepe van a celluláris stressz genotoxikus és kancerogén hatásának kivédésében azáltal, hogy a sejtciklust leállítja, illetve a rendellenesen viselked sejtek apoptózisát, programozott halálát idézi el . Ennek fontosságát aláhúzza az a tény, hogy a spontán emberi daganatok több, mint 50 %-ában a p53 fehérje funkcióképtelen. A p53 egyrészt integrálja a káros hatások által indukált jelzéseket, másrészt mint transzkripciós faktor szabályozza az apoptózis kaszkádban résztvev gének expresszióját. Míg az apoptotikus effektor gének eléggé ismertek, az apoptozist a p53-mal kölcsönhatásban kiváltó ill. gátló gének nagyrészt ismeretlenek. E gének és kölcsönhatásaik megismerése vá104








laszt adna arra a kérdésre, hogy mi az a mechanizmus, amely kijelöli az elpusztítandó sejteket, míg megkímél más sejteket. Az ecetmuslica p53 fehérjéje az emberi p53 funkcionális homológja, és a Drosophila melanogaster mint a leginkább manipulálható magasabbrend modellállat alkalmas az apoptózist szabályozó genetikai rendszer tanulmányozására. Ennek érdekében egy új típusú aktiváló P transzpozon segítségével számos, az apoptotikus fenotípust módosító, a p53-mal kölcsönható mutánst izoláltunk. A mutáns géneket azonosítottuk, és közöttük számos ismeretlen, illetve kevéssé ismert gént találtunk, mindegyiknek van emberi homológja is. E gének jellemzése nagyban hozzájárulhat a p53 génreguláló szerepének megértéséhez, az emberi homológok vizsgálata pedig megvilágíthatja a karcinogenezisben és a neurodegeneratív betegségek kialakulásában játszott szerepüket. 

Kulcsszavak: p53, apoptózis, genetikai interakció, Drosophila melanogaster, modellrendszer

E89

Az adenozin A2a receptorok az egér tímuszsejtek apoptózisát az adenilát cikláz, a Nur77 és a proapoptotikus csak BH3 Bim fehérjén keresztül váltják ki Kiss I1, Oskolás H1, Tóth R1, Bouillet P2, Fülöp A1, Ledent C3, Szondy Z1 Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet, MTA Jelátviteli és Apoptózis Kutató csoport, DEOEC, Debrecen; 2Walter Elisa Hall Institute of Medical Research, PO Royal Melbourne Hospital, Melbourne, Victoria 3050, Australia. 3 IRIBHM, Université Libre de Bruxelles, Brussels, B-1050 Belgium 1

Az adenozin folyamatosan termel dik a tímuszsejtek mikrokörnyezetében a normális limfocita szelekciós folyamatok eredményeként. Egészséges tímuszban nagy része lebomlik az adenozin dezamináz enzim hatására. Mégis, egy olyan környezetben, ahol a keletkez sejtek 95%-a elhal programozott sejtelhalással, elegend mennyiség adenozin keletkezik ahhoz, hogy a sejtfelszíni adenozin receptorokat aktiválja. El adásunkban azt mutatjuk be, hogy az adenozin képes sejtelhalást kiváltani egér tímuszsejtekben, és ez f leg az adenozin A2A receptorokon keresztül közvetít dik. A jelátviteli útvonal az adenilát cikláz aktivációjához, a Nur77 transzkripciós faktor és Nur77 függ gének, mint FasL, NDG-1 és 2 indukciójához, és a proapoptotikus csak BH3 Bim fehérje indukciójához és foszforilációjához vezet. Néhány transzgenikus és knock out egér törzsb l származó tímuszsejt vizsgálatából azt a következtetést vontuk le, hogy az adenozin kiváltotta sejtelhalás függ a Bim jelenlétét l és gátolja a Bcl-2, viszont független a “sejthalál” receptoroktól. Adataink arra utalnak, hogy az adenozin kiváltotta apoptózis program olyan sejthalál jelátviteli elemeket használ az apoptózis kiváltásához, amelyeket a negatív szelekciónál írtak le.




























