A TALAJ KÖRNYEZETTOXIKOLÓGIAI MÓDSZERTANI ÁTTEKINTÉS VIZSGÁLATA KÖRNYEZETTOXIKOLÓGIA ELŐADÁS

A TALAJ KÖRNYEZETTOXIKOLÓGIAI VIZSGÁLATA

MÓDSZERTANI ÁTTEKINTÉS KÖRNYEZETTOXIKOLÓGIA ELŐADÁS 2015.10.03. Feigl Viktória, Molnár Mónika BME ABÉT [email protected]

A TALAJ EGY KOMPLEX RENDSZER

http://egeology.blogfa.com/

Stefanovics, 1999 Prescott et al., 1993

2

SZENNYEZETT TALAJ VIZSGÁLATA 

Kémiai analitikai módszerek: fizikaikémiai hozzáférhetőség  Cél:

talajhasználattal összefüggő talajfunkciók és ivóvízbázisok tisztaságának megőrzése  Szennyezőanyagok feltárás után mérhető koncentrációja  de pl. XRF – laborgyakorlat!  De:  Az analitikai program csak a szennyezőanyagok kis hányadát tartalmazza  Talajok pufferkapacitása! 

http://portableas.com/

Integrált vizsgálatok szükségesek

Környezettoxikológia:

aktuális toxicitás,

káros hatások vizsgálata 

Függ a biológiai hozzáférhetőségtől

3

TALAJMINTÁK ELŐKÉSZÍTÉSE ÖKOTOXIKOLÓGIAI TESZTELÉSHEZ 

Talaj extraktumok  Specifikus

extrahálószerek, víz  Ált. 1:10 talaj:extrahálószer arány 

Probléma  Hígulás  Terjedést,

megoszlást nem modellezi helyesen  De: csapadékkal történő bemosódásra, vízzel való terjedésre  Egyensúlyi viszonyok beállítása – természetes folyamatok nem egyensúlyiak 

http://essre.rpcs.org/

Megoldás: direkt kontakt / interaktív / teljes talaj tesztek (whole soil tests)  Figyelembe

veszi: szennyezőanyag–talajszemcse, tesztorganizmus–talajszemcse (biofilm), tesztorganizmus– talajszemcse–szennyezőanyag kapcsolatokat  Eredeti talaj vagy szárított, porított, szitált talaj, esetleg steril talaj – laborgyakorlat!

https://plymouthculture.wordpress.com

4

HOZZÁFÉRHETŐSÉG: TELJES TALAJ ÉS PÓRUSVÍZ   

Példa: nagy agyagtartalmú talaj Talaj semlegesítő, pufferoló hatása Teljes talaj és pórusvíz közötti különbség, két görbe közötti terület

Fekete: pórusvíz Piros: teljes talaj

5

TALAJ ÖKOTOXIKOLÓGIAI TESZTELÉSÉRE ALKALMAS MÓDSZEREK 





Saját mikroflóra, flóra és fauna mennyiségi és minőségi vizsgálata  biomonitoring (passzív, in situ mérések)  fajeloszlás  biomarkerek  bioindikáció (őrző, detektor, kiaknázó, akkumuláló fajok) Saját mikroflóra aktivitása a teljes talajból mérve  légzés Laborgyakorlato  energiatermelés k anyaga  nitrifikálás  enzimaktivitások A teljes talaj és/vagy a pórusvíz hatásának mérése  laboratóriumi tesztorganizmusokra: ökotoxikológiai tesz, bioteszt bakteriális, növényi és állati tesztorganizmusokkal  modellrendszerben, kontrollált ökoszisztémára: mikrokozmosz és mezokozmosz 6  az ökoszisztémába kihelyezett kontrollált tesztorganizmusra: aktív biomonitoring.

