A xilit antimikrobiális hatásának vizsgálata Investigation of antimicrobial effect of xylitol Szili Zsuzsanna*, Szakmár Katalin, Erdősi Orsolya, Szita Géza, Horváth Judit, László Noémi SZIE ÁOTK Élelmiszer-higiéniai Tanszék H-1078 Budapest, István u. 2. *e-mail:
[email protected]
Összefoglalás A xilit a természetben előforduló öt szénatomos cukoralkohol, amely a szerves kémiában régóta ismert. Inzulinfüggetlen természete, alacsony glikémiás indexe, fogszuvasodást, középfülgyulladást és egyes légzőszervi betegségeket megelőző hatása miatt egyre nagyobb
figyelmet
kap.
A
xilit
egyre
inkább
népszerű
az
élelmiszer-
és
gyógyszeriparban, mint édesítőszer, ma már világszerte kereskedelmi mennyiségben gyártják. A szerzők kísérleteinek célja a xilit szaporodásgátló hatásának vizsgálata volt, Escherichia coli, Salmonella Enteritidis, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Candida albicans és Penicillium expansum esetében. A vizsgálatokat Tripton-szója (TSB) táplevesben végezték 2, 4, 6, 8 és 10% xilit hozzáadásával. A szaporodás detektálása redoxpotenciál-mérésen alapuló direkt és indirekt eljárással történt, amely módszer alkalmas a szaporodásgátlás mérésére. A vizsgálatokat 22 °C és 37 °C hőmérsékleteken végezték, kivéve Penicillium expansum esetében, amelyet csak 22 °C-on vizsgálták. Az eredmények alapján megállapítotható, hogy 22 °C-on végezve a vizsgálatot minden mikrobánál szaporodásgátló hatás volt megfigyelhető, amely a xilit koncentráció növelésével lineárisan nőtt. 37 °C-on, a mikrobák szaporodási hőmérsékletének
1
optimumán a xilit az alkalmazott koncentrációban gyakorlatilag minden esetben hatástalan volt. Candida albicans esetén gyenge gátlás volt tapasztalható, amely nem olyan mértékű, hogy terápiás céllal használható lenne, de további vizsgálatok után megelőzésre alkalmazható. A gátló hatás a penészgomba esetében volt a legerőteljesebb. Az eredmények felvetik annak a lehetőségét, hogy további részletesebb vizsgálatok után a xilit alkalmas lehet az élelmiszer-ipari alkalmazásra, bizonyos tartósítószerek mennyiségének csökkentésére, esetleg helyettesítésére is.
Summary Xylitol is a naturally occurring, five-carbon sugar alcohol, which has long been known to the world of organic chemistry. Its insulin independent nature, the non-cariogenic property and the role in prevention of acute otitis media and other respiratory diseases have gradually brought it to light. Xylitol has been found particularly attractive as a non sugar sweetener for food and pharmaceutical industries. Nowadays it is produced on commercial scale worldwide. The aim of this study was to investigate antimicrobial effect of xylitol on Escherichia coli, Salmonella Enteritidis, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Candida albicans and Penicillinum expansum. The tests were performed at 22 C and 37 C, except for Penicillinum expansum that was examined only at 22 C. As culture medium Tryptic Soy Broth was used supplemented with 2%, 4%, 6%, 8% and 10% xylitol, respectively. Monitoring of microbial growth performed by redox potential measurement which is suitable for the detection of inhibition.
2
According to the results obtained from the experiment the four bacteria showed pronounced growth inhibition at 22 C. The inhibition effect was increased lineary by the xylitol concentration. The same effect was not detected at 37 C. In case of Candida albicans a slight inhibition could be observed; definitively not in the extent that would prone to therapeutic use, but it might be enough for prophylaxis in the future. The most promising result was achieved with Penicillinum expansum. Although the results of the experiment are quite promising, several more detailed studies should follow before xylitol can settle into our everyday life in its new role. Should it be applied as a preservative added to foods, pharmaceuticals, biological samples or paints further investigations are highly recommended.