Támogatta: OTKA T 022705, T 029528,F-038069 és ETT 100/2003 Kulcsszavak: apoptózis, T limfocita, nur77, bim, adenilát cikláz

105

E90

Drosophila autofágia-gének szerepének vizsgálata Lippai Mónika, Csikós György, Juhász Gábor, Sass Miklós ELTE Állatszervezettani Tanszék, Budapest Az autofágia, amely az apoptózis mellett a programozott sejthalál másik f típusa, sokféle sejtélettani folyamatban játszik szerepet. A sejt túlélését segíti éhezés során, a sejtorganellumok, makromolekulák lebontását biztosítja, az egyed fejl dése során feleslegessé vált sejtek, szövetek pusztulásában játszik szerepet. Patológiás folyamatokban – pl. Alzheimer-kór, Parkinson-kór - is kimutatták az autofágia szerepét az idegsejtek pusztulásában. Csoportunk célja az autofágia szabályozásának, molekuláris mechanizmusának megismerése, az apoptózissal való esetleges kapcsolódási pontok felderítése. A teljes átalakulással fejl d rovarok esetében a lárvális szervek jó része a metamorfózis során – ekdizon hatására - autofág lebomlással t nik el. Kísérleteink során P-elemes mutagenezissel indukált, a harmadik lárvastádiumban letális Drosophila melanogaster törzseket teszteltünk. Tizenöt olyan törzset azonosítottunk, amelyekben a fiziológiás sejtpusztulási folyamat olyan mérték zavart szenvedett, hogy a mutációt homozigóta formában hordozó bábozódás el tti (3. stádiumú) lárvákban autofág vakuolák nincsenek, vagy képzésük során nagyon súlyos zavarokat szenvednek. A 3. lárvastádium végén vagy a bábozódás során ennek következtében pusztulnak el. A P-elem a 15 törzsben 9 különböz , már ismert, és 4 ismeretlen génbe épült be (3 törzsben ugyanazt a gént találta el a P-elem). 10 törzsben sikerült a P-elem kiugratásával helyreállítani a normál fenotípust. A P-elem beépülési helyével azonosított génekr l a genomiális DNS-b l PCR segítségével exonokat izoláltunk, bakteriális expressziós rendszerben fehérjét termeltettünk ellenanyag el állítása céljából. Az ellenanyaggal az autofágiában szerepet játszó géntermékek celluláris és szubcelluláris lokalizációját vizsgáljuk.






























Kulcsszavak: Drosophila, egyedfejl dés, P-elem, autofágia, immuncitokémia


106

E91

Az autofág folyamatok szabályozásának vizsgálata Drosophila mutáns vonalakon Csikós György1, Juhász Gábor1, Lippai Mónika1, Komonyi Orbán2, Maróy Péter2 és Sass Miklós1 1 Eötvös Loránd Tudományegyetem, Állatszervezettani Tanszék 2 Szegedi Tudományegyetem Az egyedfejl dés során a szöveti struktúrák átalakításának, az adott fejl dési stádiumnak megfelel fiziológiai státuszba kerülésének egyik legfontosabb eszköze az autofágia. Ennek során a sejtek a citoplazmájuk egy, olykor igen jelent s, részét kett s falú izoláló membránnal elkülönítik, majd az abban lév komponenseket a lizoszómális apparátus segítségével lebontják. Mivel a folyamat gyakran vezet a sejtek pusztulásához, ezért az autofágiát újabban – az apoptózistól (I. típusú sejthalál) megkülönböztetve – II. típusú sejtpusztulásnak nevezik. Ha ez a szöveti átépülés (remodelling) elmarad, akkor a teljes átalakulással fejl d rovarok embrionális vagy posztembrionális fejl dése súlyosan károsodik, ami gyakran az egyed pusztulásához vezet. A holometabola rovarok lárvális szerveinek lebontásában is az autofág folyamatok dominálnak. A Szegedi Drosophila Stock Center P-elem inzercióval el állított mutáns vonalai közül laboratóriumunkban kiválogattuk azokat, amelyek a lárvális zsírtestben autofágiadefektusokat mutattak. A törzsek fény- és elektronmikroszkópos morfológiai jellemzése és a mutáció által érintett gén megkeresése után komplementációs tesztek és revertánsok el állításával igazoltuk, hogy az adott gén felel s a mutáns fenotipus kialakításáért. Következ lépésként in vitro RNS-interferenciával kíséreljük meg az adott, autofág folyamatok iniciálásában részt vev gének sorrendjének megállapítását. Ehhez szükséges egy in vitro lárvális zsírtest tesztrendszer el állítása. Bár az autofágia a lárvális zsírtestben szigorú hormonális kontrol alatt van (az ekdizon serkenti, a juvenilis hormon gátolja), mégis azt tapasztaltuk, hogy az egyéb szövetek, vagy az azokból származó faktorok jelenléte ill. hiánya jelent s mértékben hatással van a vedlési hormon, ill. annak agonistája, valamint az éheztetéssel indukálható autofágia megjelenésére.















