BAKTERIÁLIS TESZTEK TALAJ VIZSGÁLATÁRA 

Biokémiai, fiziológiai változások 

Végpont gyakran enzimaktivitások változása: ATPáz, dehidrogenáz, foszfatáz, észteráz, luciferáz

Aliivibrio fischeri biolumineszcencia gátlási teszt (laborgyakorlat)  Azotobacter agile dehidrogenáz enzimaktivitás gátlási teszt  Pseudomonas fluorescens toxicitási teszt  Spirillum volutans mozgásképességi teszt 



Túlélés, pusztulás 



Bacillus subtilis teszt agardiffúziós módszerrel

Géntoxikológiai tesztek – mutáció   

Ames-teszt Mutatox-teszt SOS-chromotest

7

ALIIVIBRIO FISCHERI BIOLUMINESZCENCIA GÁTLÁSI TESZT I. (LABORGYAKORLAT) 







  

Aliivibrio fischeri: fényt emittáló tengeri baktérium (Vibrio fisheri, Photobacterium phosphoreum) Érzékenysége: toxikus fémekre, szerves makro- és mikro-szennyező anyagokra Mérési végpont: lumineszcencia intenzitás csökkenése Vizsgálati végpont: a minta hígítási sorából EC20, EC50 Szükséges műszer: luminometer Tesztelés időtartama: 30 perc Szabvány módszerek: US EPA Microtox, DIN 38412; direkt kontaktra kidolgozott változat: BME

LUMAC luminométer

8

A BAKTERIÁLIS LUCIFERÁZ ENZIM ÁLTAL KATALIZÁLT REAKCIÓ

További info az enzimrendszer működéséről: http://www.photobiology.info/Lin.html

9

Részletes leírás és protokoll: laborgyakorlat anyaga + könyv 108. oldal

Kurtafarkú tintahal

AZOTOBACTER AGILE DEHIDROGENÁZ ENZIMAKTIVITÁS GÁTLÁSI TESZT  



 

 

Azotobacter agile: talajbaktérium, nitrogén fixáló Könyv: 117. oldal Érzékenysége: szennyezőanyagok széles skálájára. Túlságosan is érzékeny, screenelésre, a negatív minták kiszűrésére javasolható. Mérési végpont: dehidrogenáz enzim aktivitás megléte vagy hiánya, illetve csökkenése Vizsgálati végpont: hígítással EC20, EC50 Szükséges műszer: vizuális (alternatív elektronakceptor színének megjelenése: igen, nem), vagy fotométer (alternatív elektronakceptor színintenzitása) Tesztelés időtartama: 48 óra Szabványosított módszerek: MSZ 21978/30 (veszélyes hulladékok kivonatára), direkt kontaktra kidolgozott változat: 12 BME

AZOTOBACTER AGILE DEHIDROGENÁZ ENZIMAKTIVITÁS GÁTLÁSI TESZT 





Módszer elve: környezeti stressz → az elektrontranszport rendszer megsérülhet. Az elektrontranszport lánc első szakaszának lépéseit a dehidrogenáz enzim katalizálja. Alternatív elektronakceptor: TTC (2,3,5trifenil-tetrazólium-klorid), mely az elektrontranszportlánc zavartalan működése esetén redukálódik, és piros színű trifenilformazánná alakul. Toxikus anyagok jelenlétében a dehidrogenáz enzimaktivitás gátolt, a piros szín nem jelenik meg, vagy intenzitása kisebb, mint a szennyezetlen kontrollé. Minta: steril talaj, hígítási sor (ha más mikrobák kerülnek a tesztoldatba, azok dehidrogenáz aktivitása meghamisítja az eredményt)

13

http://www2.pharm.u-szeged.hu/phtech/ kutatas/kutatas_muszer_altalanos_hu.html

BAKTERIÁLIS TESZTEK TALAJ VIZSGÁLATÁRA 

Biokémiai, fiziológiai változások 



Pseudomonas fluorescens toxicitási teszt  MSZ 21470-88:1993, talajkivonat  dehidrogenáz enzimaktivitás, indikátor: TTC/INT Spirillum volutans mozgásképességi teszt http://web.mst.edu/  mozgásképesség csökkenése, kemotaxisért felelős kolinészteráz izoenzimek gátlása