3
A xilit természetben előforduló, nem fermentálható cukoralkohol. Kis mennyiségben megtalálható gombák, bogyós gyümölcsök, zöldségek összetevőjeként, ugyanakkor az állatok és az ember glükóz-anyagcseréje folyamán is keletkezik. Édesítőképessége megegyezik a szacharózéval, nincs utóíze. Glikémiás indexe az étkezési cukornál kisebb és kevesebb kalóriát is tartalmaz. Az elfogyasztott xilit egyharmada közvetlenül a vékonybélből szívódik fel, kétharmada a vastagbélben fermentálódik rövid szénláncú zsírsavakká a bélben megtalálható baktériumok révén (7). Kedvező tulajdonságainak köszönhetően élelmezési és gyógyszerészeti célra is használható. Amellett, hogy nagy jelentőségű alternatív édesítőszer, számos egészségre kedvező hatása is van. Fogszuvasodás gátló hatása nagyrészt az öt szénatomos kémiai szerkezetére vezethető vissza, ami megnehezíti, hogy a mikroorganizmusok felhasználják a növekedésükhöz. Mivel a fogszuvasodást előidéző baktériumok nem tudják metabolizálni a xilitet, a száj pH-értéke nem csökken, így akadályozva meg a plakk-képző baktériumok szaporodását és a fogzománc demineralizációját. Ezen eredmények fényében javasolják
a xilit alkalmazását a
fogszuvasodás megelőzésére (6, 9, 10). Kisgyermekek körében az egyik gyakran előforduló bakteriális fertőzés a középfülgyulladás. A xilit hatását a középfület érintő bakteriális eredetű betegségek megelőzésében többen is vizsgálták, mivel a középfül megbetegedéseinek gyógyszeres, illetve sebészi kezelésére szűkösek a lehetőségek (1). 1995-ben KONTIOKARI és mtsai a Streptococcus pneumoniaera nézve számoltak be a xilit antimikrobiális hatásáról, mely szerint a xilit megelőzi a S. pneumoniae adhézióját, valamint hatására a Haemophilus influenzae kisebb arányban képes kitapadni a hámsejtekhez (5). A xilitet régóta alkalmazzák inzulinhiányban szenvedők diétájában. Az 1970-es évek előtt egyszerű édesítőszerként használták diabetikus étrendben és parenterális táplálás esetén. Inzulinfüggetlen természete és kis glikémiás indexe különleges metabolizációjának
4
köszönhető. Lassan szívódik fel az emésztőrendszerből, kisebb része a portális keringésbe jut, nagyobb részét pedig a vastagbélben található baktériumok bontják le. Az aktuális szükséglet szerint alakul át szén-dioxiddá és vízzé, tárolódhat glikogén formájában, vagy egyéb anyagok, például lipidek keletkezhetnek belőle. Jóval kisebb vércukorszint-emelkedést idéz elő, mint a szacharóz, ebben a tulajdonságában a keményítőhöz hasonlít inkább. (4, 6). A xilit infúziós terápiában is alkalmazható napi 6 g/ttkg adagban. A glükózzal ellentétben nem reagál aminosavakkal, ami megkönnyíti a komplex infúziókban való alkalmazását. Poszttraumás és posztoperatív körülmények között a stresszhormonok túlzott termelődése megakadályozza az inzulin felszívódását, és így a glükóz hasznosulását. Az ilyen kritikus helyzetekben a xilit segítheti a szövetek ellátását anélkül, hogy megemelkedne a vér glükóz-, illetve inzulinszintje (2). Az eddig tárgyalt tulajdonságai mellett nagy előnye a xilitnek, hogy a szacharóz édesítő ereje mellett csak egyharmad annyi kalóriát tartalmaz. Emiatt különböző súlycsökkentő és súlyt megtartó diétákban a szacharózt helyettesítheti. Napjainkban számos diétás ételben és italban alkalmazzák, és egyre több területét meghódítja az élelmiszeriparnak.