Kulcsszavak: autofágia, Drosophila, metamorfózis, ekdizon, zsírtest

107

E92

TPPP/p25: egy új szerkezetnélküli fehérje és a neurodegeneráció kapcsolata Lehotzky Attila1, Tirián László2, T kési Natália1, Zotter Ágnes 1, Szabó Béla3, Kovács János4, és Ovádi Judit1 1 Magyar Tudományos Akadémia, Szegedi Biológiai Kutatóközpont, Enzimológiai Intézet, Budapest; 2Szegedi Egyetem, Orvostudományi Kar, Orvosi Biológia Intézet, Szeged; 3 Eötvös Lóránd Tudományegyetem, Biológiai Fizika Tanszék, Budapest; 4 Eötvös Lóránd Tudományegyetem, Állatszervezattan Tanszék, Budapest 

Csoportunk nemrégiben azonosított egy agy-specifikus fehérjét, a TPPP/p25-t, amelyr l kimutattuk, hogy nem rendelkezik határozott szerkezettel (1), és in vitro rendszerekben aberráns mikrotubulus képz dést indukál (2). A jelen munka célja a fehérje intracelluláris lokalizációjának meghatározása, valamint strukturális és funkcionális hatásainak jellemzése volt. Humán sejteket transzfektáltunk a fehérje génjét EGFP-fúziós formában tartalmazó expressziós vektorral. Megállapítottuk, hogy a fehérje els dleges célpontja a sejten belül a mikrotubuláris rendszer, alacsony expressziós szintnél a TPPP/p25 kolokalizál a mikrotubuláris hálózattal, amely a sejtek energia állapotát nem károsítja (3). Érdekes módon, SK-N-MC sejtvonal esetén stabilan expresszáló klónokat tudtunk szelektálni (4), azonban HeLa sejtekben a fúziós fehérje tranziens kifejez dése jelent s morfológiai, strukturális és funkcionális változásokat okozott, mely sejthalálhoz vezetett. Ezt a folyamatot fluoreszcens videomikroszkópiával követtük nyomon. Transzfektált HeLa sejtekben a fúziós fehérje a centroszóma régiójában halmozódott fel, amely két jól definiált szerkezet kialakulását eredményezte: a sejtmagba benyomuló fehérje aggregátum, un. „aggreszóma” vagy egy mag körüli filamentum gy r , „cage” alakult ki (3). Elektron mikroszkópás vizsgálataink szerint az utóbbi, fluoreszcens fehérjével dekorált, magmembrán közeli struktúra, párhuzamosan szervez dött, kötegelt mikrotubulusokat, és vékony filamentumokat tartalmazott. Ezen aberráns struktúrák kialakulása MG-132 jelenlétében fokozódott, ami arra utal, hogy a szerkezet nélküli TPPP/p25 fehérje szintjét a ubiquitin-proteoszóma rendszer kontrollálhatja. Megvizsgáltuk, hogy a TPPP/p25-indukált fehérje aggregátum képz dés összefüggésbe hozható-e a neurodegenerációra jellemz zárványtest képz déssel. Ezért a TPPP/p25 el fordulását vizsgáltuk humán patológiás agyszöveti mintákon immunhisztokémiai módszerekkel. Megállapítottuk, hogy a TPPP/p25 az alfa-szinukleopátiák jellemz markere, az alfa-szinukleinnel teljes kolokalizációt mutat a Parkinson-kórra és más szinukleopátiákra jellemz zárványtestekben (5). Az Alzheimer kór és más taupátiás betegségek esetén nem mutatható ki a TPPP/p25 akkumulációja az érintett agyterületeken. Eredményeink azt valószín sítik, hogy a TPPP/p25, hasonlóan más szerkezet nélküli fehérjékhez (pl. alfaszinuklein, tau) aktív szerepet játszik bizonyos neurodegenerativ folyamatok patomechanizmusában.









































108

Hivatkozások: 1. Hlavanda, E., Kovács, J., Oláh, J., Orosz, F., Medzihradszky, K. F. and Ovádi, J. (2002) Biochemistry 41, 8657-8664 2. Tirián, L., Hlavanda, E., Oláh, J., Horváth, I., Orosz, F., Szabó, B., Kovács, J., Szabad, J. and Ovádi, J. (2003) Proc Natl Acad Sci U S A 100, 13976-13981 3. Lehotzky, A., Tirián, L., T kési, N., Lénárt, P., Szabó, B., Kovács, J. and Ovádi, J. (2004) J Cell Sci 117, 6249-6259 4. Orosz, F., Kovács, G. G., Lehotzky, A., Oláh, J., Vincze, O. and Ovádi, J. (2004) Biol Cell 96, 701-711 5. Kovács, G. G., László, L., Kovács, J., Jensen, P. H., Lindersson, E., Botond, G., Molnar, T., Perczel, A., Hudecz, F., Mez , G., Erdei, A., Tirián, L., Lehotzky, A., Gelpi, E., Budka, H. and Ovádi, J. (2004) Neurobiol Dis 17, 155-162