Pseudomonas fluorescens

Scott K. Rose

Spirillum volutans

14

BACILLUS SUBTILIS TESZT, AGARDIFFÚZIÓS MÓDSZERREL 







 

Tesztorganizmus: Bacillus subtilis, BME-en a gyöngyösoroszi Pb és Zn bánya területén izolált, fémekre érzékeny törzs Érzékenysége: közepesen érzékeny talajbaktérium, elsősorban toxikus fémekre, mint Zn, Cd, Cu érzékeny Mérési végpont: növekedésgátlás, kioltási zóna formájában Vizsgálati végpont: hígítási sorból EC20, EC50 Kiértékelés: vizuális, vonalzó Tesztelés időtartama: 48-72 óra

Könyv: 115. oldal

http://sites.google.com/site/scienceprofonline/cellbiologyhelp104

15 http://wikidoc.org/index.php/Bacillus_subtilis

BACILLUS SUBTILIS TESZT, AGARDIFFÚZIÓS MÓDSZERREL 











Agaros táptalajban egyenletesen eloszlatott és lemezként kiöntött Bacillus subtilis szaporodását, a lemez felületére helyezett, agarral szilárdított talajmintakorong toxicitásától függően gátolja. A mintakorong körül kialakult kisebb denzitású zóna → toxicitás Oldat: a kisebb denzitású zóna átmérője → szennyezőanyag mennyisége Teljes talajminták: a módszer kvalitatív természetű (toxikus, nem toxikus)

Elővizsgálat, a negatív minták kiszűrése Napi akár 500 minta

A minták a következő négy csoportba sorolhatók: kioltási zóna → erős gátlás → toxikus minta gyengítési zóna → gyenge gátlás → gyengén toxikus minta nincs zóna → nincs gátlás → nem toxikus a minta 16 serkentési zóna → serkentő hatás → nem toxikus a minta

AMES MUTAGENITÁSI TESZT TALAJRA A teszt típusa: egy fajt alkalmazó, reverz mutagenitási teszt, géntoxicitás kimutatására  Tesztorganizmus: Salmonella typhimurium mesterségesen hisztidin auxotróffá tett törzsei  Végpont: a hisztidin termelő képesség visszanyerése: hisztidin-mentes táptalajon revertáns telepek megjelenése  Időigény: 48–72 óra  Szabvány: ISO 16240:2005 szabvány vízminősítésére, OECD 471 vegyi anyagok tesztelésére, BME-n direkt kontaktra 

http://es.wikipedia.org

17

AMES MUTAGENITÁSI TESZT TALAJRA

Hisztidin + biotin oldat + (S. typhimurium törzs)

(minimál glükóz agar)

Telepek kis mennyiségű hisztidint tartalmazó táptalajon: reverz mutánsok→ mutagén hatás

Mutagén anyag nélküli kontroll: spontán revertánsok Érzékenységvizsgálat: 4-nitro-fenilén-diamin

18

BAKTERIÁLIS TESZTEK TALAJ VIZSGÁLATÁRA 

Géntoxikológiai tesztek 



Mutatox-teszt  Aliivibrio fischeri nem világító variáns, mutagén hatásra lumineszcencia SOS-chromotest  genetikailag módosított E. coli: SOS operon egy βgalaktozidáz operonnal összeépítve, X-Gal szubsztráttal kék szín, spektrofotometriás detektálás