A xilit toxicitása A legtöbb cukoralkohol laxatív (hashajtó) hatású emberekben, mivel csak részben szívódik fel a vékonybélből, és a vastagbél baktériumai fermentálják. A fermentáció melléktermékei emésztőszervi tüneteket okozhatnak, úgymint ozmotikus hasmenést, puffadást. A xilit nagyobb mennyiségben, különösen, ha a nap folyamán nem egyenletesen oszlik el az elfogyasztott mennyiség, ezeket a tüneteket okozza. Mindent összevetve a mannitolnál és a szorbitolnál jobban tolerálható (13). 1983-ban
a
FAO/WHO
Élelmiszer-adalékanyag
Szakértő
Bizottsága
a
legbiztonságosabb adalékanyagok csoportjába sorolta. A Codex Alimentarius 2013-ban
5
összeállított frissítése pontosan meghatározta, melyik élelmiszer kategóriában használható közvetlenül a xilit emberi fogyasztás céljából. Ennek köszönhetően széles körben használják, például édesítőszerként élelmiszerekben, gyógyszerekben és kozmetikumokban (3, 6).
Antimikrobiális hatás vizsgálata 2001-ben TAPIAINEN és mtsai kimutatták a xilit hatékonyságát a Streptococcus pneumoniae növekedésének gátlásában, 5%-os koncentrációban adva a táptalajhoz (12).
Saját vizsgálat Kísérleteink célja a xilit különböző, élelmiszerekben előforduló mikroorganizmusokra kifejtett gátló hatásának vizsgálata volt. Négy, élelmiszeripari szempontból fontos baktériumot ((Escherichia coli, Salmonella Enteritidis, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes), valamint két gombafajt (Candida albicans, Penicillium expansum) vizsgáltunk meg. A szakirodalomban megtalálható adatok alapján a Streptococcus mutansra, Streptococcus pneumoniaere és a Haemophilus influenzaere kifejtett gátló hatás alapján azt vártuk, hogy a xilit az általunk vizsgált mikrobákra is gátló hatást fejt ki (9, 10, 12).
Anyag és módszer Kísérleteink során Escherichia coli (ATCC 10536), Salmonella Enteritidis (NCAIM B.01908), Staphylococcus aureus (ATCC 49444), Listeria monocytogenes (ATCC 7611), Candida albicans (NCAIM Y01034), Penicillium expansum (NCAIM F00811) mikrobákat használtuk.
6
A vizsgálatok során kétszeresére hígított Tripton-szója táplevest (Merck 105459) használtunk, az alkalmazott xilit koncentráció 0, 2, 4, 6, 8 és 10 % volt. A tápleves mennyisége minden esetben 9 ml, a mikroba inokulum mennyisége 1 ml volt.
Mérési módszerek Vizsgálatainkat 32 csatornás MicroTester készülékkel, redoxpotenciál-méréssel végeztük. A mérési eljárás elvi alapja az, hogy a baktériumok szaporodása folyamán az energiatermelő biológiai oxidációs reakciók eredményeként a környezet redoxpotenciálja egy meghatározott mikrobakoncentráció felett jól detektálhatóan csökken. Detektációs időnek (TTD) tekintjük azt az időpontot, amikor a redoxpotenciál-változás sebességének abszolút értéke egy, a véletlen hatásoktól szignifikánsan különböző értéket (pl. |dE/dt| 0,5 mV/perc) meghalad (8, 11). A mért TTD-érték a mikrobák redoxaktivitásával arányos. A redoxaktivitás (A) függ a mikrobaszámtól (N) és a redox-komponensek termelődési sebességétől (P): A = k x (N x P). Ha a környezeti tényezők és ezzel a redoxaktivitás állandó a TTD csak a mikrobaszámtól függ. Ebben az esetben a TTD mérése alkalmas a mikrobaszám meghatározására (8, 11). Abban az esetben, ha a mikrobaszám állandó, a TTD változása a környezeti tényezőktől függ. Ilyen hatást fejthet ki például a táptalajban jelenlévő szaporodást gátló anyag. Ebben az esetben a TTD mérésével meghatározhatjuk a gátlás mértékét a gátlószer-koncentráció függvényében.