Kulcsszavak: neurodegeneráció, szerkezettelen fehérjék, aggreszóma, mikrotubulus, metabolizmus

E93

Hella, az els lamellocita-specifikus antigén jellemzése Drosophila melanogaster-ben Laurinyecz Barbara1, Kurucz Éva1, Medzihradszky Katalin2, Vilmos Péter1, Mihály József1, Elisabeth Gateff3, Dan Hultmark4, Andó István1 1 Institute of Genetics and 2Laboratory for Mass-Spectrometry, Biological Research Center of the Hungarian Academy of Sciences, Szeged, 3Johannes Gutenberg University, Mainz and 4Umea Center for Molecular Pathogenesis, Umea University, Umea Az els dleges immunitás egy olyan hatékonyan m köd velünk született védekez képesség, amely már a törzsfejl dés korai szakaszában kialakult és az állatvilágban - a rovaroktól az eml sökig - homológ molekuláris komponensekb l felépül egységként m ködik. A Drosophila melanogaster-t részben széleskör en tanulmányozott genetikai háttere, részben pedig az adaptív immunrendszer hiánya teszi különösen alkalmas modellszervezetté a veleszületett immunitás folyamatait szabályozó gének vizsgálatára. A Drosophila immunválaszának sejtes elemei a mikroorganizmusokat fagocitáló plazmatociták, a proteolitikus folyamatokban szerepet játszó kristálysejtek és a nagyméret testidegen anyagok, leggyakrabban parazita darazsak petéi valamint tumorok körül többréteg tokot kialakító nagyméret , lapos lamellociták. Munkacsoportunk a Drosophila immunsejtejeinek összerendezett m ködésén alapuló, rendkívül hatékony védekez rendszert szabályozó gének azonosítását t zte ki célul. Laboratóriumunkban reverz genetikai módszerrel azonosítottuk az els lamellocita specifikus gént, melynek a hella nevet adtuk. A lamellocitákon megnyilvánuló Hella antigént a molekula három különböz epitópját felismer monoklonális ellenanyag keverékével immunprecipitáltuk. Az izolált fehérje emésztési peptidjei egy 2,5 kb méret Drosophila


















































109

gént azonosítottak. A Hella antigén fehérje-szekvenciájának in silico analízisével szignál szekvenciát, extracelluláris régiót és C-terminális tramszmembrán domént azonosítottunk. A hidrofób régió el tt elhelyezked prediktált GPI-hasítási hely lehet vé teszi a molekula lipid-tutajokhoz történ kapcsolódását, amit egy lipid-tutaj marker, a kolera toxin Bvel történ kolokalizációval mutattunk ki. A fehérje szerkezeti hasonlóságot mutat a Ly6/u-PAR családba tartozó receptor molekulákkal, köztük a CD59 humán komplement regulátor fehérjével, mely jelátviteli folyamatokban és sejtadhézióban is szerepet játszik. Az u-PAR ezenkívül központi molekulája a különböz típusú karcinómák metasztatizáló folyamatainak. A Hella antigén lipid-tutajokban történ felhalmozódása, valamint a fenti eml s fehérjékkel mutatott szerkezeti hasonlósága felveti azt a lehet séget, hogy a Hella antigén részt vesz a lamellocitákban zajló jelátviteli folyamatokban. A Hella antigén sejtes immunválaszban betöltött szerepének megismeréséhez funkcióvesztéses mutáns törzseket hoztunk létre a kódoló gén közelében elhelyezked P-elem mobilizálásával. A homozigóta életképes, Hella antigén hiányos törzsek tokképzési reakciója nem különbözött a Hella molekulát expresszáló perfekt excíziót tartalmazó kontroll törzst l. A Hella antigén hiányos és a perfekt excíziót tartalmazó törzsek lárváiból in vivo immunindukciót követ en RNS-t izoláltunk és microarray analízist végeztünk. Eredményeink szerint a jelent s expressziós különbségeket mutató gének egy része immunfolyamatokban játszik szerepet, többségük azonban ismeretlen funkciójú fehérjéket kódol, melyeknek további vizsgálatát tervezzük. A microarray analízissel párhuzamosan genetikai interakciós kísérleteket végzünk. Az eddig létrehozott kett s mutánsban a Hella antigén hiánya drasztikusan csökkenti a l(3)mbn-1 tumorszupresszor mutáns fenotípusát, azaz visszaszorítja a hemociták túltermel dését és a tumorok képz dését.

















































Kulcsszavak: veleszületett immunitás, lamellocita, tokképzés, GPI-kapcsolt fehérje, tumor

110