19 http://www.ebpi.ca/

NÖVÉNYI TESZTORGANIZMUSOK  

Fehér mustár

Algák – elsősorban víztoxikológiában Magasabb rendű növények  Többnyire egynyári növények és fűfélék Kerti zsázsa  Pusztulás  csírázásgátlás – nem mindig elég érzékeny, mag belső tartalékainak hasznosítása  Növekedés  gyökér- és szárnövekedés gátlása, biomassza mennyisége Angolperje  Fotoszintetikus enzimaktivitások  klorofill mérése  Metabolikus enzimaktivitások  pl. peroxidáz, szuperoxid-dizmutáz, galutation-S-transzferáz  Szimbiotikus nitrogén-megkötés  Bioakkumuláció

http://www.kertvarazsmagazin.hu/

http://www.landw.uni-halle.de/

20

NÖVÉNYTESZT SZABVÁNYOK Szabvány módszerek: US EPA (1982), OECD (1984), US FDA (1987), MSZ 21976 (1993) stb.  Tesztorganizmusok: káposzta, sárgarépa, kukorica, uborka, saláta, hagyma, angolperje, zab, szójabab, kínai kel, zsázsa, mustár, retek, repce, rizs, paradicsom stb.  Magok száma/edény: 10−50 db  Ismétlések száma: 3−6  Időtartam: 3−14 nap  Mérési végpont: csírázás, gyökérnövekedés, biomassza tömeg  Vizsgálati végpont: kontrollhoz viszonyított gátlás, EC50 

21

SINAPIS ALBA (FEHÉR MUSTÁR) GYÖKÉR- ÉS SZÁRNÖVEKEDÉS GÁTLÁSI TESZT (LABORGYAKORLAT)Könyv: 123. oldal 



Sinapis alba érzékenysége: a szennyezőanyagok széles skálájára érzékeny Mérési végpont: csírázásgátlás  szár- és gyökérnövekedés  nedves és száraz biomassza tömeg 



Vizsgálati végpont: Gátlás százalékban megadva a kontrollhoz képest  ED20 és ED50 a minták hígítási sorozatából 

  

Szükséges műszer: vonalzó, vizuális értékelés Tesztelés időtartama: 72 óra Szabványosított módszerek: MSZ 21976-88 kivonatra, direkt érintkezésre kidolgozott változat: BME

22

ÁLLATI TESZTORGANIZMUSOK 

Egysejtűek 

Protozoák: Tetrahymena pyriformis (laborgyakorlat – vízi tesztorganizmusok), Colpoda cullus, Paramecium aurelia

Tetrahymena pyriformis

Paramecium aurelia

http://protist.i.hosei.ac.jp/

23

ÁLLATI TESZTORGANIZMUSOK 

Többsejtű állatok: elsősorban talajlakó állatok

Porcellio scaber

Cognettia sphagnetorum

wikipedia.org http://biomesthird10.wikispaces.com

Földigiliszta: Eisenia fetida, Eisenia andrei Televényférgek: Cognettia sphagnetorum Ugróvillások: Folsomia candida, Folsomia fimetaria, Isotoma viridis Fonálféreg: Plectus acuminatus, Heterocephalobus pauciannulactus, Panagrellus redivius Egyenlőlábú: Porcellio scaber (érdes pinceászka) Atka: Platynothrus peltifer Puhatestűek: Helix aspersa (petteyes éticsiga), 24 Arion ater (fekete csupaszcsiga)

FOLSOMIA CANDIDA (COLLEMBOLA) MORTALITÁSI TESZT (LABORGYAKORLAT) 





 







Folsomia candida: ugróvillások rendjébe tartozó, talajlakó, ősi rovar Teszt típusa: egy fajt alkalmazó, laboratóriumi, állati, akut toxicitási teszt, lehet krónikus (reproduktivitási) , elkerülési, mikrokozmosz teszt Érzékenysége: fémekre kevéssé, szerves szennyezőanyagokra érzékeny, főleg az illékonyakra és a bőrön át felszívódókra. Mérési végpont: állatok száma: letalitás, Vizsgálati végpont: hígításból LC20 és LC50, reproduktivitási teszt alapján NOEC Szükséges műszer: citoplaszt mikroszkóp vagy vizuális Tesztelés időtartama: akut: 5–10 nap, reprodukciós: 20 nap Szabvány: ISO 11267:1999, OECD/OCDE 232