Direkt és indirekt mérés A baktériumok szaporodása során a redoxpotenciál változása a táplevesbe merített redoxelektródával közvetlenül mérhető (direkt mérés). Eukarióta sejtek (penész- és élesztőgombák) 7
esetében a tápközeg redoxpotenciálja közvetlenül nem mérhető, ebben az esetben a szaporodás során termelődő CO2 által okozott redoxpotenciál-változást mérjük. A szaporodás során képződött CO2-t KOH-ban nyeletjük el és a KOH redoxpotenciál változását mérjük. Az indirekt mérőcellát az 1. ábrán szemléltetjük. Ebben az esetben a redoxpotenciál a szaporodás során nő. A detektációs idő ebben az esetben is a direkt módszernél leírtak szerint határozható meg.
Eredmények A vizsgált mikroorganizmusok kezdeti mikrobaszámát az 1. táblázatban foglaltuk össze. A vizsgálatokat a mikrobák szaporodási hőmérsékleti optimumán 37 °C-on végeztük (a Penicillium expansumot kivéve). A detektációs időket (TTD) a 2. táblázat tartalmazza, amely eredményekből megállapítható, hogy 37 °C tenyésztési hőmérsékleten a xilit az alkalmazott koncentrációban valamennyi mikroba esetén hatástalan. 22 °C tenyésztési hőmérsékleten is elvégzett vizsgálat eredményeiből (3. táblázat) látható, hogy a TTD a xilit koncentrációjának növekedésével nő, vagyis a mikrobák szaporodási sebessége csökken. A TTD–xilit koncentráció közötti összefüggés meghatározásához ábrázoltuk a TTD változását a xilitkoncentráció függvényében. (2. ábra), amelyből megállapítható, hogy valamennyi baktérium esetében szoros lineáris összefüggés van a xilit-koncentráció és a TTD között. Az egyenesek
egyenletének
meredekségéből
meghatározható,
koncentrációváltozás mekkora TTD-növekedést okoz.
8
hogy
egységnyi
Az egyenesek egyenlete: Salmonella Enteritidis
TTD(h) = 0,2860xC(%) + 10,13
R2 = 0,9826
Eschericia coli
TTD(h) = 0,4307xC(%) + 10,43
R2 = 0,9932
Listeria monocytogenes
TTD(h) = 0,4406xC(%) + 18,51
R2 = 0,9843
Staphylococcus aureus
TTD(h) = 0,8854xC(%) + 30,74
R2 = 0,9645
Candida albicans
TTD(h) = 0,3547xC(%) + 33,07
R2 = 0,9624
Penicillium expansum
TTD(h) = 2,4859xC(%) + 30,63
R2 = 0,9845
Az eredmények alapján a xilit legkevésbé a Salmonella Enteritidis szaporodását gátolja, ezt követi az Escherichia coli és a Listeria monocytogenes. Legerősebb gátló hatást a vizsgált mikrobák közül a Staphylococcus aureus esetén tapasztaltunk. A gombákra vonatkozó mérési eredményeket a 3. ábra szemlélteti. Mindkét gomba esetében szoros, lineáris összefüggés van a xilitkoncentráció és a detektációs idő növekedése között. Candida albicans esetében a gátló hatás kicsi. Jelentős gátló hatást tapasztaltunk viszont a Penicillium expansum esetében.