25

Részletes leírás és protokoll: laborgyakorlat anyaga + könyv 126. oldal

PANAGRELLUS REDIVIUS (NEMATODA) SZAPORODÁS GÁTLÁSI TESZT 

Érzékenység: főként peszticidekre



Fejlesztő: Bagi (2006), BME ABÉT



Teszt típusa: reprodukciós teszt



 



Szükséges eszköz: mikrotitrátor lemez

Időtartam: 1 hét Mérési végpont: új generáció megjelenése Vizsgálati végpont: toxikus/nem toxikus minősítés 26 http://edisonleatherworks.com/2011/06/19/wormpad/

EISENIA FETIDA (FÖLDIGILISZTA) TESZT 



Eisenia fetida érzékenysége:  Közepesen érzékeny tesztorganizmus.  Az expozíciós útvonalak közül a bőrkontakt és az emésztés dominál.  Akut hatásokkal szemben ellenállóbb, a krónikus toxicitás és a reproduktivitás nagyobb érzékenységet biztosít. Mérési és vizsgálati végpontok:  akut és krónikus toxicitás, elkerülési teszt esetében: az állatok száma, letalitás, hígítással EC20 és/vagy EC50, valamint NOEC  reproduktivitásnál: az utódok száma, NOEC  bioakkumuláció vizsgálata esetén: koncentráció a szövetekben

http://gogreennow5.blogspot.com/

http://veracruzinforma.com.mx/

27

EISENIA FETIDA (FÖLDIGILISZTA) TESZT 



Szükséges műszer: állatok száma: manuális és vizuális, bioakkumuláció vizsgálata esetén a szennyezőanyagnak megfelelő analitikai műszer Időigény:  szűrőpapír teszt talajkivonattal (OECD, 1984) esetén 24 és 48 óra  mesterséges talajteszt OECD talajba kevert mintaszuszpenzióval (OECD, 1984; EEC, 1982) esetén 7 és 14 nap  Artisol teszt szilikagélbe kevert oldattal (Ferriére et al., 1981) 7 és 14 nap 28

EISENIA FETIDA (FÖLDIGILISZTA) TESZT   



Talajminta: 250 g talajmintát használunk szárítás nélkül. Referencia: tiszta erdei talaj, hígításhoz OECD talaj A 750 ml-es befőttesüvegbe mért talajra mintánként 10–10 azonos korú gilisztát helyezünk, majd sötét szobában két hétig tároljuk. A két hetes akut teszt ideje alatt nem etetjük az állatokat. Reproduktivitási teszt esetében tápanyagpótlásról kell gondoskodni. Kiértékelés  Az akut toxicitási teszt értékelésekor két hét elteltével a mintákat vízzel felszuszpendáljuk ügyelve, nehogy megsértsük a gilisztákat. Végül egy tálcára borítjuk a mintát és megszámoljuk az életben maradt egyedeket. A túlélő giliszták számát ábrázoljuk a koncentráció függvényében.  Reproduktivitási teszt esetében minden 1 cm-nél nagyobb utódot megszámolunk. Az utódok méreteloszlását is vizsgálhatjuk. 29  Bioakkumulációs teszt esetén a gilisztákat kiéheztetése és kiürülés után analizálják

A TALAJ SAJÁT AKTIVITÁSÁNAK MÉRÉSE 





Talaj metabolikus aktivitásáért felelős: mikroorganizmusok, extracelluláris enzimek, mezo- és makrofauna Mikroorganizmusok kulcsszerepe: szerves anyagok bontása, tápelemek körforgása – talaj termékenységének megőrzése 

Fontos: talaj metabolikus integritásának fenntartásában



Mikrobiális aktivitás



Enzimaktivitás (növényi és állati is, nem mindig aktív sejthez kötött)

Főként aerob sejtek aktivitásnak vizsgálata, de: anaerob körülmények pl. vízzel elárasztott talajban: denitrifikáció, nitrát redukció, szulfát redukció

30

A TALAJ SAJÁT AKTIVITÁSÁNAK MÉRÉSÉN ALAPULÓ TESZTEK 

Talaj mikrobiológiai vizsgálatok (Környezeti mikrobiológia és biotechnológia, 2. előadás) 

Élő sejtek számának meghatározása (könyv 131. oldal) 



  

tenyésztéses technikák – általános és higiénés vizsgálatok (laborgyakorlat)



Szennyezőanyagot bontó sejtek számának meghatározása (könyv 132. oldal)



Géntechnikák – FISH



Mikróbaközösség szubsztrát hasznosításának jellemzése – BIOLOG EcoPlate

Légzés mérés (laborgyakorlat) (Környezeti mikrobiológia és biotechnológia, 9. előadás) 

Átlevegőztetett rendszerben (könyv 134. oldal)



Statikus rendszerben (zárt palack teszt – OxiTop Control)

A talaj nitrifikációja A talaj ATP-tartalma Enzimaktivitások mérése

31

A TALAJ NITRIFIKÁCIÓJA 





    

Szennyezetlen talajhoz adott vegyi anyag vagy szennyezett talaj hatására az eredeti talaj nitrifikáló képessége arányosan csökken (könyv 139. oldal) Nitrifikáció folyamata:  2NH4+ + 3O2 → 2NO2- + 2H2O + 4H+ + Energia  2NO2- + O2 → 2NO3- + Energia Mérési végpont: nitrit kimutatása Griess-Ilosvay reagenssel (nitrit nitráttá való oxidációját klorát hozzáadásával gátoljuk, nitrifikációt KCl-oldattal állítjuk le), Vizsgálati végpont: hígítási sorból EC20 és EC50 Mérés: fotometriásan (540 nm) Kalibrációs sor: NaNO2 KCl-oldatban Mérés időtartalma: 5 óra Kidolgozva a BME-n az ISO 9509 alapján

http://www.marchettigasse.at/

32

ATP MENNYISÉGÉNEK MÉRÉSE LUMINESZCENCIÁN ALAPULÓ ELJÁRÁSSAL 





ATP: sejtek általános energiatároló vegyülete, ATP mennyisége → sejtszám, aktivitás; toxikus hatásra ATP termelés csökken (könyv 143. oldal) Módszer: Lumac kit és BioOrbit kit, luciferáz tartalmú reagens Mérés luminométerrel

33 http://www.bmb.leeds.ac.uk/

http://www.vilaglex.hu/

DEHIDROGENÁZ-ENZIMAKTIVITÁS Légzési lánc enzimje  NAD+ + szubsztrát-H → NADH + szubsztrát  Következtetni lehet a teljes oxidációs aktivitásra  Kimutatás: alternatív elektron akceptorral 

TTC (trifenil-tetrazólium-klorid), trifenil-formazánná redukálódik, piros szín  INT [2-(p-jódfenil)-3(p-nitrofenil)-5-feniltetrazóliumklorid], jodonitrotetrazólium-kloriddá redukálódik, piros szín 



Spektrofotometriás detektálás

34

http://www.markergene.com/WebNewsletter2.10.htm

FDA HIDROLÍZIS VIZSGÁLATA Fluoreszcein származék  Lipáz, észteráz, proteázok által hidrolizálható  Aktív sejtek megfestésére is alkalmas  Spektrofotometriás detektálás 

http://www.climate-policy-watcher.org/

http://wn.com/Fluorescence_of_Fluorescein

35

REFERENCIÁK 

Gruiz Katalin, Horváth Beáta, Molnár Mónika: Környezettoxikológia, Műegyetemi Kiadó, 2001. 



62 –127. old.

www.körinfo.hu Képtár és E-tanfolyam – gyakorlati alkalmazás, talaj és felszín alatti víz, biológiai-ökológiai és környezettoxikológiai felmérés/monitoring  Adatbázisok – biológiai, ökotoxikológiai felmérési és monitoring módszerek 

36