Következtetések Vizsgálatainknak kettős célja volt. Egyrészt azt kívántuk megállapítani, hogy a redoxpotenciál-változás
mérésén
alapuló
MicroTester
vizsgálat
alkalmas-e
a
mikrobaszaporodás gátlásának mérésére, másrészt meg kívántuk vizsgálni a xilitnek, mint terjedőben lévő élelmiszer-adalékanyagnak (édesítőszernek) az esetleges mikrobaszaporodás gátló hatását. Megállapítottuk, hogy a módszer alkalmas a szaporodásgátló hatás mérésére, a 9
gátló hatás mértékének meghatározására. Gátlóhatás-vizsgálataink során megállapítottuk, hogy a xilitnek 37 °C tenyésztési hőmérséklet esetén ─ a vizsgált mikroorganizmusok esetében ─ nincs mikrobasztatikus hatása. Távolodva
a
szaporodási
szobahőmérsékletnek,
már
optimum-hőmérséklettől, minden
vizsgált
22
mikroba
°C-on, esetén
ami
megfelel
megfigyelhető
a volt
szaporodásgátló hatás. A vizsgált mikrobák közül a Penicillium expansum penészgomba esetében nem vizsgáltuk a 37 °C-on történő szaporodást, mivel a gomba szaporodási optimuma hőmérséklete 20─25 °C, a méréseket csak ebben a hőmérséklet-tartományban végeztük el. Ellentétben a többi mikrobával, amelyek szaporodásuk optimum-hőmérsékletén nem reagálnak a xilit jelenlétére, a penészgomba szaporodása jelentősen gátlódott. A xilit szaporodásgátló hatását a kísérleteink során használt mikrobákra korábban még nem vizsgálták. Az eredményeink felvetik annak a lehetőségét, hogy a xilit – további vizsgálatok után – alkalmas lehet cukortartalmú, tartósítószerrel konzervált élelmiszerek tartósítószer koncentrációjának csökkentésére. Az alkalmazáshoz a továbbiakban a xilitnek az élelmiszerekben
előforduló
penészgombák
szaporodására
gyakorolt
hatását
és
tartósítószerekkel együttes alkalmazás során fellépő esetleges kölcsönhatást kell vizsgálni.
Köszönetnyilvánítás A kutatás a TÁMOP-4.2.1.B-11/2/KMR-2011-0003 projekt támogatásával jött létre.
10
a
Irodalomjegyzék 1. AZARPAZHOOH, A. ─ LIMEBACK, H. et al.: Xylitol for preventing acute otitis media in children up to 12 years of age. Cochrane Database of Systematic Reviews 2011, Issue 11. Art. No.: CD007095. DOI: 10.1002/14651858.CD007095.pub2. 2.
DA
SILVA, S. S. ─ CHANDEL, A. K.: D-Xylitol: Fermentative production, application and
commercialization. Springer. Berlin, New York, 2012. 307─342. 3. FAO 2013 Codex Alimentarius, Xylitol www.codexalimentarius.net/gsfaonline/additives/details.html?id=146, Accessed: July 2013 4. HASSINGER, W. ─ SAUER, G. et al.: The effects of equal caloric amounts of xylitol, sucrose and starch on insulin requirements and blood glucose levels in insulin-dependent diabetics. Diabetologia, 1981. 21. 37─40. 5. KONTIOKARI, T. ─ UHARI, M. et al.: Effect of xylitol on growth of nasopharyngeal bacteria in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 1995; 39. 1820─1823. 6. MÄKINEN, K.K.: . History, Safety and Dental Properties of Xylitol Institute of Dentistry, University of Turku, Finland : http://www.naturallysweet.com.au/uploads/50072/ufiles/download_info/History_Safety_and_ Dental_Properties_of_Xylitol.pdf, Accessed July 2013 7. OKU, T. ─ NAKAMURA, S.:
Digestion, absorption, fermentation and metabolism of
functional sugar substitutes and their available energy. IUPAC, Pure Appl. Chem. 2002. 74. 1253─1261. 8. REICHART, O. ─ SZAKMÁR, K. ─ JOZWIÁK, Á. ─ FELFÖLDI, J. ─ BARANYAI, L.: Repox potential measurement as a rapid method for microbiological testing and its validation for coliform determination. Int. J. Food Microbiol. 2007. 114.143─148. 11
9. SCHEININ, A. ─ MÄKINEN, K. K. et al.: Turku sugar studies XVIII: Incidence of dental caries in relation to 1-year consumption of xylitol chewing gum. Acta Odontol Scand., 1975. 33. 269─278. 10. SCHEININ, A. ─ MÄKINEN, K.K. et al.: Turku sugar studies V: Final report on the effect of sucrose, fructose and xylitol diets on caries incidence in man. Acta Odontol Scand. 1976. 34. 179─216. 11. SZAKMÁR, K. ─ REICHART, O. ─ ERDŐSI, O. ─ FEKETE, Z.: Redox-potenciál mérésen alapuló gyorsmódszer nyers tej mikrobaszámának meghatározására. Magyar Allatorvosok, 2009. 131. 365─372. 12. TAPIAINEN, T. ─ KONTIOKARI, T. et al.: Effect of xylitol on growth of Streptococcus pneumoniae in the presence of fructose and sorbitol. Antimicrob. Agents Ch., 2001, 45, 166─169. 13. WHO/FAO: Expert Committee on Food Additives. Summary of Toxicological Data of Certain Food Additives Series 12: Xylitol (87-99-0) (1977). Available from, as of July, 2011: http://www.inchem.org/pages/jecfa.html
12
Táblázatok Tables
1. táblázat
Inokulumok mikrobaszáma
Table 1. Microbe count of inocula Inokulum koncentráció (N = cfu/ml) 1,5x106
Mikroba Escherichia coli Salmonella Enteritidis
1,6x106
Staphylococcus aureus
1,9x106
Listeria monocytogenes
9,8x105
Candida albicans
3,2x105
Penicillium expansum
5,0x103
13
2. táblázat
Detektációs idők 37 °C-os tenyésztésnél
Table 2. Detection times at 37 °C
Escherichia coli
0 3,00
TTD (h) Xilit koncentráció (%) 2 4 6 8 3,00 3,17 3,17 3,33
10 3,83
Salmonella Enteritidis
1,50
1,33
1,33
1,50
1,67
1,67
Staphylococcus aureus
5,17
5,17
5,33
5,63
5,83
6,00
Listeria monocytogenes
7,83
7,50
6,00
7,83
8,83
7,83
Candida albicans
12,67 12,67 13,33 12,83
12,67
12,67
TTD: detektációs idő
14
3. táblázat
Detektációs idők 22 °C-os tenyésztésnél
Table 3. Detection times at 22 °C
Escherichia coli,
0 10,17
TTD (h) Xilit koncentráció (%) 2 4 6 8 11,50 12,17 13,17 14,00
10 14,50
Salmonella Enteritidis
10,33
10,67
11,00
11,67
12,67
13,00
Staphylococcus aureus
30,67
32,5
34,00
36,33
38,50
39,00
Listeria monocytogenes
20,33
20,33
20,33
21,17
22,17
22,83
Candida albicans
33,17
33,67
34,17
35,5
36,17
36,37
Penicillium expansum
31,50
35,50
38,83
45,33
52,17
55,00
TTD: detektációs idő
15
Ábrák
1. ábra Indirekt mérőcella Figure 1. Indirect measuring cell
2. ábra Baktériumok TTD-értékeinek változása a xilit koncentráció függvényében (T=22 °C) Figure 2. Xylitol concentration dependent TTD values of bacteria
3. ábra Gombák TTD-értékeinek változása a xilit koncentráció függvényében (T=22 °C) Figure 3. Xylitol concentration dependent TTD values of moulds
